JPWO2010101225A1

JPWO2010101225A1 - 細胞シートを利用した細胞評価システム及びその利用方法

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Publication number: JPWO2010101225A1
Application number: JP2011502806A
Authority: JP
Inventors: 紀ノ岡　正博; 正博紀ノ岡; 康範武澤; 田谷　正仁; 正仁田谷; 充弘齋藤; 芳樹澤; 清水　達也; 達也清水; 岡野　光夫; 光夫岡野
Original assignee: Tokyo Womens Medical University
Current assignee: Tokyo Womens Medical University
Priority date: 2009-03-04
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2012-09-10
Anticipated expiration: 2030-03-04
Also published as: US20120052524A1; JP5725560B2; WO2010101225A1; EP2404992A4; EP2404992A1

Abstract

細胞シート積層体、標的細胞及び２次元解析装置からなる細胞評価システムを構築することによって、培養細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する３次元の生物学的指標を２次元の解析という簡便な手法で得ることができる。

Description

本発明は、創薬、薬学、医学、生物等の分野において有用な細胞評価システム及びその利用方法に関するものである。

近年、損傷を受けた生体組織を再生するためにさまざまな再生医療技術が注目されている。このことは、心筋組織の再生を例にとっても、心筋組織へ心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞を直接注入し再生する方法、後述するように心筋組織細胞を特殊な温度応答性基材上で培養し温度変化させて低損傷な心筋組織細胞シートして移植して再生する方法（特許文献１参照。）等の多くの研究が進められており、一部の細胞ではヒトへの臨床研究も始まっている。そして、最近では胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や間葉系幹細胞から心筋細胞を分化誘導する研究が進められ、さらには人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から心筋細胞を分化させようとする研究も始まっている。これとは別に、体外で組織工学手法を用いて心筋組織を構築した上で、体内に戻すという研究もおこなわれている。これまでに、コラーゲン、ポリ乳酸、ゼラチンからなる３次元の支持体を用いて新生仔ラットの心筋細胞を培養することにより、心筋組織様構造が構築されたと報告されている（非特許文献１、２、３参照。）。しかし、全身に血液を送り出すような収縮弛緩機能を持つ心筋組織の構築にはいくつもの障害があることが明らかとなっている。

再生医療技術の発展のためには細胞培養技術の発展が必要不可欠になってきた。そして、その動物細胞培養技術はさらに進歩し、動物細胞を対象とした研究開発もさまざまな分野に広がって実施されるようになってきた。対象となる動物細胞の使われ方も、開発当初の細胞そのものを製品化したり、その産生物を製品化するだけでなく、今や細胞やその表層蛋白質を分析することで有用な医薬品を設計したり、患者本人の細胞を生体外で増殖させたり、或いはその細胞の機能を高めて生体内へ戻し治療することも実施されつつある。現在、動物細胞を培養する技術は、多くの研究者が注目している一分野である。特に培養細胞を利用して医薬品や化粧品の評価を行う技術分野は、評価条件の均一化及び動物愛護の意味からこれまでの動物実験に代わる技術として注目されている。

そのような中、特許文献２、非特許文献５ではゲル中に包埋された細胞の状態で細胞の生物学的指標を試験する試験方法が示されている。培養しようとする細胞を生体外で組織様に立体的に培養しようとする通常用いられる方法であるが、この場合、ゲルの厚さによりゲル中の細胞の様子を２次元解析装置のような簡便な装置で分析できず、例えば常に共焦点顕微鏡のような３次元で解析するような高価で大がかりな装置を利用しなくてはならなかった。さらに、ゲル中の細胞は生体組織内のように密度の高い状態とならず、どうしても密度の低い、疎の状態となり、評価系としては必ずしも十分なものではなかった。

また、特許文献３には多孔膜を利用して細胞の機能を評価する方法が示されている。多孔膜を利用する方法としては、通常、特許文献３のように評価したい細胞を多孔膜の通過程度で判断したり、多孔膜を通して物質だけを通過させ細胞への影響を見る方法が示されれている。しかしながら、この方法では多孔膜という人工物に対する細胞の挙動を観察しているに過ぎず、必ずしも生体内における細胞の挙動を再現しているものではなかった。

さらに、非特許文献４には細胞培養基材上の細胞を利用した評価システムが示されているが、ここでの技術は基材上で培養された１層の細胞を利用するもので、細胞を利用した評価系であるものの生体内の組織の状態とは全く異なる２次元での情報しか得られず、細胞評価システムとして必ずしも十分なものではなかった。

このような背景のもと、特許文献４には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃である高分子で基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が記載されている。また、特許文献５には、この温度応答性細胞培養基材を利用して皮膚細胞を上限臨界溶解温度以下或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度以下にすることにより培養皮膚細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。温度応答性細胞培養基材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開をはかれるようになってきた。ここで得られた細胞シートは移植に利用できるものであり、その細胞シートは生体に近い構造になっていることが予想され、創薬、薬学、医学、生物等の分野において有用な細胞評価システムとして利用できることが十分に期待できる。

再表２００２−００８３８７号公報特開２００７−２５９８２９号公報特開２００８−１１８９００号公報特開平２−２１１８６５号公報特開平０５−１９２１３８号公報

ＦＡＳＥＢＪ．、１１、６８３−６９４（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２２７、Ｈ４３３−Ｈ４４４（１９９９）Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、１１９、３６８−３７５（２０００）ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ２６８，３６−４４（２００１）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ８，５２３−５３３（２００１）

本発明は、上述したような細胞評価システムに関する問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な温度応答性細胞培養基材を提供するものである。

本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、温度応答性培養基材を利用して得られた細胞シート積層体が生体内の構造に近い特殊な環境を作り出していることを見出した。さらにその細胞シート積層体を構成する細胞の種類を変えることで細胞シート積層体内の細胞の状態を変えることができ、さまざまな疑似組織を作れることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。

すなわち、本発明は、２次元の解析手法で標的細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標を３次元の情報として得る、細胞シート積層体、標的細胞及び２次元解析装置からなる細胞評価システムを提供する。また、本発明は、かかる細胞評価システムを利用し２次元の解析手法で標的細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標を３次元の情報として得る、細胞評価方法をも提供する。本発明は大がかりな装置を使って細胞シート積層体の三次元構造を直接的に測定するものではなく、簡単な手法でも入手できる２次元の情報を連続的に解析することで３次元の情報を得ようとするものである。

本発明に記載される細胞評価システムであれば、培養細胞の生物学的指標について２次元の解析という簡便な手法で３次元の高度な情報を得ることができるようになる。従来、組織中の細胞の挙動を観察するのは大がかりな解析装置を必要としていたが、本発明であればその必要がなくなり、さらに周辺の細胞培養装置と容易に組み合わせられ高度な情報を得ることができるようになる。

