KR101166257B1

KR101166257B1 - 미분화 다능성줄기세포의 제작, 유지 및 증식을 위한 뉴로펩타이드 ｙ를 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 다능성줄기세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR101166257B1
Application number: KR1020100056696A
Authority: KR
Inventors: 조이숙; 손미영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-06-16
Filing date: 2010-06-15
Publication date: 2012-07-19
Also published as: US8628963B2; US20120171766A1; KR20100135197A

Abstract

본 발명은 다능성줄기세포 (pluripotent stem cell)의 미분화 증식 및 유지에 효과적인 뉴로펩타이드 Y(Neuropeptide Y; NPY)를 포함하는 배지 조성물, 이를 이용한 미분화 다능성줄기세포 배양 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 뉴로펩타이드 Y 를 미분화 다능성줄기세포 배양 배지 조성물로 사용함으로써 미분화 상태의 다능성줄기세포를 효과적으로 증식 및 배양할 수 있고, 특히, 영양세포유래인자 또는 동물 혈청을 이용하지 않는 조건에서도 영양세포와의 공배양 조건 또는 영양세포 배양 conditioned medium을 사용한 경우와 유사한 성능으로 미분화 상태의 다능성줄기세포를 장기간 연속 계대 배양할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 미분화 상태의 다능성줄기세포의 배양 과정을 개선하고, 궁극적으로는 임상적용 가능한 다능성줄기세포 자원을 확보할 수 있는 대량 배양 시스템을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 뉴로펩타이드 Y(Neuropeptide Y; NPY)를 포함하는 역분화용 배지 조성물, 이를 이용한 역분화 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 뉴로펩타이드 Y 를 역분화 유도 과정의 배지 조성물에 첨가하였을 경우 역분화 효율을 유의하게 향상시킬 수 있었으며, 상기 방법에 의해 제조된 유도만능줄기세포는 다능성줄기세포로서의 특성을 정상적으로 가짐을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 역분화 유도 배양 과정을 개선하고, 임상적용 가능한 유도만능줄기세포 제작 기술을 개발하는데 기여함으로써 궁극적으로는 줄기세포 세포 치료제를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

미분화 다능성줄기세포의 제작, 유지 및 증식을 위한 뉴로펩타이드 Ｙ를 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 다능성줄기세포의 배양 방법 {MEDIA COMPOSITION COMPRISING NEUROPEPTIDE Y FOR THE GENERATION, MAINTENANCE, PROLOGNED UNDIFFERENTIATED GROWTH OF PLURIPOTENT STEM CELLS AND METHOD OF CULTURING PLURIPOTENT STEM CELL USING THE SAME}

본 발명은 다능성줄기세포 (pluripotent stem cell)의 미분화 증식 및 유지에 효과적인 뉴로펩타이드 Y(Neuropeptide Y; NPY)를 포함하는 배지 조성물, 이를 이용한 미분화 다능성줄기세포 배양 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 뉴로펩타이드 Y 를 미분화 다능성줄기세포 배양 배지 조성물로 사용함으로써 미분화 상태의 다능성줄기세포를 효과적으로 증식 및 배양할 수 있고, 특히 영양세포유래인자 또는 동물 혈청을 이용하지 않는 조건에서도 영양세포와의 공배양 조건 또는 영양세포 배양 conditioned medium을 사용한 경우와 유사한 성능으로 미분화 상태의 다능성줄기세포를 장기간 연속 계대 배양할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명은 뉴로펩타이드 Y(Neuropeptide Y; NPY)를 포함하는 역분화용 배지 조성물, 이를 이용한 역분화 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 뉴로펩타이드 Y 를 역분화 유도 과정의 배지 조성물에 첨가하였을 경우 역분화 효율을 유의하게 향상시킬 수 있었으며, 상기 방법에 의해 제조된 유도만능줄기세포는 다능성줄기세포로서의 특성을 정상적으로 가짐을 확인하였다.

줄기세포(stem cell)란, 미분화 상태를 유지하면서 무한히 증식할 수 있으며 일정한 환경과 조건이 주어질 경우 특정 기능과 형태를 갖도록 분화할 수 있는 세포를 말한다. 다능성줄기세포(human pluripotent stem cell)는 적당한 체외 배양조건에서 무한 증식(자가재생산능; self-renewal)을 할 수 있고, 개체를 이루고 있는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 특성(다능성 또는 전분화능 ;pluripotency)으로 인해 개체의 발생, 분화 및 성장에 대한 기초 지식 이해 측면에서 뿐만 아니라 개체의 손상 또는 다양한 질병의 근복적인 치료 방법인 세포 치료제 개발 및 다양한 신약후보물질의 약효 검색, 질환의 원인 규명, 치료법 개발 등 다양한 측면에서 이를 대상으로 한 연구성과의 활용범위가 확대되고 있다. 다양한 분야에서 인간다능성줄기세포 이용에 대한 수요가 급증하고 있음에도 불구하고 미분화 상태의 인간다능성줄기세포를 유지 및 배양하기 위한 배양 배지가 한정적일 뿐만 아니라 배양이 어렵다는 점은 관련 기술 개발의 장애요소로 작용하고 있으며 특히, 세포치료제 개발을 위해서는 동물유래 인자를 사용하지 않은 배지 사용 등 임상적용 가능한 배양조건을 구축하고 수요가 발생할 시 필요한 양을 효율적으로 수급할 수 있는 대량 배양 시스템을 개발하는 것이 필수적이다.

일반적으로 인간다능성줄기세포는 마우스배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast; MFE) 등과 같은 영양세포(feeder cells)와 공배양 하거나 영양세포를 증식시킨 배양액(conditioned media; CM)에 배양함으로써 미분화 상태를 유지하면서 지속적으로 유지 및 배양할 수 있다. 그러나, 동물 영양세포와의 직접 배양 또는 영양세포 배양액을 사용하는 배양 방법 모두 바이러스와 같은 1종 이상의 감염원이 동물세포로부터 인간다능성줄기세포로 전파될 수 있는 위험이 따른다.

이에, 최근에는 영양세포를 이용하지 않고 defined factor만을 이용하여 인간다능성줄기세포를 배양하는 방법을 개발하기 위한 노력이 지속적으로 이루어지고 있으며, 이를 위해서는 줄기세포의 미분화 상태를 유지, 증진 시킬 수 있는 방법론 개발이 중요하다. Xu (Nat Biotechnol 18:399, 2000) 등은 마우스배아섬유아세포에서 유래한 CM과 라미닌(laminin), 마트리젤(matrigel)과 같은 매트릭스를 사용하여 영양세포를 이용하지 않는 배양 조건(feeder-free)을 확립하였다. Rosler (Dev Dyn 229:259, 2004) 등은 Xu 연구팀에서 확립한 CM을 이용하여 1년 이상 영양세포가 없는(feeder-free) 상태로 인간배아줄기세포를 유지하였다. 하지만 이러한 CM은 생쥐 유래의 성분이 배지 속에 남아있는 단점이 있다. 아울러, 2005년 Xu 등은 CM을 사용하지 않고 bFGF 등의 성장 인자 (growth factor)의 조합을 이용하거나 (STEM CELLS 23:315, 2005), bFGF와 BMP 신호전달과정의 억제제인 노긴(noggin)을 배양 배지에 첨가함으로써 미분화 인간배아줄기세포를 영양세포 없는 상태에서 유지할 수 있음을 보고하였다 (Nat Methods 2:185, 2005). 또한, Sato 등은 Wnt 경로(Wnt pathway)를 활성화시키기 위해 GSK-3-특이적 억제제인 BIO를 사용하여 미분화 상태를 유지할 수 있음을 보고한 바 있다(Nat. Med 10:55, 2004).

냉동 배아의 내부세포괴 (inner cell mass)로부터 유래한 배아줄기세포는 폐기될 냉동 배아에서 추출하므로 법적인 문제는 없으나, 배아에서 추출하므로 생명 파괴라는 입장에서 윤리적, 종교적 논란의 대상이 되고 있으며, 제한된 배아로부터 유래하므로 각 개체간 면역 적합성 부재로 인하여 세포 치료제로 개발 시 이식 거부반응을 피할 수 없다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 최근 역분화 인자를 이용하여 성체세포로부터 배아줄기세포와 거의 유사한 다능성줄기세포의 특성을 가진 유도만능줄기세포를 제작하는 방법이 성공(Cell 126, 663-676, 2006; Cell 131, 861-872, 2007; Nature 441, 1061-1067, 2006; Nature 451, 141-146, 2008)함에 따라 다능성줄기세포를 이용한 줄기세포 실용화 기술 개발에 대한 기대가 높아지고 있는 실정이다. 특히, 유도만능줄기세포는 제작과정에 배아가 필요하지 않으며, 환자 자신에게서 추출한 세포를 이용하는 경우 면역거부에 대한 문제가 없어 기술적인 활용가치가 매우 높다. 다만, 현 기술을 실용화 단계까지 진입시키기 위해서는 필수적으로 현 기술이 가지고 있는 문제점 즉, 낮은 역분화 유도 효율을 개선하고 바이러스 이용에 따른 암화 가능성을 배제할 수 있는 후속기술개발이 중요하다.

이에, 역분화 효율을 증진시키기 위한 방법론으로 세포 외부 환경조절이나 첨가물 특히, 저분자 화합물을 이용한 유도효율 증가에 대한 성공사례들이 보고되고 있다. 또한, 배아줄기세포의 환경과 유사한 저산소 상태에서 역분화 줄기세포의 유도 효율이 효과적으로 증가됨이 보고된바 있으며(Cell Stem Cell, 5: 237-241, 2009), Ding 박사팀(Shi et al., Cell Stem Cell, 2008)은 BIX-01294(G9a histone methyltransferase inhibitor), BayK8644(L-type calcium channel agonist), RG108(DNA methyltransferase inhibitor)등의 저분자 화합물이 Melton 박사팀(Huangfu et al., Nat Biotechnol, 2008)은 VPA(histone deacetylase inhibitor), TSA(histone deacetylase inhibitor), SAHA(histone deacetylase inhibitor)등의 저분자 화합물이 역분화 유도 효율을 증진 시키는데 효과적임을 보고한바 있다. 바이러스 사용을 대체할 할 수 있는 방법론 개발에 있어 1) 다단백질발현단일벡터(single nonviral polycistronic vector를 이용한 transient 발현 기술(Gonzalez et al, PNAS USA, 2009; Chang et al, Stem cells, 2009), 2) adenoviral 형질도입 기술(Stadtfeld et al, Science 2008), 3) Cre/loxP 재조합 발현제어시스템 개발(Soldner et al, Cell, 2009). 다단백질발현단일벡터을 이용하여 iPSC를 확립하고, Cre transfection을 통해 역분화카세트 제거하는 기술(kaji et al, Nature, 2009), 4) piggyBac(PB) 전이인자시스템 transposon system 개발(Woltjen et al, Nature, 2009; kaji et al, Nature, 2009), 5) nonintegrating episomal vectors 개발(Yu et al, Science, 2009)등에 대한 연구 결과가 도출되고 있으나, 여전히, 유전자 이상 및 암화 유발 가능성을 완전히 배제하지 못하고 있는 실정이다.

뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y; NPY)는 36개 아미노산 펩타이드(peptide)로서, 췌장 폴리펩티드(polypeptide, PP)로 되는 신경 내분비 펩타이드(peptide)의 패밀리(family)에게 속한다. 해당 펩타이드(peptide)는 포유 동물의 중추 및 말초 신경계, 특히 시상하부 및 피질에 풍부히 존재한다. NPY는 잠재적으로는 치료학상 광범위한 생리학적 효과를 발휘하며, 단독으로 투여되는 경우에는 혈관 수축을 유도하고, 협심증을 일으킬 가능성이 있다고 알려져 있다(Clarke,et al.,Lancet 1(8541):1057(1987)). 또한, NPY는 중추와 말초신경계에 분포한 신경 전달 물질로서 기아상태에서 증가하며 식욕 증가 및 에너지 대사량 저하를 유도한다. 일예로, NPY를 뇌 내에 주사하면 여러 종에서 식욕이 강해지고 장기적으로 주사하면 체중이 증가하고 인슐린 저항성이 온다. 특히 NPY는 시상하부에서 렙틴의 작용을 중계하는데, 렙틴과 렙틴 수용체 결핍 생쥐의 경우 시상하부에서 NPY가 증가되어 있고 NPY 결핍은 렙틴 결핍 생쥐를 덜 비만하게 만든다. 특히, 인간다능성줄기세포에서의 NPY의 작용 및 이용에 대한 연구는 전무한 상태이다.

이에, 본 발명자들은 다능성줄기세포를 미분화 상태에서 지속적으로 장시간 유지 및 배양하는 과정에서 외인성 NPY가 포함된 배지 조성물이 효과적으로 미분화 상태를 유지하는데 기여하고, 이를 이용한 배양 방법이 다능성줄기세포의 배양기술을 획기적으로 개선할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 역분화 유도 배양과정에서 외인성 NPY를 포함하는 배지 조성물이 역분화 유도에 기여하고, 역분화 효율을 획기적으로 증진시킬 수 있음을 확인하였고, 상기 방법에 의해 제작된 유도만능줄기세포가 배아줄기세포와 동일한 특성을 가짐을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 동물 혈청 및 영양세포유래인자를 이용하거나 또는 이용하지 않는 상태로 미분화 상태의 다능성줄기세포를 효과적으로 유지, 배양할 수 있는 뉴로펩타이드 Y를 포함하는 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 동물 혈청 및 영양세포유래인자 없이 다능성줄기세포를 미분화 상태로 배양할 수 있도록 뉴로펩타이드 Y를 포함하는 배지 조성물에서 배양된 다능성줄기세포 및 시험관 내 세포 배양물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 뉴로펩타이드 Y를 포함한 배지 조성물을 포함하는 배양 조건 하에서 다능성줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는 미분화 상태로 유지될 수 있는 다능성줄기세포주의 제작방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 영양세포유래인자 없이 defined factor만을 이용하여 다수의 연속 계대 배양을 통해서 바이러스성 또는 동물원성 감염에 의한 오염 없이 뉴로펩타이드 Y를 포함하는 배지 조성물에서 다능성줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y)를 포함하는 역분화용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 뉴로펩타이드 Y를 포함한 배지 조성물에서 분화된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 역분화 유도 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 분화된 세포를 상기 뉴로펩타이드 Y를 포함한 배지 조성물을 포함하는 배양 조건 하에서 배양하여 역분화시키는 단계를 포함하는 역분화 세포주의 제작 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 분화된 세포, 및 상기 뉴로펩타이드 Y를 포함한 배지 조성물을 포함하며, 상기 분화된 세포는 역분화되는 시험관 내 세포 배양물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 다능성줄기세포를 미분화 상태로 유지 배양하기에 충분한 양의 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y)를 포함하는 미분화 상태 다능성줄기세포의 유지 및 배양용 다능성줄기세포의 배지 조성물을 제공한다.

본 발명에서의 용어, '뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y, NPY)'란, 36개의 아미노산으로 구성된 PP(Pancreatic Polypeptide)와 유사한 구조를 갖는 물질로서, 주로 신경세포에 존재하는 것으로 알려져 있다. 상기 펩타이드는 췌장 세포에서 생성되는 PP와 50% 동일한 아미노산 배열을 가지고 있으며 신경 세포에서 만들어지는 PYY(Peptide YY)와는 69% 동일하여 소위 PP 계열 펩타이드 군에 속한다. NPY는 위장관 전체에 걸쳐 분비 작용과 위장관 운동의 조절 등 다양한 생리학적인 작용을 나타내는 데, 주로 위산 분비를 억제하고 위배출을 감소시키며, 췌장의 여러가지 외분비 효소의 분비를 억제하고 인슐린 및 글루카곤의 분비도 억제하는 작용을 한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 배지 조성물에는 0.01 초과 내지 100 μM 이하의 농도의 뉴로펩타이드 Y가 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.1 초과 내지 10 μM 이하가 포함될 수 있다.

한편, 본 발명에서의 용어, '뉴로펩타이드 Y 수용체'는 상기와 같은 다양한 NPY 의 작용과 밀접한 관계가 있으며, 현재까지 NPY 수용체는 6개(Y1-, Y2-, Y3-, Y4-, Y5- 및 Y6-)가 알려져 있고, 포유류는 5개의 뉴로펩타이드 Y 수용체, 즉 Y1-, Y2-, Y4-, Y5- 및 Y6-아형을 가지며, 이들은 GPCR(G protein coupled receptor) 수퍼 패밀리에 속한다. 각 수용체는 위치와 분포에 따라 다른 작용을 한다. Y1 수용체는 포유류에서 장근 신경총에 존재하나 토끼, 기니피그, 쥐, 사람에서는 장근 신경총뿐만 아니라 Y2 수용체와 함께 평활근에도 분포한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 유전자 수준에서 NPY 및 그의 수용체가 인간배아줄기세포, 인간유도만능줄기세포 및 생쥐 배아섬유아세포(MEF) 영양세포(도1a)에서 발현됨을 확인하였고, 단백질 수준에서 NPY가 인간배아줄기세포 및 MEF의 핵과 세포질에서 발현되고 있음을 확인하였다(도 1b).

본 발명에서의 용어, '다능성줄기세포(pluripotent stem cell)'란 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 말하며, 배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서의 용어, '배아줄기세포'란, 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. 본 발명의 배아줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 배아줄기세포이다.

본 발명에서의 용어, '유도만능줄기세포'란, 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 역분화줄기세포 (iPSC: induced pluripotent stem cells)이라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주며, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지며, 테라토마 (teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)이 가능하다. 본 발명의 유도만능줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 유도만능줄기세포이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 미분화 인자가 첨가되지 않은 Unconditioned medium(UM)을 사용한 배양조건에서 유지, 배양된 인간배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포는 분화가 유도되는 반면, NPY가 첨가된 UM 에서 배양된 인간배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포는 미분화 상태가 유지되고 있음을 검증함으로써 NPY가 인간배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포의 미분화 유지에 기여함을 확인하였다.

보다 구체적으로, UM에서 배양되는 인간배아줄기세포는 형태학적으로 미분화 상태 특이적으로 나타나는 세포모양이 아니고, ALP (alkaline phosphatase), OCT4, SOX2, hTERT (human telomerase reverse transcriptase), TDGF (teratocarcinoma-derived growth factor) 및 SSEA-4 (도 2b 및 2c)를 포함하는 인간배아줄기세포 특이 미분화 표지 인자의 발현이 하향 조절됨으로써 미분화 상태에서 벗어나, 분화 단계가 진행되었다(도 2a). 그러나, NPY (>0.1 μM)가 첨가된 UM에서 배양된 인간배아줄기세포는 UM에서 배양된 세포에 비해 미분화 상태를 유지하는 비율이 높음을 확인하였다. 특히, UM에 0.5 μM NPY를 첨가하고 배양한 경우 CM에서 배양된 인간배아줄기세포 또는 고농도의 bFGF (≥40ng/㎖)가 첨가된 UM에서 배양된 인간배아줄기세포와 거의 유사한 범위로 미분화 특이 세포모양이 유지되고(도 2a) ALP, SOX2, hTERT 및 SSEA-4를 포함하는 인간배아줄기세포 특이 표지 인자의 발현이 관찰됨을 검증함으로써 NPY가 인간배아줄기세포의 미분화 상태를 유지하는데 효과적으로 기여함을 확인하였다(도 2a, 2b 및 2c). 또한, 인간배아줄기세포와 유사하게 UM에서 배양된 인간유도만능줄기세포는 미분화 상태를 상실하게 되나(도 2a), NPY (>0.1 μM)가 첨가된 UM에서 배양된 인간유도만능줄기세포는 정상적으로 미분화 상태가 우월하게 유지됨을 확인하였다(도 2a). 인간배아줄기세포와 유사한 양상으로 UM에 0.5 μM NPY가 첨가된 UM에서 배양된 세포의 경우 CM에서 배양된 세포와 거의 유사한 수준으로 미분화 상태를 유지함을 형태학적인 관찰과 인간배아줄기세포 특이 마커 발현을 통해 검증함으로써 본 발명의 NPY가 인간유도만능줄기세포의 미분화 상태 유지에 효과적으로 기여함을 확인하였다(도 2a). 아울러, 본 발명은 BrDu 염색 양성 세포 수를 관찰함으로써, UM에서 배양된 인간배아줄기세포의 경우 CM에서 배양된 세포와 비교하여 현저하게 미분화 증식능을 상실하게 되나(도 4a), NPY (>0.1 μM)가 첨가된 UM에서 배양된 인간배아줄기세포의 경우 정상적으로 CM에서 배양된 미분화 상태의 세포와 같은 수준으로 미분화 증식능이 유지됨을 확인함으로써(도 4a), NPY가 인간배아줄기세포 미분화 증식 유지에 기여함을 확인하였다.

본 발명에서의 용어, '영양세포(feeder cell)유래인자'란, 줄기세포의 미분화를 돕는 다른 세포, 또는 이의 배양물 등에서 유래한 인자를 말하며, 주로 생쥐배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)나 인간포피섬유아세포(human foreskin fibroblast)를 사용한다. 그러나, 상기와 같은 영양세포유래인자를 사용할 경우, 순수한 미분화 줄기세포를 얻는 효과 외에도, 영양세포들의 증식이 일어날 수 있으며, 영양세포에 의한 바이러스 등의 감염 위험과 줄기세포의 제한된 계대능으로 인하여 장기간 줄기세포의 성장력을 저해할 수 있다는 단점이 있다. 이에 본 발명은 NPY를 다능성줄기세포의 배양 기술을 개선하기 위한 신규 인간 다능성줄기세포 성장인자로서의 효능을 검증하고 이를 배지 구성물로 이용하였을 경우 영양세포유래인자 또는 동물혈청이 없는 배양조건에서 인간 다능성줄기세포의 미분화 상태 유지에 매우 효과적으로 기여함을 확인하였다.

본 발명에서의 용어, '배지(culture media)'는 체외배양 조건에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배양액을 의미하고, 줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 또한, 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 배지 조성물에는 동물혈청 및 영양세포유래인자가 포함되지 않은 상태에서 N2 보충물, B27 보충물, bFGF 및 TGFβ로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 추가로 포함될 수 있으며, 이 때, 상기 N2 보충물과 B27 보충물은 1:1의 비율로 제공되고, 상기 bFGF는 4-100 ng/㎖의 농도로 제공되며, 상기 TGFβ는 1-10ng/㎖의 농도로 제공될 수 있다.

