FR2878860A1 - Lignees de cellules souches humaines derivees de cellules es et utilisations pour la production de vaccins et de proteines recombinantes - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte au domaine de la biologie et de la virologie. En particulier, l'invention se rapporte à un procédé d'obtention de lignées de cellules humaines, notamment de cellules souches humaines dérivées de cellules embryonnaires humaines, comprenant un sevrage du serum, du tapis nourricier et d'au moins un facteur de croissance. Ces lignées sont capables de proliférer indéfiniment dans un milieu de culture de base. L'invention porte également sur l'utilisation des cellules dérivant de telles lignées pour la réplication de virus, et plus particulièrement pour la production de vaccins humains ou vétérinaires, ainsi que pour la production de protéines recombinantes d'intérêt thérapeutique.

Description

La présente invention se rapporte au domaine de la biologie et de la

virologie. En particulier, l'invention se rapporte à un procédé d'obtention de lignées de cellules humaines, notamment de cellules souches humaines dérivées de cellules embryonnaires humaines, comprenant un sevrage du serum, du tapis nourricier et d'au moins un facteur de croissance. Ces lignées sont capables de proliférer indéfiniment dans un milieu de

culture de base. L'invention porte également sur l'utilisation des cellules dérivant de telles lignées pour la réplication de virus, et plus particulièrement pour la production dé vaccins humains ou vétérinaires, ainsi que pour la production de protéines recombinantes d'intérêt thérapeutique.

Historiquement, l'industrie du vaccin a utilisé, et utilise encore aujourd'hui, les oeufs embryonnés pour produire nombre de vaccins tels que le vaccin contre la grippe humaine. Cependant, ce système de production à base d'oeufs embryonnés présente de nombreuses limitations telles que: (i) une qualité biologique variable des oeufs, à cause de la présence d'agents accidentels (virus, toxines...) ou de problèmes de stérilité, (ii) l'absence de constance dans l'approvisionnement en oeufs tout au long de l'année, (iii) l'absence de flexibilité dans la production des oeufs en cas d'une augmentation soudaine de la demande (i. e. dans le cas d'une épidémie ou d'une pandémie soudaine), (iv) un coût financier important. Une solution apportée par l'industrie pharmaceutique aux problèmes de production dans les oeufs a consisté à produire les vaccins sur culture cellulaire. En effet, les virus et vecteurs viraux peuvent être répliqués et cultivés dans un grand nombre de cellules primaires diploïdes, telles que les cellules de rein de singe, les cellules de reins de veau, les cellules de rein d'hamster et les fibroblastes d'embryons de poulet. Par exemple, la réplication et la propagation de certains virus tels les poxvirus sont réalisées dans des cultures de cellules primaires de fibroblastes d'embryons de poulets (CEF pour chicken embryo fibroblasts ). Cependant ces cellules primaires souffrent de nombreux désavantages, tels que la contamination par des agents accidentels et/ou pathogènes (bactéries, mycoplasmes, levures...), une qualité variable des cellules en culture, des sensibilités différentes à des variants d'un même virus, des faibles titres viraux, des coûts élevés de production des virus, la nécessité de ré-établir des cellules primaires à chaque préparation de vaccin, la nécessité d'utiliser des sera d'origine animale pour complémenter le milieu de culture, avec les risques inhérents de contamination par des mycoplasmes, des virus ou les agents de l'encéphalite spongiforme bovine (B SE) et enfin les difficultés à obtenir et à préparer de telles cellules en culture.

C'est la raison pour laquelle, il a été proposé l'utilisation de lignées cellulaires continues immortalisées pour la réplication de virus ou de vecteurs viraux. Ainsi, des lignées continues d'origine animale telles par exemple la lignée cellulaire MDCK dérivée du rein de chien Madin-Darby (Tobita et al., 1975 Med. Microbiol. Immunol. 162: 9-14), la lignée cellulaire VERO dérivée du rein de singe vert d'Afrique (US5,824, 536), la lignée cellulaire BHK21 dérivée de rein de bébé hamster ont été établies. Des lignées humaines telles PER.C6 (WO01/38362) ont été également développées pour la production de vaccin. Cependant, les lignées cellulaires continues actuellement disponibles ne donnent pas totalement satisfaction. Ainsi, certaines lignées éellulaires de par leur spécificité d'espèce ne répliquent pas, ou mal, certains virus animaux. Egalement, certaines lignées cellulaires ne permettent pas d'atteindre une productivité virale économiquement rentable. Par ailleurs l'exploitation industrielle de certaines lignées est parfois difficile car il est nécessaire de disposer de cellules capables de croître en milieu asérique et en suspension. De plus, certaines de ces lignées continues sont susceptibles de ne pas satisfaire aux exigences réglementaires car elles ont un caryotype instable et anormal, et/ou sont transformées génétiquement et/ou sont tumorigéniques in vivo . Ces considérations réglementaires constituent un point particulièrement important lorsqu'on envisage d'utiliser une lignée cellulaire à partir de laquelle des vaccins seront isolés. Enfin, il convient également de mentionner l'existence d'une forte protection industrielle sur les lignées cellulaires continues les plus performantes. Pour ces différentes raisons, les entreprises pharmaceutiques et vétérinaires dans le domaine de vaccin sont à la recherche de nouvelles lignées cellulaires continues ne présentant pas ces inconvénients.

