JPWO2010134619A1 - 人工多能性幹細胞からの上皮系前駆細胞・幹細胞群及び角膜上皮細胞群の分化誘導方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞より誘導された人工多能性幹細胞を、特定の条件下で培養することにより、上皮系前駆細胞・幹細胞群または角膜上皮細胞群に分化誘導する方法、及び前記方法によって得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群または角膜上皮細胞群、ならびにこれらの細胞群を用いて作製された上皮系疾患治療用細胞製剤、細胞シートに関する。
Description
本発明は、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞より誘導された人工多能性幹細胞から、上皮系前駆細胞・幹細胞群または角膜上皮細胞群を分化誘導する方法、及び前記方法によって誘導された細胞群の上皮系疾患治療への利用に関する。
難治性角膜上皮疾患に対して、献眼による角膜移植術が施行されているが、絶対的なドナー不足と移植後の拒絶反応という問題がある。これを解決するため、患者自身の角膜輪部細胞や口腔粘膜上皮細胞を用いた治療法が開発されている。この方法では、健眼角膜輪部細胞や口腔粘膜上皮細胞から培養角膜上皮細胞シートを作製し患眼に移植する（特許文献１及び２、非特許文献１）。しかし、角膜輪部上皮細胞を用いる方法は両眼性疾患者には適応できず、口腔粘膜上皮は完全な角膜上皮には分化しないため、移植後に血管侵入を生じる危険性がある。
これに対し、未分化な細胞（幹細胞）を分化誘導することで、損傷した組織器官の補填を図る再生医療の研究が進められている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胎盤以外のすべての細胞に分化可能であるため、各細胞系譜への分化誘導やその分化決定因子の同定が注目されたが、倫理的問題からその研究や利用には制約が多く、また拒絶反応の問題もあることから、未だ臨床応用には至っていない。
最近、体細胞や未分化な幹細胞に特定の因子を導入することでＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する人工多能性幹細胞が樹立された。その代表的なものは、Ｙａｍａｎａｋａらによって樹立されたｉＰＳ細胞である（特許文献３、非特許文献２及び３）。これらの人工多能性幹細胞を利用した再生医療は、倫理的問題がないばかりか、患者由来の細胞をソースとすることで拒絶反応の問題も回避することができる。
ところで、ヒトの胚は、発生の段階で３つの胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉、外胚葉を形成する。内胚葉は、胃や小腸の粘膜上皮、肝臓、膵臓等に、中胚葉は筋肉、骨、血管や血液、皮下組織、心臓、腎臓等になる、外胚葉は神経、目（角膜上皮）、表皮等を形成する。このほか、末梢神経、グリア細胞や一部の神経節に分化する神経堤を第４の胚葉ということもある。
ＥＳ細胞から外胚葉系細胞への分化誘導に関しては、これまで表皮細胞と神経細胞への分化誘導が報告されている。すなわち、ＧｒｅｅｎやＨａａｓｅらは、ＥＳ細胞から形成した胚葉体、あるいはＥＳ細胞をＳＣＩＤ ｍｏｕｓｅに投与して得たｎｏｄｕｌｅから単離した細胞を、ＦＡＤ培地を用いて平板培養することにより、ｐ６３＋やケラチン１４（Ｋ１４）＋の表皮細胞が得られたことを報告している（特許文献４、非特許文献４及び５）。また、ＳａｓａｉやＭｉｚｕｓｅｋｉらは、ＳＤＩＡ（Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）法と呼ばれるマウス由来の間質細胞（ＰＡ６細胞）を用いた方法により、ＥＳ細胞から神経細胞が誘導されたことを報告している（特許文献５及び６、非特許文献６〜８）。
しかしながら、これまでＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から角膜上皮細胞等の上皮細胞への分化誘導について具体的な報告はなされていない。
Ｎｉｓｈｉｄａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，（２００４）３５１：１１８７−９６
Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６
Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．
Ｇｒｅｅｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，（２００３）１５６２５−１５６３０
Ｈａａｓｅ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，（２００７）８０１−８０５
Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，（２０００）２８，３１−４０．
Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９９，（２００２）１５８０−１５８５
Ｍｉｚｕｓｅｋｉ，Ｋ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ １００，（２００３）５８２８−５８３３
本発明の課題は、患者自身の細胞から上皮系幹細胞・前駆細胞や角膜上皮細胞を創出することにより、角膜移植を含む上皮系疾患治療のための新規な手段を提供し、ドナー不足や拒絶反応の問題を解決することにある。
発明者らは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から目的とする上皮系細胞を分化誘導するため、種々の条件で実験を繰り返し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける上皮系幹細胞・前駆細胞と同等の形態と性質（ｐ６３陽性、ケラチン１４陽性）を有するｉＰＳ細胞由来上皮系幹細胞・前駆細胞の誘導に成功した。さらに、このｉＰＳ細胞由来上皮系幹細胞・前駆細胞から、角膜上皮分化マーカーであるケラチン１２陽性の細胞を誘導することに成功した。
この方法により、患者自身の細胞から作製した人工多能性幹細胞を用いて上皮系幹細胞・前駆細胞および角膜上皮細胞を創出することができれば、ドナー不足や拒絶反応の問題を心配することなく、角膜再生が可能になる。得られた角膜上皮細胞は、前述した方法により、重層化培養角膜上皮細胞シートにして用いれば、より良好な角膜再生治療が提供できる。
すなわち本発明は、第１の実施態様として、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞より誘導された人工多能性幹細胞から、ケラチン１４陽性かつｐ６３陽性の上皮系前駆細胞・幹細胞群を分化誘導する方法であって：前記人工多能性幹細胞を、フィーダー細胞あるいはコラーゲン（Ｉ型、ＩＶ型が好ましい）、基底膜マトリックス、羊膜、フィブロネクチン、及びラミニンから選ばれる支持体上で、上皮成長因子及び／又はコレラ毒素と、血清とを含む表皮細胞用培地を用いて培養することを特徴とする方法を提供する。
前記方法において、培地はさらにハイドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、及びセレニウムから選ばれる１又は２以上を含むことが好ましい。
また、培地はＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）を含むことが好ましく、さらにレチノイン酸を含むことがより好ましい。なお、レチノイン酸には通常用いられるその塩や誘導体も含まれる。
用いられるフィーダー細胞の例としては、３Ｔ３細胞等の間質細胞を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
前記方法において、人工多能性幹細胞は胚葉体形成を介さずに上皮系前駆細胞・幹細胞群に分化誘導させることが好ましい。
本発明は、第２の実施態様として、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞から誘導された人工多能性幹細胞から、ケラチン１４陽性、ｐ６３陽性の上皮系前駆細胞・幹細胞群を分化誘導する方法であって：前記人工多能性幹細胞を、３Ｔ３細胞上あるいは３Ｔ３細胞由来の分化因子存在下で培養することを特徴とする方法を提供する。
前記方法において、人工多能性幹細胞は、血清及び／又はＢＭＰ４を含む上皮誘導培地あるいは上皮成長因子及び／又はコレラ毒素と、血清とを含む表皮細胞用培地（例えば、ＫＣＭ培地）を用いて培養される。前記上皮誘導培地は、さらにレチノイン酸、非必須アミノ酸、βメルカプトエタノール、及びピルビン酸ナトリウムから選ばれる１又は２以上を含んでいてもよい。また前記表皮細胞用培地は、さらにハイドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、及びセレニウムから選ばれる１又は２以上を含んでいてもよい。
前記方法において、人工多能性幹細胞は、上皮誘導培地又は表皮細胞用培地を用いて培養するまえに、ＫＳＲ等の血清代替物及び／又はＢＭＰ４を含む分化培地を用いて培養することが好ましい。前記分化培地は、さらにレチノイン酸を含むことがより好ましく、非必須アミノ酸、βメルカプトエタノール、及びピルビン酸ナトリウムから選ばれる１又は２以上を含んでいてもよい。なお前記したように、レチノイン酸には通常用いられるその塩や誘導体も含まれる。
とくに、前記上皮誘導培地はＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）を含むことが好ましい。
本発明は、第３の実施態様として、上記した方法によって分化誘導された上皮系前駆細胞・幹細胞群を、さらに上皮細胞群に分化させることを特徴とする、上皮細胞群の分化誘導方法を提供する。
前記方法において、上皮細胞群の例としては、例えば、角膜上皮細胞群、口腔粘膜上皮細胞群、膀胱上皮細胞群、結膜上皮細胞群、胃粘膜上皮細胞群、小腸上皮細胞群、大腸上皮細胞群、腎臓上皮細胞群、尿細管上皮細胞群、歯肉粘膜上皮細胞群、食道上皮細胞群、肝臓上皮細胞群、膵臓上皮細胞群、肺上皮細胞群、胆嚢上皮細胞群を挙げられる。
上記した方法は、さらにケラチン１４陽性かつｐ６３陽性の細胞群を単離する工程を含んでいてもよい。
上記した方法は、さらにケラチン１４陽性かつｐ６３陽性の細胞群を単離する工程を含んでいてもよい。
本発明は、第４の実施態様として、第１及び第２の実施態様にかかる方法において、人工多能性幹細胞の培養を続けることにより、前記上皮系前駆細胞・幹細胞群からケラチン１２陽性の角膜上皮細胞群を分化誘導する方法を提供する。
前記方法は、さらにケラチン１２陽性かつケラチン１４陰性の細胞群を単離する工程を含んでいてもよい。
本発明は、第５の実施態様として、本発明の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された上皮細胞群を含む培養物を提供する。培養物の好適な一形態は、本発明の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は角膜上皮細胞群を含む培養物である。
本発明は、第６の実施態様として、本発明の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された上皮細胞群を含む上皮系疾患用細胞製剤を提供する。細胞製剤の好適な一形態は、本発明の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は角膜上皮細胞群を含む上皮系疾患用細胞製剤である。
本発明は、第６の実施態様として、本発明の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された上皮細胞群を重層化して含む細胞シートを提供する。細胞シートの好適な一形態は、本発明の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は角膜上皮細胞群を重層化して含む細胞シートである。
本発明のシートは、細胞が重層化培養によって重層化されたものであることが好ましい。
