CN115791753A - 一种双模式快速检测烟碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学分析检测技术领域，尤其涉及一种双模式快速检测烟碱的方法，包括基于Glu‑CDs/AuNPs@Hg纳米酶建立的比色法和表面增强拉曼光谱法，其中，具有过氧化物酶催化活性的Glu‑CDs/AuNPs@Hg纳米酶在H2O2存在条件下，可以催化无色TMB转化为蓝色oxTMB，而待测物质烟碱也可显著提升其过氧化物酶活性，加速Glu‑CDs/AuNPs@Hg纳米酶对TMB的氧化，随着烟碱浓度的增加，溶液吸光度逐渐增加，基于此可以建立烟碱比色检测方法；与此同时，Glu‑CDs/AuNPs@Hg纳米酶与TMB相互作用后，会显著增强拉曼散射信号，基于此建立烟碱拉曼检测方法，有效解决了拉曼增强基低对烟碱拉曼信号弱的问题。因此，本发明采用比色检测和拉曼检测双模式使得结果更加互补和一致，确保了检测结果的准确性和可信性。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，尤其涉及一种双模式快速检测烟碱的方法。
背景技术
烟碱，又称尼古丁，化学名称为1-甲基-2-(3-氮杂苯基)氮杂环戊烷，是烟草中最重要、含量最高的生物碱，一般占烟叶含量的1-3％。烟碱的毒性很大，对神经中枢具有兴奋作用，是吸烟成瘾的物质基础，其含量大小对人类健康的影响已成为烟草及其制品质量控制的重要指标。
目前，烟碱的主要分析方法包括紫外分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法等，但均需要经过复杂的前处理过程。近年来，表面增强拉曼光谱(Surface-enhancedRaman spectroscopy，SERS)由于其操作简单、快速、不需要复杂仪器设备而备受关注。
SERS是一种特异性分子识别技术，不需要操作繁琐的样品前处理，拥有高敏感性、检测时间短以及即检即测等优点，已成为表面分析科学技术领域中一种强有力的工具。SERS基底的性能是影响拉曼信号的最关键的因素，因此需要制备性能优异的拉曼增强基底，使之能够实现烟碱的快速测定。
迄今为止，尚无使用SERS技术直接实现烟碱检测的报道，主要是由于大部分所制备的纳米材料在检测过程中需要分散到溶液中，导致SERS热点较少，SERS信号增强较弱。因此，开发具有SERS增强和模拟酶活性的纳米材料对于烟碱的快速SERS检测具有重大的意义。
本发明针对拉曼增强基底对烟碱拉曼信号弱的问题，利用拉曼增强基底同时具有模拟酶活性的作用，开发了一种基于SERS活性过氧化物酶Glu-CDs/AuNPs@Hg的双模式烟碱检测新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双模式快速检测烟碱的方法，该方法具有准确性高、操作简单、处理成本低的优点。
本发明提供一种双模式快速检测烟碱的方法，包括基于Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶建立的比色法和表面增强拉曼光谱法。
本发明基于SERS活性过氧化物酶Glu-CDs/AuNPs@Hg的双模式烟碱检测方法中，具有过氧化物酶催化活性的Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶在H2O2存在条件下，可以催化无色TMB转化为蓝色oxTMB，而待测物质烟碱也可显著提升其过氧化物酶活性，加速Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶对TMB的氧化，随着烟碱浓度的增加，溶液吸光度逐渐增加，基于此可以建立烟碱比色检测方法；与此同时，Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶与TMB相互作用后，会显著增强拉曼散射信号，基于此建立烟碱拉曼检测方法，有效解决了拉曼增强基底对烟碱拉曼信号弱的问题。本发明采用比色检测和拉曼检测双模式使得结果更加互补和一致，确保了检测结果的准确性和可信性。
作为本技术方案优选地，所述比色法中，烟碱比色标准工作曲线的制作包括以下步骤：
向容器中依次加入烟碱标准品、TMB和双氧水，混匀后加入Glu-CDs/AuNPs@Hg，并用偏酸性pH缓冲液稀释，静置后使用分光光度法测定波长为654nm处的吸光度，以烟碱浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制烟碱比色标准工作曲线；