実施例１の概要を示す図である。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Growth factor: 増殖因子
Packed cells (cell sheet): 充填細胞（細胞シート）
Cellular flux: 細胞流動
Target cells: 標識細胞
Migration of target cells: 標識細胞の遊走
Elements: 要素
Endothelial cells: 内皮細胞
Fibroblast cells: 線維芽細胞
Myoblast cells: 筋芽細胞
Reagent: 試薬
Evaluation: 評価
Migration of target cells (endothelial cells) in cell aggregate: 細胞集合体における標識細胞（内皮細胞）の遊走
Fluidity of packed cells (myoblast cells): 充填細胞（筋芽細胞）の流動性
Quantification of network: ネットワークの定量
Comparing: 比較
Active migration: 能動的遊走
Passive migration: 受動的遊走
実施例１の細胞シートの積層化の手順を示す図である。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Myoblast cells: 筋芽細胞
Seeding: 播種
Depth: 深さ
Temperatured-responsive culture well plate: 温度応答性培養ウエルプレート
Gelatin gel: ゼラチンゲル
Stamp: スタンプ
Overlay: 積み重ね
Harvest: 剥離
Repetition: 繰り返し
Removal of gelatin gel: ゼラチンゲルの除去
Incubation: インキュベーション
Analysis: 分析
実施例１の細胞挙動の評価手順を示す図である。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Stacked confocal images: 積層化された共焦点画像
High magnification: 高倍率
Step: ステップ
Determination of intensity threshold: 強度閾値の決定
Conversion to binary images: 二値画像への変換
Green: 緑色
Red: 赤色
Counting number of detected pixels: 検出画素数の計算
Number of green voxels: 緑色ボクセル数
Height of captured image: 捕捉画像の高さ
Normalizing number of green voxels to total number of green and red ones: 緑色及び赤色ボクセルの総数に対する緑色ボクセル数の規格化
Ratio of green voxels: 緑色ボクセルの割合
Axial distribution of colored voxels: 有色ボクセルの軸方向（高さ方向）分布
Defining of thickness of cell sheet: 細胞シートの厚さの定義
Axial packing: 軸方向（高さ方向）充填
Distribution over layer number: 層数分布
Frequency of green voxels: 緑色ボクセルの頻度
Layer number from bottom: 底面からの層数
実施例１の細胞挙動の評価手順を示す図である。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Stacked confocal images: 積層化された共焦画像
Low magnification: 低倍率
Green: 緑色
Merge images: 併合画像
Conversion to its skeleton with morphological filters: モフォロジカルフィルタを用いる細線化
Measuring length of network and counting No. of tips: ネットワークの長さ測定及び端点数の計数
実施例１の筋芽細胞シート内での内皮細胞の共培養の結果を示す図である。具体的にはMorphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h,(A)0 layer, (B)1 layer, (C)2 layer, (D)5 layerを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells)Scale bar : 200 mm を示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Morphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h: ９６時間後における筋芽細胞シート中の内皮細胞の形態
layer: 層
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Scale bar: 目盛り線
実施例１のEBM-２培養での種々の層数における内皮細胞の挙動変化の結果を示す図である。具体的には、Morphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h,(A)0 layer, (B)1 layer, (C)5 layerを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells)Scale bar : 200 mm を示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Morphology of endothelial cells in myoblast sheet at 96 h: ９６時間後における筋芽細胞シート中の内皮細胞の形態
layer: 層
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Scale bar: 目盛り線
実施例１の5層の筋芽細胞シートと内皮細胞の共培養の経時変化の結果を示す図である。具体的には、Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells, (A)(D)0 h, (B)(E)48 h, (C)(F)96 hを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells)Scale bar : (A)-(C)200 mm, (D)-(G)20 mmを示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Frequency of green voxels: 緑色ボクセルの頻度
Layer number from bottom: 底面からの層数
Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける内皮細胞の空間分布
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Scale bar: 目盛り線
実施例１の筋芽細胞シート内流動の経時変化の結果を示す図である。具体的には、3-D images and spatial distribution of colored cells in 5-layer sheet of myoblast cells(A)0 h, (B) 48 h, (C)96 hを示し、Green : Celltracker green(Basal layer sheet)Red : Celltracker red(Other layer sheet)Green line : Basal layer sheet, Red broken line : Other layer sheetScale bar : 20 mmを示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Frequency of green voxels: 緑色ボクセルの頻度
Layer number from bottom: 底面からの層数
3-D images and spatial distribution of colored cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける有色細胞の３次元画像及び空間分布
Green: 緑色
Red: 赤色
Green line: 緑色線
Basal layer sheet: 底部層シート
Red broken line: 赤色破線
Other layer sheet: 他の層のシート
Scale bar: 目盛り線
実施例１の内皮細胞の遊走性とシート流動の比較の結果を示す図である。具体的には、Spatial distribution of endothelial cells and basal layer sheet in 5-layer sheet of myoblast cells, (A)0 h, (B)48 hを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Basal layer sheet)Green line : Endothelial cells, Red broken line : Myoblast cellsScale bar : 20 mm を示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Axial distribution of colored voxels: 有色細胞の軸方向（高さの方向）分布
Position of captured images: 捕捉画像の位置
Spatial distribution of endothelial cells and basal layer sheet in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける内皮細胞及び底部層シートの空間分布
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Scale bar: 目盛り線
実施例１のEGFのネットワーク形成への影響の結果を示す図である。具体的には、Morphology of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells (A)(C)EGF(-), (B)(D)EGF(+), (A)(B)48 h, (C)(D) 96 hを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells)Scale bar : 200 mm を示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Morphology of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける内皮細胞の形態
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Scale bar: 目盛り線
実施例１のEGFのネットワーク形成への影響の結果を示す図である。具体的には、Quantification of endothelial network (1 image 0,889 mm²) としている。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Number of tips: 端点数
Length: 長さ
image: 画像
Quantification of endothelial network: 内皮ネットワークの定量
実施例１のEGFのネットワーク形成への影響の結果を示す図である。具体的には、Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells(A)(C)EGF(-), (B)(D)EGF(+), (A)(B)48 h, (C)(D) 96 hを示し、Green : CD31 positive(Endothelial cells)Red : Celltracker orange positive (Myoblast cells)Green line : Endothelial cells, Red broken line : Myoblast cellsScale bar : 20 mm を示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Frequency of green voxels: 緑色ボクセルの頻度
Layer number from bottom: 底面からの層数
Spatial distribution of endothelial cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける内皮細胞の空間分布
Green: 緑色
CD31 positive: CD31 陽性
Red: 赤色
Celltracker orange positive: 細胞探知オレンジ色陽性
Green line: 緑色線
Endothelial cells: 内皮細胞
Red broken line: 赤色破線
Myoblast cells: 筋芽細胞
Scale bar: 目盛り線
実施例１のEGFの筋芽細胞シート流動への影響の結果を示す図である。具体的には、3-D images and spatial distribution of colored cells in 5-layer sheet of myoblast cells(A)(C) EGF(-), (B)(D)EGF(+), (A)(B)48 h, (C)(D)96 hを示し、Green : Celltracker green(Basal layer sheet)Red : Celltracker red(Other layer sheet)Green line : Basal layer sheet, Red broken line : Other layer sheetScale bar : 20 mmを示している。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Frequency of green voxels: 緑色ボクセルの頻度
Layer number from bottom: 底面からの層数
3-D images and spatial distribution of colored cells in 5-layer sheet of myoblast cells: 筋芽細胞の５層シートにおける有色細胞の３次元画像及び空間分布
Green: 緑色
Celltracker green: 細胞探知緑色
Basal layer sheet: 底部層シート
Red: 赤色
Celltracker red: 細胞探知赤色
Other layer sheet: 他の層のシート
Green line: 緑色線
Red broken line: 赤色破線
Scale bar: 目盛り線
実施例２の筋芽細胞シートだけからなる積層体と筋芽細胞と線維芽細胞が50/50の割合で混合された細胞シート積層体への血管内皮細胞の遊走性を比較検討した結果を示す図である。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞である。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Myo 100 sheet: すべて筋芽細胞からなる細胞シート
Myo 50 / Fib 50 sheet: 筋芽細胞と線維芽細胞が50/50の割合で混合された細胞シート
実施例３において、筋芽細胞の培養状態を示す図である。具体的には、Photographs of myoblast at 48 h in (a) low- and (b) high-density cultures.（Scale bar: 100 mm.）を示している。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Photographs of myoblast at48 h in (a) low- and (b) high-density cultures: （ａ）低密度、及び（ｂ）高密度の培地における４８時間後の筋芽細胞の顕微鏡写真
Scale bar: 目盛り線
実施例３において、筋芽細胞の培養状態によるサイトカイン産生特性の影響を占めす図である。具体的には、Cellular production rate of VEGF at 48h in low- and high density cultures, accompanied with that in culture of 5-layer myoblast sheetを示す。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Production rate: 産生速度
low density: 低密度
high density: 高密度
5-layer sheet: ５層シート
Cellular production rate of VEGF at 48h in a low- and high-density cultures, accompanied with that in culture of 5-layer myoblast sheet.: 低密度培地及び高密度培地における４８時間後のＶＥＧＦの細胞産生速度、並びに５層筋芽細胞シートの培地における４８時間後のＶＥＧＦの細胞産生速度
実施例４の細胞シートの積層化手順を示す図である。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Target cells: 標識細胞
seeding density: 播種細胞密度
Packed cells (5-layer of myoblast sheet) stained by Celltracker orange: 細胞探知オレンジで染色した充填細胞（５層の筋芽細胞シート）
Myoblast sheet-HUVEC co-culture: 筋芽細胞シート−HUVEC共培養
Mounting: 上載せ
Previous protocol: 従来の実験計画
実施例４の筋芽細胞シート内での内皮細胞の共培養の結果を示す図である。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。

