ES2906998T3 - Suspensión y agrupación de células pluripotentes humanas para su diferenciación en células endocrinas pancreáticas - Google Patents

Suspensión y agrupación de células pluripotentes humanas para su diferenciación en células endocrinas pancreáticas Download PDF

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Abstract

Un método de producción de agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales y, opcionalmente, de diferenciación de las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales que comprende las etapas de: a. hacer crecer células madre pluripotentes en un cultivo adherente plano, b. expandir las células madre pluripotentes a agrupaciones de células agregadas, y c. transferir las agrupaciones de células madre pluripotentes desde el cultivo adherente plano hasta un cultivo en suspensión dinámico usando una enzima, en el que se forman las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales, en el que las agrupaciones de células pluripotentes se cultivan y expanden en el cultivo en suspensión dinámico sin perder la pluripotencia, y en el que el método opcionalmente comprende además diferenciar las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales.

Description

DESCRIPCIÓN
Suspensión y agrupación de células pluripotentes humanas para su diferenciación en células endocrinas pancreáticas
Campo de la invención
La presente invención se encuentra en el campo de la diferenciación celular, incluyendo la preparación de células madre embrionarias y otras células pluripotentes que mantienen la pluripotencia en agrupaciones de células agregadas para su diferenciación a células progenitoras del endodermo, células endocrinas pancreáticas, células del mesodermo o células del ectodermo. En un aspecto, la invención da a conocer un método para generar agrupaciones de células madre pluripotentes y mantenerlas en cultivo en suspensión para su diferenciación a endodermo pancreático, células precursoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas monohormonales.
Antecedentes
Los avances en la terapia de sustitución celular para la diabetes mellitus de tipo I y la escasez de islotes de Langerhans trasplantables han centrado el interés en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina, o células p, apropiadas para el injerto. Un enfoque es la generación de células p funcionales a partir de células madre pluripotentes, tales como células madre embrionarias.
En el desarrollo embrionario de los vertebrados, una célula pluripotente da lugar a un grupo de células que comprende tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. A partir del endodermo se desarrollarán tejidos tales como la tiroides, el timo, el páncreas, el intestino y el hígado, a través de una etapa intermedia. La etapa intermedia en este proceso es la formación del endodermo definitivo.
Al final de la gastrulación, el endodermo se divide en dominios anterior-posterior que pueden ser reconocidos por la expresión de un panel de factores que marcan de manera única las regiones anterior, media y posterior del endodermo. Por ejemplo, HHEX y SOX2 identifican la región anterior, mientras que CDX1, 2 y 4 identifican la región posterior del endodermo.
La migración del tejido del endodermo hace que éste se acerque a diferentes tejidos mesodérmicos que ayudan a la regionalización del tubo intestinal. Esto se consigue gracias a una plétora de factores secretados, tales como FGF, Wnt, TGF-p, ácido retinoico (“RA”) y ligandos de BMP y sus antagonistas. Por ejemplo, se ha informado de que FGF4 y BMP fomentan la expresión de CDX2 en el presunto endodermo del intestino posterior y reprimen la expresión de los genes anteriores HHEX y SOX2 (2000 Development, 127:1563-1567). También se ha demostrado que la señalización de WNT funciona en paralelo a la de FGF para fomentar el desarrollo del intestino posterior e inhibir el destino del intestino anterior (2007 Development, 134:2207-2217). Por último, el ácido retinoico secretado por el mesénquima regula el límite entre el intestino anterior y el posterior (2002 Curr Biol, 12:1215-1220).
El nivel de expresión de factores de transcripción específicos puede usarse para designar la identidad de un tejido. Durante la transformación del endodermo definitivo en un tubo intestinal primitivo, el tubo intestinal se regionaliza en amplios dominios que pueden observarse a nivel molecular mediante patrones de expresión génica restringidos. Por ejemplo, el dominio del páncreas regionalizado en el tubo intestinal muestra una expresión muy alta de PDX1 y una expresión muy baja de CDX2 y SOX2. PDX1, NKX6.1, PTF1A y NKX2.2 se expresan altamente en el tejido pancreático; y la expresión de c DX2 es alta en el tejido intestinal.
La formación del páncreas surge de la diferenciación del endodermo definitivo en endodermo pancreático. Los dominios pancreáticos dorsal y ventral surgen del epitelio del intestino anterior. El intestino anterior también da lugar al esófago, la tráquea, los pulmones, la tiroides, el estómago, el hígado, el páncreas y el sistema de vías biliares. Las células del endodermo pancreático expresan el gen de homeosecuencia pancreático-duodenal PDX1. En ausencia de PDX1, el páncreas no se desarrolla más allá de la formación de yemas ventrales y dorsales. Por tanto, la expresión de PDX1 marca una etapa crítica en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene tanto tejido exocrino como tejido endocrino que surgen de la diferenciación del endodermo pancreático.
D'Amour et al. describen la producción de cultivos enriquecidos de endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas en presencia de una concentración alta de activina y baja de suero (Nature Biotechnol 2005, 23:1534-1541; patente estadounidense n.° 7.704.738). Según se informa, el trasplante de estas células debajo de la cápsula renal de ratones dio como resultado la diferenciación en células más maduras con características de tejido endodérmico (patente estadounidense n.° 7.704.738). Las células del endodermo definitivo derivadas de células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse adicionalmente en células positivas para PDX1 después de la adición de FGF10 y ácido retinoico (publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0266554A1). El posterior trasplante de estas células precursoras pancreáticas en la almohadilla de grasa de ratones inmunodeficientes dio como resultado la formación de células endocrinas pancreáticas funcionales tras una fase de maduración de 3-4 meses (patente estadounidense n.° 7.993.920 y patente estadounidense n.° 7.534.608).
Fisk et al. informan de un sistema para producir células de islotes pancreáticos a partir de células madre embrionarias humanas (patente estadounidense n.° 7.033.831). También se han usado inhibidores de molécula pequeña para la inducción de células precursoras endocrinas pancreáticas. Por ejemplo, se han usado inhibidores de molécula pequeña del receptor de TGF-p y de los receptores de BMP (Development 2011, 138:861-871; Diabetes 2011, 60:239-247) para aumentar significativamente el número de células endocrinas pancreáticas. Además, también se han usado activadores de molécula pequeña para generar células del endodermo definitivo o células precursoras pancreáticas (Curr Opin Cell Biol 2009, 21:727-732; Nature Chem Biol 2009, 5:258-265).
Se han hecho grandes avances en la mejora de los protocolos para cultivar células progenitoras, tales como células madre pluripotentes. La publicación PCT n.° WO2007/026353 (Amit et al.) da a conocer el mantenimiento de células madre embrionarias humanas en un estado indiferenciado en un sistema de cultivo bidimensional. Ludwig et al., 2006 (Nature Biotechnology, 24: 185-7) dan a conocer un medio definido por TeSR1 para cultivar células madre embrionarias humanas sobre una matriz. La publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0155013 (Akaike et al.) da a conocer un método para hacer crecer células madre pluripotentes en suspensión usando un portador que se adhiere a las células madre pluripotentes, y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0029462 (Beardsley et al.) da a conocer métodos de expansión de células madre pluripotentes en suspensión usando microportadores o encapsulación celular. La publicación PCT n.° WO 2008/015682 (Amit et al.) da a conocer un método de expansión y mantenimiento de células madre embrionarias humanas en un cultivo en suspensión en condiciones de cultivo desprovistas de adherencia al sustrato. Chen V C et al., Stem Cell Research 2012, 8(3):388-402, mayo de 2012, enseñan la expansión de células madre pluripotentes disociadas en cultivo dinámico.
La publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2008/0159994 (Mantalaris et al.) da a conocer un método de cultivo de células madre embrionarias humanas encapsuladas dentro de perlas de alginato en un sistema de cultivo tridimensional.
A pesar de estos avances, sigue existiendo la necesidad de un método para cultivar con éxito células madre pluripotentes en un sistema de cultivo tridimensional que puedan diferenciarse a células endocrinas funcionales. Breve descripción de los dibujos
El sumario anterior, así como la siguiente descripción detallada de la invención, se entenderán mejor cuando se lean junto con las figuras adjuntas que ilustran adicionalmente la invención. Sin embargo, debe entenderse que la invención no se limita a las disposiciones, a los ejemplos ni a los instrumentos precisos mostrados.