Les problèmes rencontrés avec les lignées cellulaires continues dans le domaine du vaccin se retrouvent également dans le domaine de la production de protéines recombinantes dans des lignées cellulaires continues. Outre les aspects réglementaires liés à la sécurité et la stabilité des lignées continues, la limitation majeure rencontrée réside dans la productivité de la cellule. Il est en effet nécessaire de disposer d'une cellule capable de croître en suspension indéfiniment dans un milieu sans serum.

Pris dans son ensemble, l'analyse de l'art antérieur fait apparaître un besoin inassouvi et longtemps attendu, de développer une cellule capable d'assurer la réplication de virus et de vecteurs viraux, mais également de production de protéines recombinantes, dans un système cellulaire ne présentant pas les désavantages des systèmes de production existant tels les oeufs embryonnés de poulets, les cellules primaires diploïdes ou les lignées cellulaires continues actuellement disponibles.

C'est le problème que se propose de résoudre la présente invention en proposant un procédé d'obtention de lignées de cellules souches humaines adaptées à une utilisation par l'industrie pharmaceutique. En effet, différents documents de l'art antérieur décrivent la mise en culture et le maintien en culture de cellules souches embryonnaires humaines primaires. Thomson et al. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 7844; US5,843,780) ont été les premiers à cultiver avec succès des cellules souches de primates. Ils sont subséquemment dérivés des lignées de cellules souches embryonnaires humaines à partir de blastocystes (1998, Science 282: 114). Gearhart et al. ont dérivé des lignées cellulaires de cellules embryonnaires germinales humaines (hEG) à partir de tissus foetaux gonadiques (WO98/43679). Néanmoins à ce jour, les cellules souches embryonnaires humaines primaires décrites ne sont pas adaptées à leur utilisation industrielle compte tenu de la nécessité de les cultiver en adhérence en milieu complet en présence de facteurs de croissance, de sérum animal et de cellules nourricières. La présente invention entend résoudre ce problème en fournissant un procédé permettant d'obtenir des lignées de cellules souches humaines, le dit procédé comprenant les étapes suivantes: a) culture des cellules souches humaines dans un milieu de culture complet contenant l'ensemble des facteurs permettant leur croissance, un couche de cellules nourricières, de préférence inactivée par irradiation, et complémenté en sérum; b) passages successifs en modifiant le milieu de culture de sorte à obtenir un sevrage progressif ou total en cellules nourricières, et/ou facteurs de croissance, et/ou en sérum. De manière préférée, la séquence du sevrage du milieu de culture est: sevrage en facteurs de croissance, puis sevrage en cellules nourricières, puis sevrage en sérum; c) établissement de lignées cellulaires humaines adhérentes et non-adhérentes capables de proliférer dans un milieu de culture de base en absence de cellules nourricières, et facultativement en absence de facteurs de croissance exogènes et/ou contenant une faible concentration sérique, voire ne contenant pas de sérum dans le milieu de culture.

Le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape préliminaire d'obtention d'une population de cellules souches humaines. Par cellule souche au sens de la présente invention, on entend désigner une cellule indifférenciée, issue de l'embryon, du foetus ou de l'adulte. La cellule souche est caractérisée par ses capacités d'auto- renouvellement (c'est-à-dire multiplication à l'identique pour produire de nouvelles cellules souches), de différentiation dans certaines conditions de culture (afin d'engendrer des cellules spécialisées) et de prolifération en culture. Selon un premier mode de réalisation, la cellule souche humaine selon l'invention est une cellule souche totipotente issues des premières divisions de l'oeuf fécondé jusqu'au quatrième jour du développement. Ces cellules souches totipotentes ont potentiellement la capacité de régénérer un individu complet. Selon un second mode de réalisation de l'invention, la cellule souche humaine selon l'invention est une cellule souche pluripotente, encore appelée cellule souche embryonnaire ES. Les cellules ES sont présentes jusqu'à une centaine de cellules dans la masse interne de l'embryon au stade blastocyste (du sème au 7ème jour après la fécondation). Les cellules ES sont capables de participer à la formation de tous les tissus de l'organisme (plus de 200 types cellulaires). Selon un troisième mode de réalisation, la cellule souche humaine selon l'invention est une cellule souche multipotente. Ces cellules qui sont présentes dans les tissus foetaux ou adultes possèdent des capacités d'auto-renouvellement et peuvent donner naissance à plusieurs types de cellules. Ces cellules sont engagées dans un programme tissulaire spécifique, telles les cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse et du sang du cordon. Selon un quatrième mode de réalisation, la cellule souche humaine selon 10 l'invention est une cellule souche unipotente. Ces cellules ne génèrent qu'un seul type de cellules différenciées en gardant certaines capacités d'auto-renouvellement et de prolifération (exemples: hépatocytes du foie, kératinocytes de la peau...). Selon un cinquième mode de réalisation, la cellule souche humaine selon l'invention est une cellule progénitrice intermédiaire. Ces cellules n'ont pas ou peu de capacité de renouvellement et se divisent uniquement en cellules différenciées. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la cellule souche selon l'invention est une cellule souche embryonnaire (ES) humaine isolée ou propagée à partir d'un blastocyste humain.

De préférence, la cellule souche humaine selon l'invention n'a pas été 15 transformée chimiquement ou à l'aide d'un agent biologique (virus, acide nucléique...).