図中、各用語は次の意味を表わす。
Seeing density: 播種細胞密度
Pre-culture time of HUVECs: HUVECの前培養
Co-culture time with myoblast sheet: 筋芽細胞シートを用いた共培養時間
the first 24 hours: 最初の２４時間
the last 24 hours: 最後の２４時間
実施例５の癌細胞シート内での内皮細胞の共培養の結果を示す図である。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。実施例６の培養手順並びに癌細胞シート内での内皮細胞の共培養の結果を示す図である。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。

本発明は、細胞シート積層体、標的細胞及び２次元解析装置からなる新規な細胞評価システムに関するものである。その際、細胞シート積層体とは標的細胞にとっては培養の足場（以下、培養フォーマット、充填細胞ということがある。）となる。本発明のシステムであれば２次元の解析手法で培養の足場内にいる標的細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標を３次元の情報として得ることができるようになる。その２次元解析装置とは、細胞を２次元の情報や平面の情報として得る手法であれば特に限定されるものではないが、例えばその装置としては、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、実体顕微鏡、レーザー顕微鏡、共焦点顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡等の顕微鏡類、プレートリーダー装置類、その他マクロレンズを有する装置類等が挙げられる。観察は画像上で行ってもよく、顕微鏡視野で目視によって行ってもよい。また、その解析手法も上述した装置を利用する通常の方法であれば特に限定されないが、例えば細胞を試薬、蛋白質、遺伝子等の少なくとも１つ以上の方法によって蛍光染色及び/または色素染色しその程度を上述した顕微鏡類等で観察する方法等が挙げられる。標識細胞とはこの蛍光染色及び/または色素染色された細胞を意味する。

本発明では細胞シート積層体が必要である。そして、この細胞シートを得るためには温度応答性基材が必要となる。この基材とは、特定の表面を持った細胞培養基材に電子線照射において温度応答性ポリマーをグラフト化させたものである。基材の材質とは、特に限定されるものではないが、細胞付着表面としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレートのいずれか、若しくは２以上を組み合わせたものである。この中で特にポリスチレン、ポリカーボネートは細胞培養用基材で通常使われており好適である。基材の被覆に用いられる温度応答性ポリマーは、水溶液中で上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度０℃〜８０℃、より好ましくは２０℃〜５０℃を有する。上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が８０℃を越えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。また、上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が０℃より低いと一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまうため、やはり好ましくない。

本発明に用いる温度応答性ポリマーはホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。

培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、１．１〜２．３μｇ／ｃｍ²の範囲が良く、好ましくは１．４〜１．９μｇ／ｃｍ²であり、さらに好ましくは１．５〜１．８μｇ／ｃｍ²である。１．１μｇ／ｃｍ²より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．３μｇ／ｃｍ²以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。本発明における培養基材の形態は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサートなどが挙げられる。

本発明の方法において、培養した細胞シートを温度応答性基材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養基材の温度を培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。

被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外のポリマー化合物、セラミックス類など全て用いることができる。

さらに温度応答性ポリマーの培養基材への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されている方法に従ってよい。すなわち、かかる被覆は、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。

本発明に用いる細胞シート積層体とは、細胞シートが単独若しくは別の細胞からなるシートと組み合わされた状態で積層化されたものでも良い。その際、２種以上の異なる細胞を利用すると異なる細胞間で相互作用し合い、より高い活性の細胞シートが得られ好ましい。また、その積層する位置、順番、積層回数は特に制約されるものではないが、被覆又は補填される組織に応じ、接着性の強い滑膜由来細胞シートを使用すること等で適宜変えられる。また、積層回数は１０回以下が良く、好ましくは８回以下、さらに好ましくは４回以下が良い。軟骨細胞は元来栄養供給が満たされた環境でなくても生存する。しかしながら１０回より多くなると積層化した中心部の細胞シートに酸素、栄養分が行き届き難くなり好ましくない。その際には、細胞シート積層体内に血管網を構築させる方法で防ぐことができる。その血管網を構築する方法は特に限定されるものではないが、例えば積層体内にあらかじめ血管内皮細胞を混在させる方法、積層体を製造する際に血管内皮細胞シートを積層させる方法、あるいは細胞シート積層体を生体内に埋入して血管網を構築させる方法等が挙げられる。

本発明における細胞シート積層体を作製する方法についても特に限定されるものではないが、例えば、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させることで得られる。その際、培地の温度は、培養基材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。また、使用される培養細胞移動治具は剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば特に限定されるわけではなく、例えば多孔膜や紙、ゴム等の膜類や板類、スポンジ類等が挙げられ、積層化作業を行い易くするために柄の付いた治具に多孔膜や紙、ゴム等の膜類や板類、スポンジ類等を取り付けたものを利用しても良い。

以上より、本発明における細胞シート積層体とは、温度応答性ポリマーが被覆された細胞培養基材上から剥離され、必要に応じて培養細胞移動治具を用いることで得られた培養細胞シートは、培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けておらず、培養時に形成される細胞−基材間の基底膜様蛋白質も酵素による破壊を受けておらず、また、細胞−細胞間のデスモソーム構造が保持され、構造的欠陥が少なく強度の高いものである。

発明者らは、本発明に利用される細胞シート積層体とは細胞シートが密に積層化されたものであり、それ故、従来の細胞評価システムに利用されていた特殊な培養の足場を作り出していることを見出した。例えば、従来の評価システムにおける培養の足場は細胞以外の物質の存在によりどうしても疎の状態であり、厚さ方向の分析にはどうしても大がかりな解析装置が必要であった。本発明の細胞シート積層体であれば、細胞が高密度に充填したような状態となっており、厚さが薄く、しかも積層体内の環境が組織様であり２次元の解析を厚さ方向に重ねることだけで情報を読み取ることができるようになる。本発明においては、細胞シートの積層化枚数は３層枚以上であれば良く、好ましくは４層以上、さらに好ましくは５層以上が良い。積層数が２層以下であると、細胞シート積層体が組織様の状態と異なり、本発明の積層体として不適当である。

本発明は、かくして得られた細胞シート積層体内に標的細胞を遊走させその挙動を観察することで評価される。標的細胞の種類は特に限定されるものではなく、評価目的に沿った細胞を適宜採用すれば良い。この中で、遊走性の高い細胞としては筋芽細胞、血管内皮細胞、間葉系幹細胞、さらに心筋細胞、表皮基底膜細胞等が挙げられるが特に限定さるものではない。また、遊走性が低い細胞としては、線維芽細胞、分化した表皮角化細胞が挙げられるが特に限定さるものではない。