La figura 1a muestra micrografías de las células tratadas con Dispase™ de la línea de células madre embrionarias humanas (“hES”) H1 inmediatamente después del levantamiento (panel izquierdo) y después de 24 horas en cultivo estático no adherente (panel derecho) según el ejemplo 1. Las células después del levantamiento (panel izquierdo) parecían fragmentos de monocapa con un diámetro de fragmento promedio de aproximadamente 20-30 micrómetros, consistiendo cada fragmento en grupos de células. Después de 24 horas en cultivo estático no adherente, las células adoptaron una configuración de tipo agrupación.
La figura 1b muestra los resultados de citometría de flujo para CD9, SSEA4, CXCR4, TRA-1-60 y TRA-1-81 de células tratadas con Dispase™ de la línea de células madre embrionarias humanas H1 después del cultivo durante 4 días en un frasco centrifugador de 125 ml que contenía 25 ml de medio mTeSR1 según el ejemplo 1. Las células mostraron una alta expresión para los marcadores de pluripotencia (CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81) con prácticamente ninguna expresión de CXCR4, un marcador de diferenciación.
La figura 1c muestra micrografías de las células tratadas con Dispase™ de la línea de células madre embrionarias humanas H1 después de 72 y 96 horas de diferenciación al final de la etapa 1. En la figura 1c se observan agregados celulares sueltos después de 72 horas con un aumento de 4* (panel izquierdo), 96 horas con un aumento de 4* (panel central) y 96 horas con un aumento de 10* (panel derecho).
La figura 1d muestra los resultados de citometría de flujo de células tratadas con Dispase™ de la línea de células madre embrionarias humanas H1 al final de la etapa 1 de diferenciación para los marcadores CD9, CD184 (CXCR4) y CD99 (véase el ejemplo 1). Tal como se muestra en la figura 1d, prácticamente se eliminó la expresión de CD9, un marcador de pluripotencia, mientras que la expresión para los marcadores de diferenciación del endodermo definitivo CXCR4 (Cd 184) y CD99 fue bastante alta.
La figura 1e muestra los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) para la expresión de genes seleccionados asociados con la pluripotencia y genes asociados con el endodermo definitivo para las células tratadas con Dispase™ de la línea de células madre embrionarias humanas H1 al final de la etapa 1 en comparación con las células hES H1 (WA01) indiferenciadas (véase el ejemplo 1). Las células al final de la etapa 1 mostraron una drástica disminución en la expresión de los genes de pluripotencia (CD9, NANOG y POU5F1/OCT4) y un gran aumento en los genes asociados con el endodermo definitivo (CXCR4, CERBERUS (CER1), GSC, FOXA2, GATA4, GATA6, MNX1 y SOX17) frente a células hES WA01 indiferenciadas.
La figura 1f muestra micrografías de las células tratadas con Dispase™ de la línea de células madre embrionarias humanas H1 a medida que las células se diferencian adicionalmente desde el endodermo definitivo hacia el endodermo pancreático (véase el ejemplo 1). Se observan claros cambios morfológicos en las células y en las agrupaciones de células a medida que avanza la diferenciación desde el día 1 de la etapa 2 (panel superior izquierdo) hasta el día 3 de la etapa 2 (panel superior derecho) hasta el día 4 de la etapa 3 (panel inferior izquierdo) y hasta el día 1 de la etapa 4 (panel inferior derecho).
La figura 2a muestra los datos de citometría de flujo de las células tratadas con EDTA de la línea de células madre embrionarias humanas H1 después de 2 días de cultivo en suspensión con agitación tras el tratamiento con EDTA, y antes de la transición al cultivo de diferenciación, para los marcadores asociados con la pluripotencia y la diferenciación según el ejemplo 2. Los datos mostraron una alta expresión para los marcadores de pluripotencia (CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TrA-1-81) con prácticamente ninguna expresión de un marcador de diferenciación (CXCR4).
La figura 2b muestra micrografías de las células tratadas con EDTA de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas en células del día 3 de la etapa 1 que se hicieron crecer en un frasco centrifugador, y células del día 2 de la etapa 2, del día 1 de la etapa 4 y del día 3 de la etapa 4 que se hicieron crecer en frascos centrifugadores o matraces de Erlenmeyer según el ejemplo 2. Los cultivos diferenciados en suspensión formaron poblaciones de células sustancialmente uniformes y homogéneas en agregados esféricos.
La figura 2c muestra los datos de citometría de flujo de las células tratadas con EDTA de la línea de células madre embrionarias humanas H1 al final de la etapa 1 para los marcadores de superficie celular de pluripotencia y diferenciación del endodermo. Tal como puede observarse en la figura 2c, prácticamente se eliminó la expresión de CD9, un marcador de pluripotencia, mientras que la expresión de CXCR4 (CD184), un marcador de diferenciación del endodermo definitivo, fue bastante alta.
La figura 2d muestra los resultados de la qRT-PCR para la expresión de genes seleccionados asociados con la pluripotencia y genes asociados con el endodermo definitivo para las células tratadas con EDTA de la línea de células madre embrionarias humanas H1 al final de la etapa 1 en comparación con las células hES H1 (WA01) indiferenciadas (véase el ejemplo 2). La figura 2d muestra una disminución en la expresión de los genes de pluripotencia (CD9, Nanog y POU5F1/OCT4) y un gran aumento en los genes asociados con el endodermo definitivo (CXCR4, CERBERUS (“CER1”), FOXA2, GATA4, GATA6, MNX1 y SOX17).
La figura 2e muestra los datos de citometría de flujo para marcadores indicativos de diferenciación (NKX6.1, CDX2, SOX2 y cromagranina) para las células tratadas con EDTA de la línea de células madre embrionarias humanas H1 que se diferenciaron desde la etapa 1 a células del endodermo pancreático mediante suspensión en frascos centrifugadores o matraces de Erlenmeyer según el ejemplo 2. Los datos de citometría de flujo muestran altos niveles de NKX6.1, un factor de transcripción necesario para las células p funcionales, y altos niveles de marcadores pancreáticos endocrinos tales como sinaptofisina (datos no mostrados) y cromogranina, con ambos formatos en suspensión.
La figura 2f muestra los resultados de la qRT-PCR para la expresión de genes seleccionados asociados con la diferenciación para las células tratadas con EDTA de la línea de células madre embrionarias humanas H1 que se diferenciaron adicionalmente desde la etapa 1 a células del endodermo pancreático mediante la suspensión en frascos centrifugadores o matraces de Erlenmeyer según el ejemplo 2. Los datos se comparan con la expresión en las células hES WA01. Los resultados de la RT-PCR muestran altos niveles de expresión de genes precursores pancreáticos.
La figura 3a muestra una micrografía de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, que se habían levantado de un cultivo estático tras el tratamiento con Accutase™. Tal como se muestra en la figura 3a, las células se retiraron de la superficie como pequeños agregados.
La figura 3b muestra micrografías de contraste de fases de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, que se habían levantado de un cultivo estático tras el tratamiento con Accutase™ y que luego se expandieron en cultivo en suspensión durante tres días. En la figura 3b se observa la formación de una población de agrupaciones de células sustancialmente uniforme y esférica.
La figura 3c muestra una micrografía de agrupaciones de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, que se habían levantado de un cultivo estático tras el tratamiento con Accutase™, que luego se expandieron en cultivo en suspensión durante tres días y que luego se hicieron pasar en serie usando la disociación Accutase™.
La figura 4a muestra micrografías de células madre embrionarias humanas cultivadas en suspensión de la línea celular H1 usando un protocolo de diferenciación dirigida en diferentes etapas de diferenciación. En la figura 4a pueden observarse micrografías de las células en cada etapa de diferenciación.
La figura 4b muestra los resultados de citometría de flujo para los marcadores de diferenciación (CXCR4, CD56 y PDX1) para las células madre embrionarias humanas cultivadas en suspensión de la línea celular H1 usando un protocolo de diferenciación dirigida en diferentes etapas de diferenciación (horas después de comenzar la diferenciación). Al final del proceso de diferenciación, en el día 4 de la etapa 4, un alto porcentaje de las células eran positivas para la expresión de PDX1.
La figura 4c muestra la glucemia posprandial de ratones SCID-Bg trasplantados con células diferenciadas encapsuladas en un dispositivo TheraCyte.
La figura 5a muestra los datos de citometría de flujo de las células tratadas con EDTA de la línea de células madre embrionarias humanas H1 antes de la transición al cultivo de diferenciación para los marcadores asociados con la pluripotencia y la diferenciación. Tal como se muestra en la figura 5a, se observó una alta expresión de los marcadores de pluripotencia CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-80.
