JP2016506246A - 多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞膵臓内分泌細胞への分化のための、空気−液体界面での、ヒト胚性幹細胞の培養 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全てが参照により組み込まれている、米国特許仮出願第61/747,662号明細書(2012年12月31日出願)に基づく優先権を主張する。
本発明は、細胞分化の分野にある。より詳細には、本発明は、空気−液体界面にて細胞を培養することによって、ヒト多能性幹細胞から、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌細胞前駆体細胞、及び単一ホルモン膵臓内分泌細胞を産出するための方法、細胞培養系及び培地を提供する。
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を製造することができる。幹細胞はまた、インビトロでの、多重胚芽層(内肺葉、中胚葉及び外胚葉)から種々の細胞系統の機能細胞へ分化させるそれらの能力によって特徴付けられる。幹細胞は、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に(全てではないとしても)ほとんどの組織に寄与する。
A.多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、1つ又はそれ以上の、設計されたTRA−1−60及びTRA−1−81抗体(Thomson et al.,1998,Science 282:1145〜1147)を発現してよい。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、TRA−1−60及びTRA−1−81発現の欠損となる。未分化多能性幹細胞は典型的に、アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、次いで、製造業者(Vector Laboratories,CA,USA)によって記述されたように、基質として、商標VECTOR(登録商標)Redの下売られている、アルカリホスファターゼ基質で現像することによって、検出可能である。未分化の多能性幹細胞はまた、RT−PCRにより検出されるように、一般にOCT4及びTERTも発現する。
使用してよい多能性幹細胞の例示型には、(胚盤胞のような)プレ胚性組織、胚性組織、又は妊娠の間、典型的に、しかし必須ではなく、妊娠およそ10〜12週前の任意の時間に取った胎児組織を含む、多能性細胞の確立された株が含まれる。非限定例としては、ヒト胚性肝細胞株H1、H7及びH9(WiCell Research Institute,Madison,WI,USA)のような、ヒト胚性幹細胞又はヒト胚性胚芽細胞の確立された株である。フィーダー細胞のない状態ですでに培養した多能性幹細胞集団から取った細胞もまた好適である。OCT4、NANOG、SOX2、KLF4及びZFP42(Annu Rev Genomics Hum Genet 2011,12:165〜185;またIPS,Cell,126(4):663〜676を参照のこと)のような、多数の多能性関連転写因子の集中発現を用いて、成体体細胞から由来した、人工多能性細胞(IPS)、又は再プログラム多能性細胞もまた使用してよい。本発明の方法に使用されるヒト胚性幹細胞は、Thomsonらによって記述されたように調製してもよい(米国特許第5,843,780号;Science,1998,282:1145〜1147;Curr Top Dev Biol 1998,38:133〜165;Proc Natl Acad Sci U.S.A.1995,92:7844〜7848)。BG01v(BresaGen,Athens,Ga)のような変異体ヒト胚性幹細胞株、又はTakahashi et al.,Cell 131:1〜12(2007)にて開示された細胞のような、成人ヒト体細胞から由来した細胞もまた使用してよい。特定の実施形態において、本発明中での使用に好適な多能性幹細胞を、Li et al.,(Cell Stem Cell 4:16〜19,2009)、Maherali et al.(Cell Stem Cell 1:55〜70,2007)、Stadtfeld et al.(Cell Stem Cell 2:230〜240)、Nakagawa et al.(Nature Biotechnol 26:101〜106,2008)、Takahashi et al.(Cell 131:861〜872,2007)及び米国特許第2011/0104805号 明細書に記述された方法に従って誘導して良い。特定の実施形態において、多能性幹細胞は、非胚性起源のものであってよい。これらの参照、特許、特許出願の全てが、とりわけ、多能性細胞の単離、培養、膨張及び分化に関連するので、その全てが参照により本明細書に組み込まれている。
多能性幹細胞は、様々な点で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞の層上で一般的に培養される。あるいは、多能性幹細胞は、フィーダー細胞を本質的に含まないが、それでもなお実質的な分化を起こすことなしに、多能性幹細胞の増殖を支持する培養系において培養されてよい。分化なしにフィーダーを含まない培養中の多能性幹細胞の増殖はしばしば、他の細胞型ですでに培養することによって条件付けた培地を用いて支持される。あるいは、分化なしのフィーダーを含まない培養中の多能性幹細胞の増殖は、化学的に定義された培地を用いて支持され得る。
多能性細胞は、β細胞に向かって分化するにつれ、それぞれが、特定のマーカーが存在する、又は存在しないことによって特徴づけられて良い、種々のステージを通して分化する。これらのステージへの細胞の分化は、圧力、培養培地に加えた特定の因子の欠如を含む、特定の培養条件によって達成される。一般に、本分化は、多能性幹細胞の、胚体内胚葉細胞への分化を含んでよい。これらの胚体内胚葉細胞は次いで、腸管細胞にさらに分化し、続いて前腸内胚葉細胞に分化して良い。前腸内胚葉細胞は、膵臓前腸前駆細胞に分化してよく、これは続いて、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞又は両方に分化可能である。これらの細胞は次いで、(β細胞のような)膵臓ホルモン産出細胞に分化してよい。本発明は、細胞を、培地で部分的にみたした培養容器内に存在する空気−液体界面で細胞を培養すること、とりわけ、空気−液体界面で、ステージ4〜ステージ6細胞を培養することによって、膵臓内分泌細胞への、多能性幹細胞の段階的な分化を提供する。
多能性幹細胞の特徴は当業者に公知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞マーカーとしては、例えば、以下の、ABCG2、クリプト、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81の1つ又はそれ以上の発現が挙げられる。
ステージ1:細胞培養株から得た、胚性幹細胞のような、多能性幹細胞を、適切な因子で処理して、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を誘導する。
ステージ2:ステージ1からの細胞を、適切な因子で処理して、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ3:ステージ2からの細胞を、適切な因子で処理して、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ4:ステージ3からの細胞を、適切な因子で処理して、膵臓前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。細胞を任意に、ステージ4にて、空気−液体界面で培養する。
ステージ5:ステージ4からの細胞を、適切な因子で処理し、空気−液体界面で培養して、膵臓内胚葉/内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
ステージ6:ステージ5からの細胞を、適切な因子で処理し、空気−液体界面で培養して、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へのさらなる分化を誘導する。
多能性幹細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって、又は本明細書で提案した任意の方法によって、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させてよい。多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるための有用な方法は、多能性幹細胞、及び胚体内胚葉系統の特徴的なマーカーを発現している細胞への多能性幹細胞の分化に関するとして、その全てが参照により組み込まれている、米国特許第2007/0254359号明細書、米国特許第2009/0170198号明細書、米国特許第2009/0170198号明細書、米国特許第2011/0091971号明細書、米国特許第2010/0015711号明細書、米国特許第2010/0015711号明細書、米国特許第2012/0190111号明細書、米国特許第2012/0190112号明細書、米国特許第2012/0196365号明細書、米国特許第20100015711号明細書、米国特許第2012/0190111号明細書、米国特許第2012/0190112号明細書、米国特許第2012/0196365号明細書、米国特許第20100015711号明細書、米国特許第2012/0190111号明細書、米国特許第2012/0190112号明細書、米国特許第2012/0196365号明細書、米国特許仮出願第61/076,900号明細書、米国特許仮出願第61/076,908号明細書、米国特許仮出願第61/076,915号明細書に開示されている。
胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へさらに分化して良い。1つの実施形態において、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成には、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、線維芽細胞増殖因子(「FGF」)7又はFGF10を含む培地で培養して、これらの細胞を分化させることが含まれる。例えば、培養培地には、約25ng/ml〜約75ng/ml、あるいは約30ng/mL〜約60ng/ml、あるいは約50ng/mlのFGF7又はFGF10、好ましくはFGF7が含まれてよい。細胞を、約2〜3日、好ましくは約2日間、これらの条件下で培養して良い。
腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞をさらに、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化して良い。1つの実施形態において、ステージ2細胞をさらに、これらの細胞を、(「MRT10」(N−[[[3−ベンゾイルアミノ)フェニル]アミノ]チオキソメチル]−3,4,5−トリメトキシベンズアミド))又はシクロパミンのような)Smoothened(「SMO」)受容体阻害剤、又は(Smoothened Antagonist 1(「SANT−1」)((E)−4−ベンジル−N−((3,5−ジメチル−1−フェニル−1H−ピラゾール−4−イル)メチレンピペラジン−1−アミン)のような)Sonic Hedgehog(「SHH」)シグナル伝達経路アンタゴニスト、又はHedgehog Pathway Inhibitor 1(「HPI−1」)(2−メトキシエチル1,4,5,6,7,8−ヘキサヒドロ−4−(3−ヒドロキシフェニル)−7−(2−メトキシフェニル)−2−メチル−5−オキソ−3−キノリンカルボキシレート))、レチノイン酸、及びNogginを補足した培養培地中で培養することによって、ステージ3細胞に分化させる。あるいは、ステージ2細胞を、これらの細胞を、SMO受容体阻害剤、SHHシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸及びNogginを補足した培養培地中で培養することによって、ステージ3細胞に分化させてよい。細胞を、およそ2〜4日間、好ましくは2日間培養して良い。1つの実施形態において、培地には、約0.1μM〜約0.3μMのSANT−1、約0.5μM〜約3μMのレチノイン酸及び約75ng/ml〜約125ng/mlのNogginを補足する。他の実施形態において、培地には、約0.25μMのSANT−1、約2μMのレチノイン酸及び約100ng/mlのNogginを補足する。
本発明は、多能性細胞の膵臓内分泌細胞への経路における全てのステージに対して、空気−液体界面にて培養することを企図するけれども、本発明は好ましくは、沈んだ培養液中、ステージ1〜ステージ3細胞の形成と、空気−液体界面で細胞を培養することによるステージ4〜ステージ6細胞を提供する。従って、特定の実施形態において、本発明は、空気−液体界面で、ステージ4〜6の間に培養することを含む、多能性細胞を分化する段階的方法を提供する。特定の実施形態において、細胞を、ステージ4〜6の全体の間、空気−液体界面で培養して良い。他の実施形態において、後期ステージ4〜ステージ6のみ、又はステージ5及び6のみ、又はステージ4と5のみ、又はステージ4と6のみが、空気−液体界面で培養することを含む。
1つの実施形態において、本発明の方法には、以下の(a)TGF−β受容体inh V、TGF−β受容体inh I、TGF−β受容体inh IV、TGF−β受容体inh VII、TGF−β受容体inh VIII、TGF−β受容体inh II、TGF−β受容体inh VI、TGF−β受容体inh III、TGF−B阻害剤SB431542、SD208、ITD−1、LY2109761、A83−01、LYA2157299、ALK5i及びALK5阻害剤IIからなる群より選択されるALK5阻害剤、(b)T3、T4、T3の類似体、T4の類似体及びこれらの混合物からなる群より選択される甲状腺ホルモン、(c)MRT10又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤、(d)SANT−1又はHPI−1から選択されるSHHシグナル伝達経路アンタゴニスト、(e)LDN−193189、Noggin又はChordinから選択されるBMP受容体阻害剤、(f)TPB、PDBu、PMA及びILVから選択されるPKCアクチベータ、(g)FGF7又はFGF10から選択される線維芽細胞増殖因子、(h)レチノイン酸、(i)アスコルビン酸、(j)ヘパリン及び(k)硫酸亜鉛の1つ又はそれ以上を補足した増殖培地を含む、分化培地でステージ3細胞を処理することが含まれる。例えば、MCDB131又はBLARのような増殖培地には、(MRT10又はCyclopamineのような)SMO阻害剤、又は(SANT−1又はHPI−1のような)SHHシグナル伝達経路アンタゴニスト、(LDN−193189、Noggin又はChordinのような)BMP受容体阻害剤、アスコルビン酸及び(TPB、PDBu、PMA又はILVのような)PKCアクチベータを補足して、有用な分化培地を提供して良い。そのような培地中、ステージ3細胞を、約2〜4日間、好ましくは3日間、培養することは通常、ステージ3細胞をステージ4細胞に分化するのに十分である。他の実施形態において、培地に、SMO阻害剤及びSHHシグナル伝達経路アンタゴニストを補足して良い。好ましい実施形態において、ステージ3細胞を、約0.25μM SANT−1、約100nMレチノイン酸、約2ng/ml FGF7、約100nM LDN−193189、約0.25mMアスコルビン酸及び約100nM TPBを補足した培地で、3日間処理して良い。他の実施形態において、培地にさらに、約5nM〜約25nM、あるいは約10nMのT3のような、T3を補足して良い。
1つの実施形態において、本発明の方法には、以下の(a)TGF−β受容体inh V、TGF−β受容体inh I、TGF−β受容体inh IV、TGF−β受容体inh VII、TGF−β受容体inh VIII、TGF−β受容体inh II、TGF−β受容体inh VI、TGF−β受容体inh III、TGF−B阻害剤SB431542、SD208、ITD−1、LY2109761、A83−01、LY2157299、ALK5i及びALK5阻害剤IIからなる群より選択されるALK5阻害剤、(b)T3、T4、T3の類似体、T4の類似体及びこれらの混合物からなる群より選択される甲状腺ホルモン、(c)MRT10又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤、(d)SANT−1又はHPI−1から選択されるSHHシグナル伝達経路アンタゴニスト、(e)LDN−193189、Noggi又はChordinから選択されるBMP受容体阻害剤、(f)TPB、PDBu、PMA及びILVから選択されるPKCアクチベータ、(g)FGF7又はFGF10から選択される線維芽細胞増殖因子、(h)レチノイン酸、(i)アスコルビン酸、(j)ヘパリン及び(k)硫酸亜鉛の1つ又はそれ以上を補足した増殖培地を含む、分化培地でステージ4細胞を処理することと、空気−液体界面にて、約2〜4日間、好ましくは約3日間、培養して、細胞をステージ5細胞に分化することと、が含まれる。他の実施形態において、増殖培地に、(MRT10又はシクロパミンのような)SMO阻害剤、又は(SANT−1又はHPI−1のような)SHHシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸、T3、アスコルビン酸、(LDN−193189、Noggin又はChordinのような)BMP阻害剤及びALK5阻害剤を補足する。他の実施形態において、本発明の方法には、ステージ4細胞を、SMO阻害剤、SHHシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸、T3、アスコルビン酸、BMP受容体阻害剤、及びALK5阻害剤を補足した培地で処理することと、細胞を、空気−液体界面にて、約2〜4日間、好ましくは約3日間培養して、ステージ5細胞に細胞を分化させることと、が含まれる。1つの実施形態において、ステージ4細胞を、約0.25μM SANT−1、約50nMレチノイン酸、約0.25mMアスコルビン酸、約50nM LDN−193189、約10nMのT3及び約1000nM ALK5阻害剤を補足した培地で細胞を処理することによって、ステージ5細胞に分化させる。特定の実施形態において、ALK5阻害剤は、SD208((2−(5−クロロ−2−フルオロフェニル)プテリジン−4−イル]ピリジン−4−イルーアミン)である。1つの実施形態において、培地に約1000nMのSD208を補足する。
本発明の1つの実施形態において、方法には、以下の(a)TGF−β受容体inh V、TGF−β受容体inh I、TGF−β受容体inh IV、TGF−β受容体inh VII、TGF−β受容体inh VIII、TGF−β受容体inh II、TGF−β受容体inh VI、TGF−β受容体inh III、TGF−B阻害剤SB431542、SD208、ITD−1、LY2109761、A83−01、LYA2157299、ALK5i及びALK5阻害剤IIからなる群より選択されるALK5阻害剤、(b)T3、T4、T3の類似体、T4の類似体及びこれらの混合物からなる群より選択される甲状腺ホルモン、(c)MRT10又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤、(d)SANT−1又はHPI−1から選択されるSHHシグナル伝達経路アンタゴニスト、(e)LDN−193189、Noggin又はChordinから選択されるBMP受容体阻害剤、(f)TPB、PDBu、PMA及びILVから選択されるPKCアクチベータ、(g)FGF7又はFGF10から選択される線維芽細胞増殖因子、(h)レチノイン酸、(i)アスコルビン酸、(j)ヘパリン及び(k)硫酸亜鉛の1つ又はそれ以上を補足した増殖培地を含む、分化培地でステージ5細胞を処理することと、空気−液体界面にて、約2〜4日間、好ましくは約3日間、培養して、ステージ5細胞をステージ6細胞に分化することと、が含まれる。1つの実施形態において、増殖培地に、(MRT10又はCyclopamineのような)SMO阻害剤、又は(SANT−1又はHPI−1のような)SHHシグナル伝達経路アンタゴニスト、レチノイン酸、アスコルビン酸、T3/T4及びALK5阻害剤を補足する。他の実施形態において、培地に、SMO阻害剤とSHHシグナル伝達経路アンタゴニスト両方を補足して良い。ステージ5細胞を、約0.25μM SANT−1、約50nM RA、約0.25mMアスコルビン酸、約500mMのALK5阻害剤、及び約0.1nMのT3を補足した培地での、約3日間の処理によって、ステージ6細胞に分化させてよい。あるいは、ステージ5細胞を、約0.25μM SANT−1、約50nMレチノイン酸、約0.25mMアスコルビン酸、約500nM ALK5阻害剤及び10nM T3を補足した培地での、約3日間の処理によって、ステージ6に分化させてよい。細胞を、望むのならば、そのような培地中で、さらに2日間、又はそれ以上培養して良い。
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法に従って調製したステージ6細胞をさらに、インビボで成熟化させて良い。1つの実施形態において、これらの細胞は、哺乳動物へのインビボ移植によってさらに成熟化させてよい。例えば、細胞を、マウスの腎臓カプセルのもと、移植して良い。1つの実施形態において、さらにインビボで成熟化するステージ6細胞は、NXK6.1とインスリンを共発現する細胞である。他の実施形態において、さらにインビボで成熟化するステージ6細胞は、NXK6.1及びクロマグラニンを共発現する細胞である。他の実施形態において、(a)NXK6.1及びインスリンを共発現する細胞、又は(b)NXK6.1とクロマグラニンを共発現する細胞のインビボ成熟化は、早期C−ペプチド製造をもたらす。特定の実施形態において、およそ3百万のステージ6細胞を移植することからのC−ペプチド産出は、およそ3,000のヒト島を移植することによって製造されるC−ペプチドの量と同様である。
本発明はまた、本発明の方法によって得ることが可能な細胞、又は細胞の集団を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって得た細胞、又は細胞の集団を提供する。
