WO2024072170A1 - 피부 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법 - Google Patents

피부 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2024072170A1
WO2024072170A1 PCT/KR2023/015147 KR2023015147W WO2024072170A1 WO 2024072170 A1 WO2024072170 A1 WO 2024072170A1 KR 2023015147 W KR2023015147 W KR 2023015147W WO 2024072170 A1 WO2024072170 A1 WO 2024072170A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
skin
organoids
clause
organoid
cells
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/015147
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조재연
Original Assignee
오알지 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 오알지 주식회사 filed Critical 오알지 주식회사
Publication of WO2024072170A1 publication Critical patent/WO2024072170A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C12N5/0698—Skin equivalents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/10—Hair or skin implants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a skin organoid with a structure similar to living skin, and more specifically, to a skin organoid that includes an outer stratum corneum, a center densely packed with cells, and a root, capable of cell movement from the center to the stratum corneum, and having a round spherical shape. It relates to skin organoids having a three-dimensional shape, a method of manufacturing the same, and a drug evaluation method using the same.
  • Organoids are attracting attention as a new human body simulation model. Organoids are formed by growing stem cells into specific cells to form three-dimensional structures such as organs. Organoids, unlike two-dimensional cell-based models, are cultured in a three-dimensional environment and can be cultured for a longer period of time. In addition, organoids are only small in size, but their constituent cells and structure are similar to actual organs. Accordingly, organoids are evaluated as the optimal test object for examining the efficacy and stability of drugs in the process of developing new drugs. Furthermore, the organoid-related field is a field with high potential that can be used not only for drug toxicity and efficacy evaluation in new drug development, but also for disease models, cancer research, personalized medicine, and regenerative treatments.
  • organoids have been successfully developed, including stomach, intestine, early liver, thyroid, lung, and brain.
  • skin organoids developed to date exhibit structurally different characteristics from living skin.
  • skin organoids are morphologically and functionally different from biological skin as the stratum corneum and epidermal layer are created inside the organoid.
  • conventional skin organoids cannot be used as organoids themselves, but are chopped up and used again in a cell-like structure, and as such, they have limitations in that they cannot represent living skin in drug and toxicity evaluations as organoids.
  • conventional skin organoids have a structure in which the epidermis, including the stratum corneum, is located inside the tissue, so the inside of the tissue is exposed to the outside through cutting and has been used by simply layering cells.
  • conventional skin organoids do not contain living skin cells such as vascular cells and immune cells, so they do not represent living skin physiologically. Accordingly, conventional skin organoids have been used only for simple skin irritation tests, and have not been used for evaluation of material effectiveness such as drug and toxicity tests and skin regeneration evaluation.
  • biological skin contains various heterogeneous cells. More specifically, the inventors of the present invention noted that biological skin is composed of the epidermis, dermis, and subcutaneous fat layer, and that these have different compositions depending on their respective characteristics. Furthermore, the inventors of the present invention recognized that the formation of various components of living skin has limitations with stem cells in a limited culture environment.
  • the inventors of the present invention discovered that it is easier to differentiate skin cells such as the epidermis and dermis when heterogeneous primary skin cells, rather than stem cells differentiated into a specific lineage, are used.
  • the inventors of the present invention developed a skin organoid that is structurally and functionally (physiologically) similar to living skin from heterogeneous primary skin cells and a method for producing the same.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing skin organoids in a specific environment and conditions, in which primary skin cells can be cultured to have a structure and function similar to living skin.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a skin organoid generated through the above-described manufacturing method, including a stratum corneum and hair roots on the outside, and having improved mimicry of living skin, and a drug evaluation method accordingly. It is provided.
  • the present invention includes a core densely packed with cells, a stratum corneum formed on the outside of the core, and hair roots, and cell movement is possible from the core to the stratum corneum, Skin organoids, which are in the form of round spheres and three-dimensional structures, are provided.
  • the stratum corneum may have a thickness of 1 to 100 ⁇ m or less, but is not limited thereto.
  • the stratum corneum may include at least one of KRT10, KRT14, and Loricrin, but is not limited thereto.
  • the center may have a diameter of 100 to 1000 ⁇ m, but is not limited thereto.
  • the center may include vimentin (VIM), but is not limited thereto.
  • VIM vimentin
  • the present invention provides a manufacturing method for forming an organoid including a stratum corneum and hair roots on the outside, using skin cells (primary skin) to form a first skin organoid.
  • a manufacturing method for forming an organoid including a stratum corneum and hair roots on the outside, using skin cells (primary skin) to form a first skin organoid.
  • ECM Extracellular Matrix
  • PEG Polyethylene glycol
  • the skin tissue isolated from the individual is chopped, and the chopped skin tissue is treated with collagenase to produce heterogeneous skin cells ( A step of obtaining primary skin cells may be further included.
  • the collagenase may include at least one of Type I Collagenase and Type IV Collagenase, but is not limited thereto.
  • the obtaining step may further include culturing the primary skin cells to expand.
  • skin cells may have a size of about 100 ⁇ m or less, but are not limited thereto.
  • the skin cells may include at least one of APOE, COL1A1, CD34, KRT7, KRT10, KRT19, HS3ST6, PECAM1, and VIM, but are not limited thereto.
  • the ECM may include at least one of an ECM (extracellular matrix) in the form of a patch and an ECM in the form of a fiber, but is not limited thereto.
  • fiber-shaped ECM can be obtained by treating patch-shaped ECM with a proteolytic enzyme.
  • the ECM in the form of fiber is Collagen alpha-1(I) chain, Collagen alpha-3(VI) chain, Collagen alpha-2(I) chain, Collagen alpha-2(VI) chain , Collagen alpha-1(VI) chain, Keratin type I cytoskeletal 9, Keratin type II cytoskeletal 1, Keratin type I cytoskeletal 10, Biglycan, Decorin, Lumican, and Collagen alpha-1(III) chain. It is not limited to this.
  • ECM can be obtained by culturing fibroblasts to form a fibroblast patch and decellularizing the fibroblast patch.
  • the first culturing step may be performed for at least one period of about 1 hour to 3 days, but is not limited thereto.
  • the first medium may include at least one of a B-27 supplement and a serum substitute, but is not limited thereto.
  • the B-27 supplement may be 1 to 10 v/v % based on the total volume of the first medium, but is not limited thereto.
  • the serum substitute may be 5 to 15 v/v % based on the total volume of the first medium, but is not limited thereto.
  • the second culturing step may be culturing for at least one period of about 7 to 40 days, but is not limited thereto.
  • the second medium may include at least one of the first medium, ascorbic acid, CHIRR99021, and a Wnt agonist, but is not limited thereto.
  • ascorbic acid may be 2 to 500 Mm based on 1 L of the second medium, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a drug evaluation method using skin organoids, including the step of processing the skin organoids and drugs described above.
  • the present invention provides skin organoids, a method for producing them, and a method for assessing drug toxicity using the same, which has the effect of evaluating drugs in the development of new drugs, that is, evaluating effectiveness, side effects, and toxicity.
  • the present invention is different from conventional organoids that have a structure different from living skin, and is a round spherical three-dimensional skin organoid that includes keratosis on the outside corresponding to the epidermis of biological skin, a center corresponding to the dermis, and hair roots.
  • it not only has a layer formation that is structurally identical to living skin, but also includes physiologically similar cell cycle phenomena.
  • the skin organoid of the present invention can confirm structural and/or physiological abnormalities of the skin in response to various substances.
  • the skin organoid of the present invention is a human model that is functionally and structurally similar to living skin and can be used to evaluate the side effects, toxicity, and effectiveness of drugs.
  • the skin organoid of the present invention can be used to screen drug candidates in the development of new drugs, dramatically reducing the cost and time required, and can be used for physiological research and clinical trials of skin cancer. Furthermore, the present invention can be used for personalized diagnosis that can reduce the cost of treatment by preventing the use of unnecessary drugs by enabling experiments on various causes of the invention.
  • Figure 1 shows the procedure of a method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2a shows an exemplary diagram of the procedure for obtaining skin cells in the method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2b shows the results of single cell transcription analysis of primary skin cells used in the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 illustrates an exemplary procedure for the first culturing step in the method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4a shows an illustration of the formation process of ECM used in the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4b shows the results of protein component analysis of the fibrous ECM used in the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows a microscope image of a first skin organoid formed by the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6a shows a staining image for LOR and KRT10 markers of the first skin organoid formed by the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6b shows a staining image for the KRT14 marker of the first skin organoid formed by the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6c shows a staining image for the VIM marker of the first skin organoid formed by the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 shows a microscope image of the stratum corneum of the first skin organoid formed by the method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows a microscope image of the size of the first skin organoid formed by the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows a microscope image of a second skin organoid formed by the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10 shows a flow chart of a drug evaluation method using skin organoids according to an embodiment of the present invention.
  • the term “about” refers to the normal error range for each value, which is readily known to those skilled in the art. Reference herein to “about” a value or parameter includes instances of the value or parameter itself. Furthermore, the term “about” refers to a range of values that falls within 10% in either direction (above or below) of the stated reference value, unless otherwise stated or apparent from the context.
  • the term “patient or subject” is used interchangeably and refers to any single animal in need of treatment, more preferably a mammal (such as a non-human animal, e.g., cat, dog, (including horses, rabbits, zoo animals, cattle, pigs, sheep, and non-human primates). Patients referred to in various embodiments herein may be humans.
  • a mammal such as a non-human animal, e.g., cat, dog, (including horses, rabbits, zoo animals, cattle, pigs, sheep, and non-human primates).
  • Patients referred to in various embodiments herein may be humans.
  • differentiation refers to the development of cells to the level of a specific cell or tissue complex or entity with a special function.
  • organoids refers to a small culture that recapitulates both the form and function of a tissue or organ. More specifically, organoids must contain one or more cell types among the various types of cells that make up an organ or tissue, must be able to reproduce the special functions of each organ, and must be able to reproduce the special functions of each organ, and the cells must cluster together to form an organ spatially. It should be organized in a similar form. Organoids differ from spheroids in that they form a system rather than a simple collection of cells, and can be used as a patient-specific model for new drug development, artificial organs, disease treatments, and disease treatment.
  • medium refers to the growth of various cells in vitro, containing essential elements for cell growth and proliferation, such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, and minerals. and mixtures for propagation.
  • extracellular matrix refers to a three-dimensional tissue that plays an important role in providing signals that affect various cellular metabolic pathways such as cell proliferation, differentiation, and death.
  • the extracellular matrix stores and supplies the biochemical factors necessary for cell growth and differentiation, while also providing a physical environment that cells can recognize.
  • the extracellular matrix is a product produced by the cells that make up each tissue according to their needs, including structural proteins such as collagen and elastin, polysaccharides such as GAG (glycosaminoglycan), and other substances that help cells adhere. Contains adhesive proteins and growth factors.