Selon un mode préféré, la présente invention concerne un procédé d'obtention de lignées continues de cellules souches.humaines non transformées, indifférenciées et capables de proliférer indéfiniment en culture, caractérisé en ce que le dit procédé comprend les étapes suivantes: a) Culture sur un tapis de cellules nourricières de cellules souches humaines primaires dans un milieu de culture complet comprenant au moins: du sérum animal; un facteur de croissance exogène sélectionné parmi: FGF (Fibroblast 25 Growth Factor), le facteur des cellules souches (SCF) et l'IGF1 (Insulin- like growth factor 1) ; un facteur de croissance exogène sélectionné parmi les ligands au récepteur qui peut former un hétéro-dimère avec la glycoprotéine gp130. Parmi les ligands, il convient de citer le Leukemia Inhibitory factor (LIF), l'interleukine 11 (IL11), l'interleukine 6 (IL6), le récepteur à l'interleukine 6 (IL6R), le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF), l'oncostatine, la cardiotrophine.

b) Passages successifs dans un milieu de culture identique ou différent, de sorte à obtenir un sevrage du tapis cellulaire nourricier, un sevrage total ou partiel des dits facteurs de croissance exogènes et un sevrage total ou partiel du serum.

c) facultativement, sélection de colonies cellulaires ayant des morphologies compactes et composées de cellules ayant un rapport nucléocytoplasmique élevé et un nucléole proéminent.

d) Etablissement des dites lignées continues de cellules souches humaines dérivées de cellules embryonnaires capables de croître en absence de cellules nourricières.

De manière préférée, les dites lignées obtenues à l'étape d) sont capables de croître dans un milieu de culture totalement déplété en facteurs de croissance. De manière encore plus préférée, les dites lignées obtenues à l'étape d) sont capables de croître dans un milieu de culture totalement déplété en facteurs de croissance et totalement déplété en sérum.

Les dites cellules souches humaines primaires sont sélectionnées parmi les cellules souches totipotentes, les cellules souches pluripotentes, les cellules souches multipotentes, les cellules souches unipotentes, les cellules progénitrices intermédiaires. De manière préférée, la dite cellule souche humaine primaire est une cellule souche pluripotente, c'est-à-dire une cellule souche embryonnaire (ES).

Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une sous- étape al) de l'étape a) consistant à dissocier les amas cellulaires formés en culture, caractérisé en ce que la dissociation est réalisée enzymatiquement et/ou mécaniquement. Lorsqu'elle est réalisée enzymatiquement, on utilise de préférence de la trypsine, de la pronase ou de la collagénase. La dissociation mécanique est réalisée avec un grattoir ou à l'aide d'un objet tranchant permettant de fractionner les amas compacts de cellules en petits groupes cellulaires facilitant l'amplification des cultures après repiquage ou d'individualiser les cellules composant les amas cellulaires.

Les termes facteur de croissance OU facteur permettant leur croissance , utilisé indifféremment dans la présente invention signifie une substance chimique ou biologique (en général il s'agit d'un peptide ou d'une protéine) nécessaire à la survie et la croissance des cellules humaines en culture. Il est possible de distinguer schématiquement deux familles de facteurs de croissance: les cytokines et les facteurs trophiques. Les cytokines sont essentiellement des protéines dont l'action se fait via le récepteur qui est associé avec la protéine GP130. Ainsi, le LIF (Leukemia Inhibitory Factor), l'interleukine 11 (11-11), l'interleukine 6 (Il-6), le récepteur de l'interleukine 6 (Il-6R), le Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), l'oncostatine et la cardiotrophine ont un mode d'action similaire avec le recrutement au niveau du récepteur d'une chaîne spécifique et de la combinaison de cette dernière avec la protéine GP130 sous la forme monomérique ou parfois hétérodimérique. Les facteurs trophiques sont principalement le SCF, l'IGF-1 et le FGF.

Par milieu de culture complet , on entend désigner un milieu de base complémenté avec des vitamines, nutriments, sels minéraux, facteurs de croissance, sérum, composés divers pour assurer une croissance optimisée des cellules en culture. Selon la présente invention, un milieu de base signifie un milieu dont la formulation permet d'assurer la survie des cellules en culture, et une croissance minimale. Des exemples de milieux de base (ou milieux basiques) sont par 'exemple le milieu BME (Basal Eagle Medium), MEM (Minimum Eagle's Medium), medium 199, DMEM (Dulbeco's Modified Eagle Medium) , GMEM (Galsgow Modified Eagle's Medium), DMEM-HamF12, Ham-F12 and Ham-FlO, Iscove's Modified Dulbecco's Medium, MacCoy's 5A medium, RPMI 1640. Le milieu de base comprend des sels minéraux (par exemple: CaCl2, KC1, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, MgSO4,...), des acides aminés, des vitamines (thiamine, riboflavine, acide folique, panthothénate de calcium,...) et d'autres composants tels le glucose. Il peut être nécessaire de complémenter le milieu de base avec au moins un des composés suivants: du sérum animal, de la L-glutamine, du pyruvate de sodium, du béta mercaptoéthanol, des acides aminés, des vitamines, des facteurs de croissance pour générer un milieu complet.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le dit milieu complet à l'étape a) comprend du sérum, et au moins du FGF et du LIF. Selon un autre mode de réalisation le dit milieu complet à l'étape a) comprend du sérum, du FGF, du LIF et au moins un composé choisi parmi IL- 6, IL6R, IL11, CNTF et IGF1. Selon encore un autre mode de réalisation le dit milieu complet à l'étape a) comprend du sérum, du FGF, du LIF, IL6, IL6R, IL11, CNTF et IGF1. De préférence le FGF selon l'invention est sélectionné parmi basic FGF, FGF3 et FGF4. La concentration des facteurs de croissance dans le milieu de base est comprise entre environ 0,01 à 10 ng/ml, de préférence 0,1 à 5 ng/ml, et de manière préférée environ 1 ng/ml.