同様に、さらに本発明で利用される細胞シート積層体とは、積層体内の細胞の種類を変えることで流動性を変えられ、そのことでさまざまな疑似組織を作れることもが特徴の一つである。その際に利用される細胞は特に限定されないが、上述のように流動性の高い細胞としては筋芽細胞、血管内皮細胞、間葉系幹細胞、さらに心筋細胞、表皮基底膜細胞等が挙げられる。また、流動性の低い細胞としては、線維芽細胞、分化した表皮角化細胞が挙げられるが特に限定さるものではない。流動性の高い細胞に流動性の低い細胞を混合することでさまざまな流動性を有する細胞シート積層体を作製することができる。

この細胞シート積層体の流動性は本発明の目的に限らず、例えば移植を目的とした細胞シートの指標になり得るものと考えている。例えば、実施例で述べるように、細胞シート積層体の流動性が高ければそれだけ生体側から血管が侵入しやすくなり、それだけ移植した細胞シート積層体が生体に適合する結果となる。また、その他の細胞においても積層体の流動性が高いと侵入しやすいものと期待される。

本発明でいうところの生物学的指標とは、細胞に関する評価ならば特に限定されるものではないが、例えば細胞の生死、増殖、遊走、分化のいずれがもしくはそれらの２種以上の組み合わせが挙げられる。本発明では、さらにその細胞に関する3次元の情報でも良く、例えば細胞が移動した軌跡、その結果得られた細胞網、管状組織の構築程度等が挙げられるが特に限定されるものではない。本発明によれば、細胞の生物学的指標という高度な情報を簡便な評価システムで得られるようになる。

本発明においては、以上のシステムに薬剤を作用させても良い。本発明のシステムに薬剤を作用させ標的細胞の挙動を観察すれば、細胞に対する薬剤の効果を知ることができる。その際、使用する薬剤は特に限定されるものではなく、評価したい系に沿って適宜利用していけば良いが、例えばＥＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ等のサイトカイン類、抗がん剤、分化誘導剤等が挙げられる。本発明は創薬、薬効評価のシステムとしても極めて有用なものと期待される。

本発明では、細胞シート積層体、標識細胞、２次元解析装置の組み合わせを変えることでさまざまな評価系が構築できる。その具体例は、特に限定されるものではないが、例えば、細胞シート積層体を構成する細胞を筋芽細胞とし、標識細胞を蛍光標識した血管内皮細胞とし、蛍光顕微鏡により標識細胞の遊走性を追跡することで血管網構築メカニズムを評価することができる。或いは、細胞シート積層体を構成する細胞を癌細胞、標識細胞を蛍光標識した血管内皮細胞とし、薬剤を抗がん剤とすれば、抗がん剤の薬効を評価できるようになる。さらに、細胞シート積層体を構成する細胞を分化細胞、標識細胞を蛍光標識した幹細胞とし、薬剤を分化誘導剤とすれば、幹細胞の分化プログラミング機構を解析することができるようになる。

本発明の細胞は限定されるものではなく、例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、細菌類が挙げられる。この中で、動物細胞は市販されているものが多く好都合である。動物細胞の由来として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット、アフリカミドリザル等が挙げられるが特に限定されるものではない。

本発明に記載される細胞評価システムであれば、培養細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標について２次元の解析という簡便な手法で３次元の情報を得ることができるようになる。従来、組織中の細胞の挙動を観察するのは大がかりな解析装置を必要としていたが、本発明であればその必要がなくなる。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

血管内皮細胞と筋芽細胞シートの共培養システムを構築した（図１）。このシステムは、「標的細胞」、「充填細胞」、「薬剤」の3つの要素からなり、充填細胞の中を遊走する内皮細胞が標識細胞で、標識細胞の場であるシートの筋芽細胞が充填細胞であり、薬剤添加の刺激により標識細胞の遊走や、充填細胞の挙動を制御することができる。これまでの研究でシートという密な環境でシートの細胞は遊走することが分かっており、これを充填細胞の「流動」と呼ぶ。すなわち標識細胞は動的な足場の中で遊走しており、このシステムは他の細胞に囲まれて細胞間コミュニケーションの影響も受けるin vivoに近いシステムで、3要素を種々変化することによって、他の系においても生体内に模倣した条件での解析が可能となる。そして標識細胞である内皮細胞の遊走および充填細胞であるシート流動を評価するための手法を確立した。図３に示す手順で評価し、内皮細胞がシートの流動より速く遊走するか（Active migration）、シート流動に受動的に遊走するか（Passive migration）を内皮細胞の遊走とシート流動を比較し検討した。またネットワークの定量評価を図４に示す手順で行った。また薬剤として、上皮細胞の増殖因子であるEpidermal growth factor（EGF）を添加し、その効果を検討した。

（初代細胞培養）
細胞培養にはCorning社のポリスチレン製培養容器（225 cm² T-flask）を用いた。筋芽細胞培養には培養面にラミニン（Sigma製）を塗布した。ラミニン塗布面はリン酸緩衝溶液（PBS、Sigma 製）によるラミニンの20倍希釈溶液を培養面25cm²当たり1ml添加し、37oC・5 % CO₂存在下での1 h（時間）のインキュベーションによりタンパクを吸着させた後、PBSで洗浄することによって作製した。

（単層継代培養）
実験には足場依存性ヒト骨格筋筋芽細胞（Camblex社製）および正常ヒトさいたい静脈内皮細胞（Lonza社製）用い、CO₂インキュベータ（MCO-17AI、三洋電機（株）製）内で37oC、5%CO₂雰囲気下で培養を行った。筋芽細胞培養には、培地は抗生物質-抗真菌剤 100×（Invitrogen社製）を1 vol%、1M HEPES buffer（Sigma社製）を2 vol%、ウシ胎児由来血清（以後FBSと称する、GIBCO社製）を10vol％でそれぞれ添加したDulbecco's modified Eagles Medium（DMEM、Sigma製）を用いた（以下DMEM（0% FBS）と称する）。初代・継代培養において0.1%のトリプシン（Sigma社製）と0.02%のEDTA（Ethlenediamine tetra-acetic acid、Sigma社製）から成るトリプシン溶液を培養面積1 cm²当たりに1 mL滴下し、37oCで3 min（分）反応させ、細胞を剥離した。懸濁状の細胞にトリプシンと同量のトリプシンインヒビター溶液（Wako Pure Chemical Industries、 Osaka、Japan）を添加し、酵素分散反応を停止させた。1000 rpm、室温にて5 min（分）の遠心分離により細胞を回収し、さらに培地により再懸濁した細胞懸濁液を、生存細胞濃度1.0×10³ cells/cm²で培養面に接種し、深さが2 mmとなるように培地を加えた。また、培地交換は24 h（時間）毎に行った。

内皮細胞培養には、培地はEGM-2 BulletKit（Lonza製）を用いた（以下EBM-2 と称する）。初代・継代培養において0.1%のトリプシン（Sigma製）と0.02%のEDTA（Ethlenediamine tetra-acetic acid、Sigma製）から成るトリプシン溶液を培養面積1 cm²当たりに1 mL滴下し、37oCで5 min（分）反応させ、細胞を剥離した。懸濁状の細胞にトリプシンと同量のトリプシンインヒビター溶液（Wako Pure Chemical Industries、Osaka、 Japan）を添加し、酵素分散反応を停止させた。1450 rpm、室温にて5 min（分）の遠心分離により細胞を回収し、さらに培地により再懸濁した細胞懸濁液を、生存細胞濃度2.5×10³ cells/cm²で培養面に接種し、深さが2 mmとなるように培地を加えた。また、培地交換は48 h（時間）毎に行った。

