CN114317272A - 一种多细胞共培养的培养装置及细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本申请实施例所公开的一种多细胞共培养的培养装置及细胞培养方法，包括第一主流道层、多孔薄膜和第二主流道层。第一主流道层包括多维细胞培养区，第二主流道层包括水凝胶支架培养区和细胞团状培养区，水凝胶支架培养区与细胞团状培养区嵌套设置，细胞团状培养区设置在水凝胶支架培养区的内部，且水凝胶支架培养区的平面高度高于细胞团状培养区的平面高度，多孔薄膜位于第一主流道层下方，多孔薄膜位于第二主流道层上方，多孔薄膜的位置与多维细胞培养区和水凝胶支架培养区相对应。本申请通过多孔薄膜分割多维细胞培养区和水凝胶支架培养区，可以实现信息互联。并通过水凝胶支架培养区模拟仿生细胞外基质，可以提高体外肝生模型和病理模型的仿生性能。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养芯片制造领域，尤其涉及一种多细胞共培养的培养装置及细胞培养方法。
背景技术
目前，肝病发病机理和药物验证方面的研究主要建立在简单的细胞二维模型和动物模型基础上。在二维培养条件下，肝细胞由于缺乏与体内相似的微环境而迅速丢失表型，丧失细胞功能，药物与实际使用效果相差甚远，导致药物研发成本增加，周期增长。而动物模型因为种间差异、伦理问题以及高昂的投资费用，限制其使用范围。微环境包括不同细胞组成的细胞微环境和器官结构所组成的生理微环境，如血流所形成的营养、氧气浓度梯度、流体剪切力、压力等。目前主流细胞培养技术如培养皿培养、Trans-well培养、细胞团培养等，此类培养技术很难同时囊括细胞微环境与结构微环境，因此细胞最终生长状态相差甚远，影响药物判定结果。
已有的肝窦模型还未能在体外高度仿真组织的硬度和结构，虽然近期有研究用生物打印技术建立肝窦模型，然而其仅反映了肝脏纤维化的硬度变化，不具有良好的结构仿生性。
发明内容
本申请实施例提供了一种多细胞共培养的培养装置及细胞培养方法，可以实现信息互联，可以提高体外肝生模型和病理模型的仿生性能。
本申请实施例提供了一种多细胞共培养的培养装置，该装置包括：第一主流道层、多孔薄膜和第二主流道层；
第一主流道层包括多维细胞培养区；
第二主流道层包括水凝胶支架培养区和细胞团状培养区，水凝胶支架培养区与细胞团状培养区嵌套设置，细胞培养区设置在水凝胶支架培养区的内部，且水凝胶支架培养区的平面高度高于细胞团状培养区的平面高度；
多孔薄膜位于第一主流道层下方，多孔薄膜位于第二主流道层上方，多孔薄膜的位置与多维细胞培养区和水凝胶支架培养区相对应。
进一步地，上述装置还包括：
第一主流道层进出样口，第一主流道层进出样口设置在第一主流道层上；
第一主流道层进出样口通过第一流体通道组与多维细胞培养区连通。
进一步地，上述装置还包括：
第二主流道层进出样口，第二主流道层进出样口设置在第一主流道层上，且未贯穿多孔薄膜；
第二主流道层进出样口通过第二流体通道组与水凝胶支架培养区、细胞团状培养区连通。
进一步地，细胞团状培养区包括细胞球体培养凹坑阵列。
进一步地，细胞球体培养凹坑阵列中每个细胞球体培养凹坑的深度在区间[100μm,500μm]内；
每个细胞球体培养凹坑的直径在区间[100μm,500μm]内；
相邻两个细胞球体培养凹坑间的距离大于等于10μm。
进一步地，多维细胞培养区包括二维细胞培养区和三维细胞培养区；
多维细胞培养区的深度在区间[20μm,1×104μm]内。
进一步地，第一主流道层、多孔薄膜与第二主流道层间的连接方式包括但不限于键合连接、浇筑连接和夹具连接。
进一步地，多孔薄膜的材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或聚乙烯。
进一步地，多孔薄膜的孔径在区间[0.5μm,5μm]内。
相应地，本申请实施例还提供了一种细胞培养方法，该细胞培养方法基于上述多细胞共培养的培养装置实现，该细胞培养方法包括：
将第一待培养细胞与置于冰上的水凝胶于无血清培养基中混合，得到第一细胞悬液；
基于第二主流道层进出样口向细胞团状培养区中导入第一细胞悬液，并将多细胞培养的培养装置置于培养箱中静置24小时，得到团状细胞聚集体；
将第二待培养细胞与水凝胶混合，得到混合体系；