Selon un mode préféré de réalisation, le tapis cellulaire nourricier de l'étape a) se compose de fibroblastes choisis parmi des fibroblastes humains primaires, des fibroblastes humains établis en lignée, des fibroblastes primaires de mammifères, des fibroblastes de mammifères établis en lignée. De préférence, il s'agit de fibroblastes de mammifères, plus particulièrement de fibroblastes de souris établis en lignée, de préférence des cellules STO transformées ou non. De préférence le tapis cellulaire nourricier est inactivé. Il peut être inactivé chimiquement par un traitement à la mitomycine par exemple ou physiquement par exposition à des rayons physiques tels les rayons X ou gamma.

La présente invention repose sur la découverte que le passage d'un milieu de culture cellulaire de base complémenté en facteurs de croissance contenant du sérum animal et des cellules nourricières, à un milieu asérique dépourvu de facteurs de croissance, ne peut être réalisé par leur simple retrait du milieu de culture de base. Le procédé de déprivation selon l'invention nécessite de réaliser la déprivation en facteurs de croissance, en cellules nourricières et en sérum de manière séquentielle et progressive.

Afin de réaliser avec succès la déprivation en facteurs de croissance, il est important que le milieu complet de départ dans lequel sont mises en culture les cellules souches humaines prélévées chez un individu comporte au moins deux, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 8 facteurs de croissance différents afin que la cellule lorsqu'elle sera déprivée en l'un de ses facteurs puissent s'adapter et compenser cette déprivation en développant un chemin métabolique alterne. De manière préférée, lorsque le milieu comporte au moins deux facteurs de croissance différents, il s'agit de LIF et de FGF.

La modification du milieu de culture à l'étape b) du procédé de l'invention, de sorte à obtenir une retrait progressif ou total en facteurs de croissance, en sérum et/ou en couches de cellules nourricières peut être réalisé simultanément, de manière successive ou séparée dans le temps. Les dits sevrages en tapis cellulaire nourricier, en facteurs de croissance exogènes, et en sérum sont réalisés successivement ou de manière décalée dans le temps, selon une séquence des sevrages choisie parmi: cellules nourricières / sérum / facteurs de croissance; cellules nourricières / facteurs de croissance /sérum; sérum / facteurs de croissance / cellules nourricières; - sérum / cellules nourricières / facteurs de croissance; facteurs de croissance / cellules nourricières / sérum; facteurs de croissance / cellules nourricières / sérum.

Le serum utilisé est de préférence du sérum animal, de manière plus préféré du sérum de veau foetal. Alternativement, le sérum peut être un substitut de sérum tel qu'actuellement commercialisé par certaines sociétés (ex KO SR de GIBCO-BRL). Selon un mode préféré de réalisation, la séquence de sevrage est 1) sevrage en facteurs de croissance, 2) sevrage en cellules nourricières et 3) sevrage en sérum.

Lors de l'étape a), la culture des cellules souches humaines est réalisée pendant environ 3 à 40 passages en milieu complet, puis le milieu complet est ensuite progressivement et séquentiellement déplété en facteurs de croissance (étape b). De préférence, pour chaque facteur de croissance, la déplétion est réalisée directement en une étape unique, d'un passage à l'autre. Alternativement, la déplétion en facteur de croissance est réalisée de manière graduelle, par une diminution progressive à chaque passage de la concentration du facteur de croissance dans le milieu de culture complet.

Selon un mode de réalisation préférée, la déplétion en facteurs de croissance est réalisée simultanément pour au moins deux facteurs de croissance. Alternativement la déplétion en facteurs de croissance est réalisée séquentiellement facteur de croissance après facteur de croissance. De manière préférée, le LIF est retiré en premier et directement du milieu de culture complet, puis après quelques passages en culture dans un milieu complet dépourvu de LIF, le FGF est à son tour retiré directement du milieu de culture. De manière préférée, le sevrage en facteurs de croissance exogènes est total. Habituellement, le milieu est totalement déplété en facteurs de croissance aux environs des passages 20 à 40.

Habituellement, la déprivation en cellules nourricières est réalisée après la déprivation en facteurs de croissance. La déprivation en cellules nourricières est progressive et réalisée sur plusieurs passages. La cellule souche humaine est en général ensemencée dans les flasques à une concentration inférieure à celle réalisée à l'étape a) à environ 4 X 104 cells/cm2 jusqu'à 5 X 104 cell/cm2. Les cellules nourricières sont ensemencées dans une flasque à environ 4 X 104 cells/cm2. Progressivement, la concentration en cellules nourricières dans les flasques est diminuée. Pratiquement, la même concentration de cellules nourricières est utilisée pendant 2 à 5 passages, puis la concentration en cellules nourricières est diminuée pendant 2 à 5 passages, et ainsi de suite. A titre d'exemple, la flasque est ainsi ensemencée à environ 4 X 104 cells/cm2, puis environ 3 X 104 cells/cm2, puis environ 2 X 104 cells/cm2, puis environ 1,5 X 104 cells/cm2, puis environ 104 cells/cm2, puis environ 0,5 X l04 cells/cm2. Enfin la flasque est ensemencée avec 6 X 104 cellules humaines/cm2 à 105 cellules humaines/cm2 en absence de cellules nourricières. Dans l'hypothèse où les cellules humaines ne sont pas en bonne condition après la diminution de la concentration en cellules nourricières dans la flasque, alors les cellules humaines sont cultivées pendant quelques passages additionnels avec la même concentration de cellules nourricières dans la flasque avant de poursuivre la déprivation en cellules nourricières. A l'étape b), un changement de nature du matériel plastique des boites de culture cellulaire utilisées est réalisé simultanément, successivement ou de manière décalée dans le temps avec le sevrage du tapis cellulaire nourricier. Le dit matériel plastique utilisé est traité spécifiquement de sorte à favoriser les interactions non ioniques ou hydrophobiques, de sorte à diminuer l'adhésion des cellules au dit matériel. L'étape b) comprend au moins 30, au moins 50, au moins 75, au moins 100, au moins 125, au moins 130 passages successifs en culture.