바람직하게 본 발명에서 사용된 UM은 80% DMEM/F12, 20% KSR, 1% NEAA, 1 mM L-글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올 (Sigma) 및 4 ng/㎖ bFGF을 포함하며, 영양세포유래인자 및 혈청 없이 배양하기 위해, 인간 배아줄기세포는 NPY 및 TGFβ (R&D systems, Minneapolis, MN) 유무에 따라 DMEM/F12, 1× N2/B27 (Invitrogen), 1% NEAA, 1mM L-글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올(mercaptoethanol)을 포함하는 N2/B27에 기초한 배지가 사용되었다(실시예 1).

본 발명의 구체적인 실시예에서, 인간배아줄기세포를 N2, B27 보충물-based defined medium 조건에서 연속적으로 장시간 배양하는 과정에서NPY (>0.1 μM)가 첨가되면 NPY가 첨가되지 않은 조건에 비하여 미분화 상태가 잘 유지됨을 미분화 특이 표지인자의 발현(도 7a), 정상 핵형 유지(도 7b), 미분화 증식률 증가(도 7c)를 검증함으로써 확인하였다. 또한, 상기 defined medium 배양조건에서 NPY와 병행적으로 bFGF와 TGFb를 첨가하였을 경우 미분화 상태 유지 효과가 우수함을 확인하였다(도 7d).

본 발명에서의 용어, '증식(proliferation)'이란, 세포 수의 증가를 의미하는 것으로 성장(growth)과 동일한 의미로 사용된다. 특히, 본 발명에서의 용어, '미분화 증식(undifferentiated proliferation)'이란, 줄기세포가 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는 즉, 전분화능을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다. 당업자는 분화되지 않은 상태와 분화된 상태를 일반적인 방법으로 확연하게 구별할 수 있다. 예를 들어, 분화되지 않은 세포는 형태학적으로 높은 (핵 비율/세포질 비율) 값을 가지고 인이 현저하게 보이는(prominent nucleoi) 특징을 갖는다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 인간배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포를 포함하는 다능성줄기세포 및 상기 다능성줄기세포가 다수의 연속 계대 배양을 통해서 미분화 상태로 유지되기에 충분한 양의 뉴로펩타이드 Y를 포함하는 배지 조성물을 포함하며, 상기 배지 조성물은 동물 혈청 및 영양세포유래인자를 포함하지 않으며, 동물 혈청이나 영양세포유래인자에 노출된 적이 없는 것인 시험관 내 세포 배양물을 제공한다.

이때, 상기 줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 다능성줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 다능성줄기세포다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 배지 조성물에는 0.01 초과 내지 100 μM 이하의 농도의 뉴로펩타이드 Y가 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.1 초과 내지 10 μM 이하가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 배지 조성물에는 동물혈청 및 영양세포유래인자가 포함되지 않은 상태에서 N2 보충물, B27 보충물, bFGF 및 TGFβ로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 추가로 포함될 수 있으며, 이 때, 상기 N2 보충물과 B27 보충물은 1:1의 비율로 제공되고, 상기 bFGF는 4-100 ng/㎖의 농도로 제공되며, 상기 TGFβ는 1-10 ng/㎖의 농도로 제공될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 다능성줄기세포를 수득하는 단계 및 상기 다능성줄기세포를 상기 배지 조성물을 포함하는 배양 조건 하에서 배양하여 다능성줄기세포주를 수득하는 단계를 포함하는 미분화 상태로 유지될 수 있는 다능성줄기세포주의 제작방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 다수의 연속 계대 배양을 통해서 다능성줄기세포를 미분화 상태로 유지하기에 충분한 양의 뉴로펩타이드 Y를 포함하는 배지 조성물 상에서 다능성줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 미분화 상태로 다능성줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.

이 때, 상기 방법은 동물 혈청 및 영양세포유래인자를 이용하거나 또는 이용하지 않는 상태로 다능성줄기세포를 미분화 상태로 유지시킬 수 있다.

이때, 상기 다능성줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 다능성줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 다능성줄기세포다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 배지 조성물에는 동물혈청 및 영양세포가 포함되지 않은 상태에서 N2 보충물, B27 보충물, bFGF 및 TGFβ로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 추가로 포함될 수 있으며, 이 때, 상기 N2 보충물과 B27 보충물은 1:1의 비율로 제공되고, 상기 bFGF는 4-100 ng/㎖의 농도로 제공되며, 상기 TGFβ는 1-10ng/㎖의 농도로 제공될 수 있다.

본 발명에서의 용어, '계대 배양'이란, 세포증식 방법의 하나로 균주를 보존하고 세포의 대를 이어가기 위해 5?7일마다 주기적으로 새로운 배지에 이식시키는 것을 의미하나, 특히 본 발명에서의 '계대(passage)'는 배양 용기에서 초기 종배양부터 동일한 배양 용기에 세포가 왕성하게 자라는 시기(confluence)까지의 다능성줄기세포의 성장으로 정의한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 다능성줄기세포를 15계대 이상 영양세포 없이 미분화 상태로 유지시킬 수 있다.

바람직한 일 양태로서 본 발명은 다능성줄기세포의 분화가 일어나지 않고 순화 배지나 영양 공급 세포 없이, 다능성줄기세포의 장기간, 미분화 증식을 위하여 다양한 농도의 NPY를 첨가한 배지 조성물에 첨가하여 두 개의 독립적으로 제작된 인간배아줄기세포(H9, HEUS-7) 및 인간유도만능줄기세포를 배양해 본 결과, 15 계대 이상 영양세포 없이 NPY 배지 (0.5 μM NPY를 첨가한 UM)에서 미분화 상태가 정상적으로 유지됨을 인간배아줄기세포 표지인자들의 정상 발현(도 5a) 및 정상 핵형 유지(도 5b), 배아체 형성을 통한 in vitro 삼배엽 분화능(도5c), 신경계로의 directed 분화유도능 검증(도5d와 도5e)을 통해 확인하였다.

또한, 상기 다능성줄기세포의 미분화 상태의 유지는 ALP(alkaline phosphatase), OCT-4, SOX2, hTERT(human telomerase reverse transcriptase), TDGF(teratocarcinoma-derived growth factor) 및 SSEA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 증가되는 것으로 확인할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일구현에 따르면, 인간배아줄기세포의 미분화 특이 표지 인자인 ALP, OCT-4, SOX2, hTERT, TEGF 및 SSEA-4의 발현 수준이 증가하는 것으로 (도 2b 및 2c) 인간배아줄기세포가 미분화된 상태를 유지하였음을 확인하였다. 또한, 외인성 NPY가 15계대 이상 장기간 다능성줄기세포를 영양세포 없이 미분화 상태로 유지시킬 수 있는지 확인하기 위해서 상기 인간배아줄기세포의 미분화 특이 표지 인자의 발현 수준을 확인하였다(도 5a).

또한, 바람직하게는 상기 NPY 매개 다능성줄기세포의 미분화 상태 및 증식능 유지는 뉴로펩타이드 Y 수용체 Y1 및 Y5의 활성 촉진에 의해 유도할 수 있으며, 상기 뉴로펩타이드 Y 수용체 Y1 및 Y5의 활성 촉진은 AKT, ERK1/2, PKA, CREB 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 신호전달경로의 활성의 촉진에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, NPY가 인간배아줄기세포의 미분화 상태 및 미분화 증식능 유지에 미치는 효과가 NPY 수용체 Y1 및 Y5를 경유한 신호전달경로와 연관되어 있음을 확인하였다. 인간배아줄기세포의 미분화 상태 유지에 기여하는 NPY 특이적 NPY 수용체를 확인하기 위해, Y1 및 Y5의 선택적 화합물 억제제인 BIBP3226(3 mM) 및 L152804(3 mM)를 사용하여 Y1및/또는 Y5 를 불활성화시킨 후 NPY에 의해 매개되는 인간배아줄기세포의 미분화 상태를 관찰한 결과 인간배아줄기세포의 미분화 상태가 상실됨을 형태적 변화(도 3a) 및 미분화 특이 표지인자 발현 감소를 통해 확인하였다(도 3a 및 3b). 따라서, NPY에 의해 매개되는 인간배아줄기세포 미분화 상태 유지는 NPY에 의해 매개되는Y1 및 Y5 수용체의 활성화와 연관되어 있음을 확인하였다. 또한, 상기 NPY 자극에 의해 유지된 인간배아줄기세포의 미분화 증식능이 Y1 및/또는 Y5 화합물 억제제(도 4a) 및 AKT, ERK1/2, PKA 활성 억제 화합물(도 4b) 에 의해 상실됨을 확인하였다. 보다 구체적으로, 인간배아줄기세포의 미분화 증식능 유지에 기여하는 NPY 특이적 NPY 수용체를 확인하기 위해, Y1 및 Y5의 선택적 화합물 억제제인 BIBP3226(3 mM) 및 L152804(3 mM)를 사용하여 Y1및/또는 Y5 를 불활성화시킨 후 NPY에 의해 매개되는 인간배아줄기세포의 증식률을 관찰한 결과 인간배아줄기세포의 미분화 증식능이 상실됨을 BrDu 염색 양성 세포의 감소를 통해 확인하였다(도 4b). 따라서, NPY에 의해 매개되는 인간배아줄기세포 미분화 증식능 유지는 NPY에 의해 매개되는Y1 및 Y5 수용체의 활성화와 연관되어 있음을 확인하였다. 또한, NPY 자극에 의해 인산화 AKT, 인산화 ERK1/2, 인산화 CREB 단백질 발현이 증가됨을 검증하였고(도6a), 특이적으로 Y1 및/또는 Y5 화합물 억제제에 의해 NPY매개 AKT, ERK1/2, CREB 인산화가 억제되며(도6b), 각각의AKT, ERK1/2, PKA 화합물 억제제에 의해 NPY 매개 AKT, ERK1/2, CREB 인산화가 억제(도6c 및 d)됨을 관찰함으로써 확인하였다(도 6e).

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y)를 포함하는 역분화용 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 뉴로펩타이드 Y를 포함한 역분화용 배지 조성물에서 분화된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 역분화 유도 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 분화된 세포를 상기 뉴로펩타이드 Y를 포함한 역분화용 배지 조성물을 포함하는 배양 조건 하에서 배양하여 역분화시키는 단계를 포함하는 역분화 세포주의 제작 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 분화된 세포, 및 상기 뉴로펩타이드 Y를 포함한 역분화용 배지 조성물을 포함하며, 상기 분화된 세포는 역분화되는 시험관 내 세포 배양물 을 제공한다.

본 발명에서의 용어, '역분화'란, 존재하는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌려 새로운 분화 조직 형성이 가능하도록 하는 후성학적인 역행과정을 의미하는 것으로 리프로그래밍 과정이라고도 말하며 세포 유전체의 후성학적인 변형 (epigenetic changes)의 가역성에 기초한 것이다. 본 발명에서의 목적에 따라, 상기 '역분화'란 0% 이상 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이라면 모두 이에 포함되고 예를 들어 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포를 1%의 분화능을 가지는 분화된 세포로 미분화시키는 과정도 이에 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 100% 분화능을 가지는 세포로 미분화시키는 것이다.