基于第二主流道层进出样口向水凝胶支架培养区导入混合体系，固化水凝胶，将多细胞共培养的培养装置置于培养箱中静置24小时，得到附着于支架的生长细胞；所述水凝胶的固化方式包括光固化、热固化或者试剂固化；
将第三待培养细胞与水凝胶无血清培养基混合，得到第二细胞悬液；第二细胞悬液的浓度高于第一细胞悬液的浓度；
基于第一主流道层进出样口向多维细胞培养区导入第二细胞悬液，进行细胞贴壁培养，得到贴壁细胞；
基于流量流通控制泵对团状细胞聚集体、生长细胞和贴壁细胞进行灌注培养。
本申请实施例具有如下有益效果：
本申请实施例所公开的一种多细胞共培养的培养装置及细胞培养方法，培养装置包括第一主流道层、多孔薄膜和第二主流道层。第一主流道层包括多维细胞培养区，第二主流道层包括水凝胶支架培养区和细胞团状培养区，水凝胶支架培养区与细胞团状培养区嵌套设置，细胞培养区设置在水凝胶支架培养区的内部，且水凝胶支架培养区的平面高度高于细胞团状培养区的平面高度，多孔薄膜位于第一主流道层下方，多孔薄膜位于第二主流道层上方，多孔薄膜的位置与多维细胞培养区和水凝胶支架培养区相对应。基于本申请实施例，通过多孔薄膜分割多维细胞培养区和水凝胶支架培养区，可以实现信息互联。并通过水凝胶支架培养区模拟仿生细胞外基质，可以提高体外肝生模型和病理模型的仿生性能。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案和优点，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1是本申请实施例提供的一种多细胞共培养的培养装置的结构示意图；
图2是本申请实施例提供的一种细胞团状培养区的示意图；
图3是本申请实施例提供的一种多孔薄膜的示意图；
图4是本申请实施例提供的一种多细胞共培养的培养系统的结构示意图；
图5是本申请实施例提供的一种细胞培养方法的流程示意图；
图6是本申请实施例提供的一种基于相差显微镜观测的人内皮细胞EAhy926的形态图；
图7是本申请实施例提供的一种基于相差显微镜观测的人肝星状细胞LX-2的形态图；
图8是本申请实施例提供的一种基于相差显微镜观测的肝癌细胞HepG2三种细胞的形态图；
图9是本申请实施例提供的一种细胞分泌白蛋白的肝功能代谢的能力评价图；
图10是本申请实施例提供的一种尿素的肝功能代谢的能力评价图。
附图标记：
第一主流道层-100、多孔薄膜-200、第二主流道层-300、多维细胞培养区-110、第一主流道层进出样口-120、第一流体通道121和122、水凝胶支架培养区-310、细胞团状培养区-320、第二主流道层进出样口-330、细胞球体培养凹坑-321。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施例作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一个实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
此处所称的“实施例”是指可包含于本申请至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本申请实施例的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置/系统或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含的包括一个或者更多个该特征。而且，术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请实施例能够以除了在这里图示或描述以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
下面介绍本申请一种多细胞共培养的培养装置的具体实施例，图1是本申请实施例提供的一种多细胞共培养的培养装置的结构示意图，本说明书提供了如实施例或示意图所示的组成结构，但基于常规或者无创造性的劳动可以包括更多或者更少的组成结构。实施例中列举的组成结构仅仅为众多组成结构中的一种方式，不代表唯一的组成结构，在实际执行时，可以按照实施例或者示意图所示的组成结构执行。