  • This extracellular matrix is composed of different components depending on the tissue and cells from which it is derived, and has special physical properties.
  • Example 1 Method for producing skin organoids and skin organoids resulting therefrom
  • Figure 1 exemplarily shows the procedure of a method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention. At this time, for convenience of explanation, description will be made with reference to FIGS. 2A to 6.
  • the skin organoid manufacturing method is a manufacturing method for forming an organoid including a stratum corneum and hair roots on the outer shell, wherein the first skin organoid is formed.
  • first cultivating primary skin cells in a first medium with at least one support of ECM (Extracellular Matrix) or PEG (Polyethylene glycol), and secondly culturing the first skin organoids in a second medium. May include steps.
  • the skin cells used in the first culturing step may refer to primary skin cells obtained from skin tissue isolated from an individual.
  • skin cells used in the first culturing step can be obtained by dissociating skin tissue into cells using an enzymatic method and growing them in a culture vessel.
  • the method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention may include the step of obtaining skin cells before the first culturing step.
  • FIG. 2A an illustration of the procedure for obtaining skin cells in a method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention is shown.
  • the step of obtaining skin cells includes chopping or cutting skin tissue (human skin biopsy) isolated from an individual, and chopping or cutting the chopped tissue using an enzymatic method. It may include a step of dissociation into cells (enzymatix dissociation) and a step of culturing the dissociated cells to proliferate.
  • the skin tissue separated from the subject can be used in various areas without restrictions, such as the face and arms of the subject.
  • the shredding step may include any method that can reduce the size of tissue by applying physical force such as shear force, and various instruments such as surgical knives or chopper may be used. You can.
  • the enzyme used in the dissociation step is collagenase, which may include at least one of Type I Collagenase and Type IV Collagenase, but is not limited thereto, and connects and supports cells and/or tissues such as collagen. It may include any substance that can dissolve and decompose (dissociate) the supporting material.
  • enzymes used in the dissociation step include not only collagenase but also dispase, protease, and trypsin, but are not limited thereto.
  • the cells obtained in the dissociation step may be primary skin cells, which can be directly used to form organoids. Accordingly, in the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention, the skin cells used to form organoids may be cells obtained through an enzymatic method, but are not limited thereto. In order to supply uniform cells, It can be used after culturing it.
  • the primary skin cells obtained from the dissociation step may be cultured to expand in a medium containing 10% FBS (fetal bovine serum).
  • FBS fetal bovine serum
  • the method for producing skin organoids involves cutting skin tissue isolated from an individual before the step of producing primary skin cells, which are the material cells of the organoid, that is, the first step of culturing. It may further include the step of treating the chopped skin tissue with collagenase to obtain heterogeneous primary skin cells. Furthermore, the obtaining step may further include the step of obtaining primary skin cells. It may further include culturing to allow expansion.
  • Primary skin cells appear to have a black peri-nucleus including the nucleus and a small size of about 100 ⁇ m or less.
  • the primary skin cells of the present invention are spindle-shaped. It is morphologically differentiated from fibroblasts, which have a size of about 100 ⁇ m or more.
  • the primary skin cells of the present invention may have heterogeneity, unlike fibroblasts and stem cells of specific lineages generally used for organoid production.
  • the primary skin cells of the present invention can be divided into a total of four groups (group 1, group 2, group 3, group 4), and group 1 is specific for KRT7 and HS3ST6, which are related to the composition of the epidermal layer and stratum corneum of the skin. They appear to be naturally expressing skin cells (KRT7+ HS3ST6+ skin cells), and groups 2 and 3 appear to be vasculogenic skin cells.
  • the cells for groups 2 and 3 are vascular skin cells, they can form blood vessels within the skin in the organoid when the cells grow.
  • VIM (vimentin) is a marker for fibroblasts inside the skin, that is, dermal fibroblasts, and is a structural protein involved in the cytoskeleton and cell support. VIM appears to be overexpressed in groups 1, 2, 3 and 4, which may mean that cells in all groups are capable of producing structural proteins such as vimentin and thus cellular keratin.
  • COL1A1 is a marker expressed in keratinocytes and is included in various parts of the body such as bone, cartilage, and basement membrane. It may be related to collagen, a structural protein distributed in the basement membrane of epithelial tissue and involved in skin cell support. COL1A1 appears to be overexpressed in all cell groups, which may mean that all cultured skin cells are capable of producing collagen and thus cellular keratin.
  • KRT10 is a marker specifically expressed in keratinocytes and may be related to keratin, a light protein involved in the formation of epithelial structures such as hair, nails, and skin. KRT10 appears to be overexpressed in all cell groups, which may mean that all cultured skin cells are capable of producing keratin and subsequent cell keratin.
  • KRT7 and KRT19 are markers specifically expressed in keratinocytes and may be related to keratin, a light protein involved in the formation of epithelial structures such as hair, nails, and skin. KRT7 and KRT19 appear to be overexpressed in group 1, which may mean that cells in group 1 are capable of producing (forming) epithelial structures containing keratinocytes of the keratin component.
  • HS3ST6 may be associated with dermis, extracellular proteoglycan and glycoproteins. HS3ST6 appears to be overexpressed in group 1, which may mean that cells in group 1 are capable of producing constructs for at least one of dermal cells, proteoglycans and glycoproteins.
  • CD34 is a marker expressed in various cells, including blood vessels and skin cells, and may be related to transmembrane proteins. CD34 appears to be overexpressed in groups 2 and 3, which may mean that cells in groups 2 and 3 can produce transmembrane proteins and substances related thereto, and can further form blood vessels in the skin.
  • APOE may be related to apolipoprotein, one of the components of keratinocytes. APOE appears to be overexpressed in groups 2 and 3, which may mean that cells in groups 2 and 3 are all capable of producing (forming) apolipoprotein, which is one of the components of keratinocytes, and a fat layer associated with the dermal layer.
  • PECAM1 is a marker expressed in dermal, vascular and endothelial cells and is associated with epithelial cells. PECAM1 appears to be overexpressed in groups 2 and 3, which may mean that cells in groups 2 and 3 are capable of producing (forming) epithelial cells and structures such as blood vessels and endothelial cells in the skin.
  • the primary skin cells used in the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention have heterogeneity expressing at least one of VIM, COL1A1, KRT10, KRT7, KRT19, HS3ST6, CD34, APOE, and PECAM1. It can refer to a group of cells.
  • organoids that mimic living organs are analogs containing cells of various heterogeneities.
  • the primary skin cells of the present invention which are capable of expressing heterogeneous proteins, can express cells of various heterogeneities to form an analogue (organoid) similar to skin in vivo.
  • the method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention has a structure similar to living skin, that is, the entire subcutaneous tissue layer including the epidermis including the stratum corneum, which is a skin barrier, the dermis including blood vessels and hair roots, and fat (
  • the skin cells used in the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention can express constituent proteins for the epidermis, dermis, and subcutaneous tissue.
  • Primary skin cells of the present invention may be most preferred for forming skin organoids.
  • the first culturing step may mean culturing to form a first skin organoid including a stratum corneum from primary skin cells.
  • FIG. 3 an exemplary diagram of the procedure of the first culturing step in the method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention is shown.
  • primary skin cells may be cultured in a support and a first medium.
  • the first medium may be a medium containing at least one of a B-27 supplement and a serum replacement.
  • B-27 supplement is a growth factor and can improve the survival rate and maturity of cells.
  • the B-27 supplement is added to the total volume of the first medium. It may be 1 to 10 v/v%, but is not limited thereto.
  • Serum replacement may refer to a chemically-defined serum replacement that can promote cell growth and contains chemically defined ingredients.
  • the serum substitute in the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention may be a commercially available serum substitute, and may be 5 to 15 v/v% based on the total volume of the first medium. , but is not limited thereto, and may preferably be 10 v/v%.
  • the method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention includes a serum substitute of chemically identified ingredients, thereby overcoming the limitation of unwanted stimulation induced by unclear ingredients such as conventional FBS, Cells can be cultured more stably.
  • the serum substitute in the first medium of the present invention may be a chemically identified serum substitute, as well as animal-derived substances such as BCS (Bovine calf serum).
  • BCS Bovine calf serum
  • BCS in the skin organoid production method may be 5 to 15 v/v% based on the total volume of the first medium, but is not limited thereto, and may preferably be 10 v/v%.
  • the first medium of the present invention includes fetal bovine serum ( Fetal Bovine Serum (FBS), dialyzed fetal bovine serum, Newborn Calf Serum (NCS), Iron supplemented bovine serum, charcoal stripped serum, It may include at least one of de-lipidated serum, human serum, horse serum, and adult bovine serum.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • NCS Newborn Calf Serum
  • Iron supplemented bovine serum Iron supplemented bovine serum
  • charcoal stripped serum It may include at least one of de-lipidated serum, human serum, horse serum, and adult bovine serum.
  • a preferred serum used in the first medium of the method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention may be a serum substitute with a chemically identified component.
  • the first medium may include a natural or artificial serum-free medium that does not contain insulin, which is used to maintain and grow animal cells, and may include a minimal essential medium that does not contain insulin.
  • MEM natural or artificial serum-free medium that does not contain insulin
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • Ham's F12 Ham's F12, SF 12, and RPMI 1640
  • it does not contain insulin and may be DMEM/F12 mixed with DMEM and Ham's F12 in a 1:1 ratio, but is not limited thereto.
  • a support may be used in the first culturing step of the present invention, and the support may be ECM (Extracellular Matrix) or PEG (Polyethylene glycol), but is not limited thereto, and various types of supports may be used.
  • the ECM may include at least one of a patch-shaped ECM (extracellular matrix) and a fiber-shaped ECM.
  • the fiber-shaped ECM is added to the patch-shaped ECM with a protein digestive enzyme ( It can be obtained by processing digestive enzymes.
  • FIG. 4A an illustration of the formation process of the ECM used in the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention is shown.
  • the ECM of the present invention can be obtained from fibroblasts.
  • the ECM in the skin organoid manufacturing method according to an embodiment of the present invention is cultured with human dermal fibroblasts (HDF) so that the fibroblasts are activated to form a patch.
  • HDF human dermal fibroblasts
  • the ECM obtained by decellularizing the fibroblast patch can be used in the first culturing step of the present invention in the form of a mesh-structured patch (hSkin-ECM Patch). Furthermore, patch-shaped ECM can be converted into fiber-shaped ECM by proteolytic enzyme treatment, and fiber-shaped ECM can also be used in the first culturing step of the present invention.
  • the protein decomposition (digestion) enzyme may be pepsin, but is not limited thereto, and various decomposition enzymes capable of decomposing protein may be used.