Le procédé d'obtention de lignées de cellules souches humaines selon l'invention permet en outre d'obtenir des lignées capables de croître en milieu asérique. Le sevrage sérique des cellules selon l'invention est réalisé en modifiant ou en changeant le milieu de culture des cellules afin d'obtenir un sevrage total en sérum, soit par dilution progressive, sevrage direct, ou sevrage progressif. Cette méthode permet de sélectionner des clones qui s'adaptent à ces nouvelles conditions de culture de plus en plus drastiques, jusqu'à obtenir des lignées cellulaires stables qui soient capables de croître en milieu déplété en sérum ou dans un milieu sans sérum.

De manière préférée, le milieu de culture de base de l'étape c) comprend encore une faible concentration en sérum (c'est-à-dire une concentration sérique dans le milieu de culture inférieure ou égale à 5%). Le procédé selon l'invention comprend facultativement l'étape additionnelle c)bis de changement du milieu de culture de l'étape c). Le milieu utilisé à l'étape c)bis est ainsi choisi parmi: le milieu de base (i) complémenté avec le sérum et dilué avec un nouveau milieu asérique (ii). Ensuite, les cellules humaines sont cultivées par passages successifs dans un milieu (i) dans lequel la proportion de milieu sans sérum (ii) est progressivement augmentée jusqu'à la complète disparition du milieu de base (i) complémenté en sérum (dilution progressive).

Un nouveau milieu sans sérum (ii) complémenté avec du sérum. Ensuite, les cellules humaines sont cultivées par passages successifs dans un milieu (ii) dans lequel la proportion de sérum est progressivement diminuée, jusqu'à obtenir un milieu asérique (sevrage progressif).

Un nouveau milieu sans sérum (ii) non complémenté en sérum. Ensuite les cellules humaines sont directement cultivées dans le milieu asérique (ii) (sevrage direct).

Le dit sevrage en sérum est réalisé en mettant en oeuvre un procédé choisi parmi la dilution progressive, le sevrage progressif ou le sevrage direct. Selon un mode préféré, le sevrage en sérum est réalisé par sevrage progressif.

Selon la présente invention, le terme milieu asérique ou milieu sans sérum (SFM) signifie un milieu de culture cellulaire prêt à l'emploi, c'est-à-dire, ne nécessitant pas l'addition de sérum pour permettre la survie et la croissance des cellules.

Le milieu n'est pas nécessairement défini chimiquement et peut contenir des hydrolysats d'origine variée, tel que les hydrolysats d'origine végétale par exemple. De manière préférée, le dit milieu SFM est qualifié sans composant d'origine animal , c'est-à-dire qu'il ne contient pas de composants d'origine animale ou humaine (statut 20 2878860 12 FAO: free of animal origin ). Dans le milieu asérique, les protéines natives du sérum sont remplacées par des protéines recombinantes. Alternativement, Le milieu SFM selon l'invention ne contient pas de protéine (milieu PF: protein-free ) et/ou est défini chimiquement milieu CDM: chemi cally-defined medium ). Le milieu SFM présente plusieurs avantages: (i) le premier étant son aptitude à satisfaire aux exigences réglementaires (il n'existe pas de risque de contamination par des agents biologiques, tels que les prions ou les virus animaux) ; (ii) l'optimisation du procédé de purification; (iii) la meilleur reproductibilité des performances de la culture cellulaire car le milieu est mieux défini. Des exemples de milieux asériques SFM commercialisés sont VP SFM (InVitrogen Ref 11681-020, catalogue 2003), Opti Pro (InVitrogen Ref 12309-019, catalogue 2003), Episerf (InVitrogen Ref 10732-022, catalogue 2003), Pro 293 S-CDM (Cambrex ref 12765Q, catalogue 2003), LC17 (Cambrex Ref BESP302Q), Pro CHO 5-CDM (Cambrex ref 12-766Q, catalogue 2003), HyQ SFM4CHO (Hyclone Ref SH30515-02), HyQ SFM4CHO-Utility (Hyclone Ref SH30516.02), HyQ PF293 (Hyclone ref SH30356. 02), HyQ PF Vero (Hyclone Ref SH30352.02), Ex cell 293 medium (JRH Biosciences ref 14570-1000M), Ex cell 325 PF CHO Protein free medium (JRH Biosciences ref 14335-1000M), Ex cell VPRO medium (JRH Biosciences ref 14560-1000M), Ex cell 302 serum free medium (JRH Biosciences ref 14312- 1000M).