其中，所述偏酸性pH缓冲液优选为pH＝5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。此外，本发明对于各反应物的配比不作严格限定，具体地，每1-500μL的烟碱标准品所对应的TMB、双氧水和Glu-CDs/AuNPs@Hg的体积分别为100μL、10μL和200μL，其中，烟碱标准品的浓度为5mg/mL，TMB的浓度为5mM，双氧水的浓度为50mM。
作为本技术方案优选地，所述表面增强拉曼光谱法中，烟碱拉曼散射标准工作曲线的制作包括以下步骤：
向96孔板中依次加入烟碱标准品、TMB和双氧水，混匀后加入Glu-CDs/AuNPs@Hg，并用水稀释，静置后使用拉曼仪扫描并记录1605cm-1位置处的拉曼信号强度，以烟碱浓度为横坐标、拉曼信号强度为纵坐标绘制烟碱拉曼散射标准工作曲线；
其中，拉曼检测的条件为：激发光波长为785nm，激光功率为500mV，扫描时间为10s。同样，本发明对于各反应物的配比不作严格限定，具体地，每0.5-100μL的烟碱标准品所对应的TMB、双氧水和Glu-CDs/AuNPs@Hg的体积分别为30μL、70μL和80μL，其中，烟碱标准品的浓度为5mg/mL，TMB的浓度为5mM，双氧水的浓度为50mM。
使用该方法对烟叶或烟丝样品中烟碱进行测试时，还需要对样品进行样品前处理和样品脱色处理，而所述样品前处理包括：准确称取烟叶或烟丝样品，剪碎后置于容器中，加入去离子水浸湿后加入氢氧化钠，超声10-20min以最大程度的将样品中的烟碱提取至溶液中，超声后于7000-9000rpm/min下离心10-20min以去除烟叶或烟丝固体残渣，过滤并收集上清液，取滤渣重复提取操作，合并上清液，得到样品提取液。
在样品提取过程中，本发明对于去离子水和氢氧化钠的具体用量不作严格限定，具体地，每1g烟叶或烟丝样品所对应去离子水、氢氧化钠的体积分别为8-10mL和0.5-2mL，其中，氢氧化钠的浓度0.5-2M；并优选为，每1g烟叶或烟丝样品所对应去离子水、氢氧化钠的体积分别为90mL和1mL，其中，氢氧化钠的浓度1M。
在对所提取的样品溶液进行测试之前，还需要对样品溶液进行脱色处理，以减少样品本色对比色法和拉曼检测的影响，而所述样品脱色处理具体包括：向样品提取液中加入六水合硫酸锌和氢氧化钠，涡旋混合1-2min，离心分离，取上清液，得到样品测定液；
优选地，按照每1mL样品提取液中含有0.2g烟碱的量添加脱色剂，1mL样品提取液所对应六水合硫酸锌、氢氧化钠的体积均为180-220μL，其中，六水合硫酸锌的浓度为0.3-0.7M，氢氧化钠的浓度0.5-2M，并优选为，每1mL样品提取液所对应六水合硫酸锌、氢氧化钠的体积均为200μL，其中，六水合硫酸锌的浓度为0.5M，氢氧化钠的浓度1M。
具体地，在对烟叶或烟丝样品进行测定时，需对样品进行比色测定和表面增强拉曼散射测定；在比色法测定时，可参照烟碱比色标准曲线建立的方法，将烟碱标准品替换为样品测定液。具体地，向容器中依次加入样品测定液、TMB和双氧水，混匀后加入Glu-CDs/AuNPs@Hg，并用pH＝5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释，静置后使用分光光度法测定波长为654nm处的吸光度，代入烟碱比色标准工作曲线，得到样品中烟碱含量。在拉曼散射测定时，可参照烟碱拉曼散射标准曲线建立的方法，将烟碱标准品替换为样品测定液。具体地，向96孔板中依次加入样品测定液、TMB和双氧水，混匀后加入Glu-CDs/AuNPs@Hg，并用水稀释，静置后使用拉曼仪扫描并记录1605cm-1位置处的拉曼信号强度，代入烟碱拉曼散射标准工作曲线，得到样品中烟碱含量。
本发明的双模式快速检测烟碱的方法，无论是比色法还是拉曼散射法，均是基于Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶建立的。因此，Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶的活性是本发明检测方法具有较高准确性的关键。具体地，所述Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将柠檬酸、葡萄糖和乙二胺溶于去离子水中，混匀后转移至聚四氟乙烯罐中，于160-220℃下加热2-6h后，在200℃下保持2-6h，依次进行过滤、离心，得到Glu-CDs溶液；
S2、将PVP、汞试剂和1/3的HAuCl4溶于去离子水中，加热搅拌5-15min后，加入1/3的HAuCl4继续反应5-15min，再加入Glu-CDs溶液和剩余的HAuCl4反应5-15min，于冰浴中冷却，得到Glu-CDs/AuNPs@Hg；
研究表明，在本发明Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶的制备过程中，只有L-葡萄糖碳点制备的金纳米与Hg2+作用后，才能同时产生比色和拉曼散射信号增强效果，而通过D-葡萄糖碳点制备的纳米材料仅可产生比色信号，无法产生拉曼信号。