  • ECM extracellular matrix
  • the fiber-type ECM of the present invention includes Collagen alpha-1(I) chain, Collagen alpha-3(VI) chain, Collagen alpha-2(I) chain, Collagen alpha-2(VI) chain, Collagen alpha-1(VI) ) chain, Keratin type I cytoskeletal 9, Keratin type II cytoskeletal 1, Keratin type I cytoskeletal 10, Biglycan, Decorin, Lumican, and Collagen alpha-1(III) chain.
  • the ECM used in the first culturing step of the skin organoid production method may preferably be an ECM in the form of a fiber, but is not limited thereto, and may be in the form of a patch or a patch shape and a fiber.
  • a mixed form of ECM can be freely selected and used.
  • the direction of proliferation and growth of cells is determined depending on the components of the culture medium and the ECM (extracellular matrix) similar to in vivo conditions, and an environment of specific conditions must be created to achieve the desired direction. It may be possible to grow into a noid.
  • the method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention includes a first culture medium of a specific composition and concentration and an ECM of a specific type as described above, thereby producing a first skin organoid that is structurally similar to skin in vivo. Noids can be formed.
  • the first skin organoid formed by the first culturing step of the present invention may include a core densely packed with cells and a stratum corneum formed on the outside of the core. More specifically, referring to Figure 5, a microscopic image of a first skin organoid formed by a method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention is shown.
  • the first skin organoid of the present invention has a round spherical three-dimensional shape and may include a stratum corneum of relatively low density at the outermost layer. Additionally, the first skin organoid of the present invention has a layered structure and may include a core where cells are densely packed in the lower part of the stratum corneum. At this time, the stratum corneum of the first skin organoid of the present invention may refer to the epidermis layer including the stratum corneum.
  • the layered structure of the first skin organoid appears to be very similar to biological skin in which the stratum corneum exists on the outside, the epidermis exists below the stratum corneum, and the dermis exists on the inside.
  • FIG. 6A a staining image for LOR and KRT10 markers of a first skin organoid formed by a method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention is shown.
  • FIG. 6B a staining image for the KRT14 marker of the first skin organoid formed by the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention is shown.
  • KRT14 a marker for keratin and epidermal cells, appears to be expressed on the surface of the first skin organoid, that is, below the LOR and KRT10 marker expression layer in FIG. 6A described above. That is, the first skin organoid of the present invention includes a stratum corneum and an epidermal layer on the surface, which may mean that it has a structure similar to biological skin.
  • FIG. 6C a staining image for a VIM marker of a first skin organoid formed by the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention is shown.
  • VIM a marker for fibroblasts inside the skin, that is, the dermis, appears to be expressed inside the first skin organoid, that is, below the KRT14 marker expression layer in FIG. 6B described above.
  • the first skin organoid of the present invention includes a central part corresponding to the dermal layer inside, which may mean that it has a structure similar to living skin.
  • the first skin organoid formed by the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention is a three-dimensional skin organoid that structurally closely resembles living skin.
  • the first skin organoid of the present invention may be physiologically very similar to living skin. More specifically, referring to FIG. 7, a microscopic image of the stratum corneum of a first skin organoid formed by a method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention is shown.
  • the first skin organoid of the present invention may mean that it has a physiological function for living skin, such as the skin regeneration cycle, and thus can represent the physiological function for living skin.
  • the first skin organoid of the present invention may have a size of about 100 to 3000 ⁇ m. More specifically, referring to FIG. 8, a microscopic image of the size of a first skin organoid formed by a method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention is shown.
  • the center of the first skin organoid of the present invention appears to have a diameter of more than 500 ⁇ m, and the stratum corneum appears to have a thickness of about 100 ⁇ m or less.
  • the diameter of the center appears to be longer than on the 2nd day, and the thickness of the stratum corneum appears to be thicker than on the 2nd day.
  • the first skin organoid of the present invention can be cultured for more than 3 days and grow continuously.
  • the first skin organoid formed by the skin organoid manufacturing method according to an embodiment of the present invention may preferably include a central area with a diameter of about 100 to 1000 ⁇ m and a stratum corneum with a thickness of 1 to 100 ⁇ m or less.
  • the first skin organoid having the above-described size may be formed by culturing for at least one period of the first culture step, that is, about 1 hour to 3 days, It may have a diameter of about 1,100 ⁇ m, including a central area of about 100 to 1000 ⁇ m in diameter and a stratum corneum with a thickness of 1 to 100 ⁇ m or less, but is not limited thereto.
  • the first skin organoid of the above-mentioned size has a size of about 1,100 ⁇ m or less, it is stored and used in various commercially available cell containers such as 96 plate wells and micro tubes. It can be.
  • the first skin organoid of the present invention can be formed 1 hour after the start of the first culture, and the first step of culturing to form the first skin organoid is performed for at least one period of about 1 hour to 3 days. It may be a culture step, but the most preferable culture period may be about 2 days (about 48 hours).
  • the first skin organoid of the present invention may preferably have a size of about 1,100 ⁇ m or less, which is easy to store in cells, but is not limited thereto.
  • 1 Skin organoids can be cultured for more than 3 days, and thus can have more diverse sizes and additional biomimetic structures.
  • the first skin organoid formed through the first culturing step has hair roots formed through the second culturing step, and can be cultured into a second skin organoid including hair roots.
  • the second culturing step may mean culturing the first skin organoid to form a second skin organoid containing hair roots.
  • the first skin organoid may be cultured in the second medium.
  • the second medium may be a medium containing at least one of the first medium, ascorbic acid, CHIRR99021, and a Wnt agonist.
  • Ascorbic acid is an antioxidant that is involved in procollagen synthesis and is a cofactor associated with increased type 1 collagen production. Ascorbic acid can stimulate and regulate the proliferation of various cells such as adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes in vitro. Furthermore, when a certain concentration of ascorbic acid is added to the skin cell culture medium, it acts as a cell growth promoter, increases cell proliferation, and even promotes DNA synthesis. However, if the concentration of ascorbic acid is not appropriate, it may inhibit the proliferation of cells and be cytotoxic, causing apoptosis. Accordingly, the appropriate concentration of ascorbic acid used in the second medium of the present invention may be 2 to 500 mM based on 1 L of the second medium, but is not limited thereto. When ascorbic acid at the above-mentioned concentration is added, , can improve the proliferation of skin organoid cells.
  • CHIRR99021 is a substance that inhibits the activity of GSK (Glycogen synthase kinase)-3 ⁇ . More specifically, as GSK-3 ⁇ is inhibited, ß-catenin in the signaling system involved in cell proliferation is not degraded by GSK-3 ⁇ , thereby increasing the expression of genes involved in cell proliferation, thereby improving cell survival and proliferation. It can be.
  • GSK Genericogen synthase kinase
  • a Wnt agonist is a substance for activating a signal transduction pathway, and can more actively promote the growth of skin organoids by activating Wnt proteins that contribute to the signal transduction system within organoid cells and enhancing their metabolism. In other words, the size of skin organoids can be improved through the addition of a Wnt agonist.
  • the second culturing step of the present invention may be culturing for at least one period of about 7 to 40 days, and after 7 days of the second culturing, the first skin organoid is a second skin organoid containing hair roots. Grows into a noid.
  • FIG. 9 a microscopic image of a second skin organoid formed by a method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention is shown.
  • the second skin organoid of the present invention includes hair roots and hair, and can structurally mimic and represent skin on which body hair and hair can be formed.
  • the method for producing skin organoids is to form primary skin cells into an extracellular matrix (ECM) or PEG (ECM) to form a first skin organoid.
  • ECM extracellular matrix
  • ECM PEG
  • Polyethylene glycol comprising a first step of culturing in a first medium with at least one support, and a second step of culturing the first skin organoid in a second medium, thereby comprising a stratum corneum and hair roots on the outside. It can be provided by forming organoids.
  • the method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention can provide two types of skin organoids depending on the presence or absence of hair roots and hair, and the final skin organoid including hair roots and hair is Skin that includes a core densely packed with cells that is structurally and functionally similar to living skin, a stratum corneum formed on the outside of the core, and hair roots, allows cell movement from the core to the stratum corneum, and has a round, three-dimensional shape. It is an organoid.
  • the method for producing skin organoids according to an embodiment of the present invention can form and provide a biological counterpart model whose form and function are very similar to biological skin.
  • the skin organoid formed by the skin organoid production method according to an embodiment of the present invention is structurally, morphologically and physiologically very similar to living skin, and thus has more accurate and reliable stability and toxicity than conventional skin organoids. Evaluation experiment results can be provided.
  • FIG. 10 a flow chart of a drug evaluation method using skin organoids according to an embodiment of the present invention is shown.
  • the drug evaluation method using skin organoids may include the step of processing skin organoids and drugs (S100).
  • the skin organoid used in the drug evaluation method using skin organoids is structurally and functionally (physiologically) similar to living skin, with a core densely packed with cells, and an outer region of the core. It contains a formed stratum corneum and hair roots, allows cell movement from the center to the stratum corneum, and has a round, three-dimensional shape, so it can be used as a bio-mimicking model with higher biocompatibility.
  • the skin organoid of the present invention can be used as a human model in evaluating the side effects, toxicity, and effectiveness of drugs, and can also be used in experiments to determine the safety and effectiveness of skin toxicity of candidate substances during the development of new drugs.
  • drug used in this specification may include all substances used to change or examine physiological systems or disease states for the benefit of living organisms. More specifically, it may include at least one of the group consisting of vitamins, hormones, metal salts, vaccines, antiserum agents, antibiotics, chemotherapy agents, cardiotonic agents, blood pressure regulators, antihistamines, steroids, antidotes, and contrast agents. It is not limited.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

오가노이드를 형성하기 위한 제조 방법에 있어서, 제 1 피부 오가노이드가 형성되도록 피부 세포(primary skin cell)를 ECM(Extracellular matrix) 및 PEG(Polyethylene glycol) 중 적어도 하나의 지지체와 제 1 배지에서 제 1 배양하는 단계, 및 제 1 피부 오가노이드를 제 2 배지에서 제 2 배양하는 단계를 포함하는, 피부 오가노이드 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 명세서에서는 전술한 방법에 의하여 배양된 고밀도로 세포가 밀집된 중심부, 중심부의 외곽에 형성된 각질층 및 모근을 포함하고, 중심부로부터 각질층으로 세포 이동이 가능하고, 둥근 구상의 입체적 형태의 피부 오가노이드 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법에 대하여 제공한다.

Description

피부 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법
본 발명은 생체 피부와 유사한 구조의 피부 오가노이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 외곽의 각질층, 고밀도로 세포가 밀집된 중심 부 및 포근을 포함하고, 중심부로부터 각질층으로 세포 이동이 가능하고, 둥근 구상의 입체적 형태를 가지는 피부 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법에 관한 것이다.