本発明は、処置方法を提供する。とりわけ、本発明は、糖尿病を患っている、又発達するリスクのある患者を処置方法を提供する。
空気−液体界面での膵臓内分泌前駆細胞の培養
本実施例は、膵臓内分泌前駆細胞(ステージ5細胞)が、空気−液体界面にて培養する際に、さらに成熟化可能であることを試験し、実証する。空気−液体界面にて膵臓内分泌前駆細胞を培養するために、胚性幹細胞を、以下に議論するプロトコールに基づいて、膵臓内分泌前駆細胞に分化させた。
a)ステージ1:(3日間):1:30 MATRIGEL(商標)コーティングされた表面上にプレートした未分化H1細胞の60〜70%コンフルエント接着培養液を、0.2%ウシ胎児血清(FBS)(Hyclone,Utah)、100ng/mlアクチビン−A(AA;Pepro−tech;Rochy Hill,NJ)及び20ng/mlのWnt3(R & D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)を補足したGIBCO(登録商標)RPMI 1640培地(Life Technologies Corporation,Grand Island,NY)に、1日目のみ曝露した。次の2日間、細胞を、0.5% FBSと100ng/ml AAを含むGIBCO(登録商標)RPMI中で培養した。
b)ステージ2:(3日間):ステージ1細胞を次いで、2% FBSと50ng/mlのFGF7(Pepro−tech)を補足したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM−F12)(Life Technologies Corporation,NY)に、3日間曝露した。
c)ステージ3:(4日間):ステージ2細胞を次いで、0.25μM SANT−1(Sigma−Aldrich;St.Louis,MO)、2μMレチノイン酸(Sigma−Aldrich)、100ng/mlのNoggin(R & D Systems)及び1%(v/v)の、Life Technologies Corporation,Grand Island,NYにより商標B27(登録商標)の下売られている栄養補助物(カタログ番号:17504044)を補足した、DMEM−HG培地(Life Technologies Corporation,Grand Island,NY)中、4日間培養した。
d)ステージ4:(3日間):ステージ3細胞を次いで、単層フォーマットにて、0.1μM ALK5阻害剤(ALK5i;Axxora,San Diego、CA)、100ng/mlのNoggin、500nM TPB((2S,5S)−(E,E)−8−(5−(4−(トリフルオロメチル)フェニル)−2,4−ペンタジエノイルアミノ)ベンゾラクタム、EMD Chemicals Inc,Gibbstown NJ)及び1% B27で補足したDMEM−HG培地中で3日間培養した。培養の最後の日のために、細胞を5mg/mlジスパーゼ(Becton Dickinson,Bedford,MA、#354235)で5分間処理し、続いて穏やかにピペッティングして、混合し、細胞クラスタ(<100ミクロン)に破壊した。細胞クラスタを、使い捨てポリスチレン125ml Spinner Flask(Corning)に移し、200nM ALK5阻害剤、100nM LDN−193189(Stemgent,CA)及び1% B27を補足したDMEM−HGを含む懸濁液中、80〜100rpmにて一晩回転させた。
e)ステージ5:(1日):ステージ4細胞を次いで、5mg/mlジスパーゼで5分間処理し、続いて穏やかにピペッティングして、混合し、細胞クラスタ(<100ミクロン)に破壊した。細胞クラスタを、使い捨てポリスチレン125ml Spinner Flask(Corning,NY)に移し、200nM ALK5阻害剤、100nM LDN−193189(Stemgent,CA)及び1% B27を補足したDMEM−HGを含む懸濁液中、80〜100rpmにて一晩回転させた。
種々のフィルタ挿入物を用いた空気−液体界面での、膵臓内分泌前駆細胞の培養
本実施例は、空気−液体界面での、膵臓内胚葉細胞の分化における、フィルタ挿入物の型及び多孔性を試験する。フィルタ挿入物の型及び多孔性の効果を試験するために、胚性幹細胞を、以下で議論したプロトコールを用いて分化させた。
a.ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCX化合物を補足した、MCDB−131培地(Invitrogenカタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。続いて、細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b.ステージ2(2日間):ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c.ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,CA)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740、EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足したMCDB−131培地で、2日間処理した。
d.ステージ4(3日間)):ステージ3細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、100nM RA、2ng/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸、10nM T3(T6397,Sigma)及び100nM TPBを補足したMCDB−131培地で、3日間処理した。
e.ステージ5(3日間):ステージ4細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、50nM RA、0.25mMアスコルビン酸、10nM T3、50nM LDN−193189、1000nM ALK5阻害剤SD208を補足した、MCDB−131培地で、3日間処理した。SD208(2−(5−クロロ−2−フルオロフェニル)プテリジン−4−イル]ピリジン−4−イル−アミン)は、2,4−二置換プテリジン、Molecular Pharmacology 2007,72:152〜161に開示され、式Iに示した構造を有する、TGF−βRIキナーゼのATP競合阻害剤である。
空気−液体界面にて培養した膵臓内胚葉細胞は、平面培養液、又は液体−液体界面でのフィルタ上で維持した培養液と比較して、内分泌マーカーの増強した発現を示した。
本実施例は、空気−液体界面で培養したものと比較して、平面基質上で培養した膵臓内胚葉細胞の分化の傾向における差に関する。さらに、空気−液体界面の効果は更に、挿入物上、しかし挿入物の頂部及び底に加えた培地での分化によって強調された。
a)ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCX化合物を補足した、MCDB−131培地(Invitrogen、カタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。続いて、細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b)ステージ2(2日間):ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c)ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,CA)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740、EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足した(Invitrogenによって製造された、BLAR培地の成分に関して、表IIを参照のこと)BLARカスタム培地で、2日間処理した。
d)ステージ4(3日間):ステージ3細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、100nM RA、2ng/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸、10nM T3(T6397,Sigma)及び100nM TPBを補足したBLAR培地で、3日間処理した。
e)ステージ5(3日間):ステージ4細胞を、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、50nM RA、0.25mMアスコルビン酸、10nM T3、50nM LDN−193189、1000nM ALK5阻害剤(SD208)を補足した、BLAR培地で、3日間処理した。
f)ステージ6(5日間):ステージ5細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、50nM RA、0.025mMアスコルビン酸、500nM ALK5阻害剤、0.1nM T3を補足したBLAR培地で、3日間処理した。
空気−液体界面で培養し、ALK5阻害剤IIで処理した膵臓内胚葉細胞は、有意により大きな数のクロモグラニン−A及びインスリンを共発現しているNKX6.1陽性細胞を示した。
a)ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCX化合物を補足した、MCDB−131培地(Invitrogen、カタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b)ステージ2(2日間):ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c)ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,CA)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740、EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足したBLARカスタム培地(Invitrogen)で、2日間処理した。
d)ステージ4(3日間):ステージ3細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、100nM RA、2ng/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸及び100nM TPBを補足したBLAR培地で、3日間処理した。
e)ステージ5(3日間):ステージ4細胞を、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、50nM RA、50nM LDN、500〜1000nMの種々のALK5阻害剤(使用した阻害剤のリストについて表IIIを参照のこと)を補足した、BLAR培地で、3日間処理した。
f)ステージ6(7日間):ステージ5細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、50nM RA、500〜1000nM ALK5阻害剤(試験した阻害剤のリストについて表IIIを参照のこと)を補足したBLAR培地で、3日間処理した。
空気−液体界面に培養した細胞に対する、ステージ5及び6における種々のALK5阻害剤の比較
本実施例は、ALK5阻害剤IIが、NKX6.1及びインスリン又はクロモグラニン−Aを発現した、空気−液体界面での有意な細胞集団を発生することにおいて固有であったことを示す。試験したさらなるTGF−β阻害剤を、表IVにリストする。
a.ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCX化合物を補足した、MCDB−131培地(Invitrogen、カタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b.ステージ2(2日間):ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c.ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,CA)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740、EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足したBLARカスタム培地(Invitrogen)で、2日間処理した。
d.ステージ4(2日間):ステージ3細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、100nM RA、2ng/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸及び100nM TPBを補足したBLAR培地で、2日間処理し、次いでステージ4の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、10μMのY27632で4時間処理し、PBSでリンスし、1× TrypLE(商標)(Invitrogen)で、室温にて5分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、6−ウェルプレート中、0.4ミクロン多孔性細胞培養フィルタ挿入物(BD 353493)上へ、又は10cmディッシュ中、10cmフィルタ挿入物(Corning,#3419)上へ、0.5〜0.75×106細胞(10μl分液中)の密度で播種した。1.5mlの培地を、6−ウェルプレート中、各挿入物の底に加え、7.5mlの培地を、各10cm挿入物の底に加えた。更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。培地を、研究の期間、毎日置換した。
e.ステージ5(3日間):ステージ4細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、0.25μM SANT−1、50nM RA、100nM LDN−193189、1000nMの種々のALK5阻害剤(使用した阻害剤のリストに関して表IVを参照のこと)を補足したBLAR培地中、空気−液体界面で、3日間培養した。
f.ステージ6(6日間):ステージ5細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、0.25μM SANT−1、100nM LDN−193189、1000nM T3、1000nM ALK5阻害剤(試験した阻害剤のリストについて表IVを参照のこと)を補足したBLAR培地で、6日間処理した。
続く内分泌細胞への分化における、空気−液体界面での、播種細胞密度の効果
本実施例は、空気−液体界面での播種密度の範囲と、内分泌マーカーの得られる発現を同定する。本実施例における研究を実施するために、胚性幹細胞を、以下の議論したプロトコールを用いて同定した。
a)ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCX化合物を補足した、MCDB−131培地(Invitrogen、カタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。続いて、細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b)ステージ2(2日間):ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMa(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c)ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,CA)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740、EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足したBLARカスタム培地(Invitrogen)で、2日間処理した。次いでステージ3の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、10μMのY27632で4時間処理し、PBSでリンスし、1× TrypLE(商標)(Invitrogen)で、室温にて5分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、6−ウェルプレート中、0.4ミクロン多孔性細胞培養フィルタ挿入物(BD 353493)上へ、0.1、0.5、1及び5×106細胞(10μl分液)の密度で播種した。1.5mlの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。培地を、研究の期間、毎日置換した。
d)ステージ4(2日間):ステージ3細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、0.25μM SANT−1、100nM RA、2mg/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸、及び100nM TPBを補足したBLAR培地中、空気−液体界面で、2日間培養した。
e)ステージ5(3日間):ステージ4細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、0.25μM SANT−1、50nM RA、100nM LDN−193189、1000nM ALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地で、3日間処理した。
f)ステージ6(14日間)ステージ5細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、0.25μM SANT−1、10000nM ALK5阻害剤、100nM LDN−193189及び1000nM T3を補足したBLAR培地で、14日間処理した。
0.4、1及び3ミクロン孔サイズフィルタ挿入物の比較
本実施例は、空気−液体界面での、続く分化における、フィルタ孔サイズの効果を比較する。本実施例における研究を実施するために、胚性幹細胞を、以下に議論するプロトコールを用いて分化させた。
a)ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCXを補足した、MCDB−131培地(Invitrogen、カタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b)ステージ2(2日間):ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c)ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,CA)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740、EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足したBLARカスタム培地(Invitrogen)で、2日間処理した。
d)ステージ4(2日間):ステージ3細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、100nM RA、2ng/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸及び100nM TPBを補足したBLAR培地で、2日間処理した。次いでステージ4の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、10μMのY27632で4時間処理し、PBSでリンスし、1× TrypLE(商標)(Invitrogen)で、室温にて5分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、6−ウェルプレート中、0.4、1又は3ミクロン多孔性細胞培養フィルタ挿入物上へ、0.5〜0.75×106細胞(10μl分液)の密度で播種した。1.5mlの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。培地を、研究の期間、毎日置換した。
e)ステージ5(4日間)ステージ4細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMa(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、0.25μM SANT−1、50nM RA、100nM LDN−193189、1000nMの種々のALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地中、空気−液体界面で、3日間培養した。
f)ステージ6(15日間):ステージ5細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、0.25μM SANT−1、100nM LDN−193189、1000nM T3、1000nM ALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地で、15日間処理した。
空気−液体界面での膵臓前腸前駆細胞の分化の、フィルタ挿入物上の液体−液体(L/L)界面との比較
本実施例は、フィルタ挿入物上の膵臓前腸前駆細胞の分化における、空気−液体界面での培養系の影響を、液体−液体界面での培養系に対して比較する。本実施例における研究を実施するために、胚性幹細胞を、以下で議論するプロトコールを用いて分化させた。
a)ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCX化合物を補足した、MCDB−131培地(Invitrogen、カタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b)ステージ2(2日間):ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c)ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,CA)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740、EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足したBLARカスタム培地(Invitrogen)で、2日間処理した。