Le procédé d'obtention de cellules souches humaines décrit précédemment peut également comprendre une étape additionnelle dans laquelle les cellules obtenues à l'étape c) sont soumises à une sélection et uneadaptation dans un milieu de culture approprié de façon à obtenir des clones cellulaires utiles pour la production de substances biologiques à large échelle.

De manière préférée, les cellules souches humaines, de préférence les cellules souches humaines derivées des cellules ES humaines, établies en mettant en oeuvre le procédé de l'invention sont des cellules qui prolifèrent en milieu asérique, en absence de cellules nourricières et ne nécessitant pas l'adjonction de facteurs de croissance dans le milieu de culture. Les nouvelles lignées de cellules souches humaines, dérivées de préférence de cellules souches embryonnaires., obtenues par le procédé selon l'invention peuvent être maintenues en culture in vitro pendant une longue durée, c'est-à-dire plus d'une centaine de passages. De manière avantageuse, les cellules souches embryonnaires obtenues à l'étape d) sont capables de proliférer pendant au moins 50 jours, au moins 100 jours, au moins 150 jours, au moins 300 jours en culture et de manière préférée au moins 600 jours en culture. Ces 600 jours ne constitue en aucune façon une limite car les cellules obtenues seront toujours vivantes après cette date. De fait, les cellules souches selon l'invention sont considérées comme étant capables de pousser indéfiniment en culture dans un milieu de culture de base ne comprenant pas de facteurs de croissance exogènes, de sérum et/ou de couches de cellules nourricières inactivées. Les expressions lignées ou lignées continues , termes qui sont employés indifféremment dans ce brevet, signifient que la population de cellule est capable de croître ou proliférer indéfiniment en culture in vitro tout en conservant essentiellement les mêmes caractéristiques morphologiques et phénotypiques. Par croissance indéfinie en culture , on entend désigner une propriété des lignées cellulaires en culture permettant une propagation sur du long terme. Cette caractéristique s'oppose à celles présentées par la plupart des cellules diploïdes normales isolées et cultivées in vitro telles les cellules dites primaires qui entrent en sénescence après de multiples passages. Selon la présente invention, le terme croissance indéfinie comprend une culture d'au moins 30 jours, au moins 60 jours, de préférence au moins 6 mois, de manière plus préférée au moins un an.

Les cellules souches établies selon l'invention sont de préférence petites, rondes, bien individualisées avec une période de doublement comprise entre 20 et 40 heures, de préférence entre 24 et 30 heures. Les cellules obtenues par le procédé selon l'invention sont au moins au passage p60, au moins au passage p70, au moins au passage p80, au moins au passage p100, au moins au passage p120, au moins au passage p140 ou plus. Les cellules ainsi établies par le procédé selon l'invention ont l'aptitude à proliférer pendant au moins 50 jours, au moins 100 jours, au moins 150 jours, au moins 300 jours en culture et de manière préférée au moins 600 jours en culture dans un milieu basal tel que le DMEM, GMEM, HamF12, Optipro (GIBCO-BRL) ou MacCoy supplémenté avec divers additifs couramment utilisés par l'homme du métier. Parmi les additifs, on peut citer les amino-acides non essentiels, les vitamines, le pyruvate de sodium, le béta- mercaptoéthanol, etc Les cellules de la lignée cellulaire obtenues par le procédé selon l'invention sont dérivées de cellules souches humaines, de préférence embryonnaires (ES), et possèdent au moins l'une des caractéristiques suivantes: prolifèrent indéfiniment en culture dans un milieu de culture dépourvu de 10 tapis cellulaire nourricier, facultativement de sérum et facultativement de facteurs de croissance exogènes; et conservent un caryotype diploïde normal qui n'est pas altéré par une culture cellulaire prolongée; et présentent un rapport nucléo-cytoplasmique important; conservent la capacité à se différencier pour former au moins un type cellulaire différencié choisi parmi un type cellulaire d'origine mésodermique, ectodermique et endodermique.

expriment au moins la télomérase et l'alcaline phosphatase.

La lignée de cellules selon l'invention se caractérise en ce que les cellules de la dite lignée expriment en outre le facteur de transcription Oct3/4 et présentent une réactivité avec au moins un des anticorps spécifiques sélectionnés parmi les anticorps dirigés contre SSEA4, TRA 1-60, TRA 1-81. La lignée de cellules selon l'invention se caractérise en outre en ce que les cellules de la dite lignée ne présentent pas de réactivité avec l'anticorps dirigés contre SSEA1.

La lignée de cellules selon l'invention a de préférence un caryotype normal choisi parmi 46 XX et 46 XY.) Le temps de doublement des cellules souches humaines obtenues par le procédé selon l'invention se caractérise par un temps de doublement plus cours que le temps de doublement des cellules souches humaines primaires de l'étape a) selon le procédé de l'invention. Le temps de doublement des cellules souches obtenues par le procédé selon l'invention est d'environ entre 20 et 40 heures, de préférence entre 24 et 30 heures.

Bien entendu, le procédé décrit précédemment permet d'obtenir des clones cellulaires dérivés des cellules obtenue de ces lignées. Ces clones sont des cellules qui sont génétiquement identiques aux cellules desquelles elles dérivent par division.

Les cellules selon l'invention sont capables de proliférer en adhérence sur le support, mais elles peuvent également être adaptées pour une culture en suspension. De manière préférée, les cellules selon l'invention ont toutes les caractéristiques mentionnées ci-dessus.