본 발명에서의 용어, '역분화 세포주'란 상기 역분화 과정에 의해 제작된 세포주는 모두 포함되며, 0% 초과 100% 이하의 분화능을 가지는 세포주를 말하며 예를 들어 0% 분화능을 가지는 세포가 상기 역분화 과정에 의해 1% 분화능을 가지는 세포로 역분화되었으며 상기 1% 분화능을 가지는 세포도 역분화 세포주에 포함될 수 있다. 예를 들어, 전구세포, 유도만능줄기세포가 포함될 수 있으며 가장 바람직하게는 유도만능줄기세포이다.

본 발명에서의 용어, '분화된 세포'란 0% 이상 내지 100% 미만의 세포 분화능을 가지는 세포를 의미한다. 이에, 역분화에 의해 전부 또는 일부가 미분화될 수 있는 범주 내의 세포는 모두 분화된 세포로 포함되며, 예를 들어 체세포 또는 전구세포가 포함된다. 상기 0%의 세포 분화능을 가지는 세포는 체세포에 해당될 것이다.

바람직하게, 본 발명에서의 상기 역분화용 배지 조성물은 체세포 또는 전구세포를 유도만능줄기세포로 역분화시키거나 전구세포를 유도만능줄기세포로 역분화시킬 수 있다.

본 발명에서의 용어, '체세포'란 성체를 구성하는 세포로서 분화능 및 자가생산능이 제한된 세포를 의미한다.

본 발명에서의 용어, '전구세포'란 특정 세포의 형태 및 기능을 갖추기 전 단계의 특정 세포 계통의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직으로 형성될 수 있는 세포로서, 자가재생산능(self-renewal)은 가지나 극히 제한된 분화능을 갖는 세포를 의미하며, 내배엽 전구세포, 중배엽 전구세포, 및 외배엽 전구세포가 모두 포함된다.

이때, 상기 역분화용 배지 조성물은 분화된 세포의 전부 또는 일부를 미분화된 세포로 역분화시킬 수 있다.

이때, 상기 분화된 세포 또는/및 역분화 세포주 또는/및 유도만능줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 분화된 세포 또는/및 역분화 세포주 또는/및 유도만능줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 분화된 세포 또는/및 역분화 세포주 또는/및 유도만능줄기세포이다.

본 발명의 일구현에 따르면, 역분화인자 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 유전자 이입 레트로바이러스 발현 방법을 이용하여 인간체세포로부터 유도만능줄기세포를 제작하는 유도배양과정에서 NPY (>0.1 μM)를 첨가한 배지를 사용하여 역분화를 유도한 결과, NPY를 첨가하지 않은 대조군에 비해 유도만능줄기세포주 확보 효율이 현저하게 증가되었음을 ALP 염색 양성 콜로니 생성 증가 (도 8a)를 통해 확인하였고, 제작된 유도만능줄기세포가 배아줄기세포와 유사한 전분화능을 가지고 있음을 인간배아줄기세포 미분화 특이 표지인자 발현(도 8b 및c), 리프로그래밍 전사인자의 숙주세포 genomic DNA 내로의 삽입(도 8d), 리프로그래밍 전사인자 Oct4, Nanog프로모터의 CpG 탈메틸화(도 8e), 삼배엽으로의 분화능(도 8f 및 g)을 검증함으로써 확인하였다.

본 발명에 따른 뉴로펩타이드 Y(NPY)를 포함하는 다능성줄기세포의 미분화 증식을 유도하는 배지 조성물은 영양세포유래인자 또는 동물혈청 없이 다능성줄기세포를 미분화 상태에서 장기적으로 유지, 배양하는데 효과적으로 이용할 수 있으며, 역분화 유도 과정에 이용함으로써 역분화 유도 효율 증진과 함께 역분화 유도 배양 조건을 개선할 수 있다. 또한, 상기 배지 조성물을 이용한 방법은, 임상적용 가능한 다능성줄기세포를 생산하는 방법을 개발하는데 효과적으로 이용될 수 있을 뿐만이 아니라, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를 포함하는 다능성줄기세포의 대량 배양 시스템 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인간배아줄기세포, 인간유도만능줄기세포 및 MEF 영양세포에서 NPY 및 그의 수용체 발현을 나타낸 것이다. (a) 인간 배아줄기세포 (H9, HEUS-7 및 H1), 인간유도만능줄기세포 및 MEFs에서 NPY, NPY 1Y, NPY 2Y, NPY 4Y 및 NPY 5Y에 대한 mRNA 발현의 Semi-quantitative RT-PCR 분석. GAPDH는 로딩 컨트롤로서 사용되었다. (b) H9 세포 및 MEFs에서 NPY 단백질 발현의 면역 형광 분석. 세포 핵은 DAPI로 대비염색 하였다. Bar =50 μm. (c) 미분화 및 분화 H9 인간 배아줄기세포 (RA-분화 인간 배아줄기세포 및 분화한 인간 배아체)에서 NPY, NPY 1R 및 NPY 5R의 mRNA 발현의 실시간 qRT-PCR분석. 그 결과를 MEF-CM에서 배양된 미분화 인간 배아줄기세포의 양을 1로 하여 그에 대한 상대적인 mRNA 량으로 도시하였고, 평균 ± SE (n=3)로 나타내었다.
도 2는 영양세포를 사용하지 않는 NPY 배지를 이용한 배양조건에서 인간 배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포 배양 결과를 나타낸 것이다. (a) 3 계대 동안 0.5 μM NPY 또는 40 ng/㎖ bFGF를 포함하는 UM(unconditioned medium) 또는 MEF-CM (conditioned medium)에서 배양된 H9 인간 배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포의 대표적 형태(Representative morphology). 상부 패널: 위상차 이미지(phase contrast images). Bar = 500 μm 또는 1 mm (삽입 이미지). 하부 패널: 35 mm 라운드 디쉬의 스캔한 이미지와 역상 현미경 이미지는 ALP 염색 후에 얻었다. Bar = 500 μm (삽입 이미지). (b) OCT4, SOX2, hTERT 및 TDGF의 발현을 위한 실시간 qRT-PCR 분석. H9 및 HEUS-7 인간 배아줄기세포를 지시 배지(indicated media)에서 하나 또는 두 계대 동안 배양하였다. 그 결과를 CM에서 배양한 미분화 인간 배아줄기세포에서 검출된 양을 1로 하여 그에 대한 상대적인 mRNA 량으로 나타내었고, 평균 ± SE로 나타내었다. (c) H9 인간 배아줄기세포에서 SSEA-4 및 ALP 발현의 FACS 분석. 세 개의 독립적인 실험으로부터 유세포 분석(flow cytometry)에 따른 대표 플롯(Representative plots)을 나타내었다.
도 3은 인간배아줄기세포 배양에서 NPY Y1 및 Y5 수용체의 선택적인 화합물 억제제의 영향을 나타낸 것이다. H9 인간 배아줄기세포는 지시 배지(indicated media)를 사용하여 영양세포 없는 상태에서 5일 동안 배양하였다. (a) H9 인간배아줄기세포의 대표 상 역상(상부 패널) 및 ALP-염색 이미지(하부 패널) Bar = 500 μm 또는 1 mm (삽입 이미지; 상부 패널). 35 mm 라운드 배양 접시의 스캔한 상 및 현미경 상은 ALP 염색 후에 얻었다. Bar = 500μm (삽입 이미지; 하부 패널). (b) OCT4, SOX2, hTERT 및 TDGF의 발현을 위한 실시간 정량 PCR 분석. 그 결과를 MEF-CM에서 배양된 미분화 인간배아줄기세포에서 검출된 양을 1로 하여 그에 대한 상대적인 mRNA 량으로 나타내었고, 평균 ± SE (n=3)로 나타내었다.
도 4는 인간배아줄기세포 증식에서 NPY의 효과를 나타낸 것이다. BrdU incorporation을 이용하여 측정한 지시 배지를 사용하여 H9 인간배아줄기세포의 증식 비율을 측정한 것이다. NPY-매개 인간배아줄기세포 증식은 NPY Y1 (BIBP3226; 3μM) 및 Y5 (L152804; 3μM) 수용체(a)의 화합물 억제제 및 AKT (AKTi; 10μM), ERK1/2 (U0126; 10μM) 또는 PKA (H89; 10μM) 의 억제자(b)의 유무에 따라 측정하였다. 상부 패널: BrdU+ 세포의 대표 이미지. Bar = 100 μm. 하부 패널: BrdU+ 세포의 정량. 시야 당 BrdU+ 세포의 상대적 수를 정량하였고 계산된 전체 세포 수의 비율로서 나타내었다. 상기 데이터를 평균 ± SE (n=3)으로 나타내었다. * p<0.01, t-test에 의함.
도 5는 영양세포를 사용하지 않는 배양조건에서 NPY 배지를 사용하여 장기간 배양한 인간배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포의 배양 결과를 나타낸 것이다. (a) OCT4, NANOG, SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-60 및 TRA-1-80의 대표 인간 배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포 콜로니 및 면역조직화학적 분석. H9 및 HEUS-7 세포를 15 계대 동안 NPY 배지에서 배양하였다. 핵을 DAPI 염색에 의해 형상화하였다(삽입). Bar = 500 μm 또는 1 mm(삽입 이미지). (b) 15 계대 동안 NPY 배지에서 배양된 인간 배아줄기세포의 핵형 분석. (c) 인간배아체 형성 및 분화. H9 세포로부터 유래한 인간배아체는 15 계대(passages) 동안 CM 또는 NPY 배지에서 배양되었다. 상부 패널 ; 인간배아체의 대표 이미지. Bar = 500 μm 또는 1 mm (삽입 이미지). 하부 패널 ; 세 개의 생식 층의 OCT4의 발현 및 분화 마커 특징에 대한 실시간 RT-PCR 분석; 외배엽(PAX6 및 NCAM), 중배엽(GATA2 및 cTnT) 그리고 내배엽(α-FP 및 GATA6). 상기 데이터를 세 개의 독립적 실험의 평균 ±SE 값으로 나타내었다. (d) 인간배아줄기세포로부터 유래한 NESs (Neuroectodermal spheres). 좌측 패널; NESs의 대표 이미지. 우측 패널 ; NESs에서 신경 세포 마커 발현의 RT-PCR 분석. (e) Ki67 (세포 증식 마커), 네스틴(nestin), MSI1, 및/또는 NCAM에 대해 염색된 NESs의 대표 이미지. Bar= 500 μm.
도 6은 인간배아줄기세포에서 세포 내 서열에서 NPY의 영향을 나타낸 것이다. (a) 지정된 시간 동안 1μM NPY를 처리한 H9 세포의 웨스턴 블롯. (b) 3 μM BIBP3226 (BIBP) 또는 3 μM L-152804 (L)를 1시간 사전 처리 유무에 따라 5분 동안 1μM NPY를 처리한 H9 세포의 웨스턴 블롯. (c) 10 μM AKTi, 10 μM U0126 또는 10 μM H89로 1시간 사전처리 유무에 따라 5분 동안 1μM NPY를 처리한 H9 세포의 웨스턴 블롯. 각 멤브레인은 지시 항체(indicated antibodies)를 사용하였고, 로딩 컨트롤로서 β-actin을 사용하였다. 단백질 정량을 위해, 블롯을 스캔하였고, 밴드를 밀도계로 정량하였다(a-c, 하부 패널). 데이터를 평균 ± SE (n= 3)로 나타내었다. **p<0.01, * p<0.05, t-test에 의함. (d) 3 μM BIBP3226, 10 μM AKTi, 10μM U0126 또는 10 μM H89로 1시간 사전처리 유무에 따라 5분 동안 1μM NPY로 처리한 인간 배아줄기세포의 면역조직화학 분석. (e) 인간배아줄기세포에서 NPY 와 Y1 및 Y5 수용체에 의해 활성화된 가능성 신호 경로의 간단한 도식화.
도 7은 NPY-N2/B27 배지에서 인간배아줄기세포의 영양세포 및 혈청을 이용하지 않고 배양하였음을 나타낸 것이다. (a) 대표 인간 배아줄기세포 콜로니 형태 및 OCT4, NANOG, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-80의 면역조직화학적 분석. H9 세포는 6 계대 동안 1×DMEM/F12, 1×N2/B27, 1μM NPY 및 20 ng/㎖ bFGF를 포함하는 영양세포 및 혈청을 이용하지 않은 상태에서 유지되었다. 핵은 DAPI 염색으로 시각화하였다. Bar = 500 μm 또는 1 mm (삽입 이미지). (b) 6 계대(passages) 동안 NPY N2/B27 배지에서 배양된 H9 세포의 핵형 분석. (c) 실험 재료 및 방법에 개시된 바에 따라 세포 수를 측정함에 있어 6일 동안 지시 배지를 사용해 배양한 H9 세포의 성장 효율 비교. 데이터를 평균 ± SE (n= 3)로 나타내었다. ** p<0.01, * p<0.02, t-test에 의함. (d) 다른 인간배아줄기세포 배양 조건의 비교. 다른 배지에서 배양된 인간배아줄기세포를 형태적, ALP 염색 및 성장 효율을 기초로 측정하였다.
도 8은 NPY를 첨가한 배양조건에서 제작한 유도만능줄기세포의 특성을 분석한 결과이다. (a) 역분화 유도 배양과정에서 NPY 첨가 유무에 따른 역분화 유도 효율 변이를 세포모양 및 ALP 염색을 통해 분석하였다. NPY를 첨가한 배양조건에서 제작한 유도만능줄기세포에서의 인간배아줄기세포 특이 마커 발현을 RT-PCR분석법(b) 및 면역화학염색법(c)을 이용하여 확인하였다. (d) NPY를 첨가한 배양조건에서 제작한 유도만능줄기세포에서의Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc 전사인자 숙주 genomic DNA내 발현 양상을 분석하였다. (e) NPY를 첨가한 배양조건에서 제작한 유도만능줄기세포에서의 Oct3/4, Nanog 전사인자 프로모터 메틸화 패턴을 분석한 것이다. 삼배엽으로의 분화능을 삼배엽-특이 마커 발현 확인을 위해 RT-PCR분석법(f) 및 면역화학염색법(g)으로 확인하였다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인간다능성줄기세포 배양