本発明のシートは、細胞が重層化培養によって重層化されたものであることが好ましい。
本発明の上皮系幹細胞・前駆細胞や角膜上皮様細胞は、患者自身の細胞に由来するため、拒絶反応の心配がない。本発明の角膜上皮様細胞を用いて作製される重層化角膜上皮細胞シートは、安全な人工角膜として利用しうる。すなわち、本発明により、角膜上皮疾患に対する再生医療分野におけるドナー不足の問題と拒絶反応の問題を同時に解決し得る。また、本発明の細胞は患者自身の体細胞より作製した人工多能性幹細胞が細胞源であり、ＥＳ細胞由来ではないため、倫理的問題もない。
角膜上皮細胞のみならず、本発明の上皮系幹細胞・前駆細胞を細胞源として、表皮細胞、口腔粘膜上皮など様々な重層化上皮を再生することが可能である。すなわち、本発明は様々な上皮疾患に対する自家再生医療技術の基盤技術として応用しうる。さらに、本技術を用いてＨＬＡジェノタイプ別に上皮細胞を創出すれば、拒絶反応の軽減可能な上皮細胞バンクを作製することも可能である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００９−１２００５３号の明細書に記載された内容を包含する。
本発明は、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞より誘導された人工多能性幹細胞から、上皮系前駆細胞・幹細胞群または角膜上皮細胞群を分化誘導する方法、及び前記方法によって誘導された細胞群の上皮系組織の疾患治療への利用に関する。
１．定義
以下、本発明にかかる用語のいくつかについて説明する。
（１）人工多能性幹細胞
本発明にかかる「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞に、特定の因子を導入することにより、ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有するように再プログラミング（初期化）された細胞を言う。
以下、本発明にかかる用語のいくつかについて説明する。
（１）人工多能性幹細胞
本発明にかかる「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞に、特定の因子を導入することにより、ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有するように再プログラミング（初期化）された細胞を言う。
「人工多能性幹細胞」は、Ｙａｍａｎａｋａらにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入することにより、初めて樹立され「ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ）」と命名された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６）。その後、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入することにより、ヒトｉＰＳも樹立され（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．）、さらにｃ−Ｍｙｃを含まない方法等（Ｎａｋａｇａｗａ Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１−１０６）、腫瘍形成誘導が低いより安全性の高いｉＰＳ細胞を樹立する方法の確立にも成功している。
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学のＴｈｏｍｓｏｎらは、ＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＮＡＮＯＧ，ＬＩＮ２８の４遺伝子をヒト線維芽細胞に導入して作製した人工多能性幹細胞の樹立に成功している（Ｙｕ Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７−１９２０．）。また、Ｈａｒｖａｒｄ大学のＤａｌｅｙらは、皮膚細胞にＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４，Ｃ−ＭＹＣ，ｈＴＥＲＴ，ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔの６遺伝子を導入して作製した人工多能性幹細胞の樹立について報告している（Ｐａｒｋ ＩＨ，Ｄａｌｅｙ ＧＱ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１−１４６）。
Ｓａｋｕｒａｄａらは、体細胞ではなく、出生後の組織に存在する未分化幹細胞を細胞源として、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ等を導入することで、より効率よく誘導される人工多能性幹細胞を報告している（特開２００８−３０７００７）。
このほか、ＯＣＴ３／４，ＫＬＦ４，低分子化合物をマウス神経前駆細胞等に導入して作製された人工多能性幹細胞（Ｓｈｉ Ｙ．，Ｄｉｎｇ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ．３，Ｉｓｓｕｅ ５，５６８−５７４，）、ＳＯＸ２，Ｃ−ＭＹＣを内因性に発現しているマウス神経幹細胞にＯＣＴ３／４，ＫＬＦ４を導入して作製された人工多能性幹細胞（Ｋｉｍ ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ ＨＲ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６−６５０）、Ｃ−ＭＹＣを用いることなく、Ｄｎｍｔ阻害剤やＨＤＡＣ阻害剤を利用して作製された人工多能性幹細胞（Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ ７，７９５−７９７）が報告されている。
上記を含めて、人工多能性幹細胞に関する公知の特許としては、特開２００８−３０７００７号、特開２００８−２８３９７２号、ＵＳ２００８−２３３６６１０、ＵＳ２００９−０４７２６３、ＷＯ２００７−０６９６６６、ＷＯ２００８−１１８２２０、ＷＯ２００８−１２４１３３、ＷＯ２００８−１５１０５８、２００９−００６９３０ＷＯ２００９−００６９９７、ＷＯ２００９−００７８５２等を挙げることができる。
本発明で用いられる「人工多能性幹細胞」は、冒頭に記載した定義を満たし、本発明の目的を損なわない限りにおいて、公知の人工多能性幹細胞及びこれと等価な人工多能性幹細胞のすべてを含み、細胞源、導入因子、導入方法等は特に限定されない。
好ましくは、細胞源はヒト由来であり、より好ましくは、当該細胞から分化誘導された上皮系前駆細胞・幹細胞群または角膜上皮を含む上皮細胞群、表皮細胞群による治療を必要とする患者自身に由来する。
（２）上皮系前駆細胞・幹細胞
本発明にかかる「上皮系前駆細胞・幹細胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ／ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」とは、未分化な上皮細胞であり、分化マーカーを発現しておらず、また高い増殖能を有している細胞群を意味する。本発明の「上皮系前駆細胞・幹細胞」は、基底上皮細胞マーカーであるケラチン１４、上皮前駆細胞・幹細胞マーカーであるｐ６３の発現によって特徴づけられる。
本発明にかかる「上皮系前駆細胞・幹細胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ／ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」とは、未分化な上皮細胞であり、分化マーカーを発現しておらず、また高い増殖能を有している細胞群を意味する。本発明の「上皮系前駆細胞・幹細胞」は、基底上皮細胞マーカーであるケラチン１４、上皮前駆細胞・幹細胞マーカーであるｐ６３の発現によって特徴づけられる。
（３）角膜上皮細胞
角膜は、表面から、角膜上皮層、角膜実質層、角膜内皮層の３層構造をしている。本発明にかかる「角膜上皮細胞」は、この角膜の一番外側の層を構成する細胞で、４〜５層の角膜上皮細胞層から構成されている。「角膜上皮細胞」は表皮外胚葉に由来するが、角膜の実質と内皮は神経堤由来であり、それぞれ個別の幹細胞が存在すると考えられている。本発明にかかる「角膜上皮細胞」は、角膜上皮分化マーカーであるケラチン１２の発現によって特徴づけられる。
角膜は、表面から、角膜上皮層、角膜実質層、角膜内皮層の３層構造をしている。本発明にかかる「角膜上皮細胞」は、この角膜の一番外側の層を構成する細胞で、４〜５層の角膜上皮細胞層から構成されている。「角膜上皮細胞」は表皮外胚葉に由来するが、角膜の実質と内皮は神経堤由来であり、それぞれ個別の幹細胞が存在すると考えられている。本発明にかかる「角膜上皮細胞」は、角膜上皮分化マーカーであるケラチン１２の発現によって特徴づけられる。
（４）フィーダー細胞
本発明で用いられる「フィーダー細胞（あるいは「フィーダー」と略記されることもある）」は、目的とする細胞の培養条件を補助、調整するために用いられる、培養細胞とは異なる種類の細胞を意味する。通常フィーダー細胞は、それ自体増殖することがないようγ線照射やマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）等の抗生物質で前処理を施しておく。
本発明で用いられる「フィーダー細胞（あるいは「フィーダー」と略記されることもある）」は、目的とする細胞の培養条件を補助、調整するために用いられる、培養細胞とは異なる種類の細胞を意味する。通常フィーダー細胞は、それ自体増殖することがないようγ線照射やマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）等の抗生物質で前処理を施しておく。
フィーダー細胞は、実験の目的や細胞の種類によって異なり、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の場合は，ＭＥＦ（マウス胎児線維芽細胞）やＳＮＬ（マウス胎児由来線維芽細胞株）が用いられる。
本発明の分化誘導方法においても、後述するＫＣＭ法を改変した方法では、間質細胞、線維芽細胞等の様々なフィーダー細胞およびマトリゲル、羊膜、１型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等のコーティングを用いることができる。
一方、ＳＤＩＡ法を改変した方法では、間質細胞が用いられるが、分化効率の点から３Ｔ３細胞が好ましい。
（５）間質細胞、間質細胞由来の分化因子
本発明で用いられる「間質細胞（Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ）」とは、骨髄に存在する血液の細胞を支持する細胞である。「間質細胞」は、培養により浮遊状態で増殖する血液細胞とは異なり、壁に付着して増殖する。「間質細胞」は間葉系由来の細胞であり、さまざまな細胞に分化する幹細胞を多く含む。
本発明で用いられる「間質細胞（Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ）」とは、骨髄に存在する血液の細胞を支持する細胞である。「間質細胞」は、培養により浮遊状態で増殖する血液細胞とは異なり、壁に付着して増殖する。「間質細胞」は間葉系由来の細胞であり、さまざまな細胞に分化する幹細胞を多く含む。
「間質細胞」は、幹細胞を多く含み、それ自体分化多能性を有するため、再生医療への応用が期待されている。しかしながら、本発明においては、「間質細胞」を人工多能性幹細胞から上皮系前駆細胞・幹細胞群あるいは角膜上皮細胞への分化誘導を促すための、フィーダー細胞等として利用する。