L'invention vise également à couvrir les cellules selon l'invention qui ont été modifiées génétiquement soit de manière stable ou transitoire en mettant en oeuvre des techniques bien connues de l'homme du métier. Le génome de la dite cellule peut ainsi été modifié par: ii. insertion d'une séquence d'ADN isolée pré-sélectionnée; ou iii. substitution d'un fragment du génome cellulaire par une séquence d'ADN isolée pré-sélectionnée; ou iv. délétion d'une séquence d'ADN isolée présélectionnée; ou v. inactivation d'une séquence d'ADN isolée présélectionnée.

L'invention vise également à couvrir des lignées de cellules humaines différenciées obtenues à partir des cellules souches obtenues par le procédé selon l'invention. La dite cellule différenciée est sélectionnée de préférence parmi les cellules neurales, les oligo- dendrocytes, les cellules gliales, les cellules hématopoiétiques, les cellules exocrines, les cellules endocrines, les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, le muscle cardiaque, le muscle squelettique, la moelle osseuse, les fibroblastes, les adipocytes, les cellules du cartilage, les cellules osseuses.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les cellules souches humaines obtenues par le procédé de l'invention sont utilisées comme médicament en thérapie cellulaire in vivo, notamment pour le traitement de maladies neurodégénératives et de maladies génétiques héréditaires ou acquises.

Les cellules souches humaines établies en lignées par le procédé selon l'invention sont également utiles à la production de substances biologiques, telles par exemple les protéines recombinantes et les vaccins viraux.

Plus précisément, les cellules souches humaines établies en lignée selon l'invention sont utiles pour répliquer des virus, les vecteurs viraux dérivés de ceux-ci, et pour produire les particules virales correspondantes. Plus précisément, les cellules souches humaines établies en lignée selon l'invention sont utiles pour la production de vaccins viraux tués, vivants ou atténués, recombinants ou non. Les vaccins ainsi produits sont destinés au traitement prophylactique et/ou thérapeutique de pathologies d'étiologie virale, des maladies chroniques acquises telles le cancer et des maladies neurodégénératives. Parmi les virus, les vecteurs viraux et les particules virales correspondantes, il convient de citer, de manière non exhaustive, les adénovirus, les hépadnavirus, les herpès virus, kes orthomyxovirus, les papovirus, les paramyxovirus, les paramyxovirus, les picornavirus, les poxvirus, les reovirus, et les rétrovirus. De manière préféré, le virus est un orthomyxovirus, en particulier l'influenza virus humain. Selon un autre mode préféré, le virus est un paramyxovirus, et plus particulièrement le virus de la rougeole, et/ou le virus des oreillons, et/ou le virus de la rubéole. Selon un autre mode préféré, le virus est un rétrovirus humain, et plus particulièrement le virus de l'immunodéficience humaine.

Alternativement les cellules souches humaines établies en lignée selon l'invention sont utiles pour la production de protéines recombinantes, notamment les protéines d'intérêt thérapeutique. A ce propos, les cellules obtenues par le procédé selon l'invention peuvent être modifiées génétiquement, de manière stable ou transitoire, en mettant en oeuvre les techniques à la disposition de l'homme du métier. Selon un mode préféré de réalisation la protéine d'intérêt thérapeutique est un anticorps, de préférence monoclonal, humanisé ou chimérisé.

Enfin, les cellules souches humaines établies en lignée selon l'invention sont 25 utiles pour la réalisation de tests de diagnostics sanitaires.

Claims (24)

REVENDICATIONS

1- Procédé d'obtention de lignées continues de cellules souches humaines dérivées 10 de cellules embryonnaires non transformées, indifférenciées et capables de proliférer indéfiniment en culture, caractérisé en ce que le dit procédé comprend les étapes suivantes: a) Culture sur un tapis de cellules nourricières de cellules souches humaines dans un milieu de culture complet comprenant au moins: - du sérum animal ou un substitut de serum animal; - un facteur de croissance exogène sélectionné parmi: FGF (Fibroblast Growth Factor), le facteur des cellules souches (SCF) et l'IGF1 (Insulinlike growth factor 1) ; - un facteur de croissance exogène sélectionné parmi: les ligands au 20 récepteur qui peut former un hétéro-dimère avec la glycoprotéine gp130; b) Passages successifs dans un milieu de culture identique ou différent, de sorte à obtenir un sevrage du tapis cellulaire nourricier, un sevrage total ou partiel des dits facteurs de croissance exogènes et un sevrage total ou partiel du serum c) facultativement, sélection de colonies cellulaires ayant des morphologies compactes et composées de cellules ayant un rapport nucléo-cytoplasmique élevé et un nucléole proéminent.

d) Etablissement des dites lignées continues de cellules souches humaines dérivées de cellules embryonnaires capables de croître en absence de cellules 30 nourricières.

2- Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les dites lignées obtenues à l'étape d) sont capables de croître dans un milieu de culture déplété en facteur de croissance.

3- Procédé selon les revendications 1 et 2 caractérisé en ce que les dites lignées obtenues à l'étape d) sont capables de croître dans un milieu de culture déplété en sérum.

4- Procédé selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce que les dites cellules souches humaines de l'étape a) sont sélectionnées parmi les cellules souches totipotentes, les cellules souches pluripotentes, les cellules souches multipotentes, les cellules souches unipotentes, les cellules progénitrices intermédiaires.

5- Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que les dites cellules souches humaines de l'étape a) sont des cellules souches pluripotentes, c'est-à-dire des cellules souches embryonnaires (ES).