具体的如图1所示，该多细胞共培养的培养装置可以包括第一主流道层100、多孔薄膜200和第二主流道层300。其中，第一主流道层100可以设置在多孔薄膜200的上方，多孔薄膜200可以设置在第二主流道层300的上方。也即是，多细胞共培养的培养装置可以为三层结构，其中，上下两层可以为具有微结构的主流道层，中间一层可以为具有低渗透孔隙的多孔薄膜200。
在一种可选的实施方式中，多细胞共培养的培养装置的主体可以由高分子聚合物聚二甲氧基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)制作而成，包括具备可塑性的高分子材料聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene glycol terephthalate,PET)、玻璃或聚苯乙烯(Polystyrene,PS)等。
在一种可选的实施方式中，第一主流道层100、多孔薄膜200与第二主流道层300间可以通过键合连接，也可以通过浇筑连接，也可以通过夹具连接，还可以包括其他连接方式，本说明不一一例举。
可选地，可以配置体积比1:100的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidoxypropyltrimethoxysilance,GLYMO)水溶液，以及配置体积比为1:20的3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane,ATPES)的水溶液，并将需要结合的PET表面和PDMS表面，即多孔薄膜200和第一主流道层100，置于等离子清洗机中进行表面处理后，分别置于上述两种水溶液中，在室温下浸泡时间超过10分钟后，取出利用氮气将表面吹干，然后将两者按照设计贴合在一起，并放置于65℃热板上超过24小时，使其完全键合。该键合连接方式可以使得多孔薄膜200和第一主流道层100之间紧密贴合，不会发生漏液现象。同样地，可以将多孔薄膜200与第二主流道层300紧密贴合。
本申请实施例中，第一主流道层100可以包括多维细胞培养区110。该多维细胞培养区110可以是二维细胞培养区，也可以是三维细胞培养区。该多维细胞培养区110的形状可以是圆形，也可以是多边形，还可以是其他形状，本申请不作具体限定。该多维细胞培养区110可以用于对细胞进行灌注培养，也可以用于打印三维细胞。
在一种可选的实施方式中，多维细胞培养区110的深度可以在区间[20μm,1×104μm]内。
本申请实施例中，第一主流道层100上可以设置第一主流道层进出样口120，即第一主流道层进样口和第一主流道层出样口，该第一主流道层进出样口120可以通过第一流体通道组与多维细胞培养区110连通，即第一主流道层100进样口可以通过第一流体通道121与多维细胞培养区110连通，以向多维细胞培养区110导入细胞悬液，第二主流道层300出样口通过第一流体通道122与多维细胞培养区110连通。也即是，第一主流道层进出样口120可以通过第一流体通道组与多维细胞培养区110相连，并贯穿培养装置与外界相连，以实现细胞接种和细胞灌注。
本申请实施例中，第二主流道层300可以包括水凝胶支架培养区310和细胞团状培养区320，该水凝胶支架培养区310可以与细胞团状培养区320嵌套设置，细胞培养区可以设置在水凝胶支架培养区310的内部，且水凝胶支架培养区310的平面高度可以高于细胞团状培养区320的平面高度。也即是，第二主流道层300可以包括呈阶梯式分布的两个平面，平面高度高的平面可以设置水凝胶支架培养区310，平面高度低的平面可以设置细胞团状培养区320。
本申请实施例中，第二主流道层300上可以设置第二主流道层进出样口330，即第二主流道层300进样口和第二主流道层300出样口，该第二主流道层进出样口330可以位于多孔薄膜200上，但未贯穿多孔薄膜200。该第二主流道层进出样口330可以通过第二流体通道组与水凝胶支架培养区310、细胞团状培养区320连通，即第二主流道层300进样口可以通过第二流体通道331与水凝胶支架培养区310、细胞团状培养区320连通，以向水凝胶支架培养区310、细胞团状培养区320导入细胞悬液。第二主流道层300出样口可以通过第二流体通道与水凝胶支架培养区310、细胞团状培养区320相连。由于水凝胶支架培养区310与细胞团状培养区320不进行分割，不同培养区需要导入的细胞悬液可以通过第二主流道层300进样口在不同时刻导入。即水凝胶支架培养区310和细胞团状培养区320共用第二主流道层300进样口和第二主流道层300出样口。