두 종의 인간배아줄기세포 H9 (NIH Code, WA09; WiCell Research Institute, Madison, WI), HUES-7 (Harvard University, Cambridge, MA) 및 H1 (NIH Code, WA01; WiCell Research Institute)와 제작된 유도만능줄기세포는 인간배아줄기세포 배양의 통상적인 방법에 따라 유지시켰다(Kim MS (2007) Lab Chip 7, 513-515). 피더-프리(feeder-free) 배양을 위해 인간배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를 인간 NPY(Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂; Sigma) 첨가 유무에 따라 MEF-CM(MEF-conditioned medium) 또는 UM(unconditioned medium)에서 마트리겔(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)이 코팅된 배지에서 배양하였다. 상기 배양된 인간배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를 주당 한 번 콜라게네이즈 IV(collagenase IV) (1 mg/㎖; Invitrogen) 또는 디스파제(dispase) (1 mg/㎖; Invitrogen)를 처리하여 계대배양 하였다. MEF-CM은 공지된 바에 따라(Xu C. Nat Biotechnol 19, 971-974) γ-방사선 조사된(γ-irradiated) MEF로 준비하였고, MEF-CM은 8 ng/㎖ bFGF을 추가하였다. UM은 80% DMEM/F12, 20% KSR, 1% NEAA, 1 mM L-글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올 (Sigma) 및 4 ng/㎖ bFGF을 포함한다. 영양세포 및 혈청 없이 배양하기 위해, 인간배아줄기세포를 NPY 및 TGFβ (R&D systems, Minneapolis, MN) 유무에 따라 DMEM/F12, 1× N2/B27 (Invitrogen), 1% NEAA, 1mM L-글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올(mercaptoethanol)을 포함하는 N2/B27에 기초한 배지에서 배양하였다.

실시예 2. ALP 염색( Alkaline Phosphatase Staining )

ALP(alkaline phosphatase) 염색은 제조사(Sigma)의 지침에 따라 시판되는 ALP 키트를 사용하여 수행하였다. ALP-양성 세포(positive cells)의 이미지를 HP Scanjet G4010으로 기록하였다. 또한, 올림푸스 현미경(IX51, Olympus, Japan)으로 명시야상(bight field images)을 얻었다.

실시예 3. 유세포 분석기( Flow cytometry )

인간배아줄기세포를 배양한 후, 유세포 분석기로 SSEA-4 및 ALP의 발현을 분석하였다.

구체적으로, 인간배아줄기세포를 세포 분리 완충액(Invitrogen)으로 분리하여, 40 μm 나일론 세포 여과기(nylon cell strainer) (BD Biosciences)를 통해 여과하였으며, 0.1% BSA가 포함된 100 μL PBS에 있는 약 5×10⁵ 세포가 되게 재현탁하였다. 상기 세포를 4 ℃에서 30분 동안 PBS, 0.1% BSA에서 1차 항체 (ALP (R&D systems, 1 μg/test) 및 SSEA-4 (R&D systems, 1 μg/test)를 사용하여 반응하였다. 세척한 후에, 상기 세포를 4 ℃에서 30분 동안 염소 항-마우스(goat anti-mouse) IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)가 부착된 FITC를 사용하여 반응하였다. CellQuest software를 사용하여 FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA)에서 분석한 후, 10,000 건 전체를 수득하였으며, 상기 분석을 전방 및 측방 산란을 기초로 한 살아있는 건들로 제한하였다. 양성 세포 분포는 동형 대조군 항체가 접합된 FITC를 사용하여 염색된 세포의 분포에 대해 보정한 후 측정하였다.

실시예 4. 핵형분석( Karyotype Analysis )

15 계대(passages)를 위해 0.5 μM NPY (NPY 배지)가 추가된 UM 에서 배양된 인간 배아줄기세포를 G-banding 분석법에 의해 확인하였다. 대표 이미지(Representative images)를 ChIPS-Karyo (Chromosome Image Processing System, GenDix)를 사용하여 얻었다.

실시예 5. 배아체 분화( Embryoid body differentiation )

인간배아줄기세포분화의 잠재성을 측정하기 위해, 인간 배아체(hEBs)를 비부착 배양접시를 사용하여 hEB 배지(10% SR(serum replacement))를 포함하는 DMEM/F12)에서 부유 배양하였다. 부유액에서 성장 5일 후, 인간 배아체를 젤라틴-코팅 배양접시로 옮겨서 부착 추가로 15일 동안 배양하였다.

실시예 6. BrdU incorporation

인간배아줄기세포를 5-브로모(bromo)-2-데옥시우리딘(deoxyuridine)(BrdU; BD Pharmingen, San Diego) incorporation assays를 위해 4일 동안 마트리겔이 코팅된 4-웰 LabTec 챔버 슬라이드에서 배양하였다.

구체적으로 BrdU incorporation을 위해, 세포를 1시간 동안 37℃에서 30 μM BrdU 존재 하에서 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후에, 상기 세포를 15분 동안 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하였으며, 실온에서 15분 동안 1 N HCl에서 반응하였다. 상기 샘플을 세척하고 15분 동안 0.1 M 소듐 테트라보레이트(sodium tetraborate)로 반응하였다. 세척한 후, 상기 세포를 1시간 동안 3% BSA를 보충한 PBS에서 항-BrdU 항체를 사용하여 반응한 후, 30분 동안 2차 항체(Invitrogen)가 부착된 FITC를 사용하여 반응하였다. 핵은 DAPI로 대비염색한 후에 올림푸스 현미경(Olympus microscope)을 사용하여 세포를 관찰하였다. 시야 당 BrdU+ 세포의 평균 값을 확인하였고, 적어도 커버슬립 당 4 시야가 측정되었다.

실시예 7. 성장 효율 시험( Growth efficiency test )

100 μm 인간 배아줄기세포군(clumps) (군집 당 약 70-90개의 세포)에 의해 동량(동 수) 100 μm를 최종 볼륨이 2 ㎖로 마트리겔(Matrigel)이 코팅된 35 mm 배양 접시에 깔았다. 상기 세포를 35 mm 배양 접시 당 약 5×10⁵ 세포의 밀도가 되도록 접종하였다. 접종된 세포를 개시된 배양 조건하에서 6일 동안 배양하였다. 세포 수를 측정하기 위해, 세포를 PBS로 세척하고 트립신 처리하였다. 상기 세포 부유액을 0.4% (wt/vol) 트리판 블루 용액(trypan blue solution)으로 섞은 다음, 살아 있는 세포 수를 헤모사이토미터(hemocytometer)를 사용하여 측정하였다. 각 실험을 세 번 실시하였다.

실시예 8. RT - PCR 및 정량 실-시간 PCR

전체 RNA는 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 인간 배아줄기세포로부터 추출하였다. cDNA 합성은 SuperScript First-strand Synthesis System kit(Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. RT-PCR을 다음 조건에 따라 platinum PCR SuperMix kit (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다: 94 ℃에서 3분, 그 다음 94 ℃에서 30초간 28 주기(cycles), 60 ℃에서 30초간, 및 72 ℃에서 30초에 상기 주기에 이어서 72 ℃에서 10분간 연장하였다. 실시간 qPCR을 다음의 조건하에서 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen)를 사용하여 수행하였다: 95℃에서 10분, 95℃에서 15초간 40주기 및 60℃에서 1분간 수행하였다. 각 실험을 적어도 3회 수행하였다. 각 유전자의 발현 값은 각 샘플에서 존재하는 mRNA의 상대량을 측정하는 GAPDH 전사량으로 표준화하였다. 에러바(Error bar)는 평균의 표준 오차(n=3)를 나타낸다. 사용한 프라이머를 표 1에 나타내었다.