La figura 5b muestra imágenes de contraste de fases de las células y datos de citometría de flujo para CXCR4/CD184 y CD99 (marcadores de diferenciación) y CD9 (un marcador de pluripotencia) para tres configuraciones de alimentación diferentes durante la etapa 1. Las condiciones sometidas a prueba fueron las siguientes: (A) cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación, sin cambio del medio a las 48 horas; (B) cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación y adición de un bolo de glucosa a las 48 horas; y (C) sin cambio del medio durante la etapa 1 con adición de un bolo de glucosa y GDF824 horas después del inicio de la diferenciación y luego adición de un bolo de glucosa a las 48 horas tras el inicio.
La figura 5c muestra imágenes de contraste de fases de las células diferenciadas que muestran morfología del endodermo pancreático, que se diferenciaron usando los siguientes ajustes de alimentación durante la formación del endodermo definitivo: (A) cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación, sin cambio del medio a las 48 horas; (B) cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación y adición de un bolo de glucosa a las 48 horas; y (C) sin cambio del medio durante la etapa 1 con adición de un bolo de glucosa y GDF824 horas después del inicio de la diferenciación y luego adición de un bolo de glucosa a las 48 horas tras el inicio.
La figura 5d muestra los resultados de citometría de flujo para marcadores de expresión de genes pancreáticos seleccionados (NKX6.1 y cromogranina) y genes no pancreáticos seleccionados (CDX2 y SOX2) para las células diferenciadas al final de la etapa 4, que se diferenciaron usando los siguientes ajustes de alimentación durante la formación del endodermo definitivo: (A) cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación, sin cambio del medio a las 48 horas; (B) cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación y adición de un bolo de glucosa a las 48 horas; y (C) sin cambio del medio durante la etapa 1 con adición de un bolo de glucosa y GDF8 24 horas después del inicio de la diferenciación y luego adición de un bolo de glucosa a las 48 horas tras el inicio.
Las figuras 5e1, 5e2, 5e3 y 5e4 muestran los resultados de la qRT-PCR para la expresión de genes pancreáticos y no pancreáticos seleccionados para las células diferenciadas al final de la etapa 4, que se diferenciaron usando los siguientes ajustes de alimentación durante la formación del endodermo definitivo: (A) cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación, sin cambio del medio a las 48 horas; (B) cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación y adición de un bolo de glucosa a las 48 horas; y (C) sin cambio del medio durante la etapa 1 con adición de un bolo de glucosa y GDF8 a las 24 horas después del inicio de la diferenciación y luego adición de un bolo de glucosa a las 48 horas tras el inicio. Los datos se muestran como diferencia de expresión en veces frente a células hES H1 (WA01) indiferenciadas (expresión de nivel inicial de 1). La figura 5f muestra la expresión del péptido C en ratones SCID-Bg a los que se les implantaron células diferenciadas según la condición A (cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación, sin cambio del medio a las 48 horas). A cada ratón SCID-Bg se le implantaron 5 millones de células debajo de la cápsula renal. Tal como se muestra en la figura 5f, a las 12 semanas tras la implantación, el péptido c humano era detectable a niveles superiores a 1 ng/ml, y a las 16 semanas los niveles de péptido c eran un promedio de 2,5 ng/ml.
La figura 5g muestra el efecto del tratamiento con glucosa para ratones SCID-Bg seleccionados antes y después de la administración (por ejemplo, la implantación) de células diferenciadas según la condición A (cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación, sin cambio del medio a las 48 horas). Tal como se muestra en la figura 5g, el tratamiento con glucosa indujo un aumento significativo del péptido c humano circulante desde un promedio de 0,93 ng/ml en ayunas hasta 2,39 ng/ml en estado posprandial.
La figura 5h muestra el efecto de la administración de estreptozotocina (STZ) (es decir, diabetes inducida por STZ) sobre los ratones SCID-Bg a los que se les habían administrado células diferenciadas según la condición A (cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación, sin cambio del medio a las 48 horas). Tal como se observa en la figura 5h, los animales con un injerto de tejido funcional competente en GSIS (es decir, aquellos a los que se les habían administrado las células) mantuvieron una glucemia normal, a diferencia de los controles no tratados que desarrollaron una diabetes franca.
La figura 6a muestra micrografías de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 que se hicieron crecer en perlas microportadoras Cytodex® 3 antes de la diferenciación.
La figura 6b muestra micrografías de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 que se hicieron crecer en perlas microportadoras Cytodex® 3 en diversas etapas de la diferenciación.
La figura 6c muestra el recuento celular (células/cm2) en función de los días de diferenciación para las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 que se hicieron crecer y diferenciaron sobre placas en medios que contenían activina A (AA) y WNT3A (placa de WTN3A/AA), microportadores en medios que contenían activina A y WNT3A (microportadores de WTN3A/AA), placas en medios que contenían MCX y GDF8 (placa de MCX/GDF8) y microportadores en medios que contenían MCX y GDF8 (microportadores de MCX/GDF8).
La figura 6d muestra el recuento celular (células/ml) en función de los días de diferenciación para las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 que se hicieron crecer y diferenciaron sobre placas en medios que contenían activina A y WNT3A (placa de WTN3A/AA), microportadores en medios que contenían activina A y WNT3A (microportador de WTN3A/AA), placas en medios que contenían MCX y GDF8 (placa de MCX/GDF8) y microportadores en medios que contenían MCX y GDF8 (microportadores de MCX/GDF8).
La figura 6e muestra los resultados de citometría de flujo para la primera etapa de diferenciación de las células que se hicieron crecer en un cultivo de microportadores o en un cultivo plano en presencia de: (a) WNT3A y AA; o (2) MCX y GDF8 como un gráfico de puntos de la expresión celular de CXCR4/CD184 (eje Y) y CD9 (eje X).
La figura 6f muestra los resultados de citometría de flujo para la primera etapa de diferenciación de las células que se hicieron crecer en un cultivo de microportadores o en un cultivo plano en presencia de: (a) WNT3A y AA; o (2) MCX y GDF8 como expresión total de cada uno de los marcadores (CXCR4 y CD9).
La figura 6g muestra los resultados de la qRT-PCR para la expresión de genes seleccionados asociados con la diferenciación para las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, que se diferenciaron mediante el crecimiento en cultivo plano o en perlas microportadoras en cultivo en suspensión en presencia de: (a) WNT3A y AA; o (2) MCX y GDF8.
La figura 7 muestra los recuentos celulares en diversas etapas de diferenciación en un biorreactor desde el día 1 de la etapa 1 hasta el día 3 de la etapa 4, para células diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. Los recuentos celulares se muestran como millones de células/ml tal como se determina mediante un citómetro basado en imágenes (NucleoCounter®).
La figura 8 muestra los niveles de pH promedio diarios del medio del biorreactor en función del tiempo (días de diferenciación) durante el protocolo de diferenciación del ejemplo 7. Los niveles de pH se determinaron mediante un dispositivo NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical, Waltham, MA).
La figura 9 muestra los niveles de lactato promedio diarios del medio del biorreactor en función del tiempo (días de diferenciación) durante el protocolo de diferenciación del ejemplo 7. Los niveles de lactato se determinaron mediante un dispositivo NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical, Waltham, MA).
La figura 10 muestra los niveles de glucosa promedio diarios del medio del biorreactor en función del tiempo (días de diferenciación) durante el protocolo de diferenciación del ejemplo 7. Los niveles de glucosa se determinaron con un dispositivo NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical, Waltham, MA).
La figura 11 muestra la expresión génica indiferenciada, tal como se determina mediante qRT-PCR, para las células del día 1 de la etapa 0 (es decir, veinticuatro horas después de la inoculación) diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7 para la matriz de pluripotencia, que contiene genes seleccionados asociados con la pluripotencia.
La figura 12 muestra la expresión génica indiferenciada, tal como se determina mediante qRT-PCR, para las células del día 1 de la etapa 0 (es decir, veinticuatro horas después de la inoculación) para la matriz de endodermo definitivo (“ED”), que contiene genes seleccionados asociados con el endodermo definitivo (véase el ejemplo 7).
La figura 13 muestra la expresión génica indiferenciada, tal como se determina mediante qRT-PCR, para las células del día 3 de la etapa 0 (es decir, setenta y dos horas después de la inoculación) para la matriz de pluripotencia, que contiene genes seleccionados asociados con la pluripotencia (véase el ejemplo 7).
La figura 14 muestra la expresión génica indiferenciada, tal como se determina mediante qRT-PCR, para las células del día 3 de la etapa 0 (es decir, setenta y dos horas después de la inoculación) para la matriz de ED, que contiene genes seleccionados asociados con el ED (véase el ejemplo 7).