d)ステージ4(2日間):ステージ3細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、100nM RA、2ng/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸、及び100nM TPBを補足したBLAR培地で、2日間処理し、次いでステージ4の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、10μMのY27632で4時間処理し、PBSでリンスし、1× TrypLE(商標)(Invitrogen)で、室温にて5分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、6−ウェルプレート中、MATRIGEL(商標)−コート0.4ミクロン孔細胞培養フィルタ挿入物上へ、0.5〜0.75×106細胞(10μl分液中)の密度で播種した。1.5mlの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。L/L条件のために、培地をまた、フィルタ挿入物の頂部上に加え、液体−液体界面をもたらした。培地を、研究の間毎日置換した。
e)ステージ5(3日間):ステージ4細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、0.25μM SANT−1、50nM RA、100nM LDN−193189、1000nMの種々のALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地中、空気−液体界面で、3日間培養した。
f)ステージ6(10日間):ステージ5細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、0.25μM SANT−1、100nM LDN−193189、1000nM T3、1000nM ALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地で、10日間処理した。
空気−液体界面で培養した膵臓内胚葉/内分泌前駆細胞は、化合物のライブラリを選別するために使用可能である。
本実施例は、化合物のライブラリを選別するために、空気−液体界面培養液の利用を試験する。そうするために、胚性幹細胞を、以下で議論したプロトコールを用いて分化した。
a)ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCX化合物を補足した、MCDB−131培地(Invitrogenカタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1×GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b)ステージ2(2日間):ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c)ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,CA)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740、EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足したBLARカスタム培地(Invitrogen)で、2日間処理した。
d)ステージ4(2日間):ステージ3細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、100nM RA、2ng/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPBを補足したBLAR培地で、2日間処理し、次いでステージ4の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、10μMのY27632で4時間処理し、PBSでリンスし、1× TrypLE(商標)(Invitrogen)で、室温にて5分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、6−ウェルプレート中、MATRIGEL(商標)−コート細胞培養フィルタ挿入物上へ、0.5〜0.75×106細胞(10μl分液中)の密度で播種した。1.5mlの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。
e)ステージ5(3日間):ステージ4細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、10μM ZnSO4(Sigma,Z0251)、0.25μM SANT−1、50nM RA、100nM LDN−193189、1000nMのALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地中、空気−液体界面で、3日間培養した。
f)ステージ6(12日間):ステージ5細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、10μM ZnSO4(Sigma,Z0251)、0.25μM SANT−1、100nM LDN−193189、1000nM T3、1000nM ALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地で、12日間処理した。本ステージにて、表Vにて列記した化合物を選別して、内胚葉及び内分泌マーカーに影響を与える潜在的な化合物を同定した。
空気−液体界面で培養したステージ5及びステージ6細胞のFACSプロファイル
本実施例は、空気−液体界面でのステージ5及びステージ6培養液の組成を研究する。本実施例における研究を実施するために、胚性幹細胞を、以下に記述するプロトコールを用いて、ステージ5及びステージ6に分化させた。
a)ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCX化合物を補足した、MCDB−131培地(Invitrogen、カタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b)ステージ2(2日間):ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c)ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,CA)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740、EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足したBLARカスタム培地(Invitrogen)で、2日間処理した。
d)ステージ4(3日間):ステージ3細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、100nM RA、2ng/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPBを補足したBLAR培地で、3日間処理し、次いでステージ4の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、10μMのY27632で4時間処理し、PBSでリンスし、1× TrypLE(商標)(Invitrogen)で、室温にて5分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、6−ウェルプレート中、MATRIGEL(商標)−コート細胞培養フィルタ挿入物上へ、0.5〜0.75×106細胞(10μl分液中)の密度で播種した。1.5mlの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。
e)ステージ5(3日間):ステージ4細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、10μM ZnSO4(Sigma,Z0251)、0.25μM SANT−1、50nM RA、100nM LDN−193189、1000nMのALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地中、空気−液体界面で、3日間培養した。
f)ステージ6(15日間)ステージ5細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、10μM ZnSO4(Sigma,Z0251)、0.25μM SANT−1、100nM LDN−193189、1000nM T3、1000nM ALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地で、5〜15日間処理した。
SCIDマウスでのNKX6.1+クロモグラニン−A+インスリン+細胞、NKX6.1+クロモグラニン−A−インスリン−及びPDX1とNKX6.1を共発現している膵臓前駆対ヒト膵島のインビボ成熟
本実施例は、分化細胞のインビトロ組成と、インビボ細胞性能における影響を強調する。特に、平面培養液上、実施例1に従って調製した5百万ステージ4、4日目(PDX1+NKX6.1+)膵臓前腸前駆細胞、空気−液体界面で培養した、5百万NKX6.1+クロモグラニン−A陰性細胞、及び空気−液体界面で、実施例10に従って調製した、3百万NKX6.1+クロモグラニン−陽性細胞を、(Dibetes 2012,61(8):2016−29)にて記述されるように、非糖尿病SCIDマウスの腎カプセル内に移植した。マウスを、時間の関数として、細胞の成熟状態の測定として、ヒトC−ペプチドを循環させることについて追跡した。さらに、別のマウスコホートにおいて、1500〜4000の死体ヒト膵島(PRODOラボ、Irvine,CA)等価物を、陽性対象として移植した。
ヒト胚性幹細胞株H1(継代40)の細胞を、10μMのY27632(Rock阻害剤、カタログ番号Y0503、Sigma)を補足した、DMEM−F12(Invitrogen,Ca)、GlutaMax(商標)(1:100希釈、Invitrogen)、0.25mMアスコルビン酸(Sigma、MO)、100ng/mlのFGF2(R & D systems、MN)、1ng/mlのTGF−β(R & D systems)、ITS−X(1:100希釈)、2%脂肪酸フリーBSA(Lampire,PA)及び20ng/mlのIGF−1(R & D systems)を含む培地中、MATRIGEL(商標)(1:30希釈:BD Biosciences,NJ)−コーティングしたディッシュ上で、1×105細胞/cm2にて単一細胞として播いた。播種の48時間後に、培養液を、不完全なPBS(Mg又はCaを含まないリン酸緩衝生理食塩水)中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
a.ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCX化合物を補足した、MCDB−131培地(Invitrogen、カタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1×GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b.ステージ2(2日間):ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c.ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,CA)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740;EMD Chemicals、Gibbstown、NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤;カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足したMCDB−131培地で、2日間処理した。次いでステージ3細胞を、1× ACCUTASE(商標)で1〜3分間、室温にて処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞の懸濁液を、0.4ミクロン多孔性細胞フィルタ挿入物上、〜2×106細胞/10μlの密度で播いた。1.5mlの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。
d.ステージ4(2日間):ステージ3細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、100nM RA、2ng/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸、100nM T3(T6397、Sigma)及び100nM TPBを補足したMCDB−131培地中、空気−液体界面にて2日間培養した。
e.ステージ5(2日間):ステージ4細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、50nM RA、50nM LDN−193189、500nM ALK5阻害剤(SD208)を補足したMCDB−131培地で、2日間処理した。
f.ステージ6(6日間):ステージ5細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、500nM ALK5阻害剤を補足したMCDB−131培地で、6日間処理した。
ガンマセクレターゼ阻害剤XXの補足が、空気−液体界面で培養したステージ6細胞の成熟マーカーをさらに増加させる。
本実施例は、ガンマセクレターゼ阻害剤のような、NOTCH阻害剤が、NKX6.1の発現を保持した一方で、β細胞の成熟マーカーをさらに増強することを強調する。ヒト胚性幹細胞株H1(継代42)の細胞を、10μMのY27632(Rock阻害剤、カタログ番号Y0503、Sigma)を補足した、DMEM−F12(Invitrogen,Ca)、GlutaMax(商標)(1:100希釈、Invitrogen)、0.25mMアスコルビン酸(Sigma、MO)、100ng/mlのFGF2(R & D systems、MN)、1ng/mlのTGF−β(R & D systems)、ITS−X(1:100希釈)、2%脂肪酸フリーBSA(Lampire,PA)及び20ng/mlのIGF−1(R & D systems)を含む培地中、MATRIGEL(商標)(1:30希釈:BD Biosciences,NJ)−コーティングしたディッシュ上で、1×105細胞/cm2にて単一細胞として播いた。播種の48時間後に、培養液を、不完全なPBS(Mg又はCaを含まないリン酸緩衝生理食塩水)中で洗浄した。細胞を次いで、以下のプロトコールに従って分化させた。
a)ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCX化合物を補足した、MCDB−131培地(Invitrogenカタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b)ステージ2(2日間:ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c)ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,Ca)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740、EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足したBLARカスタム培地(Invitrogen)で、2日間処理した。
d)ステージ4(3日間):ステージ3細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1、100nM RA、2ng/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPBを補足したBLAR培地で、3日間処理し、次いでステージ4の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、10μMのY27632で4時間処理し、PBSでリンスし、1× TrypLE(商標)(Invitrogen)で、室温にて5分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、6−ウェルプレート中、MATRIGEL(商標)−コート0.4ミクロン多孔性細胞培養フィルタ挿入物上へ、0.5〜0.75×106細胞(10μl分液中)の密度で播種した。1.5mlの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。
e)ステージ5(3日間):ステージ4細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、10μM ZnSO4(Sigma,Z0251)、0.25μM SANT−1、50nM RA、100nM LDN−193189、1000nMのALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地中、空気−液体界面で、3日間培養した。
f)ステージ6(14日間):ステージ5細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、10μM ZnSO4(Sigma,Z0251)、0.25μM SANT−1、100nM LDN−193189、1000nM T3、1000nM ALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地で、14日間処理した。
ALK5阻害剤の存在が、MAFAのアップレギュレーションのために必須であり、T3のさらなる添加が、MAFA発現をさらに増強する。
本実施例は、MAFA発現をアップレギュレートする、ALK5阻害剤II添加の能力と、ALK5阻害剤及びLDN−193189との、T3の添加が、MAFAの発現をさらに増強することを強調する。
a)ステージ1(3日間):細胞を、2%脂肪酸フリーBSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、カタログ番号S3187)、1× GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、4.5mM D−グルコース(Sigma−Aldrich、カタログ番号G8769)、100ng/ml GDF8(R & D Systems)及び1μM MCX化合物を補足した、MCDB−131培地(Invitrogen、カタログ番号10372−019)中で1日間培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、100ng/ml GDF8及び0.1μM MCX化合物を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース及び100ng/ml GDF8を補足したMCDB−131培地中、さらに1日培養した。
b)ステージ2(2日間):ステージ1細胞を次いで、2%脂肪酸フリーBSA、0.0012g/ml重炭酸ナトリウム、1× GlutaMax(商標)、4.5mM D−グルコース、0.25mMアスコルビン酸(Sigma,MO)及び25ng/ml FGF7(R & D Systems,MN)を補足したMCDB−131培地で2日間処理した。
c)ステージ3(2日間):ステージ2細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,Ca)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、1μM RA(Sigma,MO)、25ng/ml FGF7、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPB(PKCアクチベータ、カタログ番号565740、EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)及び100nM LDN−193189(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent)を補足したBLARカスタム培地(Invitrogen)で、2日間処理した。
d)ステージ4(3日間):ステージ3細胞を次いで、ITS−X(Invitrogen,CA)の1:200希釈、4.5mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0017g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、0.25μM SANT−1(Sigma、MO)、100nM RA、2ng/ml FGF7、100nM LDN−193189、0.25mMアスコルビン酸、200nM TPBを補足したBLAR培地で、3日間処理し、次いでステージ4の最後に、平面ディッシュ上で培養した細胞を、10μMのY27632で4時間処理し、PBSでリンスし、1× TrypLE(商標)(Invitrogen)で、室温にて5分間処理し、続いて酵素を除去し、基礎培地でリンスし、細胞スクレーパによって細胞をスクレープする。得られた細胞懸濁液を、6−ウェルプレート中、MATRIGEL(商標)−コート0.4ミクロン多孔性細胞培養フィルタ挿入物上へ、0.5〜0.75×106細胞(10μl分液中)の密度で播種した。1.5mlの培地を、各挿入物の底に加え、更なる培地はフィルタの頂点側に加えなかった。
e)ステージ5(3日間):ステージ4細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、10μM ZnSO4(Sigma,Z0251)、0.25μM SANT−1、50nM RA、100nM LDN−193189、1000nMのALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地中、空気−液体界面で、3日間培養した。