실시예 9. 면역 세포화학적 방법( Immunocytochemistry )

면역 염색법을 위해, 세포를 마트리겔(matrigel)로 코팅된 4 웰 Lab-Tek 챔버 슬라이드 (Nunc, Naperville, IL)에 접종하고 개시된 조건 하에서 5일 동안 배양하였다. 세포를 실온(RT)에서 15분 동안 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 고정시켰다. PBS/0.2% BSA를 사용하여 세척한 후에, 세포를 15분 동안 PBS/0.2% BSA/0.1% 트리톤 X-100에 투과시켰고, 실온에서 1시간 동안 PBS/0.2% BSA에서 4% 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)으로 반응시켰다. 세포를 PBS/0.2% BSA로 희석시킨 각각의 1차 항체를 사용하여 4 ℃에서 2시간 동안 반응하였다. 세척한 후, 세포를 1시간 동안 실온에서 PBS/0.2% BSA에 있는 2차 항체(Invitrogen)가 부착된 FITC 또는 Alexa594를 사용하여 반응하였다. 세포를 10 ㎍/㎖ DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 대비염색하였다. 챔버 슬라이드(Chamber slide)는 올림푸스 현미경(Olympus microscope) 또는 Axiovert 200M 현미경 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany)으로 분석하였다. 사용된 항체를 표 2에 나타내었다.

실시예 10. 웨스턴 블롯 분석( Western blot analysis )

인간배아줄기세포를 50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% 데옥시콜릭 산(deoxycholic acid), 1 mM PMSF를 포함하는 RIPA 완충액으로 용해하고 아이스에서 15분 동안 프로테아제 억제제(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 섞어서 4 ℃에서 10분 동안 20,000 × g로 원심분리하였다. 상청액을 10분 동안 재-원심분리하였고, BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 단백질(20 ㎍)을 SDS PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)로 분획하였으며, PVDF (polyvinylidene fluoride) 멤브레인 (Millipore Corp, Bedford, MA)으로 전기영동하였다. 맴브레인을 실온에서 2시간 동안 0.1% 트윈-20 및 5%의 탈지유(non-fat milk)가 포함된 PBS에서 반응시키고, 1시간 동안 PBS/0.2% BSA로 희석된 1차 항체를 사용하여 탐침하였다. 세척한 후, 맴브레인을 2차 HRP가 부착된 항-래빗 (anti-rabbit) 또는 HRP가 부착된 항-마우스(anti-mouse) 항체 (Amersham, Arlington Heights, IL)로 반응하고, 상기 밴드를 ECL Advance kit (Amersham)로 시각화하였다. 밴드를 Image Gauge software (Fuji Photo Film GMBH, D)를 사용하여 밀도를 분석하였고 로딩 대조군(β-actin) 밴드로 표준화하였다. 모든 실험을 3회로 수행하였다. 에러바는 평균의 표준 오차 값을 의미한다(n=3). 사용된 항체를 상기 표 2에 나타내었다.

실시예 11. 인간배아줄기세포로부터 신경외배엽성 구의 유도( Derivation of neuroectodermal spheres from hESCs )

인간배아줄기세포를 생산하기 위해, 작은 크기의 인간배아줄기세포 클럼프를 비부착성 배양접시에 옮겨서 7일 동안 인간 배아체 배지에서 배양하였다. NESs (neuroectodermal spheres)를 유도하기 위해, 인간배아체를 NES 배지(DMEM/F12 supplemented in 1×N2/B27 (Invitrogen), 20 ng/㎖ 상피 세포 성장인자(epidermal growth factor)(Invitrogen), 20 ng/㎖ bFGF, 10 ng/㎖ LIF(leukemia inhibitory factor)(Sigma) 및 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신)에서 배양하였다. 본 단계에서, 세포를 P1 (passage 1)으로 한정하였다. 배지를 매 2일 마다 교환해주었고, NESs를 McIlwain tissue chopper (Mickle Engineering, Gomshall, Surrey, UK)를 사용하여 매주 계대배양하였다.

실시예 12. 역분화 인자 발현 레트로바이러스 생산

　바이러스 생산을 위해 역분화 전사인자인 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc 각각에 대한 레트로 바이러스 벡터를 사용하여, Gag/pol가 포함된 HEK 293 세포 (GP2 293)에 lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 형질전환 (transfection)하였다.　 각 네가지 역분화 인자 유전자 벡터-lipofectamine 2000 복합체를 형성한 다음, 그 500ul의 용액을 상기 세포가 배양된 배지에 가하고, 살살 흔들어서 혼합한 다음 16시간 동안 배양하였다. 이때 형질전환 효율을 확인하기 위해서 pMXs-EGFP-Rheb-IP벡터를 이용하였다. 다음날 배지를 교환하고 24시간 배양 후부터 상등액 (supernatant)을 취하여 0.45 um (Millipore)로 필터링 (filtering)을 하여 세포 잔해 (cell debris)를 제거하였다. GFP 양성 세포를 형광현미경 관찰을 통해서 형질전환의 효율을 확인하고, 필터링한 상등액을 20,000 rpm에서 2시간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 남은 침전물에 HBSS (Gibco)를 넣어 바이러스를 농축시켰다. 효율을 확인하기 위해서 pMXs-EGFP-Rheb-IP벡터를 형질전환하여 획득한 바이러스 용액을 이용하였고, FACS 분석방법 및 형광현미경 관찰을 통해 바이러스의 타이터(titer), 즉 MOI값을 결정하였다. 상세하게는 체세포에 바이러스 농축액을 시리얼(serial)로 희석하여 각각 형질도입(transduction) 후 다음날 배지를 교환하고, 5일 후 트립신을 처리함으로써 single cell로 dissociation하였고, 1% BSA가 포함된 PBS에 Propidium iodide (PI) 를 넣고 10,000개의 세포를 FACScalibur(BD bioscience)로 분석하였다. GFP positive 세포수를 측정함으로써 MOI값을 계산하였다.

실시예 13. 유도만능줄기세포 제작

MOI 1~5의 농축시킨 바이러스 용액과 6-8 ㎍/㎖ polybrene (sigma)을 섬유아체세포에 첨가하여 24시간 배양 후 배지를 교환해 주었고, 5일 동안 배양한 후, 트립신(Trypsin-EDTA)을 이용하여 세포를 떼어낸 후, 피더 세포(feeder cell)에 세포를 뿌려주고 체세포 배지로 세포를 배양하였다. 다음날 인간배아줄기세포 배양액으로 배지를 교환해 주었고, 약 2주가 지나면 인간배아줄기세포 모양을 가진 세포가 생성됨을 확인하였고 계대배양을 하였다. 이때 역분화유도 배양과정에서 체세포 배지 및 인간배아줄기세포 배지에 다양한 농도(0.1-10 mM)의 NPY를 첨가한 후 역분화 유도 효율에 미치는 영향을 세포의 형태학적인 변화 및 인간배아줄기세포 마커 발현 변이를 조사함으로써 확인하였다.

실시예 14. 리프로그래밍 전사인자프로모터 메틸화 분석

　　　　　인간배아줄기세포와 Oct4, Sox2, c-Myc 유전자 이입 레트로바이러스를 이용하여 확립된 유도만능줄기세포의 특성을 검증하기위해 인간배아줄기세포 특이 전사인자 Oct3/4, Nanog 프로모터 메틸화 상태를 분석하였다. Genomic DNA 추출하기 위해서 인간배아줄기세포 배지에서 6일간 배양한 인간배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 DNA extraction kit (Qiagen Genomic DNA purification kit)를 이용하여 추출하였다. Bisulfite 시퀀싱(sequencing)은 3단계로 수행하였다. 첫 번째 단계는 sodium bisulfite (NaHSO₃)을 이용하여 DNA를 변형시키는 과정이고, 두 번째 단계는 분석하고자 하는 유전자 부위(보통 promoter region)를 PCR로 증폭하고, 세 번째 단계는 PCR 산물을 시퀀싱하여 DNA 메틸화의 정도를 분석하였다. Sodium bisulfite을 이용한 DNA 변형과정은 상품화된 키트 EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research)를 이용하였는데, DNA를 bisulfite로 처리를 할 경우 메틸화되어 있는 시토신은 변하지 않고 그대로 시토신을 유지되는 반면, 비메틸화되어 있는 시토신은 우라실(uracil)로 전환된다. 따라서, 시토신과 우라실 염기서열에 특이한 프라이머를 이용해서 각각 PCR로 증폭시킬 경우 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 구분할 수 있게 된다. 프라이머의 염기서열은 표 3에 나타내었다. PCR 반응 혼합액은 bisulfite로 처리한 DNA 1 ㎍, deoxynucleoside triphosphate 0.25 mM/L, MgCl₂ 1.5 mM/L, 프라이머 50 pM, 1× PCR buffer, Taq polymerase (Platinum Taq DNA polymerase, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 2.5 units로써 최종 20㎕가 되게 하였다. 또한 PCR 반응 조건은 95℃ 10분 시행 후 95℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분 과정을 40주기 시행하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR 반응 생산물은 1.5% agarose gel에서 확인하였으며, gel elution 후, pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen)에 클로닝하였다. 메틸화 및 비메틸화 염기서열은 M13 forward와 M13 reverse primers를 이용하여 시퀀싱하여 분석하였다.

결과

1. 인간 배아줄기세포, 인간유도만능줄기세포 및 MEFs 는 NPY 및 NPY 수용체를 발현시킨다.

RT-PCR 분석법에 의해 미분화 인간배아줄기세포 (H9, HUES-7, H1)에서 NPY와 NPY 수용체 발현을 검증한 결과 NPY, NPY Y1 및 NPY Y5 전사체 발현이 확인되었고, 반면에 Y2 및 Y4를 인코딩한 mRNAs는 확인되지 않았다(도 1a). 이는 38개의 다른 어레이 실험(Assou S, et al. (2007) A meta-analysis of human embryonic stem cells transcriptome integrated into a web-based expression atlas. Stem Cells 25, 961-973)(http://amazonia.montp.inserm.fr/)의 메타 분석(meta-analysis)과 유사한 결과이다. 미분화된 인간유도만능줄기세포에서도 유사하게 NPY, Y1 및 Y5 전사체 발현이 확인되었고, Y2 및 Y4의 발현은 확인되지 않았다(도 1a). MEF 영양세포에서는 NPY, Y1, Y2 및 Y5 mRNAs 발현이 확인되었고, NPY Y4 전사체는 확인할 수 없었다(도 1a). 서열 분석을 통해 RT-PCR 서열 산물이 공지된 인간 NPY, NPY Y1 및 NPY Y5 수용체 서열과 100% 동일함을 확인하였다(미도시). 미분화된 인간배아줄기세포 및 MEF 영양세포에서 성숙한(mature) NPY 단백질 발현을 면역세포화학 분석(immunocytochemical analysis)으로 측정하였다. NPY 단백질은 미분화된 인간배아줄기세포 및 MEF 영양세포의 핵과 세포질에서 발견되었다(도 1b). NPY 및 그의 수용체 발현이 인간배아줄기세포의 분화 상태에 영향을 미치는지 여부를 실험하기 위해, qRT-PCR을 이용하여 미분화 인간배아줄기세포, RA(retinoic acid)-분화된 인간배아줄기세포 및 자연분화된 인간 배아체간에 NPY 및 그의 수용체의 상대적인 mRNA 발현량을 비교하였다. 인간배아줄기세포의 분화는 인간배아줄기세포-특이적 표지인자인 OCT-4 및 NANOG의 하향 조절로 확인하였다(도 1c). NPY, Y1 및 Y5의 mRNA 발현은 인간배아줄기세포 분화에서 변화하였다. NPY 및 Y1 mRNAs 발현은 미분화된 인간 배아줄기세포에 비하여 RA-분화된 인간배아줄기세포에서 하향 조절 되었으나, 분화한 인간 배아체에서는 증가하였다. 본 발명자는 또한 상기 Y5 수용체의 발현이 다른 범위(크기)로 RA-분화 인간배아줄기세포 및 분화 인간 배아체에서 모두 하향 조절됨을 확인하였다(도 1c). 유사한 결과를 두 개의 독립적인 인간배아줄기세포 주 H9 및 HUES-7으로부터 확인하였다. 상기 결과로부터 NPY 및/또는 그의 수용체가 인간배아줄기세포의 다른 분화 단계에 영향을 미치는 것을 알 수 있다.