图2是本申请实施例提供的一种细胞团状培养区的示意图。本申请实施例中，细胞团状培养区320可以包括细胞球体培养凹坑阵列，该细胞球体培养凹坑阵列，即多个细胞球体培养凹坑321可以以圆形环状的方式排布在第二主流通道层中平面高度低的平面。并且，每个细胞球体培养凹坑的表面可以经过表面处理，以降低细胞在球体培养凹坑的表面的粘附性。
可选地，可以向紧密贴合的第一主流道层100、多孔薄膜200和第二主流道层300的通道和腔室中注入含有75％的酒精水溶液，同时在紫外光下照射超过2小时，去除通道和腔室中的杂菌。进而可以使用洁净的缓冲液将通道和腔室中残存的酒精水溶液去除，之后再向通道和腔室中通入能够降低表面细胞吸附能力的表面活性剂，例如Pluronic F-127水溶液，并在室温下孵育超过3小时，以降低细胞在球体培养凹坑的表面的粘附性。
在一种可选的实施方式中，细胞球体培养凹坑阵列中每个细胞球体培养凹坑的深度可以在区间[100μm,500μm]内，每个细胞球体培养凹坑的直径可以在区间[100μm,500μm]内，相邻两个细胞球体培养凹坑间的距离可以大于等于10μm。
本申请实施例中，多孔薄膜200可以位于第一主流道层100的下方，多孔薄膜200可以位于第二主流通道层的上方，多孔薄膜200的位置可以与多维细胞培养区110和水凝胶支架培养区310相对应。也即是，多孔薄膜200可以用于分割多维细胞培养区110和水凝胶支架培养区310，水凝胶培养区位于多孔薄膜200与细胞团状培养区320之间。
在一种可选的实施方式中，多孔薄膜200的材料可以为聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或聚乙烯。多孔薄膜200的材料也可以为其他合成高分子膜，本说明书不作具体限定。
图3是本申请实施例提供的一种多孔薄膜200的示意图，其中，多孔薄膜200的孔径可以在区间[0.5μm,5μm]内。该多孔薄膜200具有低渗作用，可以为第二主流道层300提供培养基和低剪切力的环境。
采用本申请实施例提供的多细胞共培养的培养装置，可以用于体外肝生模型和病理模型的构建，应用于毒性测试和药物筛选。该培养装置包括两个细胞培养腔，并通过多孔薄膜进行细胞分隔，以实现信息互联。并且，在该细胞培养装置包含模拟仿生细胞外基质的水凝胶支架，利用水凝胶具有快速方便易固化的特性，快速形成水凝胶与细胞支架，可以模拟内环境中的细胞外基质，提高模型的仿生性能，解决现有技术中细胞由于缺乏微环境而迅速丧失表型较高的问题。
下面介绍本申请一种多细胞共培养的培养系统的具体实施例，图4是本申请实施例提供的一种多细胞共培养的培养系统的结构示意图，本说明书提供了如实施例或示意图所示的组成结构，但基于常规或者无创造性的劳动可以包括更多或者更少的组成结构。实施例中列举的组成结构仅仅为众多组成结构中的一种方式，不代表唯一的组成结构，在实际执行时，可以按照实施例或者示意图所示的组成结构执行。
如图4所示，该多细胞共培养的培养系统可以包括流体流量控制泵410、细胞培养基420和灌流夹具430。其中，灌流夹具430可以具有两层结构，上层可以包括用于定位的四个螺丝接口和不同肝窦单元之间连接所使用的孔和导管。下层可以用于承载多细胞共培养的培养装置，可以包括四个螺丝扣和一个定位槽。灌流夹具430两侧最外侧的孔，用于液体流入口和液体流出，液体流入口与流体流量控制泵输出端连接，用于给多细胞共培养的培养装置直接泵送新鲜的培养基，液体流出口用于导出液体。
在一种可选的实施方式中，流体流量控制泵410可以为微量隔膜泵、微量气泵、注射泵等其他用于微量流体泵送的泵。
下面介绍本申请一种细胞培养方法的具体实施例，图5是本申请实施例提供的一种细胞培养方法的流程示意图，本说明书提供了如实施例或示意图所示的方法步骤，但基于常规或者无创造性的劳动可以包括更多或者更少的方法步骤。实施例中列举的方法步骤仅仅为众多方法步骤中的一种方式，不代表唯一的方法步骤，在实际执行时，可以按照实施例或者示意图所示的方法步骤执行。