f)ステージ6(8日間):ステージ5細胞を次いで、ITS−Xの1:200希釈、20mMグルコース、1× GlutaMax(商標)、0.0015g/ml重炭酸ナトリウム、2%脂肪酸フリーBSA、10μg/mlのヘパリン(Sigma,#H3149)、10μM ZnSO4(Sigma,Z0251)、0.25μM SANT−1、100nM LDN−193189、1000nM T3、1000nM ALK5阻害剤IIを補足したBLAR培地で、8日間処理した。
空気−液体界面でのステージ6細胞の培養のための追加プロトコール
本実施例は、空気−液体界面でステージ6細胞を培養する追加材料及び方法を開示する。
7.5mlのステージ6分化培地を、10cmフィルタ挿入物の底に加える。少量(20〜30μl)で細胞のクラスタを、フィルタ挿入物の頂部に加える。典型的に、およそ50細胞クラスタを、10cmの挿入物辺りで配置する。播種にて、各細胞クラスタは、およそ0.5M細胞を含む。
Claims (96)
- 多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造する方法であって、
a.多能性幹細胞を培養することと、
b.多能性幹細胞を、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、
c.ALK5阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はALK5阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した少なくとも1つの培地での処理によって、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、空気−液体界面で培養することと、を含む方法。 - 前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、NKX6.1、PDX1及びHB9に対して陽性である、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、NKX6.1とクロモグラニン−Aを共発現する、請求項1に記載の方法。
- 得られた細胞の少なくとも30パーセントが、NKX6.1とクロモグラニン−Aを共発現する、請求項3に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、NKX6.1とインスリンを共発現する、請求項1に記載の方法。
- 得られた細胞の少なくとも30パーセントが、NKX6.1とインスリンを共発現する、請求項5に記載の方法。
- 平面培養液中、ALK5阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はALK5阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- さらに、ALK5阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はALK5阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した培地での処理によって、前記膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉/内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、空気−液体界面で培養することと、を含む、請求項7に記載の方法。
- トリヨードチロニンと、ALK5阻害剤を補足した培地での処理を含む、請求項1に記載の方法。
- さらに、多孔性基質上で細胞を培養することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多孔性基質はコーティングされていない、請求項10に記載の方法。
- 前記ALK5阻害剤が、ALK5阻害剤II、ALK5i、SD208、TGF−B阻害剤SB431542、ITD−1、LY2109761、A83−01、LY2157299、TGF−β受容体inh V、TGF−β受容体inh I、TGF−β受容体inh ITGF−β受容体inh IV、TGF−β受容体inh VII、TGF−β受容体inh VIII、TGF−β受容体inh II、TGF−β受容体inh VI、TGF−β受容体inh IIIからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ALK5阻害剤は、ALK5阻害剤IIである、請求項12に記載の方法。
- さらに、ALK5阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はALK5阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した培地で、膵臓内胚葉/膵臓内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を処理することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンであり、前記ALK5阻害剤が、ALK5阻害剤IIである、請求項14に記載の方法。
- 前記培地にさらに、レチノイン酸、アスコルビン酸、SANT−1又はLDN−193189の1つ又はそれ以上が補足される、請求項15に記載の方法。
- 前記方法が、膵臓ホルモンの発現を増加させる、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、PTF1a、SOX9、CDX2、ZIC1及びSOX2の発現を減少させる、請求項16に記載の方法。
- 前記方法が、インスリン、クロモグラニン−A又はクロモグラニン−とインスリン両方を共発現する、NXK6.1陽性細胞の数を増加させる、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、非胚性起源のものである、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、β細胞に特徴的なマーカーを発現している、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって得た膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を哺乳動物に移植することを含む、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞のインビボ成熟化の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、NKX6.1とクロモグラニン−Aとを共発現する、請求項22に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞が、NKX6.1とインスリンとを共発現する、請求項22に記載の方法。
- 空気−液体界面で培養する一方で、ALK5阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はALK5阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した少なくとも1つの培地での処理によって、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることを含む、膵臓内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を製造する方法。
- 膵臓前腸前駆細胞、膵臓内胚葉細胞及び膵臓内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞のみを、空気−液体界面にて培養する、請求項25に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、NKX6.1、PDX1及びHB9に対して陽性である、請求項25に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、単一ホルモン陽性細胞である、請求項25に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、NKX6.1とクロモグラニン−Aとを共発現する、請求項28に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、NKX6.1とインスリンとを共発現する、請求項28に記載の方法。
- さらに、多孔性基質上で細胞を培養することを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記細胞が、シート内であるか、又は前記多孔性基質の頂部上の凝集体クラスタである、請求項31に記載の方法。
- ALK5阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はALK5阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した培地で、膵臓内胚葉/膵臓内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を処理することを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記甲状腺ホルモンがトリヨードチロニンであり、前記ALK5阻害剤が、ALK5阻害剤IIである、請求項33に記載の方法。
- 前記培地にさらに、レチノイン酸、アスコルビン酸、SANT−1又はLDN−193189の1つ又はそれ以上を補足する、請求項34に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、β細胞の特徴的なマーカーを発現する、請求項25に記載の方法。
- 請求項25に記載の方法によって得た、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を、哺乳動物に移植することを含む、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞のインビボ成熟化の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、NKX6.1とクロモグラニン−Aを共発現する、請求項37に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞が、NKX6.1とインスリンとを共発現する、請求項37に記載の方法。
- 多能性幹細胞から由来する細胞中で、PDX1、NKX6.1及びHB9発現とを誘導する方法であって、
a.多能性幹細胞を培養することと、
b.前記多能性幹細胞を、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、
c.ALK5阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はALK5阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した培地での処理によって、前記膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を、PDX1、NKX6.1及びHB9を発現している細胞に分化させることと、空気−液体界面で培養することと、を含む方法。 - 前記多能性幹細胞が、非胚性起源のものである、請求項40に記載の方法。
- さらに、空気−液体界面にて、トリヨードチロニンとALK5阻害剤とを補足した培地中で、膵臓内胚葉細胞又は膵臓内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することを含む、請求項40に記載の方法。
- 前記ALK5阻害剤が、ALK5阻害剤IIである、請求項42に記載の方法。
- 前記培地にさらに、レチノイン酸、アスコルビン酸、SANT−1又はLDN−193189の1つ又はそれ以上が補足される、請求項40に記載の方法。
- 空気−液体界面にて、細胞を分化するためのインビトロ細胞培養系であって、
a.培養容器と、
b.前記容器の容量の一部のみをみたすのに十分な容量の前記容器内の分化溶媒と、
c.前記培地を隣接している前記容器の一部をみたす前記容器内の空気と、
d.前記培地と前記空気間の界面に位置する多孔性基質と、
e.前記培地が前記細胞の表面の一部のみに接触するように、前記基質の表面上に析出した多能性幹細胞から由来する細胞と、を含む、インビトロ細胞培養系。 - 前記多能性幹細胞から由来した細胞が、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現する、請求項45に記載の細胞培養系。
- 前記多能性幹細胞から由来した細胞が、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現する、請求項45に記載の細胞培養系。
- 前記多能性幹細胞から由来した細胞が、膵臓内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現する、請求項45に記載の細胞培養系。
- 前記多能性幹細胞から由来した細胞が、膵臓内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現する、請求項45に記載の細胞培養系。
- 前記分化培地が、ALK5阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、又はALK5阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した増殖培地を含む、請求項45に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地が、MCDB131及びBLAR培地から選択される、請求項50に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地が、BLAR培地である、請求項51に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地に、トリヨードチロニンと、ALK5阻害剤IIが補足される、請求項52に記載の細胞培養系。
- 前記分化培地が、FGF7、FGF10及びこれらの混合物から選択される増殖因子、TPB、PDBu、PMA及びILVから選択されるPKCアクチベータ、及びLDN−193189、Noggin及びChordinから選択されるBMP受容体阻害剤を補足した増殖培地を含む、請求項46に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地が、MCDB131及びBLAR培地から選択される、請求項54に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地が、BLAR培地である、請求項55に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地に、FGF7、TPB及びLDN−193189を補足する、請求項56に記載の細胞培養系。
- 前記分化培地が、ALK5阻害剤と、LDN−193189、Noggin又はChordinからなる群から選択されるBMP阻害剤と、を補足した増殖培地を含む、請求項47に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地が、MCDB131及びBLAR培地から選択される、請求項58に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地が、BLAR培地である、請求項59に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地に、LDN−193189とALK5阻害剤IIとが補足される、請求項60に記載の細胞培養系。
- 前記分化培地が、ALK5阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、又はALK5阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した増殖培地を含む、請求項48に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地が、MCDB131及びBLAR培地から選択される、請求項62に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地が、BLAR培地である、請求項63に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地に、トリヨードチロニンと、ALK5阻害剤IIと、が補足される、請求項64に記載の細胞培養系。
- 前記分化培地が、ALK5阻害剤、又はトリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、又はALK5阻害剤と甲状腺ホルモン両方を補足した、増殖培地を含む、請求項49に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地が、MCDB131とBLAR培地から選択される、請求項66に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地が、BLAR培地である、請求項67に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地に、トリヨードチロニンとALK5阻害剤IIが補足される、請求項68に記載の細胞培養系。
- 前記増殖培地にさらに、
a.MRT10又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤と、
b.SANT−1又はHPI−1から選択されるSHHシグナル伝達経路アンタゴニストと、
c.LDN−193189、Noggin又はChordinから選択されるBMP受容体阻害剤と、
d.TPB、PDBu、PMA及びILVから選択されるPKCアクチベータと、
e.FGF7又はFGF10から選択される線維芽細胞増殖因子と、
f.レチノイン酸と、
g.アスコルビン酸と、
h.ヘパリンと、
i.硫酸亜鉛と、の1つ又はそれ以上が補足される、請求項53に記載の細胞培養系。 - 前記培地に、さらに、
a.MRT10又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤と、
b.SANT−1又はHPI−1から選択されるSHHシグナル伝達経路アンタゴニストと、
c.トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン
d.TPB、PDBu、PMA及びILVから選択されるPKCアクチベータと、
e.FGF7又はFGF10から選択される線維芽細胞増殖因子と、
f.レチノイン酸と、
g.アスコルビン酸と、
h.ヘパリンと、
i.硫酸亜鉛と、の1つ又はそれ以上が補足される、請求項61に記載の細胞培養系。 - 前記培地にさらに、
a.MRT10又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤と、
b.SANT−1又はHPI−1から選択されるSHHシグナル伝達経路アンタゴニストと、
c.LDN−193189、Noggi又はChordinから選択されるBMP受容体阻害剤と、
d.TPB、PDBu、PMA及びILVから選択されるPKCアクチベータと、
e.FGF7又はFGF10から選択される線維芽細胞増殖因子と、
f.レチノイン酸と、
g.アスコルビン酸と、
h.ヘパリンと、
i.硫酸亜鉛と、の1つ又はそれ以上が補足される、請求項65に記載の細胞培養系。 - 前記培地にさらに、
a.MRT10又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤と、
b.SANT−1又はHPI−1から選択されるSHHシグナル伝達経路アンタゴニストと、
c.LDN−193189、Noggin又はChordinから選択されるBMP受容体阻害剤と、
d.TPB、PDBu、PMA及びILVから選択されるPKCアクチベータと、
e.FGF7又はFGF10から選択される線維芽細胞増殖因子と、
f.レチノイン酸と、
g.アスコルビン酸と、
h.ヘパリンと、
i.硫酸亜鉛と、の1つ又はそれ以上が補足される、請求項69に記載の細胞培養系。 - 前記培地にさらに、レチノイン酸、アスコルビン酸、及びSANT−1が補足される、請求項70に記載の細胞培養系。
- 前記培地にさらに、レチノイン酸、ヘパリン、SANT−1、及び硫酸亜鉛が補足される、請求項71に記載の細胞培養系。
- 前記培地にさらに、LDN−193189、レチノイン酸、アスコルビン酸、及びSANT−1が補足される、請求項72に記載の細胞培養系。
- 前記培地にさらに、LDN−193189、SANT−1及びヘパリンが補足される、請求項73に記載の細胞培養系。
- 得られた細胞の少なくとも約30パーセントが、NKX6.1及びインスリンを発現する、請求項73に記載の細胞培養系。
- 得られた細胞の少なくとも約30パーセントが、NKX6.1及びクロモグラニン−Aを発現する、請求項73に記載の細胞培養系。
- a.ALK5阻害剤II、ALK5i、SD208、TGF−B阻害剤SB431542、ITD−1、LY2109761、A83−01、LY2157299、TGF−β受容体inh V、TGF−β受容体inh I、TGF−β受容体inh ITGF−β受容体inh IV、TGF−β受容体inh VII、TGF−β受容体inh VIII、TGF−β受容体inh II、TGF−β受容体inh VI、TGF−β受容体inh IIIからなる群から選択されるALK5阻害剤と、
b.LDN−193189、Noggin又はChordinから選択されるBMP受容体阻害剤と、を補足した増殖培地を含む、多能性幹細胞から由来した細胞中、分化を誘導するために有用である培地。 - さらに、SANT−1又はHPI−1から選択される、SHHシグナル伝達経路アンタゴニストを含む、請求項80に記載の培地。
- さらに、レチノイン酸を含む、請求項81に記載の培地。
- ALK5阻害剤II、SANT−1、LDN−193189及びレチノイン酸を含む、請求項82に記載の培地。
- さらに、
a.MRT10又はシクロパミンから選択される滑らかにされた受容体阻害剤と、
b.トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモンと、
c.アスコルビン酸と、
d.ヘパリンと、
e.硫酸亜鉛と、から選択される1つ又はそれ以上の補助剤を含む、請求項83に記載の培地。 - 前記増殖培地が、MCDB−131とBLAR培地とから選択される、請求項83に記載の分化培地。