（筋芽細胞シートと内皮細胞の共培養）
細胞培養基材として、ポリスチレン製の35 mm culture dish（Corning製）および温度応答性培養容器（24 穴マルチウェル、CellSeed社製）を用いた。温度応答性培養容器とはポリスチレン面にN-イソプロピルアクリルアミドをグラフト重合させた培養面であり、３２℃を臨界点として可逆的に表面が疎水性、親水性と変化するため、温度変化により細胞間接着を維持したまま容易に細胞を培養面から剥離させることが可能である。

筋芽細胞シートの作製は、37℃でのプレインキュベーション24 h（時間）後にコンフルエントとなるように、温度応答性培養容器に2.3×10⁵ cells/cm²の量で筋芽細胞を播種した。24 h（時間）後、20 ℃、5 %CO₂雰囲気下で30分インキュベートして剥離させた細胞シートを上部からゼラチンゲルで回収する。これが1層の細胞シートとなり、細胞の剥離・回収を繰り返すことで多層シートの作製を行う。

シート共培養システムの構築は、内皮細胞を1.0×10⁴ cells/cm²で35 mm culture dishに播種する。このとき培地はEBM-2（2 % FBS）であるが、後に載せる筋芽細胞シートの接着力向上のために、24 h後、FBSの比率を高くした、内皮細胞の増殖に最適な濃度である20% FBS添加のEBM-2に培地を交換する。24 h（時間）後、培地を除去して種々の層数の筋芽細胞シートを載せる。ゼラチンゲルを37℃で溶解して除去し、ゼラチンゲルが溶けた時間を0h（０時間）として共培養を開始した（図２）。

細胞質染色は、組織の高さを知るために、また筋芽細胞の流動を調べるときにシートを色分けするために、筋芽細胞をシート作製前に細胞質の染色を行う。0.1%のトリプシン（Sigma製）と0.02%のEDTA（Ethlenediamine tetra-acetic acid、Sigma製）から成るトリプシン溶液を培養面積1 cm²当たりに1 mL滴下し、37oCで3 min（分）反応させ、細胞を剥離した。懸濁状の細胞にトリプシンと同量のトリプシンインヒビター溶液（Wako Pure Chemical Industries、 Osaka、 Japan）を添加し、酵素分散反応を停止させた。1000 rpm、室温にて5 min（分）の遠心分離により細胞を回収し、さらに無血清培地により懸濁した細胞懸濁液に対して、等量の無血清培地希釈の10μM CellTracker Orange CMTMR （Molecular probes製）（またはCellTracker green CMFDA（Molecular probes製））を加えて、5 mM CellTrakcer Dyeとなるようにする。37 ℃、5 % CO²雰囲気下で15 min（分）静置した後、1000 rpm、室温にて5 min（分）の遠心分離を行って細胞を回収し、再びDMEM 10% FBSで懸濁を行った後、2.3×10⁵ cells/cm²の量で播種する。

抗体染色は、筋芽細胞と内皮細胞が混在する組織内で内皮細胞を同定して観察するためにAnti-CD31(Mouse MonoclonalAnti-Human CD31、DAKO社製)による抗体染色を行った。CD31は内皮細胞に存在する分子量100kDの糖タンパクを認識する抗体である。細胞をPBSで洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（和光純薬株式会社製）を加え、一晩4 ℃で静置し固定した。PBSで培養面を2回洗い、PBSで希釈した0.1%Triton X-100を加え、細胞に透過性を付与した。PBSで2回洗浄した後、PBS希釈の0.1 %ウシ血清由来アルブミン（和光純薬株式会社製）に1 h（時間）浸した。その後、0.1 %ウシ血清由来アルブミンで40倍に希釈したanti-CD31抗体に浸し、4 ℃で一晩静置した。PBSで2回洗い、0.1 %ウシ血清由来アルブミンで200倍に希釈した二次抗体（Alexa FluorR 488 goat anti-mouse IgG、Molecular Probes製）に室温で1 h（時間）浸した。PBSにて2回洗浄した後、Slow fade（Molecular Probes社製）を1、2滴たらして、カバーガラス（IWAKI社製）をかけて、共焦点顕微鏡（EX-20、OLYNPUS社製）により三次元画像を取得し、細胞観察を行った。

シート内流動については、上述の細胞質染色方法に示す方法で最下層のシートをCelltracker green CMFDAで緑色に、その他の4層をCelltracker orange CMTMRで赤色に染め、上述（シート共培養システムの構築）の手順で筋芽細胞シートを作製して、FBSコートした35 mm culture dishにシートを載せ、シート培養を行った。

（細胞挙動の評価手順）
垂直方向の頻度分布は、共焦点レーザー走査顕微鏡にて得られた三次元画像の垂直方向の頻度分布を求める方法をとった（図３）。まず各色のスライス画像を、目視により決定した閾値によりを二値化して（Step 1）、1枚の画像の緑色の画素数（N_G[voxel]）を、緑色と赤色の画素数の和（N_G+N_R[voxel]）で規格化して高さ方向の分布（R_G[-]）を求める（Step 2）。そして各色において最大画素数（N_G、max or N_R、max[voxel]）で規格化した分布の10%以上の部分を染色組織の存在する部分と定義して、高さ（z[μm]）を算出する（Step 3）。Step 2の分布をStep 3より求めた高さの範囲でさらに規格化して、緑色のvoxelの分布をシート各層あたりの頻度分布（F_G[-]）として求めて、内皮細胞及び最下層のシート細胞の分布を作成した（Step 4）。

血管ネットワークの定量評価は、共焦点レーザー顕微鏡で取得したネットワークの写真をImage ProPlusを用いてネットワークを2次元で画像解析する（図４）。目視にて決定した閾値により二値化して、モフォロジカルフィルタを用いて細線化した画像のネットワークの長さと端点数をカウントして、それぞれのネットワークの比較を行った。

（筋芽細胞シート内での内皮細胞の共培養）
種々の層数の筋芽細胞シート内における内皮細胞の挙動変化
内皮細胞をEBM-2培地で48 h（時間）培養した後、Celltracker orangeで染色した筋芽細胞を2.0 x 10⁴ cm²で播種（0層のシートとする）、筋芽細胞シートを1、 2、 5層載せたものをDMEM（10% FBS）で96 h（時間）共培養し、CD31染色を行った。0層の場合、内皮細胞はほとんど見られずネットワークは存在しなかった（図５A）。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。これは内皮細胞の単培養で、培地をEBM-2からDMEMに切り替えて約48 h（時間）後には、内皮細胞は脱離し始める様子を確認しているため（data not shown：データの提示なし）、96 h（時間）において内皮細胞の大半は脱離したためと予測される。1層および2層の筋芽細胞シートを載せた時は、0.層の時と同様内皮細胞の存在箇所が少なく、ネットワーク形成も見られなかった（図５B、C）。この場合も培養面からはがれて、シートの細胞間をすり抜けて脱離したと予測される。筋芽細胞シートを5層積層して内皮細胞の上に載せたものは広い範囲でネットワークを形成した（図５D）。0、1、2層のときよりも内皮細胞の存在箇所が増大したことから、層数が多い方が内皮細胞はシートをすり抜けにくく、シート内にとどまりやすいと考えられ、5層のシートが内皮細胞をとどめ、ネットワークを形成することができると示唆された。