在葡萄糖碳点(Glu-CDs)的制备过程中，本发明对于各反应物的配比不作严格限定，其中，每0.1-2g柠檬酸所对应葡萄糖、乙二胺和去离子水的量分别为0.1-1g、40-60μL和20-50mL，并优选为每2g柠檬酸所对应葡萄糖、乙二胺和去离子水的量为0.5g、50μL和40mL；
同样，在Au基纳米酶(Glu-CDs/AuNPs@Hg)的制备过程中，本发明对于各反应物的配比不作严格限定，其中，每100-1000μL的PVP所对应汞试剂、HAuCl4、去离子水和Glu-CDs溶液的量分别为100-1000μL、300-3000μL、20-40mL和10-200μL，所述PVP的质量浓度为0.5-1.5％，所述汞试剂的浓度为8-12mM，所述HAuCl4的浓度为40-60mM，并优选为每500μL的PVP所对应汞试剂、HAuCl4、去离子水和Glu-CDs溶液的量分别为500μL、1500μL、3mL和50μL，PVP的质量浓度为1％，汞试剂的浓度为1.0mM，所述HAuCl4的浓度为50mM。其中，汞试剂包括氯化汞、硝酸汞和甲基汞中的任意一种。
作为本技术方案优选地，在葡萄糖碳点(Glu-CDs)的制备过程中，柠檬酸、葡萄糖和乙二胺反应后得到的溶液为浅棕黄色，为进一步纯化还溶液，需要对其进行过滤和离心，具体地，所述过滤时，使用0.22μm的滤膜；所述离心时，控制转速为8000-12000rpm/min，时间为10-20min，并优选转速为10000rpm/min，时间为15min；
作为本技术方案优选地，在Au基纳米酶(Glu-CDs/AuNPs@Hg)的制备过程中，为提高溶解和反应速率，在搅拌时对体系进行加热处理，并控制体系温度为100℃-130℃。
本发明的双模式快速检测烟碱的方法，至少具有以下效果：
1、本发明基于SERS活性过氧化物酶Glu-CDs/AuNPs@Hg的双模式烟碱检测方法，利用烟碱加速Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)反应，基于烟碱浓度与氧化TMB蓝色线性关系，以及烟碱浓度与氧化TMB拉曼散射强度增强之间的关系，建立高灵敏、选择性强的烟碱比色和SERS双模式检测新方法；
2、本发明的Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶，Hg2+与金纳米形成金汞齐在提高拟过氧化酶活性同时，也可以有效提升拉曼检测信号，有效解决了酶活性低和拉曼信号弱的问题，因此，该纳米酶具有双重作用，一是作为纳米酶，利用其拟过氧化酶氧化TMB，产生比色信号，同时又是拉曼增强剂，增强氧化后TMB的拉曼信号；
3、本发明的双模式快速检测烟碱的方法，对于烟叶/烟丝样品中烟碱的检测，比色法的检出限为0.36μg/mL，表面增强拉曼散射的检出限为1.80μg/mL，可以满足行业内对于烟碱检测的需求；
4、本发明所建立的烟碱测定法相比于其他检测方法具有处理步骤少，所用时间短，处理成本低，操作简便，不需要大型仪器设备等优点，在实际检测中具有较强的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中烟碱对纳米酶的拟过氧化酶氧化TMB增敏紫外-可见吸收光谱；
图2为本发明烟碱比色检测标准曲线；
图3为本发明共存离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+等)、葡萄糖和抗坏血酸对烟碱检测比色信号的影响；
图4为本发明烟碱拉曼光谱检测的拉曼光谱图；
图5为本发明烟碱拉曼散射检测标准曲线；
图6为本发明共存离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+等)、葡萄糖和抗坏血酸对烟碱拉曼检测信号的影响。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶的制备
S1、分别取2g柠檬酸、0.5g L-葡萄糖和50μL乙二胺，溶解在40mL去离子水中；混匀后转移至100mL聚四氟乙烯罐中，于180℃下加热4h后，在200℃下再保持4h，得浅棕黄色Glu-CDs溶液；最后，将上述溶液过0.22μm滤膜，经10000r/min高速离心15min，即得Glu-CDs溶液。
S2、分别取500μL 1％PVP、500μL 10mM HgCl2和50mM 500μL HAuCl4，溶解在30mL去离子水中；于100℃-130℃下加热搅拌10min后，加入500μL 50mM HAuCl4，继续反应10min；随后，加入50μLGlu-CDs溶液和500μL 50mM HAuCl4反应10min；最后，将上述溶液于冰浴中冷却，即得Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶。