La figura 15 muestra los resultados de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para CD9, CD184/CXCR4, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81 para las células indiferenciadas del día 3 de la etapa 0 (es decir, setenta y dos horas después de la inoculación) (véase el ejemplo 7). Los resultados también se muestran en la tabla 8.
La figura 16 muestra la expresión génica indiferenciada, tal como se determina mediante qRT-PCR, para genes seleccionados de células del día 1 de la etapa 0 (es decir, veinticuatro horas después de la inoculación) y del día 3 de la etapa 0 (es decir, setenta y dos horas después de la inoculación) diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. Específicamente, la figura 16 muestra un modesto aumento en la expresión génica para GATA4, GSC, MIXL1 y T y un aumento >100* en la expresión de GATA2 durante el proceso de la etapa 0 antes de la diferenciación dirigida. La figura 17 muestra la expresión génica indiferenciada, tal como se determina mediante qRT-PCR, para la matriz de ED, que contiene genes seleccionados asociados con el ED, para células del día 1 de la etapa 0 (es decir, veinticuatro horas después de la inoculación) y del día 3 de la etapa 0 (es decir, setenta y dos horas después de la inoculación) diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. Específicamente, la figura 17 muestra un aumento >100* en la expresión de CER1, FGF17 y FGF4 durante el proceso de la etapa 0 antes de la diferenciación dirigida. Las figuras 18 y 19 muestran la expresión génica para las células del día 1 de la etapa 1 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. La figura 18 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para la matriz de pluripotencia, que contiene genes seleccionados asociados con la pluripotencia, para células del día 1 de la etapa 1. La figura 19 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para la matriz de ED, que contiene genes seleccionados asociados con el ED, para células del día 1 de la etapa 1. Las figuras 18 y 19 ilustran alteraciones significativas en los patrones de expresión génica, tales como un aumento de ~700* en la expresión de FOXA2 y un aumento de 1000* en la expresión de CER1, EOMES, FGF17, FGF4, GATA4, GATA6, GSC, MIXL1 y T.
Las figuras 20 y 21 muestran la expresión génica para las células del día 3 de la etapa 1 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. La figura 20 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para la matriz de pluripotencia, que contiene genes seleccionados asociados con la pluripotencia, para células del día 3 de la etapa 1. La figura 21 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para la matriz de ED, que contiene genes seleccionados asociados con el ED, para células del día 3 de la etapa 1.
La figura 22 muestra los resultados de FACS para CD9, CD184 (también conocido como CXCR4) y CD99 para células del día 3 de la etapa 1 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. Se observó una transición prácticamente completa desde una población de células pluripotentes que expresan CD9/negativas para CXCR4 al inicio de la diferenciación (figura 15) a una población homogénea de células que expresan CXCR4 (el 98,3% de células positivas para CXCR4, ± 1,9 de D.E.) al final de la etapa 1 (figura 22).
La figura 23 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para la matriz de ED, que contiene genes seleccionados asociados con el ED, para células del día 3 de la etapa 1; día 1 de la etapa 2; y día 3 de la etapa 2 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. La figura 23 muestra que aumentaron los niveles de expresión de HNF4a y GATA6 en los días 1 y 3 de la etapa 2, mientras que los genes expresados a altos niveles en el día 3 de la etapa 1 (CXCR4, EOMES, FGF17, FGF4, MNX1, PRDM1, SOX17 y VWF) mostraron una expresión reducida al final de la etapa 2.
La figura 24 muestra la expresión génica de los genes del intestino anterior AFP, PDX1 y PROX1, tal como se determina mediante qRT-PCR, para células del día 1 de la etapa 2 y células del día 3 de la etapa 2 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. Tal como se muestra en la figura 24, aumentó la expresión de estos genes.
La figura 25 muestra los resultados de FACS para PDX1, FOXA2, cromogranina, NKX2.2 y SOX2 para células del día 3 de la etapa 3 que se hicieron crecer en medio de la etapa 3 (tabla 7) diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. Tal como se muestra en la figura 25, las células expresaron marcadores compatibles con un linaje pancreático endodérmico tal como se mide mediante la expresión de PDX1 y FOXA2 (el 90,9% positivas para PDX1, ± 11,9 de D.E., y el 99,2% positivas para FOXA2, ± 0,6 de D.E.).
La figura 26 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para la matriz de la etapa 4, que contiene genes seleccionados asociados con la etapa 4, para células del día 1 de la etapa 3 y del día 3 de la etapa 3 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. La figura 26 ilustra que estas células muestran niveles aumentados de una serie de genes comúnmente expresados en el páncreas (ARX, GAST, GCG, INS, ISL1, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PAX6, PTF1A y SST).
La figura 27 muestra los resultados de FACS para NKX6.1, cromagranina (CHGA), CDX2, SOX2, NKX2.2, PDX1, FOXA2 y NEUROD para células del día 3 de la etapa 4 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. Tal como se muestra en la figura 27, en el día 3 de la etapa 4, las células mantuvieron altos niveles de expresión de PDX1 y FOXA2 y desarrollaron adicionalmente un patrón de expresión compatible con una mezcla de células endocrinas pancreáticas (el 28,1% positivas para cromogranina, ± 12,5 de D.E.) y células progenitoras pancreáticas (el 58,3% positivas para NKX6.1, ± 9,7 de D.E.).
La figura 28 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para la matriz de la etapa 4, que contiene genes seleccionados asociados con la etapa 4, para células del día 3 de la etapa 3; día 1 de la etapa 4; y día 3 de la etapa 4 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. La figura 28 muestra un aumento del nivel de expresión de genes comúnmente expresados en el páncreas (ARX, GAST, GCG, IAPP, INS, ISL1, MAFB, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PAX6, PTF1A y SST).
La figura 29 muestra los resultados de FACS promedio para NKX6.1, cromagranina (CHGA), CDX2, SOX2, NKX2.2, PDX1, FOXA2 y NEUROD para células del día 3 de la etapa 4 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7.
Específicamente, la figura 29 muestra el patrón de expresión por FACS promedio de los precursores pancreáticos generados a una escala de 3 l a partir de diferentes lotes de material de siembra.
La figura 30 muestra los resultados de FACS promedio para NKX6.1, cromagranina (CHGA), CDX2, SOX2, NKX2.2, PDX1, FOXA2 y NEUROD para células del día 3 de la etapa 4 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 7. Antes de la diferenciación en células del día 3 de la etapa 4, las células se expandieron para formar ISM y luego se hicieron crecer en la etapa 0 o bien en un medio interno personalizado “IH3” o bien Essential8™, ambos complementados con BSA al 2%. Las células que se hicieron crecer en el medio IH3 son las “células que se hicieron crecer IH3-P” y las células que se hicieron crecer en Essential8™ son las “células que se hicieron crecer EZ8”. No se observó ninguna diferencia significativa en los patrones de expresión entre las células que se hicieron crecer en los diferentes medios.
La figura 31 muestra los resultados de FACS promedio para NKX6.1, cromagranina (CHGA), CDX2, SOX2, NKX2.2, PDX1, FOXA2 y NEUROD para células del día 3 de la etapa 4 que se hicieron crecer previamente a diferentes niveles de pH en la etapa 0 (véase el ejemplo 7). No se observó ningún cambio significativo en el perfil de las células del día 3 de la etapa 4.
La figura 32 compara los resultados de FACS para NKX6.1, cromogranina (CHGA), CDX2, SOX2, NKX2.2, PDX1, FOXA2 y NEUROD para células del día 3 de la etapa 4 que no se trataron con antiespumante C y células del día 3 de la etapa 4 que se trataron con emulsión de antiespumante C (94 ppm) (véase el ejemplo 7). No se observó que la emulsión de antiespumante C (n.° de cat. de Sigma A8011) afectara al perfil de las células del día 3 de la etapa 4. Las figuras 33 a 35 muestran la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para genes seleccionados de células diferenciadas según el protocolo del ejemplo 8. La figura 33 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para genes seleccionados de células veinticuatro horas antes del inicio de la diferenciación (véase el ejemplo 8). Tal como se muestra en la figura 33, las células del biorreactor mantuvieron la expresión para los genes característicos de pluripotencia (POU5F1, NANOG, SOX2 y ZFP42) y mostraron una inducción mínima o nula de los genes característicos de diferenciación (AFP y FOXA2: aumento <50 veces; FOXD3, GATA2, GATA4, GSC, HAND2, MIXL1 y T: aumento <10 veces de la expresión). La figura 34 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para genes seleccionados de células veinticuatro horas después del inicio de la diferenciación. La figura 35 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para genes seleccionados de células setenta y dos horas después del inicio de la diferenciación.