- 前記増殖培地に、ALK5阻害剤II、SANT−1、LDN−193189、ヘパリン、硫酸亜鉛及びレチノイン酸が補足される、請求項84に記載の分化培地。
- a.ALK5阻害剤II、ALK5i、SD208、TGF−B阻害剤SB431542、ITD−1、LY2109761、A83−01、LY2157299、TGF−β受容体inh V、TGF−β受容体inh I、TGF−β受容体inh ITGF−β受容体inh IV、TGF−β受容体inh VII、TGF−β受容体inh VIII、TGF−β受容体inh II、TGF−β受容体inh VI、TGF−β受容体inh IIIからなる群から選択されるALK5阻害剤と、
b.トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモンと、
c.SANT−1又はHPI−1から選択されるSHHシグナル伝達経路アンタゴニストと、を補足した増殖培地を含む、多能性幹細胞から由来した細胞中で、分化を誘導するために有用な培地。 - さらに、レチノイン酸を含む、請求項87に記載の培地。
- さらに、アスコルビン酸を含む、請求項88に記載の培地。
- さらに、
a.LDN−193189、Noggin又はChordinから選択されるBMP受容体阻害剤と、
b.ヘパリンと、
c.硫酸亜鉛と、から選択される1つ又はそれ以上の補助剤を含む、請求項87に記載の培地。 - 前記増殖培地が、MCDB−131とBLAR培地とから選択される、請求項90に記載の分化培地。
- 前記増殖培地に、ALK5阻害剤II、LDN−193189、硫酸亜鉛、トリヨードチロニン、SANT−1及びヘパリンが補足される、請求項91に記載の分化培地。
- 少なくとも30パーセントの前記分化細胞が、NKX6.1とインスリンとを発現する、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現する分化多能性幹細胞の集団を含む、インビトロ細胞培養系。
- 少なくとも30パーセントの前記分化細胞が、NKX6.1とクロマグラニンとを発現する、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現する分化多能性幹細胞の集団を含む、インビトロ細胞培養系。
- 試験化合物の存在下、請求項1に記載の方法に従った細胞を培養することと、膵臓ホルモンの産出における前記試験化合物の効果を測定することと、を含む、膵臓ホルモン産出における効果に対して、化合物を選別する方法。
- 前記膵臓ホルモンがインスリンである、請求項95に記載の選別方法。
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Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016531087A (ja) * | 2013-06-11 | 2016-10-06 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | SC−β細胞及び組成物並びにその生成方法 |
WO2018038042A1 (ja) * | 2016-08-24 | 2018-03-01 | 学校法人慶應義塾 | ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用2dオルガノイド及びその使用 |
JP2019518465A (ja) * | 2016-06-21 | 2019-07-04 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | グルコース依存性ミトコンドリア呼吸及び二相インスリン分泌応答を示すヒト多能性幹細胞由来の機能的ベータ細胞の生成 |
US10927350B2 (en) | 2014-12-18 | 2021-02-23 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
US11085027B2 (en) | 2014-12-18 | 2021-08-10 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
US11155787B2 (en) | 2014-12-18 | 2021-10-26 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived beta cells and methods of use thereof |
US11466256B2 (en) | 2018-08-10 | 2022-10-11 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
US11945795B2 (en) | 2017-11-15 | 2024-04-02 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Islet cell manufacturing compositions and methods of use |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2473685C2 (ru) | 2007-07-31 | 2013-01-27 | Лайфскен, Инк. | Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток |
CN101878298B (zh) | 2007-11-27 | 2017-08-15 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
RU2579278C2 (ru) | 2009-07-20 | 2016-04-10 | Янссен Байотек, Инк. | Популяция панкреатических эндокринных клеток-предшественников для снижения концентрации глюкозы в крови и способ дифференцировки панкреатических эндодермальных клеток |
RU2705001C2 (ru) | 2011-12-22 | 2019-11-01 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки |
US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
DK3143127T3 (da) | 2014-05-16 | 2021-09-13 | Janssen Biotech Inc | Anvendelse af små molekyler til at forstærke mafa-ekspression i endokrine pankreasceller |
WO2016100921A1 (en) * | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED β CELLS AND USES THEREOF |
MA45329A (fr) | 2016-04-08 | 2019-02-13 | Univ California | Production de cellules bêta matures pleinement fonctionnelles à partir de progénitrices pancréatiques humaines |
KR101870240B1 (ko) * | 2016-04-12 | 2018-06-22 | 서울대학교산학협력단 | 지방줄기세포에서 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성 신경세포로의 분화 유도 방법 |
AU2017313847A1 (en) * | 2016-08-19 | 2019-02-28 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Methods of differentiating stem cells into endoderm |
FR3061206B1 (fr) * | 2016-12-23 | 2020-06-26 | Laboratoires Clarins | Modele de peau incluant epiderme, derme et hypoderme, son procede de preparation et son utilisation |
US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
US10724052B2 (en) | 2018-09-07 | 2020-07-28 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
WO2020068984A1 (en) * | 2018-09-25 | 2020-04-02 | The Regents Of The University Of California | Production and enrichment of pancreatic endocrine progenitor cells |
US20220411759A1 (en) * | 2019-05-21 | 2022-12-29 | President And Fellows Of Harvard College | Endocrine differentiation-inducing molecule |
AU2020283056B2 (en) | 2019-05-31 | 2023-06-08 | Viacyte, Inc. | A biocompatible membrane composite |
CN114206480B (zh) | 2019-05-31 | 2024-06-04 | W.L.戈尔及同仁股份有限公司 | 生物相容性膜复合材料 |
AU2020284245B2 (en) | 2019-05-31 | 2023-10-05 | Viacyte, Inc. | A biocompatible membrane composite |
US20220233299A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-07-28 | W. L. Gore & Associates, Inc. | Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances |
US11118195B2 (en) | 2019-09-05 | 2021-09-14 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
JP2022547053A (ja) | 2019-09-05 | 2022-11-10 | クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト | ユニバーサルドナー細胞 |
EP4271796A1 (en) | 2020-12-31 | 2023-11-08 | CRISPR Therapeutics AG | Universal donor cells |
CN112961823B (zh) * | 2021-03-19 | 2024-01-23 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养液 |
CN112980774B (zh) * | 2021-03-19 | 2022-04-01 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养方法 |
CN113046299B (zh) * | 2021-03-19 | 2024-06-28 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的添加剂 |
IL311994A (en) * | 2021-10-15 | 2024-06-01 | Thymmune Therapeutics Inc | Thymic cells and methods of production |
US20230377685A1 (en) | 2022-04-15 | 2023-11-23 | Aspen Neuroscience, Inc. | Methods of classifying the differentiation state of cells and related compositions of differentiated cells |
CN115011544B (zh) * | 2022-05-30 | 2023-11-17 | 广州国家实验室 | 体外诱导获得胰岛δ细胞的方法及其应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006075022A (ja) * | 2004-09-07 | 2006-03-23 | Foundation For Biomedical Research & Innovation | 膵臓ホルモン産生細胞取得方法 |
JP2009528066A (ja) * | 2006-03-02 | 2009-08-06 | サイセラ,インコーポレイテッド | 内分泌前駆細胞、膵臓ホルモン発現細胞及びそれらの製造方法 |
JP2009535058A (ja) * | 2006-05-02 | 2009-10-01 | ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 幹細胞の内胚葉細胞および膵臓系列細胞への分化方法 |
JP2010535036A (ja) * | 2007-07-31 | 2010-11-18 | ライフスキャン・インコーポレイテッド | ヒト胚性幹細胞の分化 |
US20110151560A1 (en) * | 2009-12-23 | 2011-06-23 | Jean Xu | Differentiation of human embryonic stem cells |
JP2011172586A (ja) * | 2005-10-05 | 2011-09-08 | Osaka Univ | 脂肪組織由来細胞の調製方法 |
US20110281355A1 (en) * | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of Human Embryonic Stem Cells |
Family Cites Families (263)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3209652A (en) | 1961-03-30 | 1965-10-05 | Burgsmueller Karl | Thread whirling method |
AT326803B (de) | 1968-08-26 | 1975-12-29 | Binder Fa G | Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben |
US3935067A (en) | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
CA1201400A (en) | 1982-04-16 | 1986-03-04 | Joel L. Williams | Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture |
US4499802A (en) | 1982-09-29 | 1985-02-19 | Container Graphics Corporation | Rotary cutting die with scrap ejection |
US4537773A (en) | 1983-12-05 | 1985-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | α-Aminoboronic acid derivatives |
US4557264A (en) | 1984-04-09 | 1985-12-10 | Ethicon Inc. | Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene |
US5215893A (en) | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US5089396A (en) | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US4737578A (en) | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
US5863531A (en) | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
CA1340581C (en) | 1986-11-20 | 1999-06-08 | Joseph P. Vacanti | Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices |
US5567612A (en) | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
US5804178A (en) | 1986-11-20 | 1998-09-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue |
NZ229354A (en) | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
EP0363125A3 (en) | 1988-10-03 | 1990-08-16 | Hana Biologics Inc. | Proliferated pancreatic endocrine cell product and process |
US5837539A (en) | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
AU668349B2 (en) | 1991-04-25 | 1996-05-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor |
US5449383A (en) | 1992-03-18 | 1995-09-12 | Chatelier; Ronald C. | Cell growth substrates |
GB9206861D0 (en) | 1992-03-28 | 1992-05-13 | Univ Manchester | Wound healing and treatment of fibrotic disorders |
CA2114282A1 (en) | 1993-01-28 | 1994-07-29 | Lothar Schilder | Multi-layered implant |
JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
AU687386B2 (en) | 1993-04-08 | 1998-02-26 | Human Cell Cultures, Inc. | Cell culturing method and medium |
US5523226A (en) * | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
GB9310557D0 (en) | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel process and apparatus |
TW257671B (ja) | 1993-11-19 | 1995-09-21 | Ciba Geigy | |
US6703017B1 (en) | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US5834308A (en) | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
US6001647A (en) | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
US6083903A (en) | 1994-10-28 | 2000-07-04 | Leukosite, Inc. | Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses |
ES2170815T5 (es) | 1994-12-29 | 2012-11-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Uso de un anticuerpo PM-1 o de un anticuerpo MH166 para potenciar el efecto antitumoral de cisplatino o carboplatino |
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US5718922A (en) | 1995-05-31 | 1998-02-17 | Schepens Eye Research Institute, Inc. | Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation |
US5908782A (en) | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
US5681561A (en) * | 1995-06-07 | 1997-10-28 | Life Medical Sciences, Inc. | Compositions and methods for improving autologous fat grafting |
ATE244234T1 (de) | 1997-04-24 | 2003-07-15 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Substituierte imidazole zur behandlung von entzündlichen krankheiten |