实施例2
Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶的制备
将HgCl2替换为Hg(NO2)2，其他同实施例1。
实施例3
Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶的制备
将HgCl2替换为甲基汞，其他同实施例1。
对照例
Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶的制备
将L-葡萄糖替换为D-葡萄糖，其他同实施例1。
研究表明，在本发明Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶的制备过程中，只有L-葡萄糖碳点制备的金纳米与Hg2+作用后，才能同时产生比色和拉曼散射信号增强效果，而通过D-葡萄糖碳点制备的纳米材料仅可产生比色信号，无法产生拉曼信号；而对于汞试剂不作具体要求，可以选用氯化汞、硝酸汞和甲基汞中的任意一种。
实施例4
烟碱比色标准工作曲线的制作
在10mL具塞比色管中，依次加入1-500μL的烟碱标准品(5mg/mL)，100μL TMB(5mM)和10μLH2O2(50mM)，并混匀均匀；然后加入200μLGlu-CDs/AuNPs@Hg，并用pH＝5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释至4mL，室温放置4min后，检测654nm处吸光度A，以烟碱浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制烟碱比色标准工作曲线，得到回归方程。
图1为不同烟碱浓度对纳米酶的拟过氧化酶氧化TMB增敏紫外-可见吸收光谱，由此绘制得到的烟碱比色标准工作曲线和回归方程如图2，回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围如表1所示。
表1比色法线性方程、相关系数、相对标准偏差和线性范围
由表1可知，本发明烟碱比色标准工作曲线的线性相关系数为0.9970，其检测范围为1.25-375，检出限可达1.25μg/g。
此外，本发明还研究了共存离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+等)、葡萄糖和抗坏血酸对烟碱检测比色信号的影响。
由图3可知，当烟碱浓度为0.25mg/mL，共存离子和葡萄糖浓度为12.5mg/mL时，其它共存物质对烟碱比色信号无明显影响。由此表明，烟碱对纳米酶拟过氧化酶氧化TMB有较好的选择特异性，本方法具有很好的抗干扰性。
实施例5
烟碱拉曼散射标准工作曲线的制作
在96孔板中，依次加入0.5-100μL的烟碱标准品(5mg/mL)，30μL TMB(5mM)和70μLH2O2(50mM)，混合均匀；然后加入80μLGlu-CDs/AuNPs@Hg，用水稀释至0.4mL，室温放置4min后，使用便携拉曼仪扫描并记录1605cm-1位置处的SERS信号强度，以烟碱浓度为横坐标，SERS信号强度为纵坐标，绘制烟碱拉曼散射标准工作曲线，得到回归方程。
图4为烟碱拉曼光谱检测的拉曼光谱图，由此绘制得到的烟碱比色标准工作曲线和回归方程如图5，回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围如表2所示。
表2拉曼散射法线性方程、相关系数、相对标准偏差和线性范围
由表2可知，本发明烟碱比色标准工作曲线的线性相关系数为0.9930，其检测范围为6.25-1250，检出限可达4.21μg/g。
此外，本发明还研究了共存离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+等)、葡萄糖和抗坏血酸对烟碱检测拉曼信号的影响。
由图6可知，当烟碱浓度为1mg/mL，共存离子和葡萄糖浓度为50mg/mL时，其它共存物质对烟碱比色信号无明显影响。由此表明，仅有烟碱可以显著提升氧化后TMB的拉曼信号，本方法具有很好的抗干扰性。
实施例6
复烤烟叶样品中烟碱含量的测定
(1)准确称取1g烟叶(精确到0.001g)样品，剪碎后置于50mL烧杯中，加入9mL去离子水，浸湿后加入1mL氢氧化钠(1M)，混匀超声15min后于8000rpm下离心15min，过滤并收集上清液，取滤渣后重复一次上述操作，合并上清液，得到样品提取液。
(2)样品脱色处理：按照每1mL上清液加入200μL六水合硫酸锌(0.5M)和200μL氢氧化钠(1M)除色，涡旋混合1-2min，离心分离，取出上清液，制得样品测定液。