Las figuras 36(a) a 36(e) muestran la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para genes seleccionados de células diferenciadas desde la etapa 2 hasta las etapas 3 y 4 según el protocolo del ejemplo 8. Específicamente, estas figuras muestran la expresión génica de las células en el día 1 de la etapa 2; día 2 de la etapa 2; día 3 de la etapa 2; día 3 de la etapa 3; y, dependiendo del gen, día 1 de la etapa 4. La figura 36(a) muestra la expresión génica de AFP, ATOH1 y CDX2. La figura 36(b) muestra la expresión génica de GAST, Ha Nd 1, HHEX y HNF4a. La figura 36(c) muestra la expresión génica de NKX2.2 , NKX6.1, OSR1 y PDX1. La figura 36(d) muestra la expresión génica de PROX1, PFT1a, SOX17 y SOX2. La figura 36(e) muestra la expresión génica de SOX9. Los datos se muestran como diferencia de expresión frente a células hES H1 (WA01) indiferenciadas (expresión de nivel inicial de 1).
La figura 37 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, para genes seleccionados de las células en el día 3 de la etapa 4 de diferenciación según el protocolo del ejemplo 8. Tal como se muestra en la figura 37, al final de la diferenciación en el día 3 de la etapa 3, las células se han diferenciado en células progenitoras pancreáticas caracterizadas por altos niveles de expresión de PDX1 (inducción >1*10® veces) y otros genes pancreáticos (inducción >1000 veces de ARX, GCG, GAST, INS, ISL, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PTF1a y SST) y una pérdida casi total de la expresión de OCT4/POU5F1 en comparación con las células madre embrionarias humanas H1 indiferenciadas.
La figura 38 muestra los recuentos celulares diarios durante el protocolo de diferenciación según el ejemplo 8. Específicamente, la figura 38 muestra la densidad celular en función del día de proceso. La figura 38 muestra los recuentos celulares para los protocolos de diferenciación de dos ejecuciones del reactor (PRD1205 y PRD1207) llevadas a cabo a pH 6,8 y 7,2. Para comparar, también se muestran los recuentos celulares para la deriva celular. La figura 39(a) a la figura 39(d) ilustran la bioactividad in vivo de las células del día 3 de la etapa 4, que se diferenciaron según el protocolo del ejemplo 8 y se implantaron en ratones SCID-Bg. Las células se implantaron por vía subcutánea a través de un dispositivo TheraCyte™, debajo de la cápsula renal, o se implantaron después de la incubación en una placa de fijación ultrabaja. Los ratones se monitorizaron en cuanto a la glucemia y los niveles de péptido C cada cuatro semanas tras la implantación del injerto. La figura 39(a) muestra los niveles de péptido C después de la implantación de 5 ó 10 millones de células del día 3 de la etapa 4 en un dispositivo TheraCyte™ en función del tiempo. La figura 39(b) muestra la glucemia posprandial en animales después de la implantación de 5 ó 10 millones de células del día 3 de la etapa 4 en un dispositivo TheraCyte™. Los ratones de la figura 39(b) se trataron con STZ para eliminar la función de las células p del huésped antes de la implantación. La figura 39(c) muestra el nivel de péptido C producido después de la implantación de células del día 3 de la etapa 4 previamente crioconservadas en un dispositivo TheraCyte™ en función del tiempo (semanas tras la implantación). La figura 39(d) compara los niveles de péptido C de ratones tratados con un injerto renal de células del día 3 de la etapa 4 nunca crioconservadas/recién preparadas o células del día 3 de la etapa 4 crioconservadas implantadas inmediatamente después de la descongelación (D0) o 1 día después de la descongelación (D1).
Las figuras 40A a 40D muestran gráficos de FACS para CXCR4, CD99 y CD9 de células diferenciadas durante tres días según el protocolo del ejemplo 9 que se trataron en el día 1 de la etapa 1 con: compuesto MCX y GDF-8 (figura 40A); MCX sólo (figura 40B); WNT3A y activina A (figura 40C); y WNT3A sólo (figura 40D). Estas figuras indican que, en el cultivo en suspensión, la adición de MCX 3 |iM en ausencia de un miembro de la familia de TGF-p en el primer día de diferenciación genera endodermo definitivo a niveles comparables con los obtenidos cuando las células se tratan con MCX 3 |iM más GDF-8 100 ng/ml o WNT-3A 20 ng/ml más activina A 100 ng/ml en el primer día.
Las figuras 41A a 41D muestran gráficos de FACS para CXCR4, CD99 y CD9 de células diferenciadas durante tres días según el protocolo del ejemplo 10, que se trataron con diversas cantidades de MCX en el día 1 de la etapa 1. Específicamente, las células en el día 1 de la etapa 1 se trataron con: MCX 4 |iM (figura 41A); MCX 3 |iM (figura 41B); MCX 2 |iM (figura 41C); y MCX 1,5 |iM (figura 41D).
La figura 42A y la figura 42B muestran gráficos de FACS para CXCR4, CD99 y CD9 de células diferenciadas durante tres días según el protocolo del ejemplo 11. Específicamente, estas figuras muestran el papel de la frecuencia de intercambio del medio en el cultivo en suspensión. La figura 42A muestra gráficos de FACS para CXCR4, CD99 y CD9 de células diferenciadas durante tres días según el protocolo del ejemplo 10 con intercambio completo del medio en la etapa 1. La figura 42B muestra gráficos de FACS para CXCR4, CD99 y CD9 de células diferenciadas durante tres días según el protocolo del ejemplo 10 sin ningún intercambio del medio en el día 3. Los datos sugieren que, en el sistema de cultivo en suspensión, los cultivos que reciben un intercambio del medio en el tercer día (figura 42A) de diferenciación dieron como resultado endodermo definitivo con una eficacia comparable a la de los cultivos que no recibieron ningún intercambio del medio en el tercer día (figura 42B).
La figura 43A y la figura 43B muestran gráficos de FACS para CXCR4, CD99 y CD9 de células diferenciadas durante tres días según el protocolo del ejemplo 12. Específicamente, estas figuras muestran el papel de Glutamax™ en el cultivo en suspensión. Las células se cultivaron en la etapa 1 en un medio complementado con 1* Glutamax™ (figura 43A) o sin Glutamax™ ni glutamina (Glutamax™ 0 M) (figura 43B). Los datos sugieren que, en el sistema de cultivo en suspensión, la adición de Glutamax™ no parece influir en la eficiencia con la que se genera el endodermo definitivo
Las figuras 44A a 44D muestran los efectos de diversas cantidades de bicarbonato de sodio sobre las células diferenciadas según el protocolo del ejemplo 13. La figura 44A y la figura 44B muestran gráficos de FACS para CXCR4, CD99 y CD9 de células diferenciadas durante tres días según el protocolo del ejemplo 13 con la adición o bien de 3,64 g/l (figura 44A) o bien de 2,49 g/l (figura 44B) en la etapa 1. La figura 44C y la figura 44D muestran micrografías de contraste de fases de células diferenciadas durante tres días según el protocolo del ejemplo 13 con la adición o bien de 3,64 g/l (figura 44C) o bien de 2,49 g/l (figura 44D) en la etapa 1.
La figura 45 muestra los recuentos celulares diarios de la densidad celular en función de la diferenciación para las células diferenciadas según el protocolo del ejemplo 14. Los recuentos celulares se obtuvieron usando un citómetro basado en imágenes (NucleoCounter®).
La figura 46 muestra los niveles de pH promedio diarios del medio del biorreactor en función del tiempo (días de diferenciación) durante el protocolo de diferenciación del ejemplo 14. Los niveles de pH se determinaron mediante un dispositivo NOVA BioProfile® FLEX(Nova Biomedical, Waltham, MA).
La figura 47 muestra los niveles de glucosa promedio diarios del medio del biorreactor en función del tiempo (días de diferenciación) durante el protocolo de diferenciación del ejemplo 14. Los niveles de glucosa se determinaron con un dispositivo NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical, Waltham, MA).
La figura 48 muestra los niveles de lactato promedio diarios del medio del biorreactor en función del tiempo (días de diferenciación) durante el protocolo de diferenciación del ejemplo 14. Los niveles de lactato se determinaron mediante un dispositivo No Va BioProfile® FLEX (Nova Biomedical, Waltham, MA).