EP1028737B1 (en) | 1997-07-03 | 2007-04-04 | Osiris Therapeutics, Inc. | Human mesenchymal stem cells from peripheral blood |
DK1538206T3 (da) | 1997-09-16 | 2010-07-12 | Centocor Ortho Biotech Inc | Fremgangsmåde til fuldstændig kemisk syntese og samling af gener og genomer |
US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
JP3880795B2 (ja) | 1997-10-23 | 2007-02-14 | ジェロン・コーポレーション | フィーダー細胞を含まない培養物中で、霊長類由来始原幹細胞を増殖させるための方法 |
US6372779B1 (en) | 1997-12-29 | 2002-04-16 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Anti-inflammatory compounds |
ES2258329T3 (es) | 1998-03-18 | 2006-08-16 | Osiris Therapeutics, Inc. | Celulas madre mesenquimaticas para la prevencion y tratamiento de respuestas inmunes en trasplantes. |
MY132496A (en) | 1998-05-11 | 2007-10-31 | Vertex Pharma | Inhibitors of p38 |
US6413773B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-02 | The Regents Of The University Of California | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation |
US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
US6610540B1 (en) | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
US6413556B1 (en) | 1999-01-08 | 2002-07-02 | Sky High, Llc | Aqueous anti-apoptotic compositions |
IL144359A0 (en) | 1999-01-21 | 2002-05-23 | Vitro Diagnostics Inc | Immortalized cell lines and methods of making the same |
RU2215029C2 (ru) | 1999-02-11 | 2003-10-27 | Ханми Фарм. Ко., Лтд. | Способ получения установившейся эмбриональной зародышевой клеточной линии птиц, линия куриных эмбриональных зародышевых клеток, способ получения соматических или половых химер, способ трансфекции чужеродного гена в эмбриональные зародышевые клетки |
US6815203B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-11-09 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
US6333029B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
US6306424B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-10-23 | Ethicon, Inc. | Foam composite for the repair or regeneration of tissue |
CA2385628A1 (en) | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Ammon B. Peck | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6685936B2 (en) | 1999-10-12 | 2004-02-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation |
US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
EP1240518A4 (en) | 1999-12-13 | 2006-05-17 | Scripps Research Inst | MARKERS FOR THE IDENTIFICATION AND INSULATION OF PRE-GENERIC CELLS OF A AND B PANCREAS ISOLATED CELLS |
US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
US7439064B2 (en) | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
US6436704B1 (en) | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
AU2001274624A1 (en) | 2000-06-26 | 2002-01-08 | Renomedix Institute Inc. | Cell fraction containing cells capable of differentiating into nervous system cells |
NZ524806A (en) | 2000-10-23 | 2006-03-31 | Smithkline Beecham Corp | Tri-substituted 8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-one compounds |
ES2263681T3 (es) | 2000-12-08 | 2006-12-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Compuestos de pirrolina indazolil-substituidos como inhibidores de la kinasa. |
MXPA03005139A (es) | 2000-12-08 | 2004-01-29 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Compuestos macroheterociclicos utiles como inhibidores de cinasa. |
US6599323B2 (en) | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
EP1366148A2 (en) | 2001-01-24 | 2003-12-03 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES | Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells |
EP1355910B1 (en) | 2001-01-25 | 2011-03-09 | The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Formulation of boronic acid compounds |
US6656488B2 (en) | 2001-04-11 | 2003-12-02 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering |
EP1379626A2 (en) | 2001-04-19 | 2004-01-14 | DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung | A method for differentiating stem cells into insulin-producing cells |
CN100516204C (zh) | 2001-04-24 | 2009-07-22 | 味之素株式会社 | 干细胞及其分离方法 |
CA2447015A1 (en) | 2001-05-15 | 2002-11-21 | Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences | Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells |
US6626950B2 (en) | 2001-06-28 | 2003-09-30 | Ethicon, Inc. | Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue |
KR100418195B1 (ko) | 2001-07-05 | 2004-02-11 | 주식회사 우리기술 | 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법 |
GB0117583D0 (en) | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
WO2003014313A2 (en) | 2001-08-06 | 2003-02-20 | Bresagen, Ltd. | Alternative compositions and methods for the culture of stem cells |
US6617152B2 (en) | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
CA2463914A1 (en) | 2001-10-18 | 2003-04-24 | Ixion Biotechnology, Inc. | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
US8021876B2 (en) | 2001-11-15 | 2011-09-20 | Children's Medical Center Corporation | Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof |
US20030161816A1 (en) | 2001-12-07 | 2003-08-28 | Fraser John K. | Systems and methods for treating patients with processed lipoaspirate cells |
IL162131A0 (en) | 2001-12-07 | 2005-11-20 | Geron Corp | Islet cells from human embryonic stem cells |
AU2002218893A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-09 | Thromb-X Nv | Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability |
IL162663A0 (en) | 2001-12-28 | 2005-11-20 | Cellartis Ab | A method for the establishment of apluripotent human blastocyst-derived stem cell line |
US20030162290A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
US20030180268A1 (en) | 2002-02-05 | 2003-09-25 | Anthony Atala | Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ |
US20050208029A1 (en) | 2002-04-17 | 2005-09-22 | Akihiro Umezawa | Method of forming pancreatic beta cells from mesenchymal cells |
US20040161419A1 (en) | 2002-04-19 | 2004-08-19 | Strom Stephen C. | Placental stem cells and uses thereof |
ATE387444T1 (de) | 2002-05-08 | 2008-03-15 | Janssen Pharmaceutica Nv | Substituierte pyrroline als kinase inhibitoren |
US20060003446A1 (en) * | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
US20060122104A1 (en) | 2002-05-28 | 2006-06-08 | Presnell Sharon C | Methods for in vitro expansion and transdifferentiation of human pancreatic acinar cells into insulin-producing cells |
RU2004135382A (ru) | 2002-06-05 | 2005-06-27 | Янссен Фармацевтика Н.В. (Be) | Замещенные пирролины в качестве ингибиторов киназы |
GB0212976D0 (en) | 2002-06-06 | 2002-07-17 | Tonejet Corp Pty Ltd | Ejection method and apparatus |
CN1171991C (zh) | 2002-07-08 | 2004-10-20 | 徐如祥 | 人神经干细胞的培养方法 |
US6877147B2 (en) | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
US7838290B2 (en) | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
AU2003257938A1 (en) | 2002-07-29 | 2004-02-16 | Es Cell International Pte Ltd. | Multi-step method for differentiation of insulin positive, glucose |
US20040063204A1 (en) | 2002-08-14 | 2004-04-01 | Lijun Yang | Bone marrow cell differentiation |
WO2004023100A2 (en) | 2002-09-06 | 2004-03-18 | Amcyte Inc. | Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells |
US9969977B2 (en) | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
US20040062753A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
US20060252150A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-11-09 | Linzhao Cheng | Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same |
US7144999B2 (en) | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
US20060040385A1 (en) | 2002-12-05 | 2006-02-23 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Cultured human pancreatic islets, and uses thereof |
CN100549163C (zh) | 2002-12-16 | 2009-10-14 | 技术研究及发展基金有限公司 | 制备无饲养细胞、无异源的人胚胎干细胞的方法以及使用该方法制备的干细胞培养物 |
US20050118148A1 (en) | 2002-12-20 | 2005-06-02 | Roland Stein | Compositions and methods related to mammalian Maf-A |
MXPA05007883A (es) | 2003-01-29 | 2005-09-21 | Takeda Pharmaceutical | Proceso para producir una preparacion recubierta. |
RU2359671C2 (ru) | 2003-01-29 | 2009-06-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения препарата с покрытием |
US20070155661A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University | Methods and compositions for modulating the development of stem cells |
US20070154981A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
US20070020242A1 (en) | 2003-03-27 | 2007-01-25 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
WO2004090110A2 (en) | 2003-03-31 | 2004-10-21 | Bresagen Inc. | Compositions and methods for the control, differentiation and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
US20090203141A1 (en) | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
JP5148873B2 (ja) | 2003-06-27 | 2013-02-20 | エチコン、インコーポレイテッド | 臍帯組織由来の分娩後細胞、及びその作成及び使用方法 |
IL161903A0 (en) | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
WO2005017117A2 (en) | 2003-08-14 | 2005-02-24 | Martin Haas | Multipotent amniotic fetal stem cells (mafsc) and banking of same |
US7157275B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
US20060205072A1 (en) | 2003-08-27 | 2006-09-14 | Nobuko Uchida | Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for such populations |
US6939633B2 (en) | 2003-09-17 | 2005-09-06 | General Motors Corporation | Fuel cell shutdown and startup using a cathode recycle loop |
WO2005058301A1 (en) | 2003-12-17 | 2005-06-30 | Allergan, Inc. | Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b |
US20060030042A1 (en) | 2003-12-19 | 2006-02-09 | Ali Brivanlou | Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime |
GB0329498D0 (en) | 2003-12-19 | 2004-01-28 | Novartis Ag | Organic compounds |
CN1946838A (zh) | 2003-12-23 | 2007-04-11 | 赛瑟拉公司 | 定形内胚层 |
US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
US7510876B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-03-31 | Cythera, Inc. | Definitive endoderm |
US7541185B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-06-02 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
US7625753B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
US20050233446A1 (en) | 2003-12-31 | 2005-10-20 | Parsons Xuejun H | Defined media for stem cell culture |