[부처명] (재)경기도경제과학진흥원
[연구사업명] 여성 과학기술인 연구개발 지원사업
[연구과제명] 인간 진피 세포외기질을 이용한 피부 오가노이드 제작 플랫폼 개발
[연구기간] 2023.7.1.~2024.6.30.
신약개발의 초기 단계에서는 정확한 독성 및 유효성 예측을 평가하는 모델이 필요하다. 현 기술로는 동물 모델이 신약의 독성 및 유효성에 대하여 가장 유사하게 모사할 수 있다. 그러나, 동물 실험은 시간, 금전적으로 부담이 크며 종 간의 유전적, 생화학적 및 대사과정의 차이로 인하여 인간의 생체 내 환경을 완전히 반영하기 어렵다. 또한, 기술적으로도 동물 내부에서 일어나는 일을 모니터링하는 것이 어렵고 윤리적으로도 문제가 될 수 있다.
이에, 인간의 조직에서 직접 분리하여 체외 배양된 일차 배양 세포가 표준 모델로 사용되고 있지만, 조직을 얻기에도 어렵고, 조직 세포가 체외에서 증식하지 못하는 실험적 한계가 있다. 나아가, 2차원 세포 기반 모델(cell based in vitro model)은 비용 및 노동력 측면에서 인간의 조직으로부터 유래된 일차 배양 세포보다 효율적이기 때문에 약물 독성 및 유효성 평가에 많이 사용되고 있다. 그러나, 2차원 세포 기반 모델은 세포-세포 및 세포-세포외 기질의 상호 작용으로 발생하는 생리 기능과 조직 복합성을 구현하기엔 불충분하다.
한편, 새로운 인체 모사 모델로 오가노이드가 주목을 받고 있다. 오가노이드란 줄기세포를 특정 세포로 자라게 하여 장기와 같은 입체 구조물로 형성된다. 오가노이드는 2차원의 세포 기반 모델과는 다르게 3차원의 환경에서 배양되어, 보다 장기간으로 배양될 수 있다. 또한, 오가노이드는 크기가 작을 뿐 구성 세포나 구조가 실제 장기와 흡사하다. 이에, 오가노이드는 신약 개발 과정에서 약물의 효능과 안정성을 알아보기에 최적인 실험체로 평가되고 있다. 나아가, 오가노이드 관련 분야는 신약 개발의 약물 독성 및 유효성 평가뿐만 아니라, 질병모델, 암 연구, 맞춤의학 및 재생 치료제 등에도 이용될 수 있는 잠재력이 높은 분야이다.
현재까지 위, 장, 초기 간, 갑상선, 폐, 뇌 등의 다양한 오가노이드가 성공적으로 개발되었다. 그러나, 현재까지 개발된 피부 오가노이드는 생체 피부와 구조적으로 상이한 특성을 나타낸다. 예를 들어, 피부 오가노이드는 각질층 및 표피층이 오가노이드 내부에 생성됨에 따라, 형태적 및 기능적으로 생체 피부와 차이를 가진다. 이에, 종래의 피부 오가노이드는 오가노이드 자체로서 이용되지 못하고 세절되어 다시 세포와 유사한 구조로 사용되고 있음에 따라, 오가노이드로써 약물 및 독성 평가 등에 생체 피부를 대변하지 못하는 한계를 가진다.
따라서, 생체 피부와 같이 각질층 및 표피층이 외부에 생성되어, 형태적 및 기능적으로 유사하게 모사할 수 있는 피부 오가노이드의 개발이 필요한 실정이다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
보다 구체적으로, 종래의 피부 오가노이드는 생체 피부와 다르게 각질층을 포함하는 표피가 조직 내부에 위치한 구조를 가짐에 따라, 세절을 통하여 조직 내부를 외부로 표출시키고 단순히 세포를 적층하여 이용되어 왔다.
또한, 종래의 피부 오가노이드는 혈관세포 및 면역세포 등의 생체 피부 구성 세포를 포함하지 못함에 따라, 생리기능적으로도 생체 피부를 대변하지 못하였다. 이에, 종래의 피부 오가노이드는 단순한 피부 자극 테스트에만 이용되어 왔으며, 약물 및 독성 테스트 등의 물질 유효성 평가 및 피부 재생 평가에는 이용되지 못하였다.
나아가, 종래의 피부 오가노이드는 전술한 구조적 한계에 의하여, 쉽게 일주일 이내의 짧은 배양 기간(유통 기한)을 가졌으며, 이에, 실험 계획의 수립 및 결과 재현에 제한적이여, 장기간의 추적 관찰이 불가하였다.
한편, 본 발명의 발명자들은 생체 피부가 이질성의 다양한 세포를 포함하고 있다는 것을 주목하였다. 보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 생체 피부가 표피, 진피 및 피하 지방층 등으로 이루어져 있으며, 이들은 각각의 특성에 따라 상이한 구성으로 포함한다는 것을 주목하였다. 나아가, 본 발명의 발명자들은 생체 피부의 다양한 구성에 대한 형성이 제한된 배양 환경에서의 줄기세포로는 한계를 가진다는 것을 인지하였다.
이에, 본 발명의 발명자들은 특정 계통으로 분화되는 줄기세포가 아닌 이질성의 1차 피부 세포를 이용할 경우, 표피 및 진피와 같은 피부 세포 구성 분화에 보다 용이하다는 것을 발견하였다.
이에, 본 발명의 발명자들은 이질성의 1차 피부 세포로부터 생체 피부와 구조 및 기능(생리)적으로 유사한 피부 오가노이드 및 이의 제조 방법을 개발하는데 이르렀다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 1차 피부 세포를 생체 피부와 유사한 구조 및 기능을 가지도록 배양할 수 있는, 특정 환경 및 조건의 피부 오가노이드 제조 방법을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 전술한 제조 방법을 통하여 생성되고, 외곽에 각질층(stratum corneum) 및 모근을 포함하여, 생체 피부에 대한 모사도가 향상된 피부 오가노이드 및 이에 따른 약물 평가 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고밀도로 세포가 밀집된 중심부(core), 상기 중심부의 외곽에 형성된 각질층(stratum corneum) 및 모근을 포함하고, 중심부로부터 각질층으로 세포 이동이 가능하고, 둥근 구상의 입체적 형태인, 피부 오가노이드가 제공된다.
본 발명의 특징에 따르면, 각질층은, 1 내지 100 μm 이하의 두께일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 각질층은, KRT10, KRT14 및 Loricrin 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 중심부는, 100 내지 1000 μm의 지름일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 중심부는, VIM(vimentin)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 바와 같은 다른 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 외곽에 각질층(stratum corneum) 및 모근을 포함하는 오가노이드를 형성하기 위한 제조 방법에 있어서, 제 1 피부 오가노이드가 형성되도록 피부 세포(primary skin cell)를 ECM(Extracellular matrix) 또는 PEG(Polyethylene glycol) 중 적어도 하나의 지지체와 제 1 배지에서 제 1 배양하는 단계, 및 제 1 피부 오가노이드를 제 2 배지에서 제 2 배양하는 단계를 포함하는, 피부 오가노이드 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 특징에 따르면, 제 1 배양하는 단계 이전에, 개체로부터 분리된 피부 조직을 세절하는 단계, 및 세절된 피부 조직에 콜라겐분해효소(Collagenase)를 처리하여 이질(heterogeneous)의 피부 세포(primary skin cell)를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 콜라겐분해효소는, Type I Collagenase 및 Type IV Collagenase 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 수득하는 단계는, 1차 피부 세포가 증식(expansion)되도록 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 피부 세포는, 약 100 μm 이하의 크기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 피부 세포는, APOE, COL1A1, CD34, KRT7, KRT10, KRT19, HS3ST6, PECAM1 및 VIM 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, ECM은, 패치(patch) 형태의 ECM(Extracellular matrix) 및 섬유(fiber) 형태의 ECM 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 섬유 형태의 ECM은, 패치 형태의 ECM에 단백질 분해효소(digestive enzyme)를 처리하여 수득될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 섬유 형태의 ECM은, Collagen alpha-1(Ⅰ) chain, Collagen alpha-3(Ⅵ) chain, Collagen alpha-2(Ⅰ) chain, Collagen alpha-2(Ⅵ) chain, Collagen alpha-1(Ⅵ) chain, Keratin type Ⅰcytoskeletal 9, Keratin type Ⅱ cytoskeletal 1, Keratin type Ⅰ cytoskeletal 10, Biglycan, Decorin, Lumican 및 Collagen alpha-1(Ⅲ) chain 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, ECM은, 섬유아세포(fibroblast) 패치가 형성되도록 섬유아세포를 배양하고, 섬유아세포 패치를 탈세포화(decellularization)시켜 수득될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 1 배양하는 단계는, 약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 1 배지는, B-27 보충제(supplement) 및 혈청 대체제 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, B-27 보충제는, 제 1 배지의 총 부피에 대하여 1 내지 10 v/v %일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 혈청 대체제는, 제 1 배지의 총 부피에 대하여 5 내지 15 v/v % 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 2 배양하는 단계는, 약 7일 내지 40일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는 단계일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 2 배지는, 제 1 배지, 아스코르빅산(ascorbic acid), CHIRR99021 및 Wnt 작용제(agonist) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 아스코르빅산은, 제 2 배지 1L를 기준으로 2 내지 500 Mm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 전술한 피부 오가노이드와 약물을 처리하는 단계를 포함하는, 피부 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명은 피부 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법을 제공하여, 신약 개발에 있어 약물에 대한 검증 즉, 유효성, 부작용 및 독성을 평가할 수 있는 효과가 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 생체 피부와 상이한 구조를 가졌던 종래의 오가노이드들과는 생체 피부의 표피에 해당하는 외곽의 각칠증, 진피에 해당하는 중심부, 모근을 포함하는 둥근 구상의 입체적 형태의 피부 오가노이드로써, 생체 피부와 구조적으로 동일한 층 형성을 가질뿐만 아니라, 생리학적으로도 유사한 세포 주기 현상을 포함한다. 이에, 본 발명의 피부 오가노이드는 다양한 물질에 대한 피부의 구조적 및/또는 생리학적 이상을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 피부 오가노이드는, 생체 피부와 기능적 및 구조적으로 유사한 인체 모사 모델로서 약물의 부작용, 독성 및 유효성 평가에 이용될 수 있다.