La figura 49 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para la matriz de pluripotencia, que contiene genes seleccionados asociados con la pluripotencia, para células del día 1 a 3 de la etapa 0 y día 1 a día 3 de la etapa 1 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 14. La figura 50 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para la matriz de ED, que contiene genes seleccionados asociados con el ED, para células del día 1 a 3 de la etapa 0, día 1 a día 3 de la etapa 1 y día 1 a día 3 de la etapa 2 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 14.
La figura 51 muestra los resultados de FACS para marcadores asociados con la pluripotencia (CD184/CXCR4, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81) para células de la etapa 0 antes de diferenciarse según el protocolo del ejemplo 14.
Específicamente, la figura 51 muestra una alta expresión de marcadores asociados con la pluripotencia.
La figura 52 muestra gráficos de FACS para los marcadores de endodermo definitivo CXCR4, CD99 y CD9 de las células diferenciadas hasta el final de la etapa 1 según el protocolo del ejemplo 14.
La figura 53 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para GAPDH, AFP, HHEX, HNF4a, PDX1 y PROX1 para células del día 1 de la etapa 2; día 2 de la etapa 2; y día 3 de la etapa 2 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 14. La figura 53 muestra un aumento en la expresión de los genes del intestino anterior (AFP, HHEX, PDX1 y PROX1).
La figura 54 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para GAPDH, AFP, CDX2, GAST, HNF4A, NKX2.2, OSR1, PDX1 y PFT1A para células del día 1 a día 3 de la etapa 2 y del día 1 a día 3 de la etapa 3 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 14. Tal como se muestra en la figura 54, la expresión de PDX1 aumentó en 60 veces desde 12.000x con respecto al control al final del día 3 de la etapa 2 hasta 739.000x con respecto al control al final del día 3 de la etapa 3.
La figura 55 muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para determinados genes para células del día 1 a 3 de la etapa 3 y del día 1 a día 3 de la etapa 4 diferenciadas según el protocolo del ejemplo 14. Específicamente, el panel superior de la figura 55 muestra la expresión génica para GAPDH, AFP, ALB, ARX, CDX2, CHGA, GAST, GCG, IAAP, INS, ISL1 y MAFB. El panel inferior de la figura 55 muestra la expresión génica de MAFB, MUCS, NEUROD1, NEUROG3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PDX1, POUSF1, PTF1A, SST y ZlC1.
La figura 56 muestra micrografías de la etapa final para las células diferenciadas según el protocolo del ejemplo 14. En la figura 56 se observan micrografías representativas (4*) de agrupaciones de células en la etapa 0 y al final de la diferenciación de las etapas 1 a 4.
Las figuras 57 a 80 muestran la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para células diferenciadas según diversas realizaciones del protocolo del ejemplo 15 después de 0 horas, 6 horas, 24 horas, 30 horas, 48 horas y 72 horas de diferenciación para los siguientes genes: AFP (figura 57); CD99 (figura 58); CD9 (figura 59); CDH1 (figura 60); CDH2 (figura 61); CDX2 (figura 62); CER1 (figura 63); CXCR4 (figura 64); FGF17 (figura 65); FGF4 (figura 66); FOXA (figura 67); GADPH (figura 68); GATA4 (figura 69); GATA6 (figura 70); GSC (figura 71); KIT (figura 72); MIXL1 (figura 73); MNX1 (figura 74); NANOG (figura 75); OTX2 (figura 76); POUF5F1 (figura 77); SOX17 (figura 78); SOX7 (figura 79) y T (figura 80). La figura 81 muestra el porcentaje de células en G0/G1 del ciclo celular para células después de 6 horas, 24 horas, 30 horas, 48 horas y 72 horas de diferenciación según diversas realizaciones del protocolo del ejemplo 15. Específicamente, la figura 81 muestra los resultados para agrupaciones que se trataron en el primer día de diferenciación con una de seis condiciones: (1) puro, (2) MCX 3 |iM más GDF-8 100 ng/ml (n.° de catálogo 120-00, Peprotech), (3) MCX 3 |iM sólo, (4) GDF-8 100 ng/ml sólo, (5) WNT-3A 20 ng/ml (n.° de catálogo 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más activina A 100 ng/ml (n.° de catálogo 338-AC, R&D Systems, MN) o (6) WNT-3A 20 ng/ml sólo.
La figura 82 muestra los efectos del tratamiento con EDU sobre las agrupaciones de células diferenciadas según el protocolo del ejemplo 15. El panel izquierdo muestra el porcentaje de células en G2/M del ciclo celular para células después de 0 horas, 6 horas, 24 horas, 30 horas, 48 horas y 72 horas de diferenciación según diversas realizaciones del protocolo del ejemplo 15. Específicamente, el panel izquierdo muestra los resultados para las agrupaciones que se trataron en el primer día de diferenciación con una de seis condiciones: (1) puro, (2) MCX 3 |iM más GDF-8 100 ng/ml (n.° de catálogo 120-00, Peprotech), (3) MCX 3 |iM sólo, (4) GDF-8 100 ng/ml sólo, (5) WNT-3A 20 ng/ml (n.° de catálogo 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más activina A 100 ng/ml (n.° de catálogo 338-AC, R&D Systems, MN) o (6) WNT-3A 20 ng/ml sólo. En un conjunto de datos, estas agrupaciones también se trataron con EDU. El panel derecho de la figura 82 muestra el % de células que son positivas para EDU a las 0 horas, 6 horas, 24 horas, 30 horas, 48 horas y 72 horas de diferenciación según diversas realizaciones del protocolo del ejemplo 15.
La figura 83 muestra los parámetros operativos generales usados en los protocolos del ejemplo 15.
La figura 84 muestra la cantidad de incorporación de EDU de las células después de 6 horas, 24 horas, 30 horas, 48 horas y 72 horas de diferenciación según diversas realizaciones del protocolo del ejemplo 15. Específicamente, la figura 84 muestra los resultados para las agrupaciones de células incubadas con EDU que se trataron en el primer día de diferenciación con una de seis condiciones: (1) puro, (2) MCX 3 |iM más GDF-8 100 ng/ml (n.° de catálogo 120-00, Peprotech), (3) MCX 3 |iM sólo, (4) GDF-8 100 ng/ml sólo, (5) WNT-3A 20 ng/ml (n.° de catálogo 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más activina A 100 ng/ml (n.° de catálogo 338-AC, R&D Systems, MN) o (6) WNT-3A 20 ng/ml sólo.
La figura 85 muestra el porcentaje de células en G0/G1 del ciclo celular para células después de 6 horas, 24 horas, 30 horas, 48 horas y 72 horas de diferenciación según diversas realizaciones del protocolo del ejemplo 15. Específicamente, la figura 85 muestra los resultados para las agrupaciones que se trataron en el primer día de diferenciación con una de seis condiciones: (1) puro, (2) MCX 3 |iM más GDF-8 100 ng/ml (n.° de catálogo 120-00, Peprotech), (3) MCX 3 |iM sólo, (4) GDF-8 100 ng/ml sólo, (5) WNT-3A 20 ng/ml (n.° de catálogo 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más activina A 100 ng/ml (n.° de catálogo 338-AC, R&D Systems, MN) o (6) WNT-3A 20 ng/ml sólo.
La figura 86 muestra el porcentaje de células en fase S del ciclo celular para células después de 6 horas, 24 horas, 30 horas, 48 horas y 72 horas de diferenciación según diversas realizaciones del protocolo del ejemplo 15. Específicamente, la figura 86 muestra los resultados para las agrupaciones que se trataron en el primer día de diferenciación con una de seis condiciones: (1) puro, (2) MCX 3 |iM más GDF-8 100 ng/ml (n.° de catálogo 120-00, Peprotech), (3) MCX 3 |iM sólo, (4) GDF-8 100 ng/ml sólo, (5) WNT-3A 20 ng/ml (n.° de catálogo 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más activina A 100 ng/ml (n.° de catálogo 338-AC, R&D Systems, MN) o (6) WNT-3A 20 ng/ml sólo.
La figura 87 muestra el porcentaje de células en fase S del ciclo celular para células después de horas, 6 horas, 24 horas, 30 horas, 48 horas y 72 horas de diferenciación según diversas realizaciones del protocolo del ejemplo 15. Específicamente, la figura 87 muestra los resultados para las agrupaciones que se trataron en el primer día de diferenciación con una de seis condiciones: (1) puro, (2) MCX 3 |iM más GDF-8 100 ng/ml (n.° de catálogo 120-00, Peprotech), (3) MCX 3 |iM sólo, (4) GDF-8 100 ng/ml sólo, (5) WNT-3A 20 ng/ml (n.° de catálogo 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más activina A 100 ng/ml (n.° de catálogo 338-AC, R&D Systems, MN) o (6) WNT-3A 20 ng/ml sólo.