本申请实施例中，细胞培养方法可以多细胞共培养的培养装置实现，该多细胞共培养的培养装置可以包括第一主流道层、多孔薄膜和第二主流道层。其中，第一主流道层可以包括多维细胞培养区。第二主流道层可以包括水凝胶支架培养区和细胞团状培养区，水凝胶支架培养区可以与细胞团状培养区嵌套设置，细胞培养区可以设置在水凝胶支架培养区的内部，且水凝胶支架培养区的平面高度可以高于细胞团状培养区的平面高度。多孔薄膜可以位于第一主流道层下方，多孔薄膜可以位于第二主流道层上方，多孔薄膜的位置可以与多维细胞培养区和水凝胶支架培养区相对应。
在一种可选的实施方式中，上述多细胞共培养的培养装置可以包括第一主流道层进出样口，第一主流道层进出样口可以设置在第一主流道层上，第一主流道层进出样口可以通过第一流体通道组与多维细胞培养区连通。多细胞共培养的培养装置可以包括第二主流道层进出样口，第二主流道层进出样口可以设置在第一主流道层上，且未贯穿多孔薄膜，第二主流道层进出样口可以通过第二流体通道组与水凝胶支架培养区、细胞团状培养区连通。细胞团状培养区可以包括细胞球体培养凹坑阵列，该细胞球体培养凹坑阵列中每个细胞球体培养凹坑的深度可以在区间[100μm,500μm]内，每个细胞球体培养凹坑的直径可以在区间[100μm,500μm]内，相邻两个细胞球体培养凹坑间的距离可以大于等于10μm。多维细胞培养区包括二维细胞培养区和三维细胞培养区，多维细胞培养区的深度可以在区间[20μm,1×104μm]内。第一主流道层、多孔薄膜与第二主流道层间的连接方式包括但不限于键合连接、浇筑连接和夹具连接。多孔薄膜的材料可以为聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或聚乙烯，多孔薄膜的孔径可以在区间[0.5μm,5μm]内。
本申请实施例中，可以基于多细胞共培养的培养装置可以用于培养肝癌细胞系细胞、肺细胞、乳腺细胞、膀胱细胞、心肌细胞、胚胎干细胞等其他器官细胞。其中，肝癌细胞系细胞可以包括肝实质细胞，如人原代肝细胞、HepaRG细胞、Huh等。
为了便于理解，下文将以人肝癌细胞HepG2、人肝星状细胞LX-2和内皮细胞EAhy926三种细胞进行共培养为例进行说明。
该细胞培养方法可以包括：
待培养细胞冻存于-150℃中，在培养前，可以加入细胞培养基，细胞培养基中可以添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素后置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中进行培养，直至培养至对数期，融合度高于70％-80％，以使待培养细胞复苏。
S501：将第一待培养细胞置于冰上与水凝胶无血清培养基混合，得到第一细胞悬液。
本申请实施例中，可以将需要进行细胞团状培养的细胞A制成悬液，并在冰上与含有低浓度水凝胶的无血清培养基快速混合，获得第一细胞悬液。其中，水凝胶无血清培养基可以为具有良好生物相容性的支架材料，例如型号为356253的Matrigel水凝胶基质。
在一种可选实施方式中，可以将需要进行细胞团状培养的人肝癌细胞HepG2从培养皿或培养瓶消化下来，离心去上清，在冰上与含有2％的Matrigel的无血清培养基快速混合，得到第一细胞悬液。
S503：基于第二主流道层进出样口向细胞团状培养区中导入第一细胞悬液，并将多细胞培养的培养装置置于培养箱中静置24小时，得到团状细胞聚集体。
本申请实施例中，可以将第一细胞悬液从第二主流道层进样口导入多细胞共培养的培养装置中的细胞团状培养区，并将多细胞共培养的培养装置置于37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养。在静态培养24小时后，将多细胞共培养的培养装置从培养箱中取出，在显微镜下观察团状细胞生长情况，若细胞已发生聚集，形成较小的团状细胞聚集体，则进行下一步。
S505：将第二待培养细胞与水凝胶混合，得到混合体系。
本申请实施例中，可以将细胞B从培养皿或培养瓶中取出，使用胰蛋白酶将细胞B消化下来，并取适量细胞B与未固化的水凝胶混合，得到混合体系。其中，水凝胶可以为甲基丙烯酸化水凝胶GelMA、I型胶原蛋白、海藻酸钠、改性的聚二乙醇或改性的丙烯酰胺等。
在一种可选实施方式中，可以使用胰酶将人肝星状细胞LX-2消化下来，并取适量人肝星状细胞LX-2与未固化的水凝胶混合，得到混合体系。
S507：基于第二主流道层进出样口向水凝胶支架培养区导入混合体系，并将多细胞共培养的培养装置置于培养箱中静置24小时，得到生长细胞。