나아가, 본 발명의 피부 오가노이드는 신약 개발에 있어 약물 후보 물질 스크리닝에 활용되어 소요되는 비용 및 시간을 획기적으로 줄일 수 있으며, 피부암의 생리학적 연구 및 임상시험에 활용될 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 발명의 다양한 원인에 대한 실험이 가능하여 불필요한 약의 복용을 막아 치료에 대한 비용을 줄일 수 있는 개인별 맞춤 진단에 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법의 절차를 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서의 피부 세포를 수득하는 단계의 절차에 대한 예시도가 도시한 것이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서 이용되는 1차 피부 세포에 대한 단일 세포 전사체 (single cell transcription) 분석 결과가 도시한 것이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서의 제 1 배양하는 단계의 절차에 대한 예시도가 도시한 것이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서 이용되는 ECM의 형성 과정에 대한 예시도가 도시한 것이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서 이용되는 섬유 형태의 ECM에 대한 단백질 성분 분석 결과가 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드에 대한 현미경 이미지가 도시한 것이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드의 LOR 및 KRT10 마커에 대한 염색 이미지가 도시한 것이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드의 KRT14 마커에 대한 염색 이미지가 도시한 것이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드의 VIM 마커에 대한 염색 이미지가 도시한 것이다.
도 7는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드의 각질층에 대한 현미경 이미지가 도시한 것이다.
도 8는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드의 크기에 대한 현미경 이미지가 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 2 피부 오가노이드에 대한 현미경 이미지가 도시한 것이다.
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법에 대한 흐름도가 도시한 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은, 당업자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 보통의 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 "약" 값 또는 파라미터 지칭은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 실시예를 포함한다. 나아가, 용어 "약" 은 문맥으로부터 달리 언급되거나 달리 명백하지 않는 한 언급된 참조 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 10 % 내에 해당하는 값의 범위를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "환자 또는 개체"는, 상호교환적으로 사용되고 치료가 요구되는 임의의 단일 동물, 더 바람직하게는 포유동물 (그와 같은 비-인간 동물, 예를 들어, 고양이, 개, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양, 및 비-인간 영장류 포함)을 지칭한다. 본 명세서의 다양한 실시예에서 지칭하는 환자는 인간일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "분화(Differentiation)"는 세포가 특별한 기능을 갖는 특정한 세포나 조직의 복합체 또는 개체의 수준으로 발달하는 것을 의미한다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, "오가노이드"는 조직 또는 기관의 형태와 기능 모두를 재현하는 작은 배양체를 의미한다. 보다 구체적으로, 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하고 있어야 하며, 각 기관이 갖는 특수한 기능을 재현할 수 있어야 하며, 세포들끼리 서로 뭉쳐서 공간적으로 기관과 유사한 형태로 조직되어야 한다. 이러한, 오가노이드는 단순한 세포들의 집합체가 아닌 계통을 이루고 있다는 점에서 스페로이드(speroid)와 차이를 가지며, 신약 개발, 인공 장기, 질병 치료제 및 질병 치료를 위한 환자별 모델로 이용될 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어 "배지"는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(In vitro)에서 다양한 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다.
이때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM) "은 세포의 증식, 분화 및 사멸 등의 여러가지 세포 대사경로에서 영향을 미치는 신호를 제공하는데 중요한 역할을 하는 3차원 구조의 조직의 발달에 지지체를 의미한다. 세포외 기질은 세포가 성장하고 분화하는데 필요한 화학적 인자(biochemical factors)들을 저장하고, 공급해줌과 동시에 세포가 인식할 수 있는 물리적 환경을 제공할 수 있다. 세포외 기질은 각 조직을 구성하는 세포들이 필요에 의해서 만들어낸 산물로서, 콜라겐(collagen) 및 엘라스틴(elastin)과 같은 구조체 단백질(structural protein), GAG(glycosaminoglycan)과 같은 다당류, 세포의 부착을 돕는 부착 단백질(adhesive proteins) 및 성장인자들을 포함하고 있다. 이러한, 세포외 기질은 유래되는 조직 및 세포에 따라 서로 다른 성분으로 구성되어 있으며, 특수한 물리적 성질을 지니고 있다.
실시예 1. 피부 오가노이드의 제조 방법 및 이에 따른 피부 오가노이드
이하에서는 도 1 내지 6을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드의 제조 방법 및 이에 따른 피부 오가노이드의 형성 과정에 대하여 구체적으로 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다. 이때, 설명의 편의를 위하여, 도 2a 내지 6을 참조하여 설명하도록 한다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법은, 외각에 각질층(stratum corneum) 및 모근을 포함하는 오가노이드를 형성하기 위한 제조 방법으로써, 제 1 피부 오가노이드가 형성되도록 피부 세포(primary skin cell)를 ECM(Extracellular matrix) 또는 PEG(Polyethylene glycol) 중 적어도 하나의 지지체와 제 1 배지에서 제 1 배양하는 단계 및 제 1 피부 오가노이드를 제 2 배지에서 제 2 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
먼저, 제 1 배양하는 단계에서 이용되는 피부 세포는 개체로부터 분리된 피부 조직으로부터 수득된 1차 피부 세포(primary skin cell)을 의미할 수 있다. 예를 들어, 제 1 배양하는 단계에서 이용되는 피부 세포는 피부 조직을 효소적 방법을 이용하여 세포 단위로 해리시키고, 이를 배양 용기에서 생장시켜 수득될 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법은 제 1 배양하는 단계 이전에, 피부 세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 도 2a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서의 피부 세포를 수득하는 단계의 절차에 대한 예시도가 도시된다.
먼저, 도 2a의 (a)를 참조하면, 피부 세포를 수득하는 단계는 개체로부터 분리된 피부 조직(human skin biopsy)을 세절(chopping or cutting)하는 단계, 세절된 조직을 효소적인 방법을 이용하여 세포로 해리(enzymatix dissociation)하는 단계 및 해리된 세포가 증식되도록 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
개체로부터 분리된 피부 조직은 개체의 얼굴 및 팔 등 부위에 제약없이 다양한 부위가 모두 이용될 수 있다.
세절하는 단계의 세절은 전단력(shear force)과 같은 물리적인 힘이 가해져 조직의 크기를 감소시킬 수 있는 방법을 모두 포함할 수 있으며, 수술용 칼이나 쵸퍼(chopper) 등이 다양한 기구가 이용될 수 있다.
해리하는 단계에서 이용되는 효소는 콜라겐분해효소(collagenase)로서, Type I Collagenase 및 Type IV Collagenase 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 콜라겐과 같은 세포 및/또는 조직을 연결 및 지지할 수 있는 지지 물질을 용해 및 분해(해리)할 수 있는 모든 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 해리하는 단계에서 이용되는 효소는 콜라겐분해효소뿐만 아니라, 디스페이즈(Dispase), 프로테아제(Protease) 및 트립신(Trypsin) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
해리하는 단계에서 수득된 세포는 1차 피부 세포(primary skin cell)일 수 있으며, 이는 바로 오가노이드 형성에 이용될 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서 오가노이드 형성에 이용되는 피부 세포는 효소적인 방법을 통하여 획득된 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 균일한 세포 공급을 위하여, 이를 배양한 뒤 사용될 수 있다.
이에, 배양하는 단계에서는 해리하는 단계로부터 수득한 1차 피부 세포가 10 %의 FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 배지에서 증식(expansion)되도록 배양될 수 있다.
결국, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법은 오가노이드의 재료 세포인 1차 피부 세포를 생산하는 단계 즉, 제 1 배양하는 단계 이전에, 개체로부터 분리된 피부 조직을 세절하는 단계, 및 세절된 피부 조직에 콜라겐분해효소(Collagenase)를 처리하여 이질(heterogeneous)의 피부 세포(primary skin cell)를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 나아가, 수득하는 단계는 1차 피부 세포가 증식(expansion)되도록 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 도 2a의 (b)를 참조하면, 전술한 과정에 의하여 수득된 1차 피부 세포에 대한 현미경 이미지가 도시된다.
1차 피부 세포(skin cells)는 핵을 포함한 핵 주위(peri-nucleus)가 검고 사이즈가 약 100 μm 이하의 작은 크기를 가지는 것으로 것으로 나타나며, 본 발명의 1차 피부 세포는 방추(spindle) 형태의 약 100 μm 이상의 크기를 가지는 섬유아세포(fibroblasts)와 형태학적(morphological)으로 차별성을 가진다.
나아가, 본 발명의 1차 피부 세포는 섬유아세포 및 일반적으로 오가노이드 생산에 이용되는 특정 계통의 줄기세포들과 달리 이질성을 가질 수 있다.
보다 구체적으로, 도 2b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서 이용되는 1차 피부 세포에 대한 단일 세포 전사체 (single cell transcription) 분석 결과가 도시된다.
본 발명의 1차 피부 세포는 총 4개의 그룹(group 1, group 2, group 3, group 4)으로 나뉠 수 있으며, 그룹 1(group 1)은 피부의 표피층 및 각질층 구성과 관련된 KRT7 및 HS3ST6를 특이적으로 발현하는 피부 세포(KRT7+ HS3ST6+ skin cells)인 것으로 나타나며, 그룹 2 및 3은 혈관성 피부 세포(vasculogenic skin cells)인 것으로 나타난다.
이때, 그룹 2 및 3에 대한 세포는 혈관성 피부 세포임에 따라, 세포 성장 시 오가노이드에서 피부 내 혈관을 구성할 수 있다.