「間質細胞」には、細胞の分化を制御する因子を分泌することが知られている。本発明で用いられる「間質細胞由来の分化因子」とは、このような間質細胞が分泌する細胞の分化を制御する因子を意味する。「間質細胞由来の分化因子」の実体は未解明であるものの、後述するように、ＥＳ細胞をマウス骨髄由来の間質細胞とともに培養することで、ＥＳ細胞を選択的に神経細胞に分化誘導できることが確認されており、この間質細胞あるいは間質細胞由来の分化因子を利用した神経細胞の分化誘導法はＳＤＩＡ法と命名されている（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，（２０００）２８，３１−４０．、Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２００２）９９，１５８０−１５８５、Ｍｉｚｕｓｅｋｉ，Ｋ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，（２００３）１００，５８２８−５８３３）。
（６）細胞マーカー：ケラチン１４、ｐ６３、ケラチン１２
本発明では、分化誘導された細胞を同定するために、各細胞種に特異的なマーカーを利用する。具体的には、本発明にかかる上皮前駆細胞・幹細胞は、ケラチン１４陽性かつｐ６３陽性によって特定され、角膜上皮細胞はケラチン１２陽性もしくはケラチン３陽性によって特定される。
本発明では、分化誘導された細胞を同定するために、各細胞種に特異的なマーカーを利用する。具体的には、本発明にかかる上皮前駆細胞・幹細胞は、ケラチン１４陽性かつｐ６３陽性によって特定され、角膜上皮細胞はケラチン１２陽性もしくはケラチン３陽性によって特定される。
ケラチン１４（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １４：Ｋ１４）：ケラチン１４は、基底上皮細胞の代表的マーカーである。
ｐ６３：ｐ６３はｐ５３遺伝子ファミリーに属する細胞核たんぱく質であるが、上皮前駆細胞・幹細胞の代表的マーカーで、正常ヒト表皮および毛包基底細胞等で発現が認められる。
ケラチン１２（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １２：Ｋ１２）：ケラチン１２および３は、角膜上皮の代表的分化マーカーである。
２．分化誘導方法
本発明においては、下記に詳述する２つの方法に基づいて、人工多能性幹細胞から、上皮系前駆細胞・幹細胞群あるいは角膜上皮細胞群を分化誘導する。
なお、人工多能性幹細胞は、ＭＥＦやＳＮＬ等のフィーダー細胞上で、適当な培地（市販のＥＳ細胞用培地や、ｉＰＳ細胞用培地等）を用いて培養しておく。
本発明においては、下記に詳述する２つの方法に基づいて、人工多能性幹細胞から、上皮系前駆細胞・幹細胞群あるいは角膜上皮細胞群を分化誘導する。
なお、人工多能性幹細胞は、ＭＥＦやＳＮＬ等のフィーダー細胞上で、適当な培地（市販のＥＳ細胞用培地や、ｉＰＳ細胞用培地等）を用いて培養しておく。
２．１ ＫＣＭ法の改変
ＫＣＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ）とは、表皮角化細胞培養用培地の略称である。表皮細胞用培地としては、ＫＣＭ培地、ＫＳＦＭ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅｐｉ−ｌｉｆｅ（Ｃａｓｃａｄｂｉｏ）、３Ｔ３−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍなどが知られているが、ＫＣＭ培地はコレラ毒素、牛胎児血清、ハイドロコルチゾン、通常カルシウム濃度であるという点で他の表皮角化細胞用培地とは区別される。本明細書中では、このＫＣＭ培地を用いた表皮細胞への分化誘導方法をＫＣＭ法と記載する。
ＫＣＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ）とは、表皮角化細胞培養用培地の略称である。表皮細胞用培地としては、ＫＣＭ培地、ＫＳＦＭ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅｐｉ−ｌｉｆｅ（Ｃａｓｃａｄｂｉｏ）、３Ｔ３−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍなどが知られているが、ＫＣＭ培地はコレラ毒素、牛胎児血清、ハイドロコルチゾン、通常カルシウム濃度であるという点で他の表皮角化細胞用培地とは区別される。本明細書中では、このＫＣＭ培地を用いた表皮細胞への分化誘導方法をＫＣＭ法と記載する。
発明者らは、このＫＣＭ培地を改変して適用することにより、人工多能性幹細胞から上皮系前駆細胞・幹細胞群を分化誘導することに成功した。なお、表皮角化細胞は、皮膚における上皮細胞に限定されており、一般的に表皮細胞は角化することや、ケラチン１，ケラチン１０などのマーカーを発現するなどの性質を有しており、上皮細胞の中での分化形態の一種である。そのため、表皮角膜細胞と上皮細胞は同一のものではない。
一般に、ＫＣＭ培地を用いた培養法ではコラーゲンを支持体として表皮角化細胞を培養するが、発明者らはフィーダー細胞を用いることでより良好な上皮系前駆細胞・幹細胞群および角膜上皮細胞への分化誘導が達成できることを確認した。
すなわち、人工多能性幹細胞を、フィーダー細胞あるいはコラーゲン、基底膜マトリックス（マトリゲル（登録商標））、羊膜、フィブロネクチン、及びラミニンから選ばれる支持体上で、上皮成長因子、コレラ毒素、牛胎児血清等の血清を含む表皮細胞用培地を用いて培養することにより、ケラチン１４陽性かつｐ６３陽性の上皮系前駆細胞・幹細胞群に分化誘導する。培地は、さらにハイドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、セレニウム等を含むことが好ましい。また、コラーゲンはＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンが好ましく、抗原性を除去したアテロコラーゲンが好ましい。
用いられるフィーダー細胞は特に限定されず、例えば、間質細胞、線維芽細胞等を用いることができるが、とくに間質細胞が好ましく、その好適な一例として３Ｔ３細胞を挙げることができる。
３Ｔ３細胞は、マウスの皮膚に由来する線維芽細胞培養細胞株で、その名称は「３ ｄａｙｓ，ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｉｎｏｃｕｌｕｍ ３ ｘ １０５ ｃｅｌｌｓ／５０ｍｍ ｄｉｓｈ」、つまり比較的多い細胞数を播種して短い培養期間で継代することで、その機能が保たれるという特性に由来する。
３Ｔ３細胞には、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３、３Ｔ３−ｓｗｉｓｓ ａｌｂｉｎｏ、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、ＮＩＨ／３Ｔ３等いくつかの細胞株があるが、そのいずれを用いてもよい。
上記方法で用いられるＫＣＭ培地は、基本培地としては、ＤＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、α ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ培地、ウイリアムスＥ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。この基本培地に、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を添加して作成される。
例えば、栄養源としては、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウムおよび硫酸マンガン、各種ビタミン類、アミノ酸類等を含むことができる。
分化誘導を促す成分としては、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、コレラトキシン、トランスフェリン、インスリン、ＥＧＭ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、血清あるいは血清代替物、ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）等を挙げることができる。
これらの成分を配合して得られる培地のｐＨは５．５〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の範囲である。
これらの成分を配合して得られる培地のｐＨは５．５〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の範囲である。
培養は、３６℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で、１％〜２５％ Ｏ２、１％〜１５％ ＣＯ２の条件下で行われる。
培地には、ＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）を添加すると、より良好な上皮系前駆細胞・幹細胞群への分化誘導が達成できる。ＢＭＰ４は骨形成因子の一つで、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属し、分化、増殖および様々な細胞機能を調節することが知られており、神経への分化を抑制し、表皮細胞への分化を促進することが知られている。
培地には、さらにレチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を添加すると、さらに良好な上皮系前駆細胞・幹細胞群への分化誘導が達成できる。レチノイン酸はビタミンＡ誘導体の一種で、表皮細胞の分化・増殖促進など、種々の細胞において、その分化・増殖の制御に関与していることが知られている。なお、レチノイン酸は、通常用いられるその塩や誘導体であってもよい。
人工多能性幹細胞は、凝集した状態で培養し、胚葉体形成をさせてもよいが、分化効率の点からは、凝集をさせることなく胚葉体形成を介さずに分化誘導することが好ましい。
２．２ ＳＤＩＡ（Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）法の改変
ＳＤＩＡ法とは、前述したとおり、Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ法の略称で、間質細胞が分泌する分化因子を利用して、ＥＳ細胞から神経細胞が誘導されることが知られている（前掲）。
ＳＤＩＡ法とは、前述したとおり、Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ法の略称で、間質細胞が分泌する分化因子を利用して、ＥＳ細胞から神経細胞が誘導されることが知られている（前掲）。
発明者らは、このＳＤＩＡ法を改変して適用することにより、人工多能性幹細胞から上皮系前駆細胞・幹細胞群を分化誘導することに成功した。なお、上皮細胞と神経細胞は、同じ外胚葉由来の細胞であるが、神経は神経外胚葉由来であり、上皮系細胞は表皮外胚葉由来であり、また機能的、形態的にもまったく異なる細胞系譜である。
通常、ＳＤＩＡ法では、ＰＡ６という間質細胞株を用いるが、発明者らは、ＰＡ６と３Ｔ３細胞を比較した結果、３Ｔ３細胞をフィーダーとして用いることにより、上皮系幹細胞・前駆細胞への分化誘導効率が有意に向上することを確認した。また、血清存在下のほうが、上皮系幹細胞・前駆細胞への分化誘導効率は高かった。なお、ＰＡ６細胞をフィーダーとして用いる場合は、レチノイン酸等の促進因子を添加することにより、３Ｔ３フィーダーと同様に上皮系幹細胞・前駆細胞に分化誘導することができた。
本発明においては、人工多能性幹細胞を、３Ｔ３細胞上あるいは３Ｔ３細胞由来の分化因子存在下で培養することにより、ケラチン１４陽性、ｐ６３陽性の上皮系前駆細胞・幹細胞群に分化誘導する。
用いられる培地は、基本培地としては、ＤＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、α ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ培地、ウイリアムスＥ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。この基本培地に、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を添加して作成される。
例えば、栄養源としては、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウムおよび硫酸マンガン、各種ビタミン類、アミノ酸類等を含むことができる。