Las figuras 88A a 88E muestran la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para células diferenciadas según diversas realizaciones del protocolo del ejemplo 15 después de 0 horas, 6 horas, 24 horas, 30 horas, 48 horas y 72 horas de diferenciación. La figura 88A muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para CD99, CD9, CDH1 y CDH2. La figura 88A muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para CXD2, CER1, CXCR4 y FGF17. La figura 88C muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para FGF4, FOXA, GATA4 y GATA6. La figura 88D muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para GSC, KIT, MIXL1 y MNX1. La figura 88E muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para NANOG, OTX2, POUF5F1 y SOX17. La figura 88F muestra la expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR como expresión en veces frente a células indiferenciadas, para SOX7 y T. Los datos subyacentes para las figuras 88A a 88F se muestran en las figuras 58 a 67 y 69 a 80.
La figura 89 muestra el patrón de expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, de células pluripotentes cultivadas en medio de diferenciación ectodérmica según el protocolo del ejemplo 16. Tal como se muestra en la figura 89, las células se diferenciaron hacia el linaje celular neural. Específicamente, el panel izquierdo de la figura 89 muestra el patrón de expresión génica para una línea de células madre pluripotentes inducidas generada a partir de células de tejido umbilical (UTC). El panel derecho de la figura 89 muestra el patrón de expresión génica para el subclón WB0106 de la línea de células hES H1.
La figura 90 muestra el patrón de expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, de células pluripotentes cultivadas en medio de diferenciación mesodérmica según el protocolo del ejemplo 16. Tal como se muestra en la figura 90, las células se diferenciaron hacia el linaje celular cardiaco. Específicamente, el panel izquierdo de la figura 90 muestra el patrón de expresión génica para una línea de células madre pluripotentes inducidas generada a partir de células de tejido umbilical (UTC). El panel derecho de la figura 90 muestra el patrón de expresión génica para el subclón WB0106 de la línea de células hES H1.
La figura 91 muestra el patrón de expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, de células pluripotentes cultivadas en medio de diferenciación ectodérmica según el protocolo del ejemplo 16. Tal como se muestra en la figura 91, las células se diferenciaron hacia el linaje celular neural. Específicamente, el panel izquierdo de la figura 91 muestra el patrón de expresión génica para una línea de células madre pluripotentes inducidas generada a partir de células de tejido umbilical (UTC). El panel derecho de la figura 91 muestra el patrón de expresión génica para el subclón WB0106 de la línea de células hES H1.
La figura 92 muestra el patrón de expresión de proteínas para PAX6, SOX2 y POU5F1/OCT4, tal como se determina mediante FACS, de células pluripotentes cultivadas durante tres días en medio de diferenciación ectodérmica según el protocolo del ejemplo 16. Especialmente, los paneles izquierdos de la figura 92 muestran el patrón de expresión para PAX6, SOX2 y POU5F1/OCT4 para una línea de células madre pluripotentes inducidas generada a partir de células de tejido umbilical (UTC). El panel derecho de la figura 92 muestra el patrón de expresión de proteínas para PAX6, SOX2 y POU5F1/OCT4 para el subclón WB0106 de la línea de células hES H1.
La figura 93 muestra el patrón de expresión génica, tal como se determina mediante qRT-PCR, de células pluripotentes cultivadas en medio de diferenciación mesodérmica según el protocolo del ejemplo 16. Tal como se muestra en la figura 93, las células se diferenciaron hacia el linaje celular cardiaco. Específicamente, el panel izquierdo de la figura 93 muestra el patrón de expresión génica para una línea de células madre pluripotentes inducidas generada a partir de células de tejido umbilical (UTC). El panel derecho de la figura 93 muestra el patrón de expresión génica para el subclón WB0106 de la línea de células hES H1.
La figura 94 muestra micrografías para células diferenciadas en medio de diferenciación mesodérmico según el protocolo del ejemplo 16. Tal como se muestra en la figura 94, las células se diferenciaron hacia el linaje celular cardiaco. Específicamente, los paneles de la izquierda de la figura 94 muestran micrografías de células del subclón WB0106 de la línea de células hES H1 en el día 3, el día 5 y el día 10 de diferenciación. El panel derecho de la figura 94 muestra una micrografía de la línea de células madre pluripotentes inducidas generadas a partir de células de tejido umbilical (UTC iPSC) después de 10 días de diferenciación.
La figura 95 muestra micrografías de células diferenciadas en medio de diferenciación ectodérmico según el protocolo del ejemplo 16. Tal como se muestra en la figura 95, las células se diferenciaron hacia el linaje celular neural. Específicamente, los paneles de la izquierda de la figura 95 muestran micrografías de células del subclón WB0106 de la línea de células hES H1 en el día 3, el día 5 y el día 10 de diferenciación. El panel derecho de la figura 95 muestra una micrografía de la línea de células madre pluripotentes inducidas generada a partir de células de tejido umbilical (UTC iPCS) después de 10 días de diferenciación.
Descripción detallada
Esta solicitud se refiere a la preparación de células madre embrionarias y otras células pluripotentes que mantienen la pluripotencia en la agrupación de células agregadas para su diferenciación a células progenitoras del endodermo, células endocrinas pancreáticas, células del mesodermo o células del ectodermo.
Por tanto, la invención se refiere, en particular, a un método de producción de agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales y, opcionalmente, de diferenciación de las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales que comprende las etapas de:
a. hacer crecer células madre pluripotentes en un cultivo adherente plano,
b. expandir las células madre pluripotentes a agrupaciones de células agregadas, y
c. transferir las agrupaciones de células madre pluripotentes desde el cultivo adherente plano hasta un cultivo en suspensión dinámico usando una enzima,
en el que se forman las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales, en el que las agrupaciones de células pluripotentes se cultivan y expanden en el cultivo en suspensión dinámico sin perder la pluripotencia, y en el que el método opcionalmente comprende además diferenciar las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales.
Para mayor claridad de la divulgación, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran determinadas características, realizaciones o aplicaciones de la presente invención.
DEFINICIONES
Las células madre son células indiferenciadas que se definen por su capacidad, a nivel unicelular, tanto para autorrenovarse como para diferenciarse. Las células madre pueden producir células progenitoras, incluyendo progenitores autorrenovables, progenitores no renovables y células terminalmente diferenciadas. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de diversos linajes celulares de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las células madre también dan lugar a tejidos de múltiples capas germinales tras el trasplante y contribuyen sustancialmente a la mayoría, sino a todos, los tejidos tras la inyección en blastocistos.
Las células madre se clasifican según su potencial de desarrollo. “Cultivo celular” o “cultivo” se refieren generalmente a células tomadas de un organismo vivo y hechas crecer en condiciones controladas (“en cultivo” o “cultivadas”). Un cultivo celular primario es un cultivo de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo antes del primer subcultivo. Las células se expanden en cultivo cuando se colocan en un medio de crecimiento en condiciones que facilitan uno o ambos de crecimiento y división celular, lo que da como resultado una mayor población de células. Cuando las células se expanden en cultivo, la tasa de proliferación celular se mide a veces por el tiempo necesario para que las células se dupliquen en número (denominado tiempo de duplicación). “Expandir”, tal como se usa en el presente documento, es el proceso de aumentar el número de células madre pluripotentes mediante cultivo, tal como, por ejemplo, en al menos el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 60%, el 75%, el 90%, el 100%, el 200%, el 500%, el 1000% o más, y niveles dentro de estos porcentajes. Se aprecia que el número de células madre pluripotentes que pueden obtenerse a partir de una sola célula madre pluripotente depende de la capacidad de proliferación de la célula madre pluripotente. La capacidad de proliferación de la célula madre pluripotente puede calcularse mediante el tiempo de duplicación de la célula, es decir, el tiempo necesario para que una célula experimente una división mitótica en el cultivo, y el periodo en que la célula madre pluripotente puede mantenerse en estado indiferenciado, que equivale al número de pases multiplicado por los días entre cada pase.