TWI334443B (en) | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
US7794704B2 (en) | 2004-01-23 | 2010-09-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration |
WO2005071066A1 (en) | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells |
WO2005080551A2 (en) | 2004-02-12 | 2005-09-01 | University Of Newcastle Upon Tyne | Stem cells |
US7964401B2 (en) | 2004-02-19 | 2011-06-21 | Kyoto University | Screening method for somatic cell nuclear reprogramming substance affecting ECAT2 and ECAT3 |
US20060281174A1 (en) | 2004-03-09 | 2006-12-14 | Gang Xu | Methods for generating insulin-producing cells |
CN1950498A (zh) | 2004-03-10 | 2007-04-18 | 加利福尼亚大学董事会 | 培养胚胎干细胞的组合物和方法 |
US7892835B2 (en) | 2004-03-23 | 2011-02-22 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Pluripotent stem cell growing method |
WO2005097980A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Geron Corporation | New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
JP4491014B2 (ja) | 2004-04-01 | 2010-06-30 | ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 幹細胞の内胚葉および膵臓系統への分化 |
KR101395516B1 (ko) | 2004-04-27 | 2014-05-14 | 비아싸이트, 인크. | Pdx1 발현 내배엽 |
JP2007511451A (ja) | 2004-06-08 | 2007-05-10 | シク ヨーン,イ | エレベーター天井に設置される組立式照明反射システム |
JP5687816B2 (ja) | 2004-07-09 | 2015-03-25 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | 胚体内胚葉を分化させるための因子を同定する方法 |
AU2005272681B2 (en) | 2004-08-13 | 2009-11-19 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells |
US20080268533A1 (en) | 2004-08-25 | 2008-10-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells |
DE102004043256B4 (de) | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
GB2432846B (en) | 2004-09-08 | 2009-12-30 | Wisconsin Alumni Res Found | Medium and culture of embryonic stem cells |
WO2006029198A2 (en) | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Culturing human embryonic stem cells |
EP1853698A1 (en) | 2005-01-28 | 2007-11-14 | NovaThera Ltd. | Methods for embryonic stem cell culture |
JP2008528038A (ja) | 2005-01-31 | 2008-07-31 | エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド | 胚性幹細胞の指示された分化及びその利用 |
US20060182724A1 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-17 | Riordan Neil H | Method for expansion of stem cells |
PL1860950T3 (pl) | 2005-03-04 | 2017-09-29 | Lifescan, Inc. | Dojrzałe komórki podścieliska pochodzenia trzustkowego |
GB0505970D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof |
EP1876893B1 (en) | 2005-04-15 | 2012-04-11 | Geron Corporation | Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities |
CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
US20080227656A1 (en) | 2005-04-26 | 2008-09-18 | Flemming Besenbacher | Biosurface Structure Array |
JP4557797B2 (ja) | 2005-05-20 | 2010-10-06 | 株式会社日立製作所 | 光ディスク装置 |
JP5092124B2 (ja) | 2005-05-24 | 2012-12-05 | 国立大学法人 熊本大学 | Es細胞の分化誘導方法 |
AU2006202209B2 (en) | 2005-05-27 | 2011-04-14 | Lifescan, Inc. | Amniotic fluid derived cells |
EP1899344A1 (en) | 2005-06-10 | 2008-03-19 | Irm, Llc | Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells |
WO2006138433A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
US20080199959A1 (en) | 2005-06-21 | 2008-08-21 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method For Cell Culture |
GB2441488C (en) | 2005-06-22 | 2011-10-05 | Geron Corp | Suspension culture of human embryonic stem cells |
UA92608C2 (en) | 2005-06-30 | 2010-11-25 | Янссен Фармацевтика Н.В. | Cyclic anilino - pyridinotriazines as gsk-3 inhibitors |
US20080194021A1 (en) | 2005-07-29 | 2008-08-14 | Mays Robert W | Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells |
AU2006274438A1 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Australian Stem Cell Centre Limited | Compositions and methods for growth of pluripotent cells |
WO2007025234A2 (en) | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
EP1962719A4 (en) | 2005-08-29 | 2011-05-04 | Technion Res And Dev Of Foundation Ltd | MEDIA FOR BREEDING STEM CELLS |
EP1937801A1 (en) | 2005-09-02 | 2008-07-02 | Agency for Science, Technology and Research | Method of deriving mesenchymal stem cells |
WO2007030870A1 (en) | 2005-09-12 | 2007-03-22 | Es Cell International Pte Ltd | Cardiomyocyte production |
WO2008048671A1 (en) | 2006-10-18 | 2008-04-24 | University Of Illinois | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
CN101310012B (zh) | 2005-10-14 | 2012-05-09 | 明尼苏达大学董事会 | 非胚胎干细胞分化成具有胰腺表型的细胞 |
US7732202B2 (en) | 2005-10-21 | 2010-06-08 | International Stem Cell Corporation | Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells |
JP5404047B2 (ja) | 2005-10-27 | 2014-01-29 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | Pdx1発現背側及び腹側前腸内胚葉 |
EP2206724A1 (en) | 2005-12-13 | 2010-07-14 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor |
WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
SG10202109176RA (en) | 2006-02-23 | 2021-09-29 | Viacyte Inc | Compositions and methods useful for culturing differentiable cells |
US7695965B2 (en) * | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
CA2650812C (en) | 2006-04-28 | 2017-12-12 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
US8685730B2 (en) * | 2006-05-02 | 2014-04-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage |
US7964402B2 (en) | 2006-05-25 | 2011-06-21 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
AU2007254766A1 (en) | 2006-06-02 | 2007-12-13 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems |
CN101541953A (zh) | 2006-06-02 | 2009-09-23 | 佐治亚大学研究基金会 | 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织 |
US8415153B2 (en) | 2006-06-19 | 2013-04-09 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
CN100494359C (zh) | 2006-06-23 | 2009-06-03 | 中日友好医院 | 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法 |
US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
WO2008036447A2 (en) | 2006-06-26 | 2008-03-27 | Lifescan, Inc. | Pluripotent stem cell culture |
WO2008004990A2 (en) | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Es Cell International Pte Ltd | Method for stem cell culture and cells derived therefrom |
WO2008013664A2 (en) | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
DK3441459T3 (da) | 2006-08-02 | 2021-06-07 | Technion Res & Dev Foundation | Fremgangsmåder til ekspansion af embryonale stamceller i en suspensionskultur |
KR101331510B1 (ko) | 2006-08-30 | 2013-11-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
US20080091234A1 (en) | 2006-09-26 | 2008-04-17 | Kladakis Stephanie M | Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth |
KR101419965B1 (ko) | 2006-10-17 | 2014-07-16 | 스티펠 래버러토리즈, 인코포레이티드 | 탈라로졸 대사물 |
US20100323442A1 (en) | 2006-10-17 | 2010-12-23 | Emmanuel Edward Baetge | Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells |
JP5067949B2 (ja) | 2006-11-09 | 2012-11-07 | 独立行政法人国立国際医療研究センター | 霊長類動物胚性幹細胞の培養及び継代方法、並びにその分化誘導方法 |
US8217027B2 (en) | 2006-12-21 | 2012-07-10 | Abbott Laboratories | Sphingosine-1-phosphate receptor agonist and antagonist compounds |
WO2008086005A1 (en) | 2007-01-09 | 2008-07-17 | University Of South Florida | Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof |
US9175260B2 (en) | 2007-01-30 | 2015-11-03 | TheUniversity of Georgia Research Foundation, Inc. | Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (MMC) |
GB0703188D0 (en) | 2007-02-19 | 2007-03-28 | Roger Land Building | Large scale production of stem cells |
US20090053182A1 (en) | 2007-05-25 | 2009-02-26 | Medistem Laboratories, Inc. | Endometrial stem cells and methods of making and using same |
DK2173863T3 (en) | 2007-06-29 | 2019-01-21 | Fujifilm Cellular Dynamics Inc | Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture |
KR101732952B1 (ko) | 2007-07-01 | 2017-05-08 | 라이프스캔, 인코포레이티드 | 단일 다분화성 줄기 세포 배양 |
CN105176919A (zh) | 2007-07-18 | 2015-12-23 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
ES2648128T3 (es) | 2007-07-31 | 2017-12-28 | Lifescan, Inc. | Diferenciación de células madre pluripotentes usando células alimentadoras humanas |
AU2008291930B2 (en) | 2007-08-24 | 2014-04-17 | Slotervaart Participaties Bv | Compositions for the treatment of neoplastic diseases |
US20110151447A1 (en) | 2007-11-06 | 2011-06-23 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells |
CN101878298B (zh) | 2007-11-27 | 2017-08-15 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
SG154367A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-28 | Es Cell Int Pte Ltd | Method of differentiating stem cells |
WO2009096049A1 (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Kyoto University | 人工多能性幹細胞由来分化細胞 |
EP2250252A2 (en) | 2008-02-11 | 2010-11-17 | Cambridge Enterprise Limited | Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained |
CN105886459A (zh) | 2008-02-21 | 2016-08-24 | 詹森生物科技公司 | 用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物 |
JPWO2009110215A1 (ja) | 2008-03-03 | 2011-07-14 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 繊毛細胞の分化誘導方法 |
JP2011514169A (ja) | 2008-03-17 | 2011-05-06 | エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ | 幹細胞培養のためのマイクロキャリア |
RU2359030C1 (ru) | 2008-03-19 | 2009-06-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" | Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты) |
AU2008355123B2 (en) | 2008-04-21 | 2014-12-04 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
US8338170B2 (en) | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
US8728812B2 (en) | 2008-04-22 | 2014-05-20 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of PDX1+ pancreatic cells |
US7939322B2 (en) | 2008-04-24 | 2011-05-10 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
US20090298178A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
DK2993226T3 (da) | 2008-06-03 | 2021-02-22 | Viacyte Inc | Vækstfaktorer til fremstilling af en definitiv endoderm |
DE102008032236A1 (de) | 2008-06-30 | 2010-04-01 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential |
JP2011526784A (ja) | 2008-06-30 | 2011-10-20 | セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド | 多能性幹細胞の分化 |