その他必要に応じて、ピルビン酸、ピルビン酸、βメルカプトエタノール等のアミノ酸還元剤、血清あるいは血清代替物等を挙げることができる。なお血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、βメルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、市販のＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。
これらの成分を配合して得られる培地のｐＨは５．５〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の範囲である。
これらの成分を配合して得られる培地のｐＨは５．５〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の範囲である。
培養は、３６℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で、１％〜２５％ Ｏ２、１％〜１５％ ＣＯ２の条件下で行われる。
人工多能性幹細胞の培養は、血清代替物及び／又はＢＭＰ４を含む分化培地を用いて培養したのち、牛胎児血清等の血清及び／又はＢＭＰ４を含む上皮誘導培地又は上皮成長因子及び／又はコレラ毒素と、血清とを含む表皮細胞用培地（例えば、ＫＣＭ培地）を用いて培養するほうが、分化効率の点で好ましい。分化培地や上皮誘導培地、表皮細胞用培地は、さらに非必須アミノ酸、βメルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム等を含むことが好ましい。なお血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、βメルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、市販のＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆ ｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。また、非必須アミノ酸とは、必須アミノ酸（その動物の体内で合成できず、栄養分として摂取しなければならないアミノ酸）以外のアミノ酸を意味し、ヒトの場合、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、オルニチン、チロシン、セリン、アラニンの１１種が非必須アミノ酸に該当する。本発明において、「非必須アミノ酸」は、上記１１種のすべてを含む必要はなく、これらの一部であってもよい。好ましくは、基本培地に含有されないアスパラギン、アスパラギン酸、プロリン、オルニチン、アラニンを含む５種以上が含まれていればよい。
上皮誘導培地や表皮細胞用培地には、レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を添加すると、さらに良好な上皮系前駆細胞・幹細胞群への分化誘導が達成できる。上皮誘導培地のみならず、分化培地にも、レチノイン酸を添加することができる。なお前記したように、レチノイン酸は、通常用いられるその塩や誘導体であってもよい。
いずれの培地も、上記した成分組成を基本とするが、分化培地は牛胎児血清を含んでおらず主に未分化細胞の増殖に寄与すると考えられ、上皮誘導培地は牛胎児血清を含む培地であり、上皮細胞への分化を促進するといった特徴を有している。表皮細胞用培地の具体的な一例はＫＣＭ培地である。
３．上皮系前駆細胞・幹細胞群からの分化誘導
３．１ 上皮系細胞への分化誘導
本発明の方法によって分化誘導された上皮系前駆細胞・幹細胞群は、他のさまざまな上皮細胞群に分化させることができる。
３．１ 上皮系細胞への分化誘導
本発明の方法によって分化誘導された上皮系前駆細胞・幹細胞群は、他のさまざまな上皮細胞群に分化させることができる。
上皮系前駆細胞・幹細胞群から分化誘導可能な上皮細胞群としては、角膜上皮細胞群、表皮細胞群、毛包細胞群、口腔粘膜上皮細胞群、膀胱上皮細胞群、結膜上皮細胞群、胃粘膜上皮細胞群、小腸上皮細胞群、大腸上皮細胞群、腎臓上皮細胞群、尿細管上皮細胞群、歯肉粘膜上皮細胞群、食道上皮細胞群、肝臓上皮細胞群、膵臓上皮細胞群、肺上皮細胞群および胆嚢上皮細胞群等を挙げることができる。
３．２ 角膜上皮細胞への分化誘導
本発明の２種類の方法（ＫＣＭ改変法とＳＤＩＡ改変法）のいずれにおいても、一定期間培養を続けることにより、上皮系前駆細胞・幹細胞群からケラチン１２陽性かつケラチン１４陰性の角膜上皮細胞群を分化誘導することができる。例えば、輪部下線維芽細胞との共培養により、表皮細胞から角膜上皮細胞を分化誘導する方法（Ｂｌａｚｅｊｅｗｓｋａ Ｅ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，（２００９）Ｍａｒ；２７（３）：６４２−６５２）により、ｉＰＳ細胞より角膜上皮細胞へ分化誘導することができる。
本発明の２種類の方法（ＫＣＭ改変法とＳＤＩＡ改変法）のいずれにおいても、一定期間培養を続けることにより、上皮系前駆細胞・幹細胞群からケラチン１２陽性かつケラチン１４陰性の角膜上皮細胞群を分化誘導することができる。例えば、輪部下線維芽細胞との共培養により、表皮細胞から角膜上皮細胞を分化誘導する方法（Ｂｌａｚｅｊｅｗｓｋａ Ｅ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，（２００９）Ｍａｒ；２７（３）：６４２−６５２）により、ｉＰＳ細胞より角膜上皮細胞へ分化誘導することができる。
角膜上皮細胞群に分化誘導するための培養期間は、用いる細胞の種類と、培養条件によって適宜決定される。
４．細胞の単離（純化）
４．１ 上皮系前駆細胞・幹細胞群の単離
本発明の方法によって分化誘導された上皮系前駆細胞・幹細胞群は、そのマーカーであるケラチン１４とｐ６３を利用して、単離することができる。
４．１ 上皮系前駆細胞・幹細胞群の単離
本発明の方法によって分化誘導された上皮系前駆細胞・幹細胞群は、そのマーカーであるケラチン１４とｐ６３を利用して、単離することができる。
常法にしたがい各マーカーに特異的な抗体を用いて容易に実施できる。たとえば、抗体で標識された磁気ビーズ、抗体を固相化したカラム、蛍光標識された抗体を用いたセルソーター（ＦＡＣＳ）による分離を用いて単離すればよい。抗体は、市販のものを利用してもよいし、常法にしたがい作製してもよい。
具体的に言えば、抗ｉｎｔｅｇｒｉｎ α６抗体や、抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を固定化した免疫磁気ビーズをそれぞれ調整し、その両方に結合する分画を分離する。あるいは、抗ｉｎｔｅｇｒｉｎ α６抗体や、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を固定化した担体を用いたカラムクロマグラフィーを用いて分離したり、ｉｎｔｅｇｒｉｎ α６とＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞をＦＡＣＳで分離することもできる。
４．２ 角膜上皮細胞群の単離
本発明の方法によって分化誘導された角膜上皮細胞群についても、その角膜上皮細胞の培養方法を利用して、単離することができる。
本発明の方法によって分化誘導された角膜上皮細胞群についても、その角膜上皮細胞の培養方法を利用して、単離することができる。
具体的に言えば、前述したように、分化誘導された角膜上皮細胞群を、トリプシン処理により回収し、再びＫＣＭやＫＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地等の上皮細胞培養用倍地中（ＫＣＭ培地の場合は３Ｔ３細胞をフィーダーに使用する）に播種、培養を行い、さらに継代を繰り返すことにより、角膜上皮細胞を純化することが可能である。
５．再生医療への利用
５．１ 培養物
本発明の方法によって得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された表皮細胞群あるいは、上皮細胞群を含む培養物は、それ自体、研究、再生医療あるいは後述する細胞製剤の原料として利用することができる。
５．１ 培養物
本発明の方法によって得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された表皮細胞群あるいは、上皮細胞群を含む培養物は、それ自体、研究、再生医療あるいは後述する細胞製剤の原料として利用することができる。
５．２ 上皮疾患治療用細胞製剤
本発明の方法によって、分化誘導され、単離された上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された表皮細胞群あるいは上皮細胞群は、上皮系疾患用細胞製剤として利用できる。
本発明の方法によって、分化誘導され、単離された上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された表皮細胞群あるいは上皮細胞群は、上皮系疾患用細胞製剤として利用できる。
本発明の細胞製剤の投与方法は特に限定されず、適用部位に応じて、外科的手段による局所移植、静脈内投与、腰椎穿刺投与、局所注入投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、又は静脈投与などが考えられる。
本発明の細胞製剤は、細胞の維持・増殖、患部への投与を補助する足場材料や成分、他の医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。
細胞の維持・増殖に必要な成分としては、炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、塩類、各種サイトカイン等の培地成分、あるいはマトリゲルＴＭ等の細胞外マトリックス調製品、が挙げられる。
患部への投与を補助する足場材料や成分としては、生分解性ポリマー；例えば、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、セルロース、及びこれらの誘導体、ならびにその２種以上からなる複合体、注射用水溶液；例えば生理食塩水、培地、ＰＢＳなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液（例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等と併用してもよい。
その他、必要に応じて、医薬的に許容される有機溶剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤等を含んでいてもよい。
実際の添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン等を加えたものを使用することができる。
本発明の細胞製剤の対象となりうる疾患としては、例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群、眼類天疱瘡、熱・化学外傷、無虹彩症、Ｓａｌｚｍａｎｎ角膜変性症、特発性角結膜上皮症、トラコーマ後瘢痕、角膜穿孔、角膜周辺部潰瘍、エキシマレーザー治療後の角膜上皮剥離、食道癌治療後の狭窄、その他の角結膜、皮膚、口腔粘膜、食道粘膜、胃粘膜疾患患者が挙げられる。
５．３ 重層化細胞シート
本発明の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された上皮細胞群を重層化して培養上皮細胞シートを作製することができる。
本発明の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された上皮細胞群を重層化して培養上皮細胞シートを作製することができる。