VIM(vimentin)은 피부 내부의 섬유아세포 즉, 진피 섬유아세포 마커로써, 세포 골격 및 세포 지지 등에 관여하는 구조적 단백질이다. VIM은 1, 2, 3과 4 그룹 모두에서 과발현되는 것으로 나타나며, 모든 그룹의 세포들은 모두 비멘틴과 같은 구조적 단백질 및 이에 따른 세포 각질을 생성할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
COL1A1은 각질 세포에서 발현되는 마커로써, 뼈, 연골, 기저막 등 체내 다양한 부위에 포함되며, 상피조직의 기저막에 분포하여 피부 세포 지지 등에 관여하는 구조적 단백질인 콜라겐(Collagen)과 관련될 수 있다. COL1A1은 모든 세포 그룹에서 과발현되는 것으로 나타나며, 이는 배양된 피부세포가 모두 콜라겐 및 이에 따른 세포 각질을 생성할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
KRT10은 각질 세포에서 특이적으로 발현되는 마커로써, 털, 손톱 및 피부 등 상피 구조 형성에 관여하는 경단백질인 케라틴(keratin)과 관련될 수 있다. KRT10은 모든 세포그룹에서 과발현되는 것으로 나타나며, 배양된 피부세포들은 모두 케라틴 및 이에 따른 세포 각질을 생성할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
KRT7 및 KRT19은 각질 세포에서 특이적으로 발현되는 마커로써, 털, 손톱 및 피부 등 상피 구조 형성에 관여하는 경단백질인 케라틴(keratin)과 관련될 수 있다. KRT7 및 KRT19은 1 그룹에서 과발현되는 것으로 나타나며, 1 그룹의 세포들은 케라틴 성분의 각질 세포를 포함하는 상피 구조를 생성(형성)할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
HS3ST6은 진피, 세포외 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 당단백질 등에 관련될 수 있다. HS3ST6은 1 그룹에서 과발현되는 것으로 나타나며, 1 그룹의 세포들은 진피 세포, 프로테오글리칸 및 당단백질 중 적어도 하나에 대한 구성을 생성할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
CD34는 혈관 및 피부 세포 등 다양한 세포에서 발현되는 마커로써, 막관통 단백질(transmembrane protein)과 관련될 수 있다. CD34은 2 및 3 그룹에서 과발현되는 것으로 나타나며, 2 및 3 그룹의 세포들은 막관통 단백질 및 이와 관련된 물질을 생성할 수 있으며, 나아가 피부 내 혈관 등을 형성할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
APOE은 각질 세포의 구성 중 하나인 아포지단백(Apolipoprotein)에 관련될 수 있다. APOE은 2 내지 3 그룹에서 과발현되는 것으로 나타나며, 2 내지 3 그룹의 세포들은 모두 각질 세포의 구성 중 하나인 아포지단백, 진피층과 관련된 지방층을 생성(형성)할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
PECAM1은 진피, 혈관 및 내피 세포에서 발현되는 마커로써, 상피성 세포와 관련될 있다. PECAM1은 2 및 3 그룹에서 과발현되는 것으로 나타나며, 2 및 3 그룹의 세포들은 피부 내 혈관, 내피 세포와 같은 상피성 세포 및 구조를 생성(형성)할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서 이용되는 1차 피부 세포는 VIM, COL1A1, KRT10, KRT7, KRT19, HS3ST6, CD34, APOE 및 PECAM1 중 적어도 하나를 발현하는 이질성(Heterogeneity)의 세포 그룹을 의미할 수 있다. 나아가, 생체 기관을 모사하는 오가노이드는 다양한 이질성의 세포들을 포함하는 유사체이다. 이에, 이질성의 단백질 발현이 가능한 본 발명의 1차 피부 세포는 다양한 이질성의 세포들을 발현시켜 생체 내 피부와 유사하도록 유사체(오가노이드)를 형성할 수 있다.
결국, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법은 생체 피부와 유사한 구조 즉, 피부 장벽인 각질층을 포함하는 표피, 혈관 및 모근 등을 포함하는 진피 및 지방 등을 포함하는 피하 조직 전층(full skin)을 포함하는 피부 오가노이드를 생산함을 목적함에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서 이용되는 피부 세포는 표피, 진피, 피하 조직에 대한 구성 단백질을 발현할 수 있는 본 발명의 1차 피부 세포가 피부 오가노이드 형성에 가장 바람직할 수 있다.
다시, 도 1을 참조하면, 제 1 배양하는 단계는 1차 피부 세포로부터 각질층을 포함하는 제 1 피부 오가노이드가 형성되도록 배양하는 단계를 의미할 수 있다.
보다 구체적으로, 도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서의 제 1 배양하는 단계의 절차에 대한 예시도가 도시된다.
본 발명의 제 1 배양하는 단계에서는 1차 피부 세포가 지지체와 제 1 배지에서 배양될 수 있다.
이때, 제 1 배지는 B-27 보충제(supplement) 및 혈청 대체제(serum replacement) 중 적어도 하나를 포함하는 배지일 수 있다.
B-27 보충제(supplement)는 성장 인자로서, 세포의 생존율 및 성숙도를 향상시킬 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서의 B-27 보충제는, 제 1 배지의 총 부피에 대하여 1 내지 10 v/v %일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
혈청 대체제(serum replacement)는, 세포의 성장을 촉진시킬 수 있으며, 화학적으로 규명된 성분을 포함하는 혈청 대체제(chemically-defined serum replacement)를 의미할 수 있다. 이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서의 혈청 대체제는 상업적으로 이용되는 혈청 대체제가 이용될 수 있으며, 제 1 배지의 총 부피에 대하여 5 내지 15 v/v %일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 10 v/v %일 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서는 화학적으로 규명된 성분의 혈청 대체제를 포함함에 따라, 종래의 FBS와 같이 불명확한 성분에 의하여 원치 않은 자극이 유도되는 한계를 극복하고, 보다 안정적으로 세포를 배양할 수 있다.
그러나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 제 1 배지에서의 혈청 대체제는 화학적으로 규명된 성분의 혈청 대체제 뿐만 아니라, BCS(Bovine calf serum)와 같은 동물 유래 물질이 이용될 수 있다. 예를 들어, BCS(Bovine calf serum)는 우아 혈청을 의미하며, 16개월된 송아지에서 혈청을 채취한 것으로 세포 증식 및 성장에 필요한 다양한 항체 및 호르몬을 포함하고 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서의 BCS는 제 1 배지의 총 부피에 대하여 5 내지 15 v/v %일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 10 v/v %일 수 있다. 한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서는 제 1 배지의 조성물로서, BCS 뿐만 아니라, 다양한 혈청이 이용될 수 있으며, 예를 들어, 본 발명의 제 1 배지는 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 투석 우태아 혈청(dialyzed fetal bovine serum), 신생 우아 혈청(Newborn Calf Serum, NCS), 철 보충 우아 혈청(Iron supplemented bovine serum), 챠콜 여과된 혈청(charcoal stripped serum), 탈지된 혈청(De-lipidated serum), 사람 혈청(human serum), 말 혈청(horse serum) 및 성체 소 혈청(adult bovine serum) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법의 제 1 배지에서 이용되는 바람직한 혈청은 화학적으로 규명된 성분의 혈청 대체제일 수 있다.
나아가, 제 1 배지는 동물세포를 유지 및 성장시키기 위해 사용되는 인슐린을 포함하지 않은 천연 또는 인공의 무혈청 배지를 기본 배지로 포함할 수 있으며, 인슐린을 포함하지 않는 최소 필수 배지(Minimal essential medium, MEM), 이글 최소 필수 배지(Eagle's MEM), 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), Ham's F12, SF 12 및 RPMI 1640 등과 같은 다양한 무혈청 배지 및 이들의 변이형을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인슐린을 포함하지 않고, DMEM 및 Ham's F12가 1:1의 비율로 혼합된 DMEM/F12일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 본 발명의 제 1 배양하는 단계에서는 지지체가 이용될 수 있으며, 지지체는 ECM(Extracellular matrix) 또는 PEG(Polyethylene glycol)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 다양한 형태의 지지체가 이용될 수 있다. 예를 들어, ECM은 패치(patch) 형태의 ECM(Extracellular matrix) 및 섬유(fiber) 형태의 ECM 중 적어도 하나를 포함할 수 있으며, 이때, 섬유 형태의 ECM은 패치 형태의 ECM에 단백질 소화효소(digestive enayme)를 처리하여 수득될 수 있다.
보다 구체적으로, 도 4a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서 이용되는 ECM의 형성 과정에 대한 예시도가 도시된다.
본 발명의 ECM은 섬유아세포(fibroblast)로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서의 ECM은 섬유아세포가 활성화(activation)되어 패치(patch)를 형성하도록 인간 진피 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast, HDF)를 배양하고, 형성된 섬유아세포 패치를 탈세포화(decellularization)시켜 수득될 수 있다.
섬유아세포 패치를 탈세포화시켜 수득된 ECM은 그물망 구조의 패치 형태(hSkin-ECM Patch)으로 본 발명의 제 1 배양하는 단계에서 이용될 수 있다. 나아가, 패치 형태의 ECM은 단백질 분해효소 처리에 의하여 섬유(fiber) 형태의 ECM으로 변환될 수 있으며, 섬유 형태의 ECM 또한, 본 발명의 제 1 배양하는 단계에서 이용될 수 있다. 이때, 단백질 분해(소화)효소는 펩신(pepsin)이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 단백질을 분해할 수 있는 다양한 분해효소가 이용될 수 있다.
이러한, 패치(patch) 형태의 ECM(Extracellular matrix) 및 섬유(fiber) 형태의 ECM은 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서 자유롭게 선택되어 이용될 수 있으나, 바람직하게는 섬유 형태의 ECM일 수 있다.
보다 구체적으로, 도 4b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에서 이용되는 섬유 형태의 ECM에 대한 단백질 성분 분석 결과가 도시된다. 이때, 단백질 성분 분석은 액체 크롸토그래피 질량분석기(Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)에 의해 분석되었다.
본 발명의 섬유 형태의 ECM은 Collagen alpha-1(Ⅰ) chain, Collagen alpha-3(Ⅵ) chain, Collagen alpha-2(Ⅰ) chain, Collagen alpha-2(Ⅵ) chain, Collagen alpha-1(Ⅵ) chain, Keratin type Ⅰcytoskeletal 9, Keratin type Ⅱ cytoskeletal 1, Keratin type Ⅰ cytoskeletal 10, Biglycan, Decorin, Lumican 및 Collagen alpha-1(Ⅲ) chain을 포함하고 있는 것으로 나타난다.
이들은 피부의 결합 조직과 관련된 경단백질로서, 모두 1 % 이상의 고함량으로, 전체 ECM의 95.12 %를 차지하는 것으로 나타난다. 이러한, 특정 12종의 단백질을 고함량으로 포함하는 섬유 형태의 ECM은 단백질 분해효소에 의하여 패치 형태의 ECM과 조성이 다를 수 있으며, 이에, 섬유 형태의 ECM은 넓은 표면적 및 차별화된 특정 단백질 조성을 포함함에 따라, 피부 세포로부터 오가노이드를 보다 빠르게 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법의 제 1 배양하는 단계에서 이용되는 ECM은 바람직하게 섬유 형태의 ECM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 패치 형태 또는, 패치 형태와 섬유 형태의 ECM이 혼용된 형태가 자유롭게 선택되어 사용될 수 있다.
다시, 도 3을 참조하면, 일반적으로 세포는 배양액의 성분과 생체 내 조건과 유사한 ECM(세포외 기질)에 따라, 증식 및 성장의 방향이 결정되며, 특정 조건의 환경을 조성해주어야 원하는 방향의 오가노이드로 성장이 가능할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법은 전술한 바와 같이 특정 조성 및 농도의 제 1 배양 배지 및 특정 형태의 ECM을 포함함에 따라, 생체 내 피부와 구조적으로 유사한 제 1 피부 오가노이드를 형성할 수 있다.
본 발명의 제 1 배양하는 단계에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드는 및 고밀도로 세포가 밀집된 중심부(core) 및 중심부의 외곽에 형성된 각질층(stratum corneum)를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 도 5를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드에 대한 현미경 이미지가 도시된다.