6- Procédé selon les revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le dit ligand au récepteur qui peut former un hétéro-dimère avec la glycoprotéine gp130 est choisi parmi le leukemia inhibitory factor (LIF), l'interleukine 11 (IL11), l'interleukine 6 (IL6), le récepteur à l'interleukine 6 (IL6R), le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF), l'oncostatine, la cardiotrophine.

7- Procédé selon les revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le dit milieu complet à l'étape a) comprend du sérum, et au moins du FGF et du LIF.

8- Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le dit milieu complet à l'étape a) comprend du sérum, du FGF, du LIF, IL-6, IL6R, IL11, CNTF et IGF1.

9- Procédé selon les revendications 1 à 8 comprenant en outre une sous-étape al) de l'étape a) consistant à dissocier les amas cellulaires formés en culture, caractérisé en ce que la dissociation est réalisée enzymatiquement et/ou mécaniquement.

10- Procédé selon les revendications 1 à 9 caractérisé en ce que le tapis cellulaire nourricier de l'étape a) se compose de fibroblastes choisis parmi des fibroblastes humains primaires, des fibroblastes humains établis en lignée, des fibroblastes primaires de mammifères, des fibroblastes de mammifère établis en lignée.

11-Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que les dits fibroblastes de mammifère sont des fibroblastes de souris établis en lignée, de préférence des cellules STO transformées ou non.

12-Procédé selon les revendications 1 à 11 caractérisé en ce que l'étape b) comprend au moins 30, au moins 50, au moins 75, au moins 100, au moins 125, au moins 130 passages successifs en culture.

13- Procédé selon les revendications 1 à 12 caractérisé en ce que les dits sevrages en tapis cellulaire nourricier, en facteurs de croissance exogènes, et en sérum sont réalisés successivement ou de manière décalée dans le temps, selon une séquence des sevrages choisie parmi: i. tapis cellulaire nourricier / serum / facteurs de croissance exogènes ii. tapis cellulaire nourricier / facteurs de croissance exogènes / serum iii. serum / facteurs de croissance exogènes / tapis cellulaire nourricier iv. serum / tapis cellulaire nourricier / facteurs de croissance exogènes v. facteurs de croissance exogènes / serum / tapis cellulaire nourricier vi. facteurs de croissance exogènes / tapis cellulaire nourricier / serum.

14- Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que la séquence des sevrages est: sevrage en facteurs de croissance exogènes, sevrage en tapis cellulaire nourricier, sevrage en sérum.

15- Procédé selon les revendications 1 à 14 caractérisé en ce que le sevrage de chacun des facteurs de croissance exogènes est réalisée par diminution progressive sur plusieurs passages, de préférence au moins 3, de la concentration de chaque facteur dans le milieu de culture.

16- Procédé selon les revendications 1 à 15 caractérisé en ce que le sevrage en facteurs de croissance exogènes est total.

17- Procédé selon les revendications 1 à 16 caractérisé en ce que le dit sevrage en sérum est réalisé en mettant en oeuvre un procédé choisi parmi la dilution progressive, le sevrage progressif ou le sevrage direct.

18- Lignée continue de cellules souches humaines susceptibles d'être obtenues par le procédé selon les revendications 1 à 17, caractérisée en ce que les dites cellules souches humaines de la lignée continue: i. prolifère indéfiniment en culture dans un milieu de culture dépourvu de tapis cellulaire nourricier, facultativement de sérum et facultativement de facteurs de croissance exogènes; et ii. conserve un caryotype diploïde normal qui n'est pas altéré par une culture cellulaire prolongée; et iii. présente un rapport nucléo-cytoplasmique important; iv. conserve la capacité à se différencier pour former au moins un type cellulaire différencié choisi parmi un type cellulaire d'origine mésodermique, ectodermique et endodermique.

v. exprime au moins la télomérase et l'alcaline phosphatase.

19- Lignée continue de cellules souches humaines selon la revendication 18 caractérisée en ce que les dites cellules souches humaines de la lignée continue expriment en outre le facteur de transcription Oct3/4 et présente une réactivité avec au moins un des anticorps spécifiques sélectionnés parmi les anticorps dirigés contre SSEA4, TRA 1-60, TRA 1-81.

20- Lignée continue de cellules souches humaines transgéniques selon les revendications 18 et 19 caractérisée en ce que le génome dites cellules souches humaines de la lignée continue a été modifié par: i. insertion d'une séquence d'ADN isolée pré-sélectionnée; ou ii. substitution d'un fragment du génome cellulaire par une séquence d'ADN isolée pré-sélectionnée; ou iii. délétion d'une séquence d'ADN isolée présélectionnée; ou iv. inactivation d'une séquence d'ADN isolée présélectionnée.

21- Utilisation de la lignée continue de cellules souches humaines selon l'une des revendications 18 à 20 pour la réplication de virus, vivant ou atténué, recombinant ou non, ou de vecteurs viraux.

22- Utilisation de la lignée continue de cellules souches humaines selon l'une des revendications 18 à 20 pour la production de vaccins humains ou vétérinaires.

23- Utilisation de la lignée continue de cellules souches humaines selon l'une des revendications 18 à 20 pour la production de protéines ou de polypeptides recombinants, de préférence d'intérêt thérapeutique.

24- Utilisation de la lignée continue de cellules souches humaines selon l'une des revendications 18 à 20 pour la réalisation de tests de diagnostics sanitaires.