本申请实施例中，可以将混合体系从第二主流道层进样口缓慢导入水凝胶培养区，利用水凝胶光固化性质，将水凝胶固化，形成稳定的水凝胶与细胞支架。进而可以向多细胞共培养的培养装置的水凝胶支架培养区通满细胞所需的培养基，并放入培养箱中5分钟，更换新鲜培养基，将未完成反应的溶剂稀释去除。之后可以将含有细胞A和细胞B的多细胞共培养的培养装置放入37℃的二氧化碳培养箱，使得细胞生长。在静态培养24小时后，将多细胞共培养的培养装置取出，去除培养基。
S509：将第三待培养细胞与水凝胶无血清培养基混合，得到第二细胞悬液；第二细胞悬液的浓度高于第一细胞悬液的浓度。
本申请实施例中，可以对细胞C进行消化处理，离心去上清，并添加适量水凝胶无血清培养基将细胞C打散，得到第二细胞悬液，该第二细胞悬液的浓度高于第一细胞悬液的浓度。
在一种可选实施方式中，可以对内皮细胞EAhy926进行消化处理，离心去上清，并添加培养基打散，得到第二细胞悬液。
S511：基于第一主流道层进出样口向多维细胞培养区导入第二细胞悬液，进行细胞贴壁培养，得到贴壁细胞。
本申请实施例中，可以将第二细胞悬液从第一主流道层进样口导入多维细胞培养区，进行贴壁培养，得到贴壁细胞。
S513：基于流量流通控制泵对团状细胞聚集体、生长细胞和贴壁细胞进行灌注培养。
本申请实施例中，可以将多细胞共培养的培养装置与灌流夹具连接，拧紧量测螺母，并将其与流量流通控制泵连接，进行7.1μL/min的灌注培养。图6是本申请实施例提供的一种基于相差显微镜观测的人内皮细胞EAhy926的形态图，图7是本申请实施例提供的一种基于相差显微镜观测的人肝星状细胞LX-2的形态图，图8是本申请实施例提供的一种基于相差显微镜观测的肝癌细胞HepG2三种细胞的形态图。
采用本申请实施例所提供的细胞培养方法，可以用于体外肝生模型和病理模型的构建，应用于毒性测试和药物筛选。该培养装置包括两个细胞培养腔，并通过多孔薄膜进行细胞分隔，以实现信息互联。并且，在该细胞培养装置包含模拟仿生细胞外基质的水凝胶支架，利用水凝胶具有快速方便易固化的特性，快速形成水凝胶与细胞支架，可以模拟内环境中的细胞外基质，提高模型的仿生性能，解决现有技术中细胞由于缺乏微环境而迅速丧失表型较高的问题。
本申请还提供一种体外构建模型纤维化方法，通过添加促进肝脏发生纤维化的关键因子TGF-β1和具有分化为成纤维细胞潜力的肝星状细胞LX-2成纤维分化，对肝窦模型进行纤维化诱导。具体操作过程如下：
在细胞培养装置灌流的培养基中添加重组蛋白10ng/mL的TGF-β1，在灌流24小时后，对多细胞共培养的培养装置上的清液进行蛋白检测，主要检测细胞分泌白蛋白和尿素。图9是本申请实施例提供的一种细胞分泌白蛋白的肝功能代谢的能力评价图，图10是本申请实施例提供的一种尿素的肝功能代谢的能力评价图。
上述本申请提供的多细胞共培养的培养装置、多细胞共培养的培养系统、细胞培养方法的实施例可见，本申请中多细胞共培养的培养装置包括第一主流道层、多孔薄膜和第二主流道层。第一主流道层包括多维细胞培养区，第二主流道层包括水凝胶支架培养区和细胞团状培养区，水凝胶支架培养区与细胞团状培养区嵌套设置，细胞培养区设置在水凝胶支架培养区的内部，且水凝胶支架培养区的平面高度高于细胞团状培养区的平面高度，多孔薄膜位于第一主流道层下方，多孔薄膜位于第二主流道层上方，多孔薄膜的位置与多维细胞培养区和水凝胶支架培养区相对应。基于本申请实施例，可以用于体外肝生模型和病理模型的构建，应用于毒性测试和药物筛选。该培养装置包括两个细胞培养腔，并通过多孔薄膜进行细胞分隔，以实现信息互联。并且，在该细胞培养装置包含模拟仿生细胞外基质的水凝胶支架，利用水凝胶具有快速方便易固化的特性，快速形成水凝胶与细胞支架，可以模拟内环境中的细胞外基质，提高模型的仿生性能，解决现有技术中细胞由于缺乏微环境而迅速丧失表型较高的问题。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的相连或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
需要说明的是：上述本申请实施例的先后顺序仅仅为了描述，不代表实施例的优劣，且上述本说明书对特定的实施例进行了描述，其他实施例也在所附权利要求书的范围内。在一些情况下，在权利要求书中记载的动作或者步骤可以按照不同的实施例中的顺序来执行并且能够实现预期的结果。另外，在附图中描绘的过程不一定要求示出特定顺序或者而连接顺序才能够实现期望的结果，在某些实施方式中，多任务并行处理也是可以的或者可能是有利的。