(3)样品比色测定：在10mL具塞比色管中，加入100μL样品测定液，再加入100μLTMB(5mM)和10μLH2O2(50mM)，混合均匀；然后加入200μL实施例1所制得的Glu-CDs/AuNPs@Hg，并用pH＝5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释至4mL，室温放置4min后，检测654nm处吸光度A，代入烟碱比色检测回归方程，折算后，得到样品中烟碱含量为1.80mg/g。
(4)样品表面增强拉曼散射测定：在96孔板中，加入100μL样品测定液，再加入30μLTMB(5mM)和70μLH2O2(50mM)，混合均匀；然后加入80μL实施例1所制得的Glu-CDs/AuNPs@Hg，并用水稀释至0.4mL，室温放置4min后，使用便携拉曼仪扫描并记录1605cm-1位置处SERS信号强度，代入烟碱拉曼散射检测回归方程，折算后，得到样品中烟碱含量1.83mg/g。
(5)回收率与精密度实验：在烟叶样品提取液中分别添加2个不同浓度的烟碱标准溶液，每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差RSD，结果如表3所示。
表3样品加标回收率及RSD(n＝3)
由表3可知，本实施例测得的烟碱的加标回收率为96.1％-105.7％，RSD为2.2％-4.8％，具有较好的准确性和精密度；且比色法和拉曼散射法测定的结果较为一致，进一步说明了本方法的准确性较高。
实施例7
烟丝样品中烟碱的测定
(1)准确称取1g烟丝(精确到0.001g)样品，剪碎后置于50mL烧杯中，加入9mL去离子水，浸湿后加入1mL氢氧化钠(1M)，混匀超声15min后于8000rpm/min离心15min，过滤并收集上清液，取滤渣后重复一次上述操作，合并上清液，得到样品提取液；
(2)样品脱色处理：同实施例6；
(3)样品比色测定：操作步骤同实施例6，计算样品烟碱含量为2.10mg/g。
(4)样品SERS测定：操作步骤同实施例6，计算样品烟碱含量为2.02mg/g。
实施例8
霉变烟叶样品烟碱含量的测定
(1)准确称取1g霉变烟叶(精确到0.001g)样品，剪碎后置于50mL烧杯中，加入9mL去离子水，浸湿后加入1mL氢氧化钠(1M)，混匀超声15min后于8000rpm/min离心15min，过滤并收集上清液，取滤渣后重复一次上述操作，合并上清液，得到样品提取液；
(2)样品脱色处理：同实施例1；
(3)样品比色测定：操作步骤同实施例6，计算样品烟碱含量为1.30mg/g。
(4)样品SERS测定：操作步骤同实施例6，计算样品烟碱含量为1.35mg/g。
将实施例6-8与中国烟草行业标准YC/T 246-2008烟草及烟草制品烟碱的测定气相色谱法进行比对，结果见表4。
表4加标回收率及相对标准偏差(mg/g)
| 测定方法 | 实施例6 | 实施例7 | 实施例8 |
| 比色法 | 1.80 | 2.10 | 1.30 |
| 拉曼散射法 | 1.83 | 2.02 | 1.35 |
| YC/T 246-2008测得值 | 1.79 | 2.05 | 1.33 |
由表4可知，本发明基于SERS活性过氧化物酶Glu-CDs/AuNPs@Hg的双模式烟碱检测方法与气相色谱检测方法基本一致。但本发明所建立的烟碱测定法具有处理步骤少，所用时间短，处理成本低，操作简便，不需要大型仪器设备等优点，在实际检测中具有较强的优势。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种双模式快速检测烟碱的方法，其特征在于，包括基于Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶建立的比色法和表面增强拉曼光谱法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述比色法中，烟碱比色标准工作曲线的制作包括以下步骤：
向容器中依次加入烟碱标准品、TMB和双氧水，混匀后加入Glu-CDs/AuNPs@Hg，并用偏酸性pH缓冲液稀释，静置后使用分光光度法测定波长为654nm处的吸光度，以烟碱浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制烟碱比色标准工作曲线；
优选地，所述偏酸性pH缓冲液为pH＝5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每1-500μL的烟碱标准品所对应的TMB、双氧水和Glu-CDs/AuNPs@Hg的体积分别为100μL、10μL和200μL，其中，烟碱标准品的浓度为5mg/mL，TMB的浓度为5mM，双氧水的浓度为50mM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面增强拉曼光谱法中，烟碱拉曼散射标准工作曲线的制作包括以下步骤：