2. 외인성 NPY 는 인간배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포를 미분화 상태로 유지하는데 효과적이며, Y1 및 Y5 의 선택적 억제는 인간배아줄기세포 미분화 상태 유지능 및 자가재생산능의 상실을 유도한다.

인간배아줄기세포와 인간유도만능줄기세포의 자가재생산능에 있어서 NPY의 기능을 실험하기 위해, 본 발명자는 MEF-CM 또는 UM에서 영양세포 없이(feeder-free) 마트리겔에서 인간배아줄기세포와 인간유도만능줄기세포를 배양하는 과정에서 다양한 농도의 NPY를 추가한 후, 줄기세포에 미치는 효과를 형태학적인 변화 및 인간배아줄기세포 특이적 마커 발현 양상을 확인함으로써 검증하였다. 5일 동안 UM에서 배양된 인간배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포(도2a)는 미분화 상태의 세포모양을 유지하지 못했고 인간배아줄기세포 특이 마커의 발현이 하향 조절됨을 확인함으로써 배양된 인간배아줄기세포가 분화 초기 상태에 있음을 확인하였다. 반대로, NPY (>0.1 μM)가 첨가된 UM에서 배양된 인간배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포는 하나 및 두 단계의 연속 계대(passages) 후에도 전형적인 인간배아줄기세포 형태를 나타내며(도 2a), 인간배아줄기세포 마커가 정상적으로 발현됨을 검증하였다. UM에 0.5 μM NPY를 첨가하고 배양된 세포의 경우 MEF-CM (CM-hESCs) 또는 고농도의 bFGF (≥40ng/㎖)가 첨가된 UM에서 배양된 인간배아줄기세포와 거의 유사한 조건으로 인간배아줄기세포(도 2a 및 2c) 및 인간유도만능줄기세포(도2a)가 미분화 상태로 건강하게 유지됨을 확인하였다. 본 발명자는 NPY의 작용 경로를 이해하기위해 Y1 및/또는 Y5의 기능을 선택적 Y1 (BIBP3226) 및 Y5 (L152804) 화합물 억제제를 처리함으로써 차단하였을 때, 인간배아줄기세포에서 NPY의 효과가 유지되는지 여부를 분석하였다. BIBP3226 (3 μM) 또는 L152804 (3 μM)를 첨가하고 NPY 배지(NPY medium)에서 배양된 인간배아줄기세포는 4일내 미분화 세포 모양을 상실하고(도 3a) ALP, OCT-4, SOX2, hTERT 및 TDGF의 발현이 감소됨(도 3a 및 3b)을 확인함으로써 미분화상태 유지에 실패하고, 분화가 진행됨을 확인하였다.

따라서, 미분화 상태 인간배아줄기세포를 유지하는데 Y1 및 Y5 수용체를 경유한 NPY 신호 전달 과정이 중요한 역할을 담당하고 있음을 확인하였고, 이를 차단하였을 경우 인간배아줄기세포 자가재생산능의 상실이 유도됨을 알 수 있다.

3. NPY 배지에서 미분화 인간 배아줄기세포의 증식을 유지시킨다.

인간배아줄기세포에서 NPY의 역할을 규명하기 위해, 본 발명자는 BrdU incorporation에 의한 인간배아줄기세포 분석에서 NPY의 직접적인 효과를 시험하였다. UM에서 배양된 인간배아줄기세포는 미분화 상태를 유지하지 못하였으며, MEF-CM(72.4±2.9%; 도 4a)에서 배양된 미분화 인간배아줄기세포와 비교했을 때 BrdU incorporation (24.5±2.3%)이 현저히 낮았다. 인간배아줄기세포에 대한 BrdU incorporation은 UM에 0.5 μM NPY를 첨가하면 MEF-CM에서 배양한 인간배아줄기세포에 비교할만한 수준으로 현저히 증가하였다(도 4a). 또한, NPY 배지 (73.4±2.9%)에서 배양한 인간배아줄기세포 (72.4±2.9%; 도 4a)와 MEF-CM (72.4±2.9%; 도 4a)에서 배양한 인간배아줄기세포간 BrdU+ 세포 수에 있어 육안으로 현저한 차이점이 보이지 않음을 확인할 수 있었다.

본 발명자는　NPY-매개 다능성줄기세포 증식에서 Y1 및 Y5의 기여도를 측정하기 위해 NPY가 첨가된 배지에 선택적 화합물 억제제인 BIBP3226 또는 L152804를 첨가하고 인간배아줄기세포를 배양한 후 BrdU+ 세포 수를 측정하였다. NPY만 있는 배지에서 배양된 인간배아줄기세포(73.4±2.9%; 도 4a)보다 3 μM BIBP3226(16.3±1.7%) 또는 3 μM L152804 (29.1±1.8%)가 있는 NPY 배지에서 배양된 인간배아줄기세포의 BrdU+ 세포 수가 현저히 낮았으며, Y1 및 Y5 화합물 억제제를 함께 첨가한 경우(11.7±0.6%) 인간배아줄기세포 증식이 더욱 억제됨을 확인하였다. 이와 같은 결과는 영양세포유래인자가 없는 인간배아줄기세포 배양조건에서 NPY는 미분화 인간배아줄기세포 증식을 정상상태로 유지하는데 기여하며, 인간배아줄기세포 증식에서 NPY의 효과는 Y1 및 Y5 수용체 활성화를 통해 나타남을 보여주고 있다.

본 발명자는 PI3K/AKT, MAPK/ERK1/2 및 PKA 신호전달경로가 다능성줄기세포에서 NPY의 증식 효과를 매개하는 것과 관련이 있는지 여부를 각 신호 캐스케이드(signaling cascade)에 대한 선택적 화합물 저해제를 사용하여 밝혔다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, Akt (AKTi), ERK1/2 (U0126) 및 PKA (H89) 저해제는 NPY-자극 BrdU incorporation 억제에 영향을 미침을 알 수 있다. 이와 같은 결과는, NPY에 의해 매개되는 인간배아줄기세포 증식 효과는 AKT, ERK1/2 및 PKA를 포함하는 세포 내 다중 신호 경로(multiple signaling pathways)를 자극하는 Y1 및 Y5 수용체를 통해 매개됨을 알 수 있다.

4. 외인성 NPY 는 영양세포를 사용하지 않는 배양조건에서 미분화 상태의 인간배아줄기세포를 장기간, 지속적으로 배양하기 위한 배지 조성물로 이용될 수 있다

본 발명자는 NPY가 영양세포유래인자를 사용하지 않은 배양조건을 개선하는데 실질적으로 기여할 수 있는지를 조사하였다. 독립적으로 제작된 두 개의 인간배아줄기세포 세포주를 장시간 지속적으로 배양한 후 인간배아줄기세포의 미분화 유지 상태를 조사한 결과　4개월 동안　15 계대 이상 NPY 배지 (0.5 μM NPY를 첨가한 UM) 배양된 인간배아줄기세포에서 인간배아줄기세포 특이 마커가 정상적으로 발현됨을 확인하였다(도 5a). 이와 유사하게 NPY 배지에서 배양된 인간유도만능줄기세포에서도 인간배아줄기세포 특이 마커가 정상적으로 발현됨을 확인하였다(도 5a). NPY 배지(NPY-hESCs)에서 배양된 인간배아줄기세포는 정상 핵형을 유지하며(도 5b), MEF-CM에서 배양된 인간배아줄기세포와 동일한 세포증식률을 나타내었다(도4a). 15 계대(passages) 동안 NPY 배지에서 배양된 인간배아줄기세포의 전분화능 특성을 검증하기 위해 5일간 부유 배양를 통해 인간 배아체(hEBs)를 형성하였고 젤라틴이 코팅된 배양접시로 옮겼으며, 분화를 위해 15일 동안 추가로 배양하였다(도5c). real-time RT-PCR을 통해 NPY 배지에서 배양된 인간배아줄기세포 유래 배아체에서 인간배아줄기세포 특이 마커인 OCT-4의 발현이 감소하고 외배엽(PAX6, NCAM), 중배엽(GATA2, cTnT), 내배엽(GATA6, α-FP) 특이적 마커가 증가됨을 확인하였고, 이와 같은 결과는 CM에서 배양된 인간배아줄기세포 유래 인간 배아체와 유사한 것으로 나타났다(도 5c). 상기 결과는 NPY 배지에서 유지된 인간배아줄기세포가 삼배엽(three germ layers)으로 분화할 수 있는 잠재력을 보유하고 있으며, 전분화능이 보존되고 있음을 나타낸다.

본 발명자는　NPY 배지에서 배양된 인간다능성줄기세포가 신경외배엽성 (neuroectodermal) 계통(lineage)으로 분화가 유도될 수 있는지 여부를 실험하였다. NPY 배지에서 배양된 인간배아줄기세포 유래 배아체를 지속적으로 NES(neuroectodermal sphere) 배지에서 배양하였다. 배양 7 내지 10일 후, 형태학적으로 로제트 구조(rosette structure)를 관찰할 수 있었으며(도 5d), semi-quantitative RT-PCR을 이용하여 신경 전구체 특이 마커인 SOX1, PAX6, MSI1, NES, SOX3 및 MAP2등의 발현을 검증하였다(도 5d). 분화세포의 대부분에서 증식 표지인자인 Ki67 및 신경 전구체 마커인 NES, MSI1 및NCAM의 발현을 확인할 수 있었다(도 5e). 이와 같은 결과는 NPY 배지에서 배양된 인간배아줄기세포가 성공적으로 신경 세포로 분화 유도됨으로써 전분화능이 보존되고 있음을 보여준다.