（EBM-2培養での種々の層数における内皮細胞の挙動変化）
0、1、5層の筋芽細胞シートを内皮細胞の上に載せてEBM-2で96 h（時間）共培養した結果を図６に示す。DMEMで培養したとき、0、1層では内皮細胞はほとんど存在していなかった（図６A、B）。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。EBM-2は内皮細胞，筋芽細胞共に接着できるが、すべて集塊を形成しておりネットワークは存在しない。一方、5層シートを載せた時は広い範囲でネットワーク形成した（図６C）。これらの結果よりネットワーク形成は培地の種類が問題ではなく、5層シートという3次元組織内での成長がネットワーク形成を促したと考えられる。またEBM-2の方がDMEM（10 % FBS）よりきめ細かなネットワークを形成しており、また凹凸の少ない滑らかな糸状であった。すなわち、ネットワーク形成は培地の種類や培養面への接着が重要なのではなく、5層シートという3次元組織内での成長がネットワーク形成を促したと考えられる。よってシートは内皮細胞のマトリックスの役割をしており、マトリゲルやコラーゲンゲルなどin vitroのマトリックスと同様にネットワーク形成をする働きを持つことが示唆された。マトリックスが細胞シートであることから、他の細胞に囲まれて成長するin vivoに模倣した内皮細胞のネットワーク形成システムを確立できたと考える。内皮細胞を組織内にとどめるためには細胞シートは5層が有効と考えられ、また培地はDMEM（10 % FBS）が使用できることから、ネットワーク形成共培養システムとしてこれを基本条件と定める。

（5層の筋芽細胞シートと内皮細胞の共培養の経時変化）
5層の筋芽細胞シートと内皮細胞をDMEM（10. % FBS）で0 、48 、96 h（時間）培養して共焦点で撮影した写真を図７に示す。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。図７Aよりゼラチンゲルが溶解してすぐの0hで、すでに内皮細胞同士が結合し始めているのが分かる。これはシート積層手順上、0hの時点で筋芽細胞シートを内皮細胞の上に載せてから、3 h（時間）が経過しており、その間に結合したと考えられる。48 h（時間）では内皮細胞が繊維状のネットワークを作り、96 h（時間）では48 h（時間）の時と異った形態のネットワークを形成していた（図７B、C）。断面図の写真より、シート培養0h（時間）において、内皮細胞は筋芽細胞シートの下に存在する（図７D）。培養48、96 h（時間）では、内皮細胞がシート内部に存在しているものが多いことから、内皮細胞はシート内部を上方向に遊走したと考えられる（図７E、F）。また48、96 h（時間）でシート上部表面には図７Gに示すように集塊形成が見られた。垂直方向の分布より、0 h（時間）では内皮細胞の大部分がシート1層目に存在し、培養時間とともに存在箇所が上部にシフトしていることが分かる（図７D'、E'、F'、G'）。よって、シートの下にあった内皮細胞は細胞同士が結合して、培養時間と共にシート上部にシフトして、3次元のネットワークを形成したと示唆され、また上部まで行き着いた細胞は集塊になったと予想される。

（シート内流動）
（筋芽細胞シート内流動の経時変化）
内皮細胞の環境、場であるシートの流動性を検討するために、最下層のシートをcelltracker green（緑色）で、他の4層をcelltracker orange（赤色）で染めて積層した後、シート培養を行った。図８に共焦点にて撮影した3次元画像、断面図および最下層のシート細胞の分布を示す。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。ゼラチンゲルが溶解した0h（時間）では、最下層とその他のシートがきれいに分かれており、ゼラチンゲルが溶解した時点では最下層のシートの細胞が上方にはほとんど遊走しておらず、構造を維持していることが確認できた（図８A）。また48、96 h（時間）後の写真より、最下層の細胞が上方に遊走していることが分かる（図８B、C）。垂直方向の分布で、0h（時間）では1層目に大部分があった緑色の細胞が、48、96 h（時間）には上方にシフトしていることがグラフでも示され、シートという密な環境で細胞が流動していることが示唆された。

（内皮細胞の遊走性とシート流動の比較）
前項より内皮細胞は流動している筋芽細胞シート内で、遊走してネットワーク形成することが分かった。そこで内皮細胞の垂直方向の遊走と筋芽細胞の流動を比較して、内皮細胞がシートの流動より速く遊走しているか（Active migration）、あるいはシートの流動に受動的に遊走しているか（Passive migration）を調べた。内皮細胞とそれとほぼ同位置にある最下層の細胞の垂直方向の分布の比較を行った。0h（時間）では内皮細胞の方がわずかに下位置にあるが、48 h（時間）において内皮細胞の方がより上方向に遊走している様子が見られた（図９A、B。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。）。よって内皮細胞はシート流動より速く遊走して内皮細胞同士が結合して、結果内皮細胞がネットワーク及び集塊形成していると考えられる。したがって内皮細胞は筋芽細胞より積極的に遊走するActive migrationをしていると考えられる。

（EGF添加による影響）
（EGFのネットワーク形成への影響）
薬剤による影響を検討するためDMEMにEGF（100 ng/mL）を添加した。48 h（時間）ではEGFを添加したものと添加していないものそれぞれがきめ細やかなネットワークを形成しているが、その形態で差は見られない（図１０A、B。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。）。一方、96 h（時間）においてEGF添加したものの方が、よりきめ細やかなネットワークを形成していることが確認できる（図１０C、D）)。

5層シート内で内皮細胞は3次元のネットワークを形成しているが、内皮細胞はシート内部という高さが限られた中でネットワークを形成していることから、高さを無視しても差支えがなく、2次元で定量評価できると考えられる。画像処理を経て細線化して、ネットワーク長さL（μm/image）と端点数T[tip]を評価して、96 h（時間）の画像に関してプロットしたものが図１１である。EGFを添加した方がネットワーク長さが大きく、端点数が少ない傾向が見られた。よってEGFを添加した方がより内皮細胞同士がつながり、きめ細やかなネットワークを形成していることがこの指標より示された。48 h（時間）の画像に関しては同じの画像処理では、細線化画像が元のネットワークと大きく異なるため、定量評価することができなかった。また、図１２に内皮細胞の断面図の写真及び垂直方向の分布を示す。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。図１２A'、B'、C'、D'より48、 96 h（時間）共にEGFの有無で差はないように思われ、EGFは内皮細胞の遊走に影響を与えないと考えられる。両条件で内皮細胞の遊走速度はほぼ同じで、内皮細胞同士が接触（衝突）する頻度は同じと考えられる。接触後、はなれるものとつながるものがあるが、EGFを添加したものの方がつながる頻度が高くなり、結果きめこまやかなネットワークを形成したのでないかと考えられる。

（EGFの筋芽細胞シート流動への影響）
EGF添加がシートの流動に影響を及ぼすかを調べた。以前に単層培養でEGF添加により筋芽細胞の遊走性が増大することが確認されており、シート内でも遊走性が増大することも考えられる。図１３にEGFを添加したときの共焦点にて撮影した3次元画像、断面図および最下層のシート細胞の分布を示す。図中の色の薄い部分が図の脚注の”Green”に相当する。しかし、垂直方向の分布はEGF添加による影響が48、96h（時間）共にないように思われる（図１３A'、B'、C'、D'）。よってEGFはシートの流動性への影響は小さく、内皮細胞のネットワーク形成の促進が、シート流動の増大によって引き起こされたものではないと予測される。本検討においてEGFの添加によって、EGFRが活性化したために発達したネットワークを形成したのではないと予測される。EGFはシート流動にも内皮細胞の垂直方向の遊走にも影響を与えなかったが、図１１でEGF添加のプロットがEGFを添加していないプロットの延長上にあることから、EGFを添加した方が早く細胞同士が接着したと考えられ、その要因として、EGFが何らかの経路で内皮細胞の接着分子に影響したのではないかと予測している。その経路として、EGFが筋芽細胞のサイトカインの分泌に影響を与え、その中でbFGFの発現が増大したとすれば、bFGFは内皮細胞の接着分子であるVE-カドヘリンの発現を増大させることから、結果細胞同士の接着が強くつながる頻度が高くなり、きめこまやかなネットワークを形成したのではないと考えられる。