본 발명의 제 1 피부 오가노이드는 둥근 구상의 입체적 형태를 가지며, 최외곽에 상대적으로 밀집도가 낮은 각질층(stratum corneum)을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드는 층상 구조로서, 각질층 하부에 고밀도로 세포가 밀집된 중심부(core)를 포함할 수 있다. 이때, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드의 각질층은 각질층을 포함하는 표피(epidermis)층을 의미할 수 있다.
이러한, 제 1 피부 오가노이드의 층상 구조는 각질층이 외부에 존재하고, 각질층 하부에 표피가 존재하고, 진피가 내부에 존재하는 생체 피부와 매우 유사한 구조인 것으로 나타난다.
보다 구체적으로, 도 6a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드의 LOR 및 KRT10 마커에 대한 염색 이미지가 도시된다. 피부 각질의 껍질을 구성하는 단백질인 로리크린(loricrin) 및 케라틴 유형 Ⅰ 세포골격 10(Keratin type Ⅰ cytoskeletal 10)은 제 1 피부 오가노이드 최외곽에 발현하는 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드는 최외곽에 즉, 껍질에 각질층을 포함하며, 이는 생체 피부와 유사한 구조를 가진다는 것을 의미할 수 있다.
더 나아가, 도 6b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드의 KRT14 마커에 대한 염색 이미지가 도시된다. 각질 및 표피 세포에 대한 마커인 KRT14은 제 1 피부 오가노이드 표면 즉, 전술한 도 6a에서의 LOR 및 KRT10 마커 발현층 하부에 발현하는 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드는 표면에 각질층 및 표피층을 포함하며, 이는 생체 피부와 유사한 구조를 가진다는 것을 의미할 수 있다.
더 나아가, 도 6c를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드의 VIM 마커에 대한 염색 이미지가 도시된다. 피부 내부의 섬유아세포 즉, 진피에 대한 마커인 VIM은 제 1 피부 오가노이드의 내부 즉, 전술한 도 6b에서의 KRT14 마커 발현층 하부에 발현하는 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드는 내부에 진피층에 해당하는 중심부를 포함하며, 이는 생체 피부와 유사한 구조를 가진다는 것을 의미할 수 있다.
따라서, 본 발명의 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드는 생체 피부를 구조적으로 매우 유사하게 모사한 입체적 형태의 피부 오가노이드이다.
나아가, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드는 생리학적으로도 생체 피부와 매우 유사할 수 있다. 보다 구체적으로, 도 7을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드의 각질층에 대한 현미경 이미지가 도시된다.
도 7의 (a)를 참조하면, 제 1 피부 오가노이드의 중심부 경계면에 분포되어 있는 세포는 오가노이드의 최외곽의 각질층으로 이동할 수 있는 것으로 나타나며, 도 7의 (b)를 참조하면, 이동된 세포는 사멸하여 제 1 피부 오가노이드의 최외곽에 분포하는 것으로 나타난다.
이러한 세포의 이동 및 최외곽 층에서의 세포 사멸 현상은, 기저층의 표피 세포가 점차 상층부로 밀려나 각질층에 도달하여 사멸되는 피부 세포의 생리와 유사한 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드는 피부의 재생주기와 같은 생체 피부에 대한 생리적 기능을 가진다는 것을 의미할 수 있으며, 이에 따라, 생체 피부에 대한 생리적 기능을 대변할 수 있다.
한편, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드의 크기는 약 100 내지 3000 μm의 크기를 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 도 8을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드의 크기에 대한 현미경 이미지가 도시된다.
본 발명의 제 1 피부 오가노이드의 중심부는 2일 동안 배양될 경우, 500 μm 이상 지름을 가지는 것으로 나타나며, 각질층은 약 100 μm 이하의 두께인 것으로 나타난다.
나아가, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드가 5일 동안 배양될 경우, 중심부의 지름은 2일차 때 보다 길어진 것으로 나타나며, 각질층의 두께는 2일차 때 보다 두꺼워진 것으로 나타난다.
즉, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드는 3일 이상 배양되어, 지속적으로 성장할 수 있다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 1 피부 오가노이드는 바람직하게 약 100 내지 1000 μm 지름의 중심부 및 1 내지 100 μm 이하 두께의 각질층을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 다시 도 3을 참조하면, 전술한 크기를 가지는 제 1 피부 오가노이드는 제 1 배양하는 단계의 기간 즉, 약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양되어 형성될 수 있으며, 약 100 내지 1000 μm 지름의 중심부 및 1 내지 100 μm 이하 두께의 각질층을 포함하는 약 1,100 μm의 지름의 크기를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에, 전술한 크기의 제 1 피부 오가노이드는 약 1,100 μm 이하의 크기를 가짐에 따라, 96 웰 플레이트(96 plate well) 및 마이크로 튜브(micro tube) 등 상업적으로 이용되는 다양한 세포 용기에 보관되어 이용될 수 있다.
결국, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드는 제 1 배양 시작 1시간 이후부터 형성될 수 있으며, 제 1 피부 오가노이드를 형성하는 제 1 배양하는 단계는 약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는 단계일 수 있으나, 가장 바람직한 배양 기간은 약 2일(약 48시간)의 기간일 수 있다.
한편, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드는 상업적으로 이용되거나 또는 보관에 용이하기 위하여, 세포에 보관되기 용이한 약 1,100 μm 이하의 크기가 바람직할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 제 1 피부 오가노이드는 3일 이상 배양이 가능하며, 이에 따라, 보다 다양한 크기 및 추가적인 생체 모사 구조를 가질 수 있다.
보다 구체적으로, 다시 도 1을 참조하면, 제 1 배양하는 단계를 통하여 형성된 제 1 피부 오가노이드는 제 2 배양하는 단계를 통하여 모근이 형성되어, 모근을 포함하는 제 2 피부 오가노이드로 배양될 수 있다. 즉, 제 2 배양하는 단계는 제 1 피부 오가노이드로부터 모근을 포함하는 제 2 피부 오가노이드가 형성되도록 배양하는 단계를 의미할 수 있다.
이때, 제 1 피부 오가노이드는 제 2 배지에서 배양될 수 있다. 보다 구체적으로, 제 2 배지는 제 1 배지, 아스코르빅산(ascorbic acid), CHIRR99021 및 Wnt 작용제(agonist) 중 적어도 하나를 포함하는 배지일 수 있다.
아스코르빅산(Ascorbic acid)는 산화방지제로 procollagen 합성에 관여하며, type 1 콜라겐 생산의 증가와 관련된 보조인자(Cofactor)이다. 아스코르빅산은 in vitro에서 지방세포, 조골세포, 연골세포와 같은 다양한 세포 증식을 자극 및 조절할 수 있다. 나아가, 피부 세포 배양 배지에 특정 농도의 아스코르빅산을 첨가할 경우, 세포 성장 촉진제로 작용하여 세포의 증식력이 증가되고, DNA의 합성까지 촉진시킬 수 있다. 그러나, 아스코르빅산의 농도가 적절하지 못할 경우, 오히려 세포의 증식력을 억제시키고, 세포 독성(Cytotoxic)을 가짐으로 세포 자살(Apoptosis)를 일으킬 수 있다. 이에, 본 발명의 제 2 배지에서 이용되는 적정 아스코르빅산의 농도는 제 2 배지 1L를 기준으로 2 내지 500 mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 전술한 농도의 아스코르빅산을 첨가할 경우, 피부 오가노이드 세포의 증식력을 향상시킬 수 있다.
CHIRR99021은 GSK(Glycogen synthase kinase)-3β의 활성을 억제하는 물질이다. 보다 구체적으로, GSK-3β가 억제됨에 따라 세포 증식에 관여하는 신호전달체계의 ß-catenin이 GSK-3β에 의해 분해되지 않아 세포 증식에 관여하는 유전자 발현량이 증가되어, 세포의 생존 및 증식이 향상될 수 있다.
Wnt 작용제(agonist)는 신호 전달 경로 활성화를 위한 물질로서, 오가노이드 세포 내 신호 전달 시스템에 기여하는 Wnt 단백질을 활성화하여, 이의 대사를 증진시킴으로써, 피부 오가노이드의 성장을 보다 활발히 촉진시킬 수 있다. 즉, Wnt 작용제의 첨가를 통하여 피부 오가노이드의 크기를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 제 2 배양하는 단계는 약 7일 내지 40일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는 단계일 수 있으며, 제 2 배양하는 7일 이후부터 제 1 피부 오가노이드는 모근을 포함하는 제 2 피부 오가노이드로 성장된다.
보다 구체적으로, 도 9를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 제 2 피부 오가노이드에 대한 현미경 이미지가 도시된다.
제 1 배양하는 단계 및 제 2 배양하는 단계를 포함하여 10일 동안 배양된 제 2 피부 오가노이드는 모근(hair root) 유사 구조이 형성된 것으로 나타난다. 나아가, 제 2 피부 오가노이드는 각질층에 일부 모간(hair shaft)이 도출된 것으로 나타남에 따라, 모발(hair)을 포함한 것으로 나타난다.
즉, 본 발명의 제 2 피부 오가노이드는 모근 및 모발을 포함하며, 체모 및 두발이 형성될 수 있는 피부를 구조적으로 모사 및 대변할 수 있다.
다시 도 1을 참조하면, 이상의 과정에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법은 제 1 피부 오가노이드가 형성되도록 피부 세포(primary skin cell)를 ECM(Extracellular matrix) 또는 PEG(Polyethylene glycol) 중 적어도 하나의 지지체와 제 1 배지에서 제 1 배양하는 단계, 및 제 1 피부 오가노이드를 제 2 배지에서 제 2 배양하는 단계를 포함함으로써, 외곽에 각질층(stratum corneum) 및 모근을 포함하는 오가노이드를 형성하여 제공할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법은 모근 및 모발의 유무 여부에 따라 2가지 형태의 피부 오가노이드를 제공할 수 있으며, 모근 및 모발을 포함하는 최종 피부 오가노이드는 생체 피부와 구조적 기능적으로 유사한 고밀도로 세포가 밀집된 중심부(core), 중심부의 외곽에 형성된 각질층(stratum corneum) 및 모근을 포함하고, 중심부로부터 각질층으로 세포 이동이 가능하고, 둥근 구상의 입체적 형태인 피부 오가노이드이다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법은 형태 및 기능이 생체 피부와 매우 유사한 생체 대응 모델을 형성하여 제공할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드 제조 방법에 의하여 형성된 피부 오가노이드는 생체 피부와 구조형태적 및 생리적으로 매우 유사함에 따라, 종래의 피부 오가노이드보다 정확하고 신뢰도 높은 안정성 및 독성 약물 평가 실험 결과를 제공할 수 있다.