5. NPY 는 인간배아줄기세포에서 AKT , ERK1 /2, PKA , 및 CREB 를 포함한 다중 신호전달경로를 활성화시킨다 .

인간다능성줄기세포에서의 NPY 작용경로를 분석하기 위해, 본 발명자는 AKT, ERK1/2, PKA 및 CREB 신호 인자의 활성화 정도를 측정하였다. NPY에 반응하여, 인간배아줄기세포에서 AKT 및 ERK 단백질의 전체 발현양은 변화하지 않고, 인산화 pAKT(phospho-AKT) 및 인산화 pERK(phospho-ERK)의 발현이　1분 내 일시적으로 증가됨으로써 각 신호전달인자의 활성화상태가 증가됨을 확인하였다(도 6a). 1 μM NPY를 처리한 후 0.5분에 AKT의 인산화가 피크를 나타냈으며 60분 내에 상기 활성이 낮은 수준으로 감소되었다. NPY를 추가한 후, ERK1/2의 인산화는 5분에 피크를 나타냈으며, 30분에 낮은 수준으로 떨어졌다(도 6a). 반대로, 전체 및 인산화 된 p38 및 JNK 단백질 수준은 NPY 가 추가됨에 따라 안정화된 상태로 유지되었다(미도시). NPY-매개 AKT 및 ERK 활성은 Y1 또는 Y5 수용체 화합물 억제제로 30분 사전처리하자 현저히 감소되었다. 그러나, Y1 및 Y5 화합물 억제제를 함께 처리하자 추가적이거나 시너지한 효과는 나타나지 않았다(도 6b). 게다가, NPY 매개 AKT 활성은 AKT 또는 ERK1/2 억제제를 사용한 사전처리에 의해 억제되었으나 PKA 억제제에 의해서는 억제되지 않았다. 반대로, NPY-매개 ERK 활성은 세 개의 억제제에 의해 차단되었다(도 6c).

본 발명자는 CREB 신호가 CREB 및 인산-CREB(p-CREB)의 발현 수준의 측정에 의해 NPY-매개 신호 전달과 관련이 있는지 여부를 조사하였다. 1 μM NPY에 대하여, 인간배아줄기세포는 전체 CREB 단백질 수준에서 현저한 변화 없이 15분 내에 p-CREB의 급격한 증가를 보였다(도 6a). p-CREB는 대부분 NPY-처리된 인간배아줄기세포에 있는 핵에 현저하게 위치하고 있다(도 6d). Y1 화합물 억제제로 사전처리 하였으나, Y5 화합물 억제제를 사전 처리하지 않는 것은 p-CREB의 NPY-매개 상위 조절을 부분적으로 차단한다(도 6b 및 6d). 추가로 AKT, ERK1/2 또는 PKA에 대한 특이적 억제제를 사용한 인간배아줄기세포의 사전처리는 NPY-매개 CREB 인산화를 차단하였다; 그러나, CREB 인산화를 억제하는 능력은 완벽하였다(도 6c). 상기 데이터는 AKT, ERK1/2 및 PKA를 통해 NPY-매개 CREB 활성이 중재되었음을 나타낸다. 이와 같은 결과는 NPY가 인간배아줄기세포에서 Y1 및 Y5 수용체를 통해 NPY의 효과를 매개하고 상기와 같은 효과가 AKT, ERK1/2, PKA 및 CREB 경로의 활성에 밀접하게 연관되었다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 신호 경로간 상호작용이 NPY-매개된 인간배아줄기세포의 미분화 상태 유지에 있어 중요함을 확인할 수 있다.

6. 외인성 NPY 는 영양세포유래인자 및 동물혈청을 사용하지 않는 배양 조건을 개선하는데 효과적으로 이용될 수 있다

영양세포유래인자 및 동물혈청사용을 배제하고, 배지성분이 알려진 배양액 (defined media)을 이용한 배양 조건을 확보하기 위해 NPY와 함께 N2/B27 보충물(supplement) 및 bFGF를 사용하였다. 20 ng/㎖ bFGF (N2/B27 배지)를 포함한 N2/B27-기초 배지에서 배양된 인간 배아줄기세포는 미분화 상태를 유지하는데 실패하였으며, 세포증식률이 낮아지고, 광범위하게 분화하였다. 하지만, 20 ng/㎖ bFGF를 포함한 N2/B27 배지에 1 μM NPY를 첨가한 경우 인간배아줄기세포의 자발적인 분화가 최소화되었다. 이와 같은 조건에서, 인간 배아줄기세포는 여섯 계대 이상 미분화 상태를 유지하였고, 세포의 형태적인 면에서도 MEF-CM에서 배양된 인간 배아줄기세포와 유사하게 나타났으며, 정상 인간 배아줄기세포 표지인자 발현(도 7a) 및 정상 핵형(karyotypes)을 유지하였다(도 7b). N2/B27-기초 배지 또는 UM에 1 μM NPY를 첨가하였을 때, 미분화 세포모양이 유지되었으며, 성장 효율 및 인간배아줄기세포에서의 인간배아줄기세포 특이 마커의 발현이 CM 또는 영양세포에서 배양된 미분화 상태의 인간배아줄기세포와 유사하게 확인되었다(도 7).

인간배아줄기세포 배양을 위해 필요한 NPY의 최적 및 최소 농도는 대부분 배지 조성(UM에서는 0.5 μM; N2/B27 배지에서는 1 μM)에 의존적이나, 인간배아줄기세포 자가재생산능에 있어서 NPY의 효과는 농도 의존적이었다. 인간배아줄기세포 자가재생산 조절인자 중의 하나로 알려진 TGFβ는 저농도로 인간배아줄기세포 배양배지에서 제한 성분으로 사용되었다. 본 발명의 화학적 규명배지(chemically defined media)에 있어서, 시험관 내(in vitro) 미분화 인간배아줄기세포의 장기 유지(≥15 계대)는 N2/B27 배지에 1 μM NPY 및 1 ng/㎖ TGFβ를 함께 사용함으로써 달성할 수 있었다. MEF-CM 및 NPY를 추가한 UM을 사용하여 인간배아줄기세포 배양 조건을 비교해 본 결과, 세포 수에 따른 인간배아줄기세포의 성장 효율은 TGFβ의 추가에도 별 다른 영향이 없었다(도7c 및 7d). 상기와 같은 결과로부터 영양세포유래인자 및 동물혈청을 사용하지 않은 화학적 규명배지조건에서 NPY의 첨가는 인간배아줄기세포를 미분화 상태로 유지하는데　효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.

7. 외인성 NPY 는 인간유도만능줄기세포 제작과정에서 역분화 효율을 증가시킨다.

인간 체세포의 리프로그래밍 과정에서의 외인성 NPY의 촉진효과를 검증하기위해 인간 섬유아체세포주(ATCC, CRL-2097)에 Oct4 (O), Sox2 (S), Klf4 (K), c-Myc (M) 유전자 이입 레트로바이러스 용액을 처리하여 감염시키고, 이때 배양액에 다양한 농도의 NPY를 첨가한 후 유도만능줄기세포의 생성을 형태학적인 분석과 ALP 활성 분석을 통해 관찰하였다. NPY를 첨가한 역분화유도 배양조건에서 첨가하지 않은 대조군에 비해 역분화 유도 효율이 증가됨 (10배 이상)을 확인하였다(도 8a). NPY를 첨가한 배양조건에서 확립된 유도만능줄기세포의 특성을 분석한 결과 인간배아줄기세포 특이 마커 발현이 유전자 (도8b) 및 단백질수준(도8c)에서 인간배아줄기세포와 유사한 수준으로 발현되고 있음을 확인하였고, 외인성 리프로그래밍 전사인자가 숙주세포의 genomic DNA에 내재하고 있음을 확인하였다 (도 8d). 또한 NPY를 첨가한 배양조건에서 확립된 유도만능줄기세포는 Oct4, Nanog promoter 영역이 탈메틸화 되었음을 확인하였으며(도8e), 또한 삼배엽으로의 분화능을 가지고 있음을 삼배엽 특이 마커의 유전자 (도 8f) 및 단백질 수준 (도 8g)에서 확인하였다.

Claims

다능성줄기세포를 미분화 상태로 유지시키기에 충분한 양의 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y)를 포함하는 미분화 상태의 다능성줄기세포 유지 및 배양용 다능성줄기세포의 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 다능성줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 다능성줄기세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 뉴로펩타이드 Y의 농도는 0.01 초과 내지 100 μM 이하인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 동물혈청 및 영양세포유래인자가 포함되지 않은 상태에서 N2 보충물, B27보충물, bFGF 및 TGFβ로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제5항에 있어서, 상기 N2 보충물과 B27 보충물은 1:1의 비율로 제공되고, 상기 bFGF는 4-100 ng/㎖의 농도로 제공되고, 상기 TGFβ는 1-10ng/㎖의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
다능성줄기세포; 및 상기 다능성줄기세포가 다수의 연속 계대 배양을 통해서 미분화 상태로 유지되도록 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 배지 조성물을 포함하며, 상기 배지 조성물은 동물 혈청 및 영양세포유래인자를 포함하지 않으며, 동물 혈청이나 영양세포유래인자에 노출된 적이 없는 것임을 특징으로 하는 시험관 내 세포 배양물.
제7항에 있어서, 상기 다능성줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포인 것을 특징으로 하는 시험관 내 세포 배양물.
제7항에 있어서, 상기 다능성줄기세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 시험관 내 세포 배양물.
유도만능줄기세포를 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 배지 조성물을 포함하는 배양 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 미분화 상태로 유지될 수 있는 유도만능줄기세포의 제작방법.
삭제
제10항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
다수의 연속 계대 배양을 통해서 다능성줄기세포를 미분화 상태로 유지시키기도록 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 배지 조성물 상에서 다능성줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 미분화 상태로 다능성줄기세포를 배양하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 방법은 동물 혈청 및 영양세포유래인자를 이용하거나 또는 이용하지 않는 상태로 다능성줄기세포를 미분화 상태로 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 다능성줄기세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 다능성줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 방법은 다능성줄기세포를 15계대 이상 영양세포 없이 미분화 상태로 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 다능성줄기세포의 미분화 상태의 유지는 ALP(alkaline phosphatase), OCT-4, SOX2, hTERT(human telomerase reverse transcriptase), TDGF(teratocarcinoma-derived growth factor) 및 SSEA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 뉴로펩타이드 Y를 포함하지 않는 최소배지에서 배양된 다능성줄기세포에 비해 증가되는 것으로 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 다능성줄기세포의 미분화 상태의 유지는 뉴로펩타이드 Y 수용체 Y1 및 Y5의 활성 촉진에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 뉴로펩타이드 Y 수용체 Y1 및 Y5의 활성의 촉진은 AKT, ERK1/2, PKA, CREB 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 신호전달경로의 활성의 촉진에 의해 이루어지는 것임을 특징으로 하는 방법.
뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y)를 포함하는 체세포 또는 전구세포에서 유도만능줄기세포로의 역분화 효율 증진용 배지 조성물.
제21항에 있어서, 상기 배지 조성물은 체세포 또는 전구세포의 전부 또는 일부를 미분화된 유도만능줄기세포로 역분화시키는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
삭제
제21항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제21항에 있어서, 상기 뉴로펩타이드 Y의 농도는 0.01 초과 내지 100 μM 이하인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제21항, 제22항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항의 배지 조성물에서 체세포 또는 전구세포를 배양하여 유도만능줄기세포로 역분화시키는 단계를 포함하는 체세포 또는 전구세포에서 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 방법.
삭제
체세포 또는 전구세포를 제21항, 제22항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항의 배지 조성물을 포함하는 배양 조건 하에서 배양하여 유도만능줄기세포로 역분화시키는 단계를 포함하는 유도만능줄기세포의 제작 방법.
삭제
제28항에 있어서, 상기 체세포 또는 전구세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
체세포 또는 전구세포; 및 제21항, 제22항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항의 배지 조성물을 포함하며, 상기 체세포 또는 전구세포는 유도만능줄기세포로 역분화되는 시험관 내 세포 배양물.
삭제
제 31항에 있어서, 상기 체세포 또는 전구세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 세포 배양물.