細胞の重層化は、発明者らの既報（ＷＯ２００４／０６９２９５、特開２００５−１３０８３８号、Ｎｉｓｈｉｄａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００４）３５１：１１８７−９６等）にしたがって実施できる。たとえば、３Ｔ３細胞やその他間質細胞をフィーダー細胞として用いて、本発明の方法で分化誘導された上皮細胞群を上皮細胞重層化用培地（例えば、ＫＣＭ培地）中で培養し、上皮系細胞を重層培養することにより培養上皮細胞シートを作製できる（Ｎｉｓｈｉｄａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００４）３５１：１１８７−９６）。あるいは、本発明の方法で分化誘導された上皮細胞群を多孔膜上で培養し、当該多孔膜を介して培地が下層から常に供給されるようにすることで、上皮系細胞を重層化して培養上皮細胞シートを作製できる（特開２００５−１３０８３８号）。
６．その他
本発明の方法を用いてＨＬＡジェノタイプ別に上皮細胞を創出することにより、拒絶反応を軽減可能な上皮細胞バンクを作製することも可能である。細胞バンクを用いた他家再生医療技術は産業化が望まれる分野である。
本発明の方法を用いてＨＬＡジェノタイプ別に上皮細胞を創出することにより、拒絶反応を軽減可能な上皮細胞バンクを作製することも可能である。細胞バンクを用いた他家再生医療技術は産業化が望まれる分野である。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：マウスｉＰＳ細胞からの上皮細胞の分化誘導
１．マウスｉＰＳ細胞の培養：
マウスｉＰＳ細胞は、京都大学山中伸弥教授より供与を受けた（Ｏｋｉｔａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４４８：３１３−３１７）。ＳＮＬ（ＳＮＬ７６／７）はＢａｙｅｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＤｒ．Ａｌｌａｎ Ｂｒａｄｌｅｙより供与を受けた。マウスｉＰＳ細胞は、このＳＮＬ（ＳＮＬ７６／７）をフィーダーとして、下記に示すＳＮＬフィーダー用培地を用いて維持した。
１．マウスｉＰＳ細胞の培養：
マウスｉＰＳ細胞は、京都大学山中伸弥教授より供与を受けた（Ｏｋｉｔａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４４８：３１３−３１７）。ＳＮＬ（ＳＮＬ７６／７）はＢａｙｅｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＤｒ．Ａｌｌａｎ Ｂｒａｄｌｅｙより供与を受けた。マウスｉＰＳ細胞は、このＳＮＬ（ＳＮＬ７６／７）をフィーダーとして、下記に示すＳＮＬフィーダー用培地を用いて維持した。
ゲラチンコートした培養皿にマイトマイシン（ＭＭＣ）処理したＳＮＬ細胞を播種し、これをフィーダー細胞とした。この上にマウスｉＰＳ細胞を播種し、ｉＰＳ細胞培養用培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ２で維持した。
２．分化誘導系の準備
２．１．ＫＣＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）法
（１）コラーゲン上での培養
ＳＮＬフィーダー上のｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理することにより、ｉＰＳ細胞を回収し、さらにピペッティングを行うことによりｉＰＳ細胞の細胞懸濁液（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を作製した。得られた細胞縣濁液をゼラチンコーティングした培養皿上で１−２時間程度インキュベートし、上清を回収することで、フィーダー細胞のみ接着させ、ｉＰＳ細胞のみを回収した。得られたｉＰＳ細胞の細胞数をカウントし、下記のとおり４型コラーゲンをコーティングした培養皿上に０．５ − １０ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、下記に示すＫＣＭ培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ２で７−２８日間培養した。さらに、ＫＣＭ培地に０．５ｎＭ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を添加して、同様に培養を行った。
２．１．ＫＣＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）法
（１）コラーゲン上での培養
ＳＮＬフィーダー上のｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理することにより、ｉＰＳ細胞を回収し、さらにピペッティングを行うことによりｉＰＳ細胞の細胞懸濁液（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を作製した。得られた細胞縣濁液をゼラチンコーティングした培養皿上で１−２時間程度インキュベートし、上清を回収することで、フィーダー細胞のみ接着させ、ｉＰＳ細胞のみを回収した。得られたｉＰＳ細胞の細胞数をカウントし、下記のとおり４型コラーゲンをコーティングした培養皿上に０．５ − １０ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、下記に示すＫＣＭ培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ２で７−２８日間培養した。さらに、ＫＣＭ培地に０．５ｎＭ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を添加して、同様に培養を行った。
＜コーティング法＞
４型コラーゲン（新田ゼラチン）を希塩酸（ｐＨ３）で１０倍希釈し、培養皿に薄く塗り広げ、クリーンベンチ内で３０分以上置き乾燥させた。使用前にＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅｓ（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回洗浄した。
４型コラーゲン（新田ゼラチン）を希塩酸（ｐＨ３）で１０倍希釈し、培養皿に薄く塗り広げ、クリーンベンチ内で３０分以上置き乾燥させた。使用前にＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅｓ（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回洗浄した。
（２）３Ｔ３細胞上での培養
ＭＭＣ処理した３Ｔ３細胞をフィーダー細胞として播種した培養皿上に、前項と同様にして調製したｉＰＳ細胞を、０．１ − １０ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種して３７℃で、７−２７日間培養を行った。細胞は適宜ＰＦＡによる固定を行った。さらに、ＫＣＭ培地に０．５ｎＭ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を添加して、同様に培養を行った。
ＭＭＣ処理した３Ｔ３細胞をフィーダー細胞として播種した培養皿上に、前項と同様にして調製したｉＰＳ細胞を、０．１ − １０ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種して３７℃で、７−２７日間培養を行った。細胞は適宜ＰＦＡによる固定を行った。さらに、ＫＣＭ培地に０．５ｎＭ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を添加して、同様に培養を行った。
２．２．ＳＤＩＡ（Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ）法
（１）ＰＡ６細胞上での培養
ＳＮＬフィーダー上のｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理することにより、ｉＰＳ細胞を回収し、さらにピペッティングを行うことによりｉＰＳ細胞の細胞懸濁液（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を作製した。得られた細胞縣濁液をゼラチンコーティングした培養皿上で１−２時間程度インキュベートし、上清を回収することで、フィーダー細胞のみ接着させ、ｉＰＳ細胞のみを回収した。得られたｉＰＳ細胞の細胞数をカウントし、ＰＡ６細胞を播種した培養皿上に０．１−１０ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、下記に示す分化培地中で３７℃、５％ ＣＯ２、８日間培養し、次いで上皮誘導培地中で３７℃、２−２７日間培養した。細胞は適宜ＰＦＡによる固定を行った。さらに、上皮誘導培地にＦＢＳを添加しない場合と添加する場合の違いについても評価した。
（１）ＰＡ６細胞上での培養
ＳＮＬフィーダー上のｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理することにより、ｉＰＳ細胞を回収し、さらにピペッティングを行うことによりｉＰＳ細胞の細胞懸濁液（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を作製した。得られた細胞縣濁液をゼラチンコーティングした培養皿上で１−２時間程度インキュベートし、上清を回収することで、フィーダー細胞のみ接着させ、ｉＰＳ細胞のみを回収した。得られたｉＰＳ細胞の細胞数をカウントし、ＰＡ６細胞を播種した培養皿上に０．１−１０ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、下記に示す分化培地中で３７℃、５％ ＣＯ２、８日間培養し、次いで上皮誘導培地中で３７℃、２−２７日間培養した。細胞は適宜ＰＦＡによる固定を行った。さらに、上皮誘導培地にＦＢＳを添加しない場合と添加する場合の違いについても評価した。
上皮誘導培地（ＳＤＩＡ改変法）
分化培地（−１０％ＫＳＲ）＋１０％ＦＢＳ（Ｊａｐａｎ ｂｉｏ ｓｅｒｕｍ）＊
＊分化培地からＫＳＲを除き、１０％ＦＢＳを加えたものを上皮誘導培地として用いた。
分化培地（−１０％ＫＳＲ）＋１０％ＦＢＳ（Ｊａｐａｎ ｂｉｏ ｓｅｒｕｍ）＊
＊分化培地からＫＳＲを除き、１０％ＦＢＳを加えたものを上皮誘導培地として用いた。
（２）３Ｔ３細胞上での培養
ＭＭＣ処理した３Ｔ３細胞をフィーダー細胞として播種した培養皿上に、前項と同様にして調製したｉＰＳ細胞を０．１−１０ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、分化培地中で３７℃、５％ ＣＯ２で８日間培養し、次いで上皮誘導培地中で３７℃、２−２７日間培養した。細胞は適宜ＰＦＡによる固定を行った。さらに、上皮誘導培地にＦＢＳを添加しない場合と添加する場合の違いについても評価した。
ＭＭＣ処理した３Ｔ３細胞をフィーダー細胞として播種した培養皿上に、前項と同様にして調製したｉＰＳ細胞を０．１−１０ ｘ １０３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、分化培地中で３７℃、５％ ＣＯ２で８日間培養し、次いで上皮誘導培地中で３７℃、２−２７日間培養した。細胞は適宜ＰＦＡによる固定を行った。さらに、上皮誘導培地にＦＢＳを添加しない場合と添加する場合の違いについても評価した。
３．分化誘導細胞の検証
分化誘導後の細胞について、免疫染色法により基底上皮細胞マーカーであるケラチン１４、上皮前駆細胞・幹細胞マーカーであるｐ６３、角膜上皮分化マーカーであるケラチン１２の発現をみた。また、フローサイトメトリーによりケラチン１４陽性細胞について解析した。免疫染色法及びフローサイトメトリー解析の詳細は下記に示す。
分化誘導後の細胞について、免疫染色法により基底上皮細胞マーカーであるケラチン１４、上皮前駆細胞・幹細胞マーカーであるｐ６３、角膜上皮分化マーカーであるケラチン１２の発現をみた。また、フローサイトメトリーによりケラチン１４陽性細胞について解析した。免疫染色法及びフローサイトメトリー解析の詳細は下記に示す。
＜免疫染色法＞
Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４（ケラチン１４（Ｋ１４））
冷メタノール固定（−３０℃／２０分）後、５％ＮＳＴを入れ３０分室温に置きブロッキングした。その後、１次抗体（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４（ＡＦ６４）：Ｃｏｖａｎｃｅ）で１晩反応（４℃）させた後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体に２時間反応（室温）させた。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。
Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４（ケラチン１４（Ｋ１４））
冷メタノール固定（−３０℃／２０分）後、５％ＮＳＴを入れ３０分室温に置きブロッキングした。その後、１次抗体（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４（ＡＦ６４）：Ｃｏｖａｎｃｅ）で１晩反応（４℃）させた後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体に２時間反応（室温）させた。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。
Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１２（ケラチン１２（Ｋ１２））
冷メタノール固定（−３０℃／２０分）後、５％ＮＳＴを入れ３０分室温に置きブロッキングした。その後、１次抗体（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１２（Ｌ−１５）：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１晩反応（４℃）させた後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体に２時間反応（室温）させた。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。
冷メタノール固定（−３０℃／２０分）後、５％ＮＳＴを入れ３０分室温に置きブロッキングした。その後、１次抗体（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１２（Ｌ−１５）：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１晩反応（４℃）させた後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体に２時間反応（室温）させた。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。
Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ３（ケラチン３（Ｋ３））
冷メタノール固定（−３０℃／２０分）後、５％ＮＳＴを入れ３０分室温に置きブロッキングした。その後、１次抗体（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ３／２ｐ（ＡＥ５：Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で１晩反応（４℃）させた後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体に２時間反応（室温）させた。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。
冷メタノール固定（−３０℃／２０分）後、５％ＮＳＴを入れ３０分室温に置きブロッキングした。その後、１次抗体（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ３／２ｐ（ＡＥ５：Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で１晩反応（４℃）させた後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体に２時間反応（室温）させた。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。
ｐ６３
冷メタノール固定（−３０℃／２０分）後、５％ＮＳＴを入れ３０分室温に置きブロッキングした。その後、１次抗体（ｐ６３（Ｓ−１６）：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で７２時間反応（４℃）させた後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体に２時間反応（室温）させた。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。
冷メタノール固定（−３０℃／２０分）後、５％ＮＳＴを入れ３０分室温に置きブロッキングした。その後、１次抗体（ｐ６３（Ｓ−１６）：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で７２時間反応（４℃）させた後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体に２時間反応（室温）させた。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。
＜フローサイトメトリー解析＞
Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４
細胞を０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡで回収し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞の固定および膜透過処理を行った。処理後、１次抗体（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４（ＡＦ６４）：Ｃｏｖａｎｃｅ）を１０００倍希釈で添加し、２時間室温に静置した。遠心分離によりペレットを洗浄し、さらに２次抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ａｌｅｘａ４８８）を２００倍希釈で添加し、１時間室温で静置した。遠心分離によりペレットを洗浄した後、１−２ｍｌのＰＢＳに縣濁した。縣濁液をフローサイトメーターに供与し、ケラチン１４陽性細胞率を調べた。
Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４
細胞を０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡで回収し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞の固定および膜透過処理を行った。処理後、１次抗体（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４（ＡＦ６４）：Ｃｏｖａｎｃｅ）を１０００倍希釈で添加し、２時間室温に静置した。遠心分離によりペレットを洗浄し、さらに２次抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ａｌｅｘａ４８８）を２００倍希釈で添加し、１時間室温で静置した。遠心分離によりペレットを洗浄した後、１−２ｍｌのＰＢＳに縣濁した。縣濁液をフローサイトメーターに供与し、ケラチン１４陽性細胞率を調べた。
３．１．ＫＣＭ改変法
ＫＣＭ培地によるコラーゲン上での分化誘導の結果、Ｄａｙ１０以降において、基底上皮細胞マーカーであるケラチン１４、Ｄａｙ１７以降において、ケラチン１４に加え上皮前駆細胞・幹細胞マーカーであるｐ６３の両方を発現する細胞が認められた（図１）。また、Ｄａｙ１７以降において、ケラチン１４陰性でかつ角膜上皮分化マーカーケラチン１２を発現する上皮細胞が認められた（図２：角膜上皮分化マーカーケラチン１２（ａ，ｄ）を発現し、ケラチン１４（ｂ，ｅ）を発現しない角膜上皮細胞が認められた（ｃ，ｆ））。
ＫＣＭ培地によるコラーゲン上での分化誘導の結果、Ｄａｙ１０以降において、基底上皮細胞マーカーであるケラチン１４、Ｄａｙ１７以降において、ケラチン１４に加え上皮前駆細胞・幹細胞マーカーであるｐ６３の両方を発現する細胞が認められた（図１）。また、Ｄａｙ１７以降において、ケラチン１４陰性でかつ角膜上皮分化マーカーケラチン１２を発現する上皮細胞が認められた（図２：角膜上皮分化マーカーケラチン１２（ａ，ｄ）を発現し、ケラチン１４（ｂ，ｅ）を発現しない角膜上皮細胞が認められた（ｃ，ｆ））。
ＢＭＰ４を培養系に添加することにより、上皮誘導効率は有意に増加した（図３：Ｄａｙ２８におけるＢＭＰ４を添加した場合の上皮マーカーケラチン１４陽性、ｐ６３陽性の上皮前駆細胞・幹細胞の誘導（ａ−ｄ））。ケラチン１４陽性細胞のフローサイトメトリー解析の結果、分化誘導効率は、ＢＭＰ４添加により２．９％から６．０％に増加することが確認された（図３：ｅ）。
さらに、コラーゲンの代わりに３Ｔ３細胞をフィーダーに用いることで、分化誘導効率は向上することが確認された（図４）。
３．２．ＳＤＩＡ改変法
ＰＡ６細胞をフィーダーとして、分化培地中で８日間（ａ−ｃ）、さらに上皮誘導培地中で２−２７日間培養した（図５（ｄ−ｆ）には３日目の結果を示した）。その結果、ｐ６３（ａ，ｄ）およびケラチン１４（ｂ，ｅ）を共発現する複数の上皮細胞コロニーが認められた（ｃ）。さらにＦＢＳ含有上皮誘導培地により、上皮細胞への分化が促進されることが確認された（ｄ−ｆ）。
ＰＡ６細胞をフィーダーとして、分化培地中で８日間（ａ−ｃ）、さらに上皮誘導培地中で２−２７日間培養した（図５（ｄ−ｆ）には３日目の結果を示した）。その結果、ｐ６３（ａ，ｄ）およびケラチン１４（ｂ，ｅ）を共発現する複数の上皮細胞コロニーが認められた（ｃ）。さらにＦＢＳ含有上皮誘導培地により、上皮細胞への分化が促進されることが確認された（ｄ−ｆ）。
フィーダーとして３Ｔ３細胞を用いた場合（図６：ａ−ｃ）、ＰＡ６細胞を用いた場合（図６：ｄ−ｆ）に比較して、ケラチン１４陽性、ｐ６３陽性の上皮前駆細胞・幹細胞コロニーが効率良く誘導された（１４．９％ ｖｓ ３．２％）。ケラチン１４陽性細胞のフローサイトメトリー解析の結果、Ｄａｙ２２における上皮前駆細胞・幹細胞の誘導効率は、３Ｔ３細胞とＰＡ６細胞で、それぞれ１６．８％と８．１％であった（図６：ｇ）。
４．考察
以上の結果から、ＫＣＭ改変法あるいはＳＤＩＡ改変法により、マウスｉＰＳ細胞を上皮系幹細胞・前駆細胞および角膜上皮細胞を分化誘導できることが確認された。上皮系幹細胞・前駆細胞への分化誘導効率は、ＫＣＭ改変法、ＳＤＩＡ改変法いずれの場合も、３Ｔ３細胞をフィーダーとして用いることにより、有意に向上することが確認された。
以上の結果から、ＫＣＭ改変法あるいはＳＤＩＡ改変法により、マウスｉＰＳ細胞を上皮系幹細胞・前駆細胞および角膜上皮細胞を分化誘導できることが確認された。上皮系幹細胞・前駆細胞への分化誘導効率は、ＫＣＭ改変法、ＳＤＩＡ改変法いずれの場合も、３Ｔ３細胞をフィーダーとして用いることにより、有意に向上することが確認された。
また、ＫＣＭ改変法においてはＢＭＰ４の添加により、ＳＤＩＡ改変法においては、上皮誘導培地にＦＢＳを添加することにより、上皮系幹細胞・前駆細胞への分化誘導効率が向上することが確認された。
以上の結果から、ＳＤＩＡ改変法により上皮系幹細胞・前駆細胞を分化誘導できることが確認された。
以上の結果から、ＳＤＩＡ改変法により上皮系幹細胞・前駆細胞を分化誘導できることが確認された。
実施例２：ヒトｉＰＳ細胞からの上皮細胞の分化誘導
１．ヒトｉＰＳ細胞の培養：
ヒトｉＰＳ細胞は、京都大学山中伸弥教授より供与を受けた（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２）。ヒトｉＰＳ細胞は、ＭＥＦ細胞（北山ラベス）をフィーダーとして、下記に示すＭＥＦフィーダー用培地を用いて維持した。
１．ヒトｉＰＳ細胞の培養：
ヒトｉＰＳ細胞は、京都大学山中伸弥教授より供与を受けた（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２）。ヒトｉＰＳ細胞は、ＭＥＦ細胞（北山ラベス）をフィーダーとして、下記に示すＭＥＦフィーダー用培地を用いて維持した。