実施例１と同様な手法で筋芽細胞シートだけからなる５層の筋芽細胞シート積層体（図１４（Ａ））と筋芽細胞と線維芽細胞が５０／５０の割合で混合された５層の細胞シート積層体（図１４（Ｂ））を作製した。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。それぞれの細胞シートへ実施例１と同様な手法でヒト血管内皮細胞を遊走させる評価を行った。結果を図１４に示す。培養５ｈ（時間）後の血管内皮細胞の遊走性の検討から、線維芽細胞が混在することで筋芽細胞シート内の流動性が低下し、結果として血管内皮細胞の遊走性を低下させていることが分かった。すなわち、血管内皮細胞を積極的に細胞シート積層体内へ誘導させるには、積層体内の流動性を高めることが必要であることが考えられる。一方、血管網の形成に関しては、線維芽細胞が混在する筋芽細胞シートの方が密なネットワークが形成されていた。これとは別の検討で、筋芽細胞シートのみからなる積層体と筋芽細胞と線維芽細胞が５０／５０の割合で混合された細胞シート積層体のそれぞれのＶＥＧＦ産生量とＨＧＦ産生量とを測定し比較検討した。その結果、筋芽細胞シートのみからなる積層体は筋芽細胞と線維芽細胞が５０／５０の割合で混合された細胞シート積層体に比べＶＥＧＦの産生量が高く、ＨＧＦの産生量が低いことが分かった。このことより、ＶＥＧＦは筋芽細胞が産生し、ＨＧＦは線維芽細胞が産生しているものと考えられる。以上より、侵入してきた血管内皮細胞による血管網を十分に発達させるには、積層体内の流動性を下げ、ＶＥＧＦ及びＨＧＦを存在させることが必要と考えられる。

（筋芽細胞の培養状態によるサイトカイン産生特性の影響）
次に筋芽細胞の培養状態がVEGF産生量に影響するのかどうかを検討した。多層細胞シートはコンフルエントで形成された単層シートが重ねられたものであるため、3次元的にも密なコンフルエントであり、細胞は接触阻害によって増殖性を一時的に失った状態にある。そこで、細胞が密に接触したシート模倣系と見なせる状態と比較的自由に遊走できる状態で、サイトカイン特性を比較した。筋芽細胞をシートと同じ高密度（2.3 x 10⁵ cells/cm²）と低密度（1.0 x 10⁴ cells/cm²）で播種し、培養48 時間における培養培地を取得した。ELISAによってVEGF生成量を測定した。培地採取時の細胞数をカウンティングより求め、細胞あたりのVEGF生成量として評価した。

（実験条件）
細胞：ヒト骨格筋筋芽細胞（Np5）
培地： DMEM（10% FBS）
培養面： 8wellポリスチレン培養皿、ラミニンコート-ポリスチレン培養面（筋芽細胞増殖）
培養環境： 37℃、5% CO₂ in air
播種密度： 2.3 x 10⁵ cells / cm²（高密度）、1.0 x 10⁵ cells / cm²（低密度）
培養期間： 48h、 168h
培地体積： 2.1 mL（培地深さ 0.2 cm）
培地交換： 24時間毎
ターゲット： VEGF（Vascular endothelial growth factor）
採取試料： 24時間毎の培養培地（ELISA）
細胞数：トリパンブルー染色法によりカウント

（結果）
図１５に低密度、高密度培養48時間後の結果を示す。トリパンブルー染色法によりカウントし、細胞密度はそれぞれ、（1.22±0.10） x 10⁴ cells/cm²、（1.89±0.14）x 10⁵ cells/cm²であった。培養48 hで採取した培地から求めた細胞あたりのVEGF生成量を図１６に示す。ELISAで検出された濃度と培地体積2.1 mLから全生成量を求め、上記細胞密度と培養皿面積10.5 cm²より得られた全細胞数で規格化することによって算出した。筋芽細胞5層シートの培養48 時間における生成量についても細胞数で規格化した値を併せて載せた。高密度培養の細胞あたり生成量は、低密度培養の約2倍であり、これは密なコンフルエント状態をとることで筋芽細胞のVEGF生成能が増大していることを示唆している。高密度培養の値は5層シート培養の値に近く、移植材料となるシートをコンフルエント状態の細胞のみで作製することがVEGF分泌能（分泌効率）を上げる点で重要であると考えられる。

実施例１において血管内皮細胞の培養をEBM-2（含2%FBS）培地で24時間培養し、その後、EBM-2（含20%FBS）培地で24時間培養していた条件（図１７記載のPrevious protocol（C））を、EBM-2（含2%FBS）培地で24時間培養だけ培養する方法（図１７（A））、或いは初めからEBM-2（含20%FBS）培地として24時間だけ培養する方法（図１７（B））とする以外は実施例1と同様な手法によって筋芽細胞シート中の血管内皮細胞の挙動を検討した。A〜Cの各条件で培養した際の血管内皮細胞の培養のようす（各条件のようすを８ヶ所ランダムに撮影）を図１８に示す。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。その結果、培養条件（B）は実施例１で示される培養条件（C）と同様に細かなネットワークを形成することが分かった。

癌細胞と血管内皮細胞の共培養システムを構築した。
（癌細胞シートと血管内皮細胞の共培養）
癌細胞として、A549株化癌細胞を利用し、実施例１の方法に従って、癌細胞多層シートを作製した。その際の細胞播種数は5.0x10⁵ cells/cm²とし、24時間培養後に、5層を積層化することによって行った。培地としては、10%FBS含有DMEMを使用した。一方、これとは別に血管内皮細胞（HUVEC）をEBM-2培地で24時間培養（播種密度1.0x10⁴ cells/cm²）し、その後、EBM-2（含20%FBS）培地で24時間培養した。このHUVEC上に癌細胞多層シートを接着させ、HUVECの積層化A549細胞シート下における0、12、24時間培養後の挙動について共焦点顕微鏡を用いて実施例１と同様に検討を行った。また、共培養開始直後から24時間後の間に観測点（共培養開始5時間後）を加えた。これは前回観察できなかったネットワーク形成からHUVECのシート組織外遊走までのイベントにおけるネットワークの崩壊とHUVECの遊走を確認することを目的としている。得られた0、5、24時間後における積層化A549細胞シート内におけるHUVECの挙動を図１９に示す。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。積層化A549細胞シート下のHUVECは、細胞シートの転写完了直後（0時間後）においても、すでにネットワーク形成が進んでいることが分かる。また、この時点ではシート状細胞塊の外側へのHUVECの遊走は進んでいないようであった。5時間後の様子をみると、すでにネットワークの崩壊とHUVECの積層化細胞シート外への遊走が始まっており、シート状細胞塊外周付近に存在するHUVECが目立ち始めた。その後ネットワークの崩壊とHUVECの遊走が亢進し、24時間後においては積層化細胞シート内に存在するHUVECはほとんど見られなかった。その結果は、48時間後もほぼ同様であった。また、癌細胞多層シートの外側では多くのHUVECが観察された。血管内皮細胞の積層化細胞シート外への遊走は充填細胞が筋芽細胞の場合でも観察された現象であるが、A549を充填細胞とすると、血管内皮細胞のネットワーク形成からその崩壊、シート外への遊走が非常に早く進んでいた。