La diferenciación es el proceso por el cual una célula no especializada (“no comprometida”) o menos especializada adquiere las características de una célula especializada tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula diferenciada o inducida por diferenciación es aquella que ha adoptado una posición más especializada (“comprometida”) dentro del linaje de una célula. El término “comprometida”, cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha avanzado en la ruta de diferenciación hasta un punto en el que, en circunstancias normales, seguirá diferenciándose en un tipo celular específico o en un subconjunto de tipos celulares, y, en circunstancias normales, no puede diferenciarse en un tipo celular diferente o volver a un tipo celular menos diferenciado. “Desdiferenciación” se refiere al proceso por el cual una célula vuelve a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Tal como se usa en el presente documento, el linaje de una célula define la herencia de la misma, es decir, de qué células procede y a qué células puede dar lugar. El linaje de una célula sitúa a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico de linaje se refiere a una característica específicamente asociada con el fenotipo de las células de un linaje de interés y puede usarse para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida al linaje de interés. Los “marcadores”, tal como se usan en el presente documento, son moléculas de ácido nucleico o polipeptídicas que se expresan de manera diferencial en una célula de interés. En este contexto, expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo en comparación con una célula indiferenciada. El nivel detectable del ácido nucleico o polipéptido marcador es lo suficientemente mayor o menor en las células de interés en comparación con otras células, de manera que la célula de interés puede identificarse y distinguirse de otras células usando cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Tal como se usa en el presente documento, una célula es “positiva para” un marcador específico o “positiva” cuando el marcador específico se detecta suficientemente en la célula. De manera similar, la célula es “negativa para” un marcador específico o “negativa” cuando el marcador específico no se detecta suficientemente en la célula. En particular, positiva por FACS suele ser superior al 2%, mientras que el umbral negativo por FACS suele ser inferior al 1%. Positiva por PCR suele ser inferior a 34 ciclos (Ct); mientras que negativa por PCR suele ser superior a 34,5 ciclos.
En el presente documento, “densidad celular” y “densidad de siembra” se usan de manera intercambiable y se refieren al número de células sembradas por unidad de superficie de un sustrato sólido o semisólido, plano o curvo. Tal como se usa en el presente documento, “cultivo en suspensión” se refiere a un cultivo de células, individuales o en agrupaciones, suspendidas en un medio en lugar de adheridas a una superficie.
Tal como se usa en el presente documento, “libre de suero” se refiere a estar desprovisto de suero humano o animal. Por consiguiente, un medio de cultivo libre de suero no comprende suero ni porciones de suero.
En los intentos de replicar la diferenciación de células madre pluripotentes en células endocrinas pancreáticas funcionales en cultivo celular, el proceso de diferenciación se ve a menudo como un progreso a través de una serie de etapas consecutivas. Tal como se usa en el presente documento, las distintas etapas se definen por los tiempos de cultivo y los reactivos establecidos en los ejemplos incluidos en el presente documento.
“Endodermo definitivo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a células que tienen las características de las células que surgen del epiblasto durante la gastrulación y que forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo definitivo expresan al menos uno de los siguientes marcadores FOXA2 (también conocido como factor nuclear de hepatocitos 3-p (HNF3P)), GATA4, GATA6, MNX1, SOX17, CXCR4, Cerberus, OTX2, braquiuria, goosecoid, C-Kit, CD99 y MIXL1. Los marcadores característicos de las células del endodermo definitivo incluyen CXCR4, FOXA2 y SOX17. Por tanto, las células del endodermo definitivo pueden caracterizarse por su expresión de CXCR4, FOXA2 y SOX17. Además, dependiendo del tiempo que se permita a las células permanecer en la etapa 1, puede observarse un aumento de HNF4a.
“Células endocrinas pancreáticas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a células que pueden expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, grelina y polipéptido pancreático. Además de estas hormonas, los marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas incluyen uno o más de NGN3, NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2 y PAX6. Las células endocrinas pancreáticas que expresan marcadores característicos de células p pueden caracterizarse por su expresión de insulina y de al menos uno de los siguientes factores de transcripción: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNF3p, MAFA, PAX4 y PAX6.
En el presente documento se usan de manera intercambiable “d1”, “d 1” y “día 1”; “d2”, “d 2” y “día 2”; “d3”, “d 3” y “día 3”, etc. Estas combinaciones de letras y números se refieren a un día de incubación específico en las diferentes etapas durante el protocolo de diferenciación gradual de la presente solicitud.
“Glucosa” y “D-glucosa” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a dextrosa, un azúcar que se encuentra comúnmente en la naturaleza.
En el presente documento se usan de manera intercambiable “NeuroD” y “NeuroDI”, que identifican una proteína expresada en células progenitoras endocrinas pancreáticas y el gen que la codifica.
“LDN” y “LDN-193189” se refieren a ((clorhidrato de 6-(4-(2-(piperidin-1-il)etoxi)fenil)-3-(piridin-4-il)pirazolo[1,5-a]pirimidina; DM-3189)), un inhibidor del receptor de BMP disponible bajo la marca comercial STEMOLECULE™ de Stemgent, Inc., Cambridge, MA, EE.UU.
AISLAMIENTO, EXPANSIÓN Y CULTIVO DE CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES
Las células madre pluripotentes pueden expresar uno o más de los anticuerpos designados como TRA-1-60 y TRA-1-81 (Thomson et al. 1998, Science 282:1145-1147). La diferenciación de células madre pluripotentes in vitro da como resultado la pérdida de expresión de TRA-1-60 y TRA-1-81. Las células madre pluripotentes indiferenciadas tienen normalmente actividad fosfatasa alcalina, que puede detectarse fijando las células con paraformaldehído al 4% y revelando después con Vector® Red como sustrato, tal como describe el fabricante (Vector Laboratories, CA, EE.UU.). Las células madre pluripotentes indiferenciadas también expresan normalmente OCT4 y TERT, tal como se detecta mediante RT-PCR.
Otro fenotipo deseable de las células madre pluripotentes propagadas es el potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejidos del endodermo, del mesodermo y del ectodermo. La pluripotencia de las células madre puede confirmarse, por ejemplo, inyectando células en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (“SCID”), fijando los teratomas que se formen usando paraformaldehído al 4% y examinando después histológicamente las evidencias de tipos celulares de estas tres capas germinales. Alternativamente, la pluripotencia puede determinarse mediante la creación de cuerpos embrioides y la evaluación de los cuerpos embrioides para detectar la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.
Las líneas de células madre pluripotentes propagadas pueden someterse a cariotipado usando una técnica de bandeo G convencional y compararse con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable obtener células que tengan un “cariotipo normal”, lo que significa que las células son euploides, en las que todos los cromosomas humanos están presentes y no están notablemente alterados. Las células pluripotentes pueden expandirse fácilmente en cultivo usando diversas capas alimentadoras o usando recipientes recubiertos de proteínas de matriz. Alternativamente, pueden usarse superficies químicamente definidas en combinación con medios definidos tales como medio mTeSR®1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) para la expansión rutinaria de las células.
El cultivo en un cultivo en suspensión puede efectuarse sembrando las células madre pluripotentes en un recipiente de cultivo a una densidad celular que fomente la supervivencia y proliferación celular, pero que limite la diferenciación. Normalmente, se usa una densidad de siembra que mantiene la indiferenciación de las células. Se apreciará que, aunque pueden sembrarse suspensiones unicelulares de células madre, pueden ser ventajosas pequeñas agrupaciones de células.
Para dotar a las células madre pluripotentes de un suministro suficiente y constante de nutrientes y factores de crecimiento mientras están en el cultivo en suspensión, el medio de cultivo puede reemplazarse o reponerse diariamente o según un esquema predeterminado, tal como, por ejemplo, cada 1-5 días. Las agrupaciones grandes de células madre pluripotentes pueden provocar la diferenciación celular, por tanto, pueden tomarse medidas para evitar grandes agregados de células madre pluripotentes. Las agrupaciones de células madre pluripotentes formadas pueden disociarse, por ejemplo, cada 2-7 días, y las células individuales o los pequeños grupos de células o bien pueden dividirse en recipientes de cultivo adicionales (es decir, someterse a pases) o bien mantenerse en el mismo recipiente de cultivo y procesarse con un medio de cultivo de reemplazo o adicional.
Los grandes grupos de células madre pluripotentes, incluyendo un sedimento de células madre pluripotentes resultante de la centrifugación, pueden someterse a una o ambas de digestión enzimática y disociación mecánica. La digestión enzimática del grupo de células madre pluripotentes puede realizarse sometiendo el grupo a una enzima, tal como colagenasa de tipo IV, Dispase o Accutase. La disociación mecánica de grandes grupos de células madre pluripotentes puede realizarse usando un dispositivo diseñado para romper los grupos para dar un tamaño predeterminado. De manera adicional o alternativa, la disociación mecánica puede realizarse manualmente usando una aguja o una pipeta.
El recipiente de cultivo usado para cultivar las células madre pluripotentes en suspensión puede ser cualquier recipiente de histocultivo (por ejemplo, con un grado de pureza adecuado para cultivar células