向96孔板中依次加入烟碱标准品、TMB和双氧水，混匀后加入Glu-CDs/AuNPs@Hg，并用水稀释，静置后使用拉曼仪扫描并记录1605cm-1位置处的拉曼信号强度，以烟碱浓度为横坐标、拉曼信号强度为纵坐标绘制烟碱拉曼散射标准工作曲线；
优选地，拉曼检测的条件为：激发光波长为785nm，激光功率为500mV，扫描时间为10s。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，每0.5-100μL的烟碱标准品所对应的TMB、双氧水和Glu-CDs/AuNPs@Hg的体积分别为30μL、70μL和80μL，其中，烟碱标准品的浓度为5mg/mL，TMB的浓度为5mM，双氧水的浓度为50mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括样品前处理和样品脱色处理，
所述样品前处理包括：准确称取烟叶或烟丝样品，剪碎后置于容器中，加入去离子水浸湿后加入氢氧化钠，超声10-20min后于7000-9000rpm/min下离心10-20min，过滤并收集上清液，取滤渣重复提取操作，合并上清液，得到样品提取液；
优选地，每1g烟叶或烟丝样品所对应去离子水、氢氧化钠的体积分别为8-10mL和0.5-2mL，其中，氢氧化钠的浓度0.5-2M；
所述样品脱色处理包括：向样品提取液中加入六水合硫酸锌和氢氧化钠，涡旋混合1-2min，离心分离，取上清液，得到样品测定液；
优选地，每1mL样品提取液所对应六水合硫酸锌、氢氧化钠的体积均为180-220μL，其中，六水合硫酸锌的浓度为0.3-0.7M，氢氧化钠的浓度0.5-2M。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括样品测定，所述样品测定包括样品比色测定和样品表面增强拉曼散射测定；
所述样品比色测定包括：向容器中依次加入样品测定液、TMB和双氧水，混匀后加入Glu-CDs/AuNPs@Hg，并用pH＝5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释，静置后使用分光光度法测定波长为654nm处的吸光度，代入烟碱比色标准工作曲线，得到样品中烟碱含量；
所述样品表面增强拉曼散射测定包括：向96孔板中依次加入样品测定液、TMB和双氧水，混匀后加入Glu-CDs/AuNPs@Hg，并用水稀释，静置后使用拉曼仪扫描并记录1605cm-1位置处的拉曼信号强度，代入烟碱拉曼散射标准工作曲线，得到样品中烟碱含量。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Glu-CDs/AuNPs@Hg纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将柠檬酸、葡萄糖和乙二胺溶于去离子水中，混匀后转移至聚四氟乙烯罐中，于160-220℃下加热2-6h后，在200℃下保持2-6h，依次进行过滤、离心，得到Glu-CDs溶液；
S2、将PVP、汞试剂和1/3的HAuCl4溶于去离子水中，加热搅拌5-15min5后，加入1/3的HAuCl4继续反应5-15min，再加入Glu-CDs溶液和剩余的HAuCl4反应5-15min，于冰浴中冷却，得到Glu-CDs/AuNPs@Hg；
其中，每0.1-2g柠檬酸所对应葡萄糖、乙二胺和去离子水的量分别为0.1-1g、40-60μL和20-50mL；
每100-1000μL的PVP所对应汞试剂、HAuCl4、去离子水和Glu-CDs0溶液的量分别为100-1000μL、300-3000μL、20-40mL和10-200μL，所述PVP的质量浓度为0.5-1.5％，所述汞试剂的浓度为8-12mM，所述HAuCl4的浓度为40-60mM。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述过滤时，
使用0.22μm的滤膜；
5所述离心时，控制转速为8000-12000rpm/min，时间为10-20min；
步骤S2中，所述加热搅拌时，控制温度为100℃-130℃。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述汞试剂包括氯化汞、硝酸汞和甲基汞中的任意一种。
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