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的均为与其他实施例的不同之处。尤其，对于方法的实施例而言，由于其基于相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种多细胞共培养的培养装置，其特征在于，包括：第一主流道层、多孔薄膜和第二主流道层；
所述第一主流道层包括多维细胞培养区；
所述第二主流道层包括水凝胶支架培养区和细胞团状培养区，所述水凝胶支架培养区与所述细胞团状培养区嵌套设置，所述细胞培养区设置在所述水凝胶支架培养区的内部，且所述水凝胶支架培养区的平面高度高于所述细胞团状培养区的平面高度；
所述多孔薄膜位于所述第一主流道层下方，所述多孔薄膜位于所述第二主流道层上方，所述多孔薄膜的位置与所述多维细胞培养区和所述水凝胶支架培养区相对应。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：
第一主流道层进出样口，所述第一主流道层进出样口设置在所述第一主流道层上；
所述第一主流道层进出样口通过第一流体通道组与所述多维细胞培养区连通。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：
第二主流道层进出样口，所述第二主流道层进出样口设置在所述第一主流道层上，且未贯穿所述多孔薄膜；
所述第二主流道层进出样口通过第二流体通道组与所述水凝胶支架培养区、所述细胞团状培养区连通。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述细胞团状培养区包括细胞球体培养凹坑阵列。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述细胞球体培养凹坑阵列中每个细胞球体培养凹坑的深度在区间[100μm,500μm]内；
所述每个细胞球体培养凹坑的直径在区间[100μm,500μm]内；
相邻两个细胞球体培养凹坑间的距离大于等于10μm。
6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述多维细胞培养区包括二维细胞培养区和三维细胞培养区；
所述多维细胞培养区的深度在区间[20μm,1×104μm]内。
7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第一主流道层、所述多孔薄膜与所述第二主流道层间的连接方式包括但不限于键合连接、浇筑连接和夹具连接。
8.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述多孔薄膜的材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或聚乙烯。
9.根据权利要求1-8任一所述的装置，其特征在于，所述多孔薄膜的孔径在区间[0.5μm,5μm]内。
10.一种细胞培养方法，其特征在于，所述细胞培养方法基于权利要求1-9任一项所述的多细胞共培养的培养装置实现，所述细胞培养方法包括：
将第一待培养细胞与置于冰上的水凝胶于无血清培养基中混合，得到第一细胞悬液；
基于第二主流道层进出样口向细胞团状培养区中导入所述第一细胞悬液，并将所述多细胞培养的培养装置置于培养箱中静置24小时，得到团状细胞聚集体；
将第二待培养细胞与水凝胶混合，得到混合体系；
基于所述第二主流道层进出样口向水凝胶支架培养区导入所述混合体系，固化所述水凝胶后，将所述多细胞共培养的培养装置置于所述培养箱中静置24小时，得到附着于支架的生长细胞；所述水凝胶的固化方式包括光固化、热固化或者试剂固化；
将第三待培养细胞与所述水凝胶无血清培养基混合，得到第二细胞悬液；所述第二细胞悬液的浓度高于所述第一细胞悬液的浓度；
基于第一主流道层进出样口向多维细胞培养区导入所述第二细胞悬液，进行细胞贴壁培养，得到贴壁细胞；
基于流量流通控制泵对所述团状细胞聚集体、所述生长细胞和所述贴壁细胞进行灌注培养。
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