예를 들어, 도 10을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법에 대한 흐름도가 도시된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법은 피부 오가노이드와 약물을 처리하는 단계(S100)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 피부 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법에서 이용되는 피부 오가노이드는 생체 피부와 구조 및 기능(생리학)적으로 유사하게 고밀도로 세포가 밀집된 중심부(core), 중심부의 외곽에 형성된 각질층(stratum corneum) 및 모근을 포함하고, 중심부로부터 각질층으로 세포 이동이 가능하고, 둥근 구상의 입체적 형태임에 따라, 보다 생체 대응성이 높은 생체 유사 모델로 이용될 수 있다.
즉, 본 발명의 피부 오가노이드는 약물에 대한 부작용, 독성 및 유효성 평가에 있어 인체 모사 모델로 이용될 수 있으며, 신약 개발 과정에서 후보물질의 피부 독성에 대한 안정성 및 효과 판별 실험에도 사용될 수 있다.
이때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "약물"은, 생물의 이익을 위해 생리적 시스템 또는 질병 상태를 변화시키거나 검토하기 위해서 사용되는 모든 물질을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 비타민제, 호르몬제, 금속염류, 백신, 항혈청제, 항생제, 화학요법제제, 강심제, 혈압조절제, 항히스타민제, 스테로이드제, 해독제 및 조영제로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 피부 오가노이드를 약물과 함께 플레이트에서 반응시킨 뒤, 이의 상태를 현미경적 방법으로 관찰하거나, 단백질 분석 등을 통하여 이의 변화를 확인할 수 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] 1425164801
[과제번호] S3222933
[부처명] 중소벤처기업부
[과제관리(전문)기관명] 중소기업기술정보진흥원
[연구사업명] 창업성장기술개발
[연구과제명] 오가노이드 전용 one-step 조직투명화 용액
[기여율] 1/1
[과제수행기관명] 오알지(주)
[연구기간] 2022.05.02 ~ 2023.05.01

Claims (23)

  1. 고밀도로 세포가 밀집된 중심부(core);
    상기 중심부의 외곽에 형성된 각질층(stratum corneum); 및
    모근을 포함하고,
    상기 중심부로부터 상기 각질층으로 세포 이동이 가능하고,
    둥근 구상의 입체적 형태인, 피부 오가노이드.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 각질층은,
    1 내지 100 μm 이하의 두께인, 피부 오가노이드.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 각질층은,
    KRT10, KRT14 및 Loricrin 중 적어도 하나를 포함하는, 피부 오가노이드.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 중심부는,
    100 내지 1000 μm의 지름인, 피부 오가노이드.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 중심부는,
    VIM(vimentin)을 포함하는, 피부 오가노이드.
  6. 외곽에 각질층(stratum corneum) 및 모근을 포함하는 피부 오가노이드를 형성하기 위한 제조 방법에 있어서,
    제 1 피부 오가노이드가 형성되도록 피부 세포(primary skin cell)를 ECM(Extracellular matrix) 또는 PEG(Polyethylene glycol) 중 적어도 하나의 지지체와 제 1 배지에서 제 1 배양하는 단계, 및
    상기 제 1 피부 오가노이드를 제 2 배지에서 제 2 배양하는 단계를 포함하는, 피부 오가노이드 제조 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 제 1 배양하는 단계 이전에,
    개체로부터 분리된 피부 조직을 세절하는 단계, 및
    세절된 상기 피부 조직에 콜라겐분해효소(Collagenase)를 처리하여 이질(heterogeneous)의 피부 세포(primary skin cell)를 수득하는 단계를 더 포함하는, 피부 오가노이드 제조 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 콜라겐분해효소는,
    Type I Collagenase 및 Type IV Collagenase 중 적어도 하나를 포함하는, 피부 오가노이드 제조 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 수득하는 단계는,
    상기 1차 피부 세포가 증식(expansion)되도록 배양하는 단계를 더 포함하는, 피부 오가노이드 제조 방법.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 피부 세포는,
    약 100 μm 이하의 크기인, 피부 오가노이드 제조 방법.
  11. 제 6항에 있어서,
    상기 피부 세포는,
    APOE, COL1A1, CD34, KRT7, KRT10, KRT19, HS3ST6, PECAM1 및 VIM 중 적어도 하나를 포함하는, 피부 오가노이드 제조 방법.
  12. 제 6항에 있어서,
    상기 ECM은,
    패치(patch) 형태의 ECM(Extracellular matrix) 및 섬유(fiber) 형태의 ECM 중 적어도 하나를 포함하는, 피부 오가노이드 제조 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 섬유 형태의 ECM은,
    상기 패치 형태의 ECM에 단백질 분해효소(digestive enzyme)를 처리하여 수득된, 피부 오가노이드 제조 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 섬유 형태의 ECM은,
    Collagen alpha-1(Ⅰ) chain, Collagen alpha-3(Ⅵ) chain, Collagen alpha-2(Ⅰ) chain, Collagen alpha-2(Ⅵ) chain, Collagen alpha-1(Ⅵ) chain, Keratin type Ⅰcytoskeletal 9, Keratin type Ⅱ cytoskeletal 1, Keratin type Ⅰ cytoskeletal 10, Biglycan, Decorin, Lumican 및 Collagen alpha-1(Ⅲ) chain 중 적어도 하나를 포함하는, 피부 오가노이드 제조 방법.
  15. 제 6항에 있어서,
    상기 ECM은,
    섬유아세포(fibroblast) 패치가 형성되도록 섬유아세포를 배양하고,
    상기 섬유아세포 패치를 탈세포화(decellularization)시켜 수득된, 피부 오가노이드 제조 방법.
  16. 제 6항에 있어서,
    상기 제 1 배양하는 단계는,
    약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는, 피부 오가노이드 제조 방법.
  17. 제 6항에 있어서,
    상기 제 1 배지는,
    B-27 보충제(supplement) 및 혈청 대체제 중 적어도 하나를 포함하는, 피부 오가노이드 제조 방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 B-27 보충제는,
    상기 제 1 배지의 총 부피에 대하여 1 내지 10 v/v %인, 피부 오가노이드 제조 방법.
  19. 제 17항에 있어서,
    상기 혈청 대체제는,
    상기 제 1 배지의 총 부피에 대하여 5 내지 15 v/v %인, 피부 오가노이드 제조 방법.
  20. 제 6항에 있어서,
    상기 제 2 배양하는 단계는,
    약 7일 내지 40일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는, 피부 오가노이드 제조 방법.
  21. 제 6항에 있어서,
    상기 제 2 배지는,
    상기 제 1 배지, 아스코르빅산(ascorbic acid), CHIRR99021 및 Wnt 작용제(agonist) 중 적어도 하나를 포함하는, 피부 오가노이드 제조 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 아스코르빅산은,
    상기 제 2 배지 1L를 기준으로 2 내지 500 mM인, 피부 오가노이드 제조 방법.
  23. 청구항 제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 기재된 피부 오가노이드와 약물을 처리하는 단계를 포함하는, 피부 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법.
PCT/KR2023/015147 2022-09-27 2023-09-27 피부 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법 WO2024072170A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20220122635 2022-09-27
KR10-2022-0122635 2022-09-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024072170A1 true WO2024072170A1 (ko) 2024-04-04

Family

ID=90478819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2023/015147 WO2024072170A1 (ko) 2022-09-27 2023-09-27 피부 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20240043723A (ko)
WO (1) WO2024072170A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170014678A (ko) * 2015-07-31 2017-02-08 주식회사 바이오솔루션 저온배양을 이용한 3차원 인공피부모델 제조방법 및 이를 이용한 인체 독성물질의 평가방법
US20180305671A1 (en) * 2015-10-21 2018-10-25 Indiana University Research And Technology Corporation Derivation of human skin organoids from pluripotent stem cells
KR102291265B1 (ko) * 2020-03-19 2021-08-18 연세대학교 산학협력단 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170014678A (ko) * 2015-07-31 2017-02-08 주식회사 바이오솔루션 저온배양을 이용한 3차원 인공피부모델 제조방법 및 이를 이용한 인체 독성물질의 평가방법
US20180305671A1 (en) * 2015-10-21 2018-10-25 Indiana University Research And Technology Corporation Derivation of human skin organoids from pluripotent stem cells
KR102291265B1 (ko) * 2020-03-19 2021-08-18 연세대학교 산학협력단 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. GORKUN: "587 Skin organoids as an in vitro skin injury model", JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, ELSEVIER, NL, vol. 141, no. 5, 1 May 2021 (2021-05-01), NL , pages S102, XP093153398, ISSN: 0022-202X, DOI: 10.1016/j.jid.2021.02.614 *
XUAN WANG: "Human primary epidermal organoids enable modeling of dermatophyte infections", CELL DEATH & DISEASE, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, vol. 12, no. 1, 2021, GB , XP093153400, ISSN: 2041-4889, DOI: 10.1038/s41419-020-03330-y *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20240043723A (ko) 2024-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5478739A (en) Three-dimensional stromal cell and tissue culture system
WO2021187758A1 (ko) 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법
Li et al. Adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells contribute to wound healing of skin appendages
Yoshizato Biochemistry and cell biology of amphibian metamorphosis with a special emphasis on the mechanism of removal of larval organs
Auger et al. Skin equivalent produced with human collagen
Jahoda et al. Dermal-epidermal interactions: adult follicle-derived cell populations and hair growth
Xie et al. Development of a three-dimensional human skin equivalent wound model for investigating novel wound healing therapies
US6497875B1 (en) Multilayer skin or dermal equivalent having a layer containing mesenchymal stem cells
Vapniarsky et al. Concise review: human dermis as an autologous source of stem cells for tissue engineering and regenerative medicine
WO2019182358A1 (en) Method and system for hair regrowth using 3d organoid system of hair follicle stem cell
EP0282746A1 (en) Method for producing artificial cultured tissue
Yoo et al. Hair follicular cell/organ culture in tissue engineering and regenerative medicine
Qiao et al. Hair follicle neogenesis induced by cultured human scalp dermal papilla cells
JP2000189158A (ja) 細胞および組織の三次元培養系
CN103785064A (zh) 一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法
CN101001652A (zh) 生产皮肤替代物的交联胶原基质
CN101479376A (zh) 含有源自身体的多个细胞种类的、能形成原始的器官样的细胞块
WO2016006944A1 (ko) 진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델을 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 삼차원 배양 피부모델
CN104548209B (zh) 一种组织工程表皮及其制备方法
US9592257B2 (en) Complete human skin organ generated from culture-expanded cells
Cui et al. Biology of melanocytes in mammals
WO2024072170A1 (ko) 피부 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법
Messenger Isolation, culture and in vitro behavior of cells isolated from papillae of human hair follicles
Kalyanaraman et al. Wound healing on athymic mice with engineered skin substitutes fabricated with keratinocytes harvested from an automated bioreactor
CN115651890A (zh) 成纤维细胞向毛乳头样细胞转分化的方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23873277

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1