実施例５とは異なる条件で癌細胞と血管内皮細胞の共培養システムを構築した。
（癌細胞シートと血管内皮細胞の共培養）
図２０に示す通り、実施例５におけるHUVECに癌細胞多層シートを接着した後の培地を10％FBS含有DMEM培地（図２０最上段の写真）から、HUVECの専用培地であるEBM-2（2%FBS含有）としたもの（図２０最下段の写真）、またはさらにFBSを添加したEBM-2（20%FBS含有）（図２０中央の列の写真）としたものを用いてA549細胞シートと共培養すること以外は実施例５に従った。図中の色の薄い部分が血管内皮細胞（HUVEC）に相当する。その結果、EBM-2（含2%FBS）培地、並びにEBM-2（含20%FBS）培地の双方において、A549細胞シートとの共培養を続けると、HUVECの凝集を維持することができた。

間葉系幹細胞と血管内皮細胞の共培養システムを構築した。
（間葉系幹細胞シートと血管内皮細胞の共培養）
脂肪由来間葉系幹細胞を利用し、実施例１の方法に従って、間葉系幹細胞の多層シートを作製した。その際の細胞播種数は4.5x10⁵ cells/cm²とし、48時間培養後に、5層を積層化することによって行った。培地としては、10%FBS含有α-MEMを使用した。一方、これとは別に血管内皮細胞（HUVEC）をEBM-2培地で24時間培養（播種密度1.0x10⁴ cells/cm²）し、その後、EBM-2（含20%FBS）培地で24時間培養した。このHUVEC上に積層化間葉系幹細胞シートを接着させ、HUVECの積層化間葉系幹細胞シート下における挙動について蛍光顕微鏡を用いて実施例１と同様な検討を行った。その結果、積層化間葉系幹細胞シート下のHUVECは48時間後には積層化間葉系幹細胞シート最上層へ移動していることが分かった。

心筋細胞と血管内皮細胞の共培養システムを構築した。
（心筋細胞シートと血管内皮細胞の共培養）
ラット心筋細胞を利用し、実施例１の方法に従って、心筋細胞の多層シートを作製した。その際の細胞播種数は5.5x10⁵ cells/cm²とし、24時間培養後に、5層を積層化することによって行った。培地としては、10%FBS含有M199を使用した。一方、これとは別に血管内皮細胞（HUVEC）をEBM-2培地で24時間培養（播種密度1.0x10⁴ cells/cm²）し、その後、EBM-2（含20%FBS）培地で24時間培養した。このHUVEC上に積層化心筋細胞シートを接着させ、HUVECの積層化心筋細胞シート下における挙動について光学顕微鏡を用いて実施例１と同様な考え方で検討を行った。その結果、積層化心筋細胞シート下のHUVECは96時間後には積層化心筋細胞シート最上層へ移動していることが分かった。

表皮角化細胞と線維芽細胞の共培養システムを構築した。
（表皮角化細胞シートと線維芽細胞の共培養）
表皮角化細胞を利用し、3T3細胞をフィーダー細胞とした常法に従って表皮角化細胞の重層化シートを作製した。その際の細胞播種数は4.5x10⁴ cells/cm²とし、14日間培養後に、約３層が積層された重層化表皮角化細胞シートを得ることができた。培地としては、10%FBS含有DMEM培地を使用した。一方、これとは別に線維芽細胞をDMEM培地で24時間培養（播種密度1.0x10⁴ cells/cm²）した。この線維芽細胞上に重層化表皮角化細胞シートを接着させ、線維芽細胞の重層化表皮角化細胞シート下における挙動について蛍光顕微鏡を用いて実施例１と同様な検討を行った。その結果、重層化表皮角化細胞シート下の線維芽細胞は48時間後においても重層化表皮角化細胞シート内へほとんど移動していないことが分かった。

本発明に記載される細胞評価システムであれば、培養細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標について２次元の解析という簡便な手法で３次元の情報を得ることができるようになる。従来のような高価で大がかりな解析装置を必要とせず、さらに周辺の細胞培養装置と容易に組み合わせられ高度な情報を得ることができるようになる。したがって、本発明は創薬、薬学、医学、生物等の分野における極めて有用な発明である。

図中における各符号は次の意味を有する。

N_G ：1枚の画像スライスに占める緑色のvoxelの数 [voxel]
N_R ：1枚の画像スライスに占める赤色のvoxelの数 [voxel]
R_G ：1枚の画像スライスに占める緑色のvoxelの割合 [-]
h ：撮影した画像スライスの高さ [μm]
N_G、max ：画像スライス中の緑色のvoxelの最大値 [-]
N_R、max ：画像スライス中の赤色のvoxelの最大値 [-]
N_G/ N_G、max ：各スライスにおける緑色のvoxelの最大値に対する割合 [-]
N_R/ N_R、max ：各スライスにおける赤色のvoxelの最大値に対する割合 [-]
z ：シート厚さ [μm]
F_G ：各層ごとの緑色のvoxelの頻度 [-]
l ：1画像に占める血管ネットワーク長さの合計 [mm/image]
t ：血管ネットワーク1 mmあたりの端点数の数 [tip/mm]

Claims

２次元の解析手法で標的細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標を３次元の情報として得る、細胞シート積層体、標的細胞及び２次元解析装置からなる細胞評価システム。
当該システムに薬剤を負荷させることを特徴とする、請求項１記載の細胞評価システム。
細胞シート積層体が、０〜８０℃に相転移を有する温度応答性ポリマーを被覆した温度応答性培養皿上で作製された細胞シートが積層化されたものである、請求項１、２のいずれか１項記載の細胞評価システム。
細胞シート積層体が、細胞シートが３層以上積層化されたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞評価システム。
細胞シート積層体を構成する細胞が細胞シート積層体内で流動する、請求項１〜４のいずれか１項記載の細胞評価システム。
細胞シート積層体を構成する細胞が筋芽細胞、心筋細胞及び血管内皮細胞から選択される少なくとも１つを含むものである、請求項５記載の細胞評価システム。
細胞シート積層体を構成する細胞が細胞シート積層体内で流動しない、請求項１〜４のいずれか１項記載の細胞評価システム。
細胞シート積層体を構成する細胞が線維芽細胞及び表皮角化細胞のいずれかを含むものである、請求項７記載の細胞評価システム。
細胞シート積層体を構成する細胞の細胞シート積層体内における流動性が制御された、請求項１〜４のいずれか１項記載の細胞評価システム。
標的細胞が蛍光標識された細胞である、請求項１〜９のいずれか１項記載の細胞評価システム。
２次元の解析手法が蛍光顕微鏡である、請求項１０記載の細胞評価システム。
請求項１〜１１の細胞評価システムを利用し２次元の解析手法で標的細胞の生死、増殖、遊走及び分化から選択される少なくとも１つに関連する生物学的指標を３次元の情報として得る、細胞評価方法。
当該システムに薬剤を加えることで標的細胞の生物学的指標を追跡することを特徴とする、請求項１２記載の細胞評価方法。
当該システムにおいて、細胞シート積層体を構成する細胞を筋芽細胞とし、標識細胞を蛍光標識した血管内皮細胞とし、蛍光顕微鏡により標識細胞の遊走性を追跡する、組織中への血管網構築メカニズムの評価方法。
当該システムにおいて、細胞シート積層体を構成する細胞を癌細胞、標識細胞を蛍光標識した血管内皮細胞とし、薬剤を抗がん剤とした、抗がん剤薬効評価方法。
当該システムにおいて、細胞シート積層体を構成する細胞を分化細胞、標識細胞を蛍光標識した幹細胞とし、薬剤を分化誘導剤とした、幹細胞の分化プログラミング機構の評価方法。