すなわち、ゲラチンコートした培養皿にマイトマイシン処理したＭＥＦ細胞を播種し、これをフィーダー細胞とした。そして、この上にヒトｉＰＳ細胞を播種し、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加した霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル）を用いて３７℃、５％ ＣＯ２で維持した。
２．１．ＫＣＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）改変法
（１）コラーゲン上での培養
ＭＥＦフィーダー上のヒトｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理することにより、ｉＰＳ細胞コロニーを砕き、ピペッティング数回行うことで、ｉＰＳ細胞コロニーのクラスター集団を回収した（シングルセルにしない）。得られたｉＰＳ細胞コロニーを、ＫＣＭ培地中で、ゼラチンコーティングした培養皿上で１−２時間程度インキュベートし、上清を回収することで、ＭＥＦフィーダー細胞のみ接着させ、ヒトｉＰＳ細胞のみを回収した。得られたヒトｉＰＳ細胞コロニーのコロニー数をカウントし、４型コラーゲンコーティング培養皿上に、１０−１０００ ｃｏｌｏｎｉｅｓ／ｃｍ２の密度で播種し、下記に示すＫＣＭ培地に０．５ｎＭ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を添加して、培養を行った。
（１）コラーゲン上での培養
ＭＥＦフィーダー上のヒトｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理することにより、ｉＰＳ細胞コロニーを砕き、ピペッティング数回行うことで、ｉＰＳ細胞コロニーのクラスター集団を回収した（シングルセルにしない）。得られたｉＰＳ細胞コロニーを、ＫＣＭ培地中で、ゼラチンコーティングした培養皿上で１−２時間程度インキュベートし、上清を回収することで、ＭＥＦフィーダー細胞のみ接着させ、ヒトｉＰＳ細胞のみを回収した。得られたヒトｉＰＳ細胞コロニーのコロニー数をカウントし、４型コラーゲンコーティング培養皿上に、１０−１０００ ｃｏｌｏｎｉｅｓ／ｃｍ２の密度で播種し、下記に示すＫＣＭ培地に０．５ｎＭ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を添加して、培養を行った。
＜コーティング法＞
４型コラーゲン（新田ゼラチン）を希塩酸（ｐＨ３）で１０倍希釈し、培養皿に薄く塗り広げ、クリーンベンチ内で３０分以上置き乾燥させた。使用前にＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅｓ（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回洗浄した。
４型コラーゲン（新田ゼラチン）を希塩酸（ｐＨ３）で１０倍希釈し、培養皿に薄く塗り広げ、クリーンベンチ内で３０分以上置き乾燥させた。使用前にＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅｓ（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回洗浄した。
２．２．分化誘導系（ＳＤＩＡ改変法）の準備
（１）ＰＡ６細胞上での培養
ＭＥＦフィーダー上のヒトｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理することにより、ｉＰＳ細胞コロニーを砕き、ピペッティング数回行うことで、ｉＰＳ細胞コロニーのクラスター集団を回収した（シングルセルにしない）。得られたｉＰＳ細胞コロニーを、０．５ｎＭ ＢＭＰ４を含んだ分化培地中で、ゼラチンコーティングした培養皿上で１−２時間程度インキュベートし、上清を回収することで、ＭＥＦフィーダー細胞のみ接着させ、ヒトｉＰＳ細胞のみを回収した。得られたヒトｉＰＳ細胞コロニーのコロニー数をカウントし、ＰＡ６細胞を播種した培養皿上に１００−１０００ ｃｏｌｏｎｉｅｓ／ｃｍ２の密度で播種し、下記に示す分化培地中で３７℃、５％ ＣＯ２で８日間培養し、次いで上皮誘導培地中で３７℃、７−２２日間培養した。細胞は適宜ＰＦＡによる固定を行った。さらに、上皮誘導培地にＦＢＳを添加しない場合と添加する場合の違いについても評価した。
（１）ＰＡ６細胞上での培養
ＭＥＦフィーダー上のヒトｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理することにより、ｉＰＳ細胞コロニーを砕き、ピペッティング数回行うことで、ｉＰＳ細胞コロニーのクラスター集団を回収した（シングルセルにしない）。得られたｉＰＳ細胞コロニーを、０．５ｎＭ ＢＭＰ４を含んだ分化培地中で、ゼラチンコーティングした培養皿上で１−２時間程度インキュベートし、上清を回収することで、ＭＥＦフィーダー細胞のみ接着させ、ヒトｉＰＳ細胞のみを回収した。得られたヒトｉＰＳ細胞コロニーのコロニー数をカウントし、ＰＡ６細胞を播種した培養皿上に１００−１０００ ｃｏｌｏｎｉｅｓ／ｃｍ２の密度で播種し、下記に示す分化培地中で３７℃、５％ ＣＯ２で８日間培養し、次いで上皮誘導培地中で３７℃、７−２２日間培養した。細胞は適宜ＰＦＡによる固定を行った。さらに、上皮誘導培地にＦＢＳを添加しない場合と添加する場合の違いについても評価した。
上皮誘導培地（ＳＤＩＡ改変法）
分化培地（−１０％ＫＳＲ）＋ １０％ＦＢＳ（Ｊａｐａｎ ｂｉｏ ｓｅｒｕｍ）＊
＊分化培地からＫＳＲを除き、１０％ＦＢＳを加えたものを上皮誘導培地として用いた。
分化培地（−１０％ＫＳＲ）＋ １０％ＦＢＳ（Ｊａｐａｎ ｂｉｏ ｓｅｒｕｍ）＊
＊分化培地からＫＳＲを除き、１０％ＦＢＳを加えたものを上皮誘導培地として用いた。
（２）３Ｔ３細胞上での培養
ＭＭＣ処理した３Ｔ３細胞をフィーダー細胞として播種した培養皿上に、前項と同様にして調製したヒトｉＰＳ細胞コロニーを１０−１０００ ｃｏｌｏｎｉｅｓ／ｃｍ２の密度で播種し、分化培地中で３７℃、５％ ＣＯ２で８日間培養し、次いで上皮誘導培地中で３７℃、７−２２日間培養した。細胞は適宜ＰＦＡによる固定を行った。さらに、上皮誘導培地にＦＢＳを添加しない場合と添加する場合の違いについても評価した。
ＭＭＣ処理した３Ｔ３細胞をフィーダー細胞として播種した培養皿上に、前項と同様にして調製したヒトｉＰＳ細胞コロニーを１０−１０００ ｃｏｌｏｎｉｅｓ／ｃｍ２の密度で播種し、分化培地中で３７℃、５％ ＣＯ２で８日間培養し、次いで上皮誘導培地中で３７℃、７−２２日間培養した。細胞は適宜ＰＦＡによる固定を行った。さらに、上皮誘導培地にＦＢＳを添加しない場合と添加する場合の違いについても評価した。
３．分化誘導細胞の検証
実施例１と同様にして、分化誘導後の細胞について、免疫染色法による解析を行った。
その結果、ヒトｉＰＳ細胞からＫＣＭ改変法を用いて、ｄａｙ１５において、ケラチン１４陽性上皮前駆細胞およびケラチン１２陽性角膜上皮細胞を誘導可能であることが示された（図７）。また、ＳＤＩＡ改変法により、ｄａｙ１５においては、ＰＡ６細胞をフィーダーに用いた場合ではほとんどケラチン１４陽性上皮前駆細胞は認められなかったが、３Ｔ３フィーダー細胞をフィーダーに用いた場合では多くのケラチン１４陽性細胞が認められた（図８）。
実施例１と同様にして、分化誘導後の細胞について、免疫染色法による解析を行った。
その結果、ヒトｉＰＳ細胞からＫＣＭ改変法を用いて、ｄａｙ１５において、ケラチン１４陽性上皮前駆細胞およびケラチン１２陽性角膜上皮細胞を誘導可能であることが示された（図７）。また、ＳＤＩＡ改変法により、ｄａｙ１５においては、ＰＡ６細胞をフィーダーに用いた場合ではほとんどケラチン１４陽性上皮前駆細胞は認められなかったが、３Ｔ３フィーダー細胞をフィーダーに用いた場合では多くのケラチン１４陽性細胞が認められた（図８）。
実施例３：上皮細胞への分化誘導に対するレチノイン酸の効果（ＫＣＭ改変法）
実施例１に示したＫＣＭ改変法において、レチノイン酸添加によるマウスｉＰＳ細胞あるいはＥＳ細胞から上皮細胞への分化誘導効率の影響を調べた。
実施例１に示したＫＣＭ改変法において、レチノイン酸添加によるマウスｉＰＳ細胞あるいはＥＳ細胞から上皮細胞への分化誘導効率の影響を調べた。
１．レチノイン酸存在下での分化誘導
（１）免疫染色法
実施例１にしたがい、マウスｉＰＳ細胞を（ｉ）ＫＣＭ培地、（ｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４添加ＫＣＭ培地、（ｉｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４＋１μＭレチノイン酸添加ＫＣＭ培地を用いて、コラーゲン上で培養を行った。
同様に、マウスＥＳ細胞（ＲＦ８，Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＤｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｆａｒｅｓｅ，Ｊｒ．より提供）を、（ｉ）ＫＣＭ培地、（ｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４添加ＫＣＭ培地、（ｉｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４＋１μＭレチノイン酸添加ＫＣＭ培地を用いて、コラーゲン上で培養を行った。
（１）免疫染色法
実施例１にしたがい、マウスｉＰＳ細胞を（ｉ）ＫＣＭ培地、（ｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４添加ＫＣＭ培地、（ｉｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４＋１μＭレチノイン酸添加ＫＣＭ培地を用いて、コラーゲン上で培養を行った。
同様に、マウスＥＳ細胞（ＲＦ８，Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＤｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｆａｒｅｓｅ，Ｊｒ．より提供）を、（ｉ）ＫＣＭ培地、（ｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４添加ＫＣＭ培地、（ｉｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４＋１μＭレチノイン酸添加ＫＣＭ培地を用いて、コラーゲン上で培養を行った。
２１日間培養（分化誘導）後の細胞について、それぞれｐ６３（赤）及びケラチン１４（Ｋ１４：緑）の発現を免疫染色法により検討した。結果を図９に示す（Ａ−Ｃ：マウスｉＰＳ（ＫＣＭ）、Ｄ−Ｆ：マウスｉＰＳ（ＫＣＭ＋ＢＭＰ）、Ｇ−Ｉ：マウスｉＰＳ（ＫＣＭ＋ＢＭＰ＋レチノイン酸）、Ｊ−Ｌ：マウスＥＳ（ＫＣＭ＋ＢＭＰ＋レチノイン酸））。
図９に示されるように、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞のいずれにおいても、１μＭレチノイン酸を添加した場合に、上皮細胞マーカーであるｐ６３及びケラチン１４（Ｋ１４）の高い発現が見られることが確認された。
図９に示されるように、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞のいずれにおいても、１μＭレチノイン酸を添加した場合に、上皮細胞マーカーであるｐ６３及びケラチン１４（Ｋ１４）の高い発現が見られることが確認された。
（２）リアルタイムＰＣＲ
前項と同様にして、マウスｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞を（ｉ）ＫＣＭ培地、（ｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４添加ＫＣＭ培地、（ｉｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４＋１μＭレチノイン酸添加ＫＣＭ培地を用いて、コラーゲン上で培養し、各誘導日数における、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ΔＮｐ６３、ケラチン１４（Ｋ１４）の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した。結果を図１０に示す（Ａ：Ｏｃｔ３／４、Ｂ：Ｎａｎｏｇ、Ｃ：ΔＮｐ６３、Ｄ：ケラチン１４（Ｋ１４））。なお図中レチノイン酸添加群のＤａｙ０前は、レチノイン酸を添加したうえで、ＳＮＬフィーダー上での通常培養を行っている（実施例１参照）。