KR101829310B1 (ko) | 2008-06-30 | 2018-02-14 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 만능 줄기 세포의 분화 |
US20100028307A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
WO2010022395A2 (en) | 2008-08-22 | 2010-02-25 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of reprogramming cells |
ES2634445T3 (es) | 2008-10-31 | 2017-09-27 | Janssen Biotech, Inc. | Diferenciación de las células madre embrionarias humanas con el linaje endocrino pancreático |
EP2350265B1 (en) | 2008-10-31 | 2019-04-17 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
NZ592622A (en) | 2008-11-04 | 2012-10-26 | Viacyte Inc | Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof |
US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
CN105349517B (zh) | 2008-11-14 | 2021-05-04 | 维赛特公司 | 源于人多能干细胞的胰腺细胞的包封 |
US20100124781A1 (en) | 2008-11-20 | 2010-05-20 | Shelley Nelson | Pluripotent Stem Cell Culture on Micro-Carriers |
EP2356218B1 (en) | 2008-12-05 | 2017-05-03 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells |
CN102482640B (zh) | 2009-07-20 | 2015-03-11 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
CN102597219B (zh) | 2009-07-20 | 2015-08-19 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
RU2579278C2 (ru) | 2009-07-20 | 2016-04-10 | Янссен Байотек, Инк. | Популяция панкреатических эндокринных клеток-предшественников для снижения концентрации глюкозы в крови и способ дифференцировки панкреатических эндодермальных клеток |
ES2590036T3 (es) | 2009-08-12 | 2016-11-17 | Kyoto University | Método para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en células precursoras neurales |
JP5957382B2 (ja) | 2009-10-29 | 2016-07-27 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 多能性幹細胞 |
JP6276918B2 (ja) | 2009-11-12 | 2018-02-07 | テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド | 多能性幹細胞を未分化状態で培養する培地、細胞培養および方法 |
FI20096288A0 (fi) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | Kristiina Rajala | Formulations and methods for culturing stem cells |
EP2516626B1 (en) | 2009-12-23 | 2017-05-10 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US8932853B2 (en) | 2009-12-29 | 2015-01-13 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Method for manufacturing pancreatic-hormone-producing cells |
EP2532741B1 (en) | 2010-02-03 | 2018-04-04 | Tetsuya Ishikawa | Induced hepatic stem cell and process for production thereof, and applications of the cell |
SG10201501513TA (en) | 2010-03-02 | 2015-04-29 | Univ Singapore | Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response |
AU2011235212B2 (en) | 2010-03-31 | 2014-07-31 | The Scripps Research Institute | Reprogramming cells |
US9234170B2 (en) | 2010-04-25 | 2016-01-12 | Mount Sinai School Of Medicine | Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells |
US8932857B2 (en) | 2010-06-15 | 2015-01-13 | Kyoto University | Method for selecting reduced differentiation resistance human induced pluripotent stem cells |
US9085757B2 (en) | 2010-06-17 | 2015-07-21 | Regents Of The University Of Minnesota | Production of insulin producing cells |
DK2601288T3 (en) | 2010-08-05 | 2016-05-30 | Wisconsin Alumni Res Found | Simplified base media for human pluripotent cell culture |
CA2809305C (en) | 2010-08-31 | 2019-06-11 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
MY177150A (en) | 2011-02-28 | 2020-09-08 | Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd | Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof |
WO2013055834A2 (en) | 2011-10-11 | 2013-04-18 | The New York Stem Cell Foundation | Er stress relievers in beta cell protection |
WO2013056072A1 (en) | 2011-10-13 | 2013-04-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells |
US9670463B2 (en) | 2011-10-14 | 2017-06-06 | Children's Medical Center Corporation | Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes |
RU2705001C2 (ru) | 2011-12-22 | 2019-11-01 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки |
US10519422B2 (en) | 2012-02-29 | 2019-12-31 | Riken | Method of producing human retinal pigment epithelial cells |
AU2013271581B2 (en) | 2012-06-08 | 2018-08-09 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells |
EP2893000B1 (en) | 2012-09-03 | 2019-04-10 | Novo Nordisk A/S | Generation of pancreatic endoderm from pluripotent stem cells using small molecules |
BR112015015701A2 (pt) | 2012-12-31 | 2017-07-11 | Janssen Biotech Inc | diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células pancreáticas endócrinas com o uso de reguladores hb9 |
US8987471B2 (en) | 2013-02-14 | 2015-03-24 | Allergan, Inc. | Substituted dihydropyrazoles as sphingosine receptor modulators |
US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
CA2906643A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-25 | The Jackson Laboratory | Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof |
-
2013
- 2013-12-18 WO PCT/US2013/075939 patent/WO2014105543A1/en active Application Filing
- 2013-12-18 US US13/998,884 patent/US10344264B2/en active Active
- 2013-12-18 CA CA2896655A patent/CA2896655C/en active Active
- 2013-12-18 CN CN201380074040.4A patent/CN105008518B/zh active Active
- 2013-12-18 SG SG10201709338RA patent/SG10201709338RA/en unknown
- 2013-12-18 AU AU2013368221A patent/AU2013368221B2/en active Active
- 2013-12-18 ES ES13869259T patent/ES2837763T3/es active Active
- 2013-12-18 RU RU2018116648A patent/RU2768963C2/ru active
- 2013-12-18 BR BR112015015770A patent/BR112015015770A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-12-18 KR KR1020157020562A patent/KR102084561B1/ko active IP Right Grant
- 2013-12-18 RU RU2018116647A patent/RU2018116647A/ru unknown
- 2013-12-18 JP JP2015550478A patent/JP6557146B2/ja active Active
- 2013-12-18 EP EP13869259.5A patent/EP2938724B1/en active Active
- 2013-12-18 RU RU2015131835A patent/RU2658488C2/ru active
- 2013-12-18 DK DK13869259.5T patent/DK2938724T3/da active
- 2013-12-18 SG SG11201505128SA patent/SG11201505128SA/en unknown
- 2013-12-18 MX MX2015008577A patent/MX2015008577A/es unknown
-
2014
- 2014-01-03 AR ARP140100011A patent/AR094347A1/es unknown
-
2015
- 2015-06-25 PH PH12015501465A patent/PH12015501465A1/en unknown
-
2016
- 2016-05-04 HK HK16105105.3A patent/HK1217110A1/zh unknown
-
2018
- 2018-12-14 AU AU2018279009A patent/AU2018279009B2/en active Active
-
2021
- 2021-10-09 AU AU2021245259A patent/AU2021245259B2/en active Active
-
2023
- 2023-12-19 AU AU2023285724A patent/AU2023285724A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006075022A (ja) * | 2004-09-07 | 2006-03-23 | Foundation For Biomedical Research & Innovation | 膵臓ホルモン産生細胞取得方法 |
JP2011172586A (ja) * | 2005-10-05 | 2011-09-08 | Osaka Univ | 脂肪組織由来細胞の調製方法 |
JP2009528066A (ja) * | 2006-03-02 | 2009-08-06 | サイセラ,インコーポレイテッド | 内分泌前駆細胞、膵臓ホルモン発現細胞及びそれらの製造方法 |
JP2009535058A (ja) * | 2006-05-02 | 2009-10-01 | ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 幹細胞の内胚葉細胞および膵臓系列細胞への分化方法 |
JP2010535036A (ja) * | 2007-07-31 | 2010-11-18 | ライフスキャン・インコーポレイテッド | ヒト胚性幹細胞の分化 |
US20110151560A1 (en) * | 2009-12-23 | 2011-06-23 | Jean Xu | Differentiation of human embryonic stem cells |
US20110281355A1 (en) * | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of Human Embryonic Stem Cells |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
AM. J. PHYSIOL. LUNG CELL MOL. PHYSIOL., 2011, VOL.300, L25-L31, JPN6017044251, ISSN: 0003683302 * |
DIABETES, 2012.08, VOL.61, PP.2016-2029, JPN6017042162, ISSN: 0003683304 * |
J. INVEST. DERMATOL., 1983, VOL.81, 28S-33S, JPN6017044252, ISSN: 0003683303 * |
JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY, 2005, VOL.204, PP.286-296, JPN6017042164, ISSN: 0003683306 * |
NATURE BIOTECHNOLOGY, 2006, VOL.24, NO.11, PP.1392-1401, JPN6017042160, ISSN: 0003683305 * |
RESPIRATORY RESEARCH, 2009, VOL.10, 105, JPN6017044250, ISSN: 0003683301 * |
日本内科学会雑誌, 2012.04.10, VOL.101, NO.4, P.1000-1006, JPN6018035941, ISSN: 0003878129 * |
Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11078463B2 (en) | 2013-06-11 | 2021-08-03 | President And Fellows Of Harvard College | SC-beta cells and compositions and methods for generating the same |
US11162078B2 (en) | 2013-06-11 | 2021-11-02 | President And Fellows Of Harvard College | SC-beta cells and compositions and methods for generating the same |
US11104883B2 (en) | 2013-06-11 | 2021-08-31 | President And Fellows Of Harvard College | SC-beta cells and compositions and methods for generating the same |
US10655106B2 (en) | 2013-06-11 | 2020-05-19 | President And Fellows Of Harvard College | SC-beta cells and compositions and methods for generating the same |
JP2016531087A (ja) * | 2013-06-11 | 2016-10-06 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | SC−β細胞及び組成物並びにその生成方法 |
US11085026B2 (en) | 2014-12-18 | 2021-08-10 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
US11085027B2 (en) | 2014-12-18 | 2021-08-10 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
US11085025B2 (en) | 2014-12-18 | 2021-08-10 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
US10927350B2 (en) | 2014-12-18 | 2021-02-23 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
US11155787B2 (en) | 2014-12-18 | 2021-10-26 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived beta cells and methods of use thereof |
JP2019518465A (ja) * | 2016-06-21 | 2019-07-04 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | グルコース依存性ミトコンドリア呼吸及び二相インスリン分泌応答を示すヒト多能性幹細胞由来の機能的ベータ細胞の生成 |
JP7044726B2 (ja) | 2016-06-21 | 2022-03-30 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | グルコース依存性ミトコンドリア呼吸及び二相インスリン分泌応答を示すヒト多能性幹細胞由来の機能的ベータ細胞の生成 |
WO2018038042A1 (ja) * | 2016-08-24 | 2018-03-01 | 学校法人慶應義塾 | ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用2dオルガノイド及びその使用 |
US11945795B2 (en) | 2017-11-15 | 2024-04-02 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Islet cell manufacturing compositions and methods of use |
US11466256B2 (en) | 2018-08-10 | 2022-10-11 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
US11525120B2 (en) | 2018-08-10 | 2022-12-13 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
US11999971B2 (en) | 2018-08-10 | 2024-06-04 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
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