前項と同様にして、マウスｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞を（ｉ）ＫＣＭ培地、（ｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４添加ＫＣＭ培地、（ｉｉｉ）０．５ｎｍ ＢＭＰ４＋１μＭレチノイン酸添加ＫＣＭ培地を用いて、コラーゲン上で培養し、各誘導日数における、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ΔＮｐ６３、ケラチン１４（Ｋ１４）の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した。結果を図１０に示す（Ａ：Ｏｃｔ３／４、Ｂ：Ｎａｎｏｇ、Ｃ：ΔＮｐ６３、Ｄ：ケラチン１４（Ｋ１４））。なお図中レチノイン酸添加群のＤａｙ０前は、レチノイン酸を添加したうえで、ＳＮＬフィーダー上での通常培養を行っている（実施例１参照）。
図１０に示されるように、ＥＳ細胞マーカーであるＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇはいずれの分化誘導法によってもＤａｙ７以降にほぼ消失した。一方ｄａｙ７以降において上皮前駆細胞マーカーΔＮｐ６３やＫ１４発現が上昇し、その発現量はＢＭＰ４とレチノイン酸を添加した場合に最も高い傾向を示した。
３．考察
以上の結果から、ＫＣＭ改変法によるｉＰＳ細胞あるいはＥＳ細胞からの上皮細胞への分化誘導は、レチノイン酸の添加によって顕著に向上することが確認された。
以上の結果から、ＫＣＭ改変法によるｉＰＳ細胞あるいはＥＳ細胞からの上皮細胞への分化誘導は、レチノイン酸の添加によって顕著に向上することが確認された。
実施例４：上皮細胞への分化誘導に対するレチノイン酸の効果（ＳＤＩＡ改変法）
実施例２に示した分化培地にレチノイン酸を添加し、ヒトｉＰＳ細胞から上皮細胞への分化誘導に対する影響を調べた。
なお、発明者らは、ヒトｉＰＳ細胞については、ＫＣＭ培地を用いた場合に誘導効率が向上することを確認しているため、ここではＫＣＭ培地を利用した。
実施例２に示した分化培地にレチノイン酸を添加し、ヒトｉＰＳ細胞から上皮細胞への分化誘導に対する影響を調べた。
なお、発明者らは、ヒトｉＰＳ細胞については、ＫＣＭ培地を用いた場合に誘導効率が向上することを確認しているため、ここではＫＣＭ培地を利用した。
１．レチノイン酸存在下での分化誘導
実施例２にしたがい、ヒトｉＰＳ細胞を細胞塊として３Ｔ３もしくはＰＡ６フィーダー上に播種し、０．５ｎｍ ＢＭＰ４と１μＭレチノイン酸を添加した分化培地を用いて培養した後、８日目にＫＣＭ培地に交換し、さらに隔日で培地を交換しながら２−８週間培養を行った。
培養方法の概要を以下に示す。
実施例２にしたがい、ヒトｉＰＳ細胞を細胞塊として３Ｔ３もしくはＰＡ６フィーダー上に播種し、０．５ｎｍ ＢＭＰ４と１μＭレチノイン酸を添加した分化培地を用いて培養した後、８日目にＫＣＭ培地に交換し、さらに隔日で培地を交換しながら２−８週間培養を行った。
培養方法の概要を以下に示す。
培養後の細胞について、それぞれｐ６３（赤）及びケラチン１４（Ｋ１４：緑）の発現を免疫染色法により検討した。３Ｔ３フィーダー上で０．５ｎｍ ＢＭＰ４と１μＭのレチノイン酸を添加した分化培地とＫＣＭ培地を用いて１５日間（分化培地８日間＋ＫＣＭ培地７日間）及び２９日間（分化培地８日間＋ＫＣＭ培地２１日間）培養した結果、レチノイン酸を添加せずに０．５ｎｍ ＢＭＰ４を添加した分化培地とＫＣＭ培地を用いて１５日間培養した結果、３Ｔ３フィーダー上で０．５ｎｍ ＢＭＰ４と１μＭのレチノイン酸を添加した分化培地と上皮誘導培地を用いて１５日間（分化培地８日間＋上皮誘導培地７日間）培養した結果をそれぞれ図１１Ａ〜Ｄに示す。またＰＡ６フィーダー上で１μＭのレレチノイン酸を添加した分化培地を用いて１５日間（分化培地８日間＋ＫＣＭ培地７日間）培養した結果を図１２に示す。
３Ｔ３フィーダー上での培養では、Ｄａｙ１５で上皮細胞マーカーであるｐ６３の高い発現が見られ（図１１Ａ）、さらにｐ６３の発現に続いてＫ１４の発現も確認された（図１１Ｂ）が、レチノイン酸を添加しない場合はＤａｙ１５でもｐ６３陽性細胞は出現せず（図１１Ｃ）、Ｄａｙ１５以降もｐ６３もＫ１４陽性の細胞はほとんど出現しなかった。ＰＡ６フィーダー上でレチノイン酸を添加した場合では、３Ｔ３フィーダーを用いた場合と同様に、Ｄａｙ１５で上皮細胞マーカーであるｐ６３の高い発現が見られた（図１２）。また、ＳＤＩＡ法で通常用いられる分化培地＋上皮誘導培地ではレチノイン酸を添加してもＤａｙ１５ではｐ６３陽性細胞は出現しなかった（図１１Ｄ）。
３．考察
以上の結果から、ＳＤＩＡ改変法においても、レチノイン酸の添加が上皮細胞への分化誘導に有用であることが確認された。また、ヒトｉＰＳ細胞からの上皮細胞誘導効率は、ＳＤＩＡ法で通常用いられる分化培地＋上皮誘導培地よりも、分化培地＋ＫＣＭ培地のほうが優れていることが確認された。
以上の結果から、ＳＤＩＡ改変法においても、レチノイン酸の添加が上皮細胞への分化誘導に有用であることが確認された。また、ヒトｉＰＳ細胞からの上皮細胞誘導効率は、ＳＤＩＡ法で通常用いられる分化培地＋上皮誘導培地よりも、分化培地＋ＫＣＭ培地のほうが優れていることが確認された。
本発明は、ドナー不足や拒絶反応の心配がない。角膜上皮疾患に対する新たな再生医療として有用である。さらに、本発明の上皮系幹細胞・前駆細胞を細胞源として、表皮細胞、口腔粘膜上皮など様々な重層化上皮を再生することが可能である。すなわち、本発明は様々な上皮疾患に対する自家再生医療技術の基盤技術として応用しうる。さらに、本発明を利用してＨＬＡジェノタイプ別に上皮細胞を創出することにより、拒絶反応の軽減可能な上皮細胞バンクを作製することも可能である。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
Claims (24)
- 哺乳動物体細胞または未分化幹細胞より誘導された人工多能性幹細胞から、ケラチン１４陽性かつｐ６３陽性の上皮系前駆細胞・幹細胞群を分化誘導する方法であって：
前記人工多能性幹細胞を、フィーダー細胞あるいはコラーゲン、基底膜マトリックス、羊膜、フィブロネクチン、及びラミニンから選ばれる支持体上で、上皮成長因子及び／又はコレラ毒素と、血清とを含む表皮細胞用培地を用いて培養することを特徴とする方法。 - 培地がさらにハイドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、及びセレニウムから選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- フィーダー細胞が間質細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
- 間質細胞が３Ｔ３細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 培地がＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）及び／又はレチノイン酸を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 胚葉体形成を介さずに上皮系前駆細胞・幹細胞群に分化誘導することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 哺乳動物体細胞または未分化幹細胞から誘導された人工多能性幹細胞から、ケラチン１４陽性、ｐ６３陽性の上皮系前駆細胞・幹細胞群を分化誘導する方法であって：
前記人工多能性幹細胞を、３Ｔ３細胞上あるいは３Ｔ３細胞由来の分化因子存在下で培養することを特徴とする前記方法。 - 血清及び／又はＢＭＰ４を含む上皮誘導培地、あるいは上皮成長因子及び／又はコレラ毒素と、血清とを含む表皮細胞用培地を用いて培養することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
- 上皮誘導培地が、さらにレチノイン酸、非必須アミノ酸、βメルカプトエタノール、及びピルビン酸ナトリウムから選ばれる１又は２以上を含み、表皮細胞用培地がさらにハイドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、及びセレニウムから選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
- 血清代替物、ＢＭＰ４、及びレチノイン酸から選ばれる１又は２以上を含む分化培地を用いて培養したのち、さらに上皮誘導培地又は表皮細胞用培地を用いて培養することを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
- 分化培地が、さらに非必須アミノ酸、βメルカプトエタノール、及びピルビン酸ナトリウムから選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
- 上皮誘導培地がＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４）含むことを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法によって分化誘導された上皮系前駆細胞・幹細胞群を、さらに上皮細胞群に分化させることを特徴とする、上皮細胞群の分化誘導方法。
- 前記上皮細胞群が角膜上皮細胞群、口腔粘膜上皮細胞群、膀胱上皮細胞群、結膜上皮細胞群、胃粘膜上皮細胞群、小腸上皮細胞群、大腸上皮細胞群、腎臓上皮細胞群、尿細管上皮細胞群、歯肉粘膜上皮細胞群、食道上皮細胞群、肝臓上皮細胞群、膵臓上皮細胞群、肺上皮細胞群および胆嚢上皮細胞群から選ばれるいずれかである、請求項１３記載の方法。
- 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法において、培養を続けることにより、前記上皮系前駆細胞・幹細胞群からケラチン１２陽性の角膜上皮細胞群を分化誘導する方法。
- さらにケラチン１４陽性かつｐ６３陽性の細胞群を単離する工程を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
- さらにケラチン１２陽性かつケラチン１４陰性の細胞群を単離する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
- 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された上皮細胞群を含む培養物。
- 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は角膜上皮細胞群を含む培養物。
- 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された上皮細胞群を含む上皮系疾患用細胞製剤。
- 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は角膜上皮細胞群を含む上皮系疾患用細胞製剤。
- 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された上皮細胞群を重層化して含む細胞シート。
- 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法で得られた上皮系前駆細胞・幹細胞群、及び／又は角膜上皮細胞群を重層化して含む細胞シート。
- 細胞が重層化培養によって重層化されたものである、請求項２２又は２３に記載の細胞シート。
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| US20120142103A1 (en) | 2012-06-07 |
| WO2010134619A1 (ja) | 2010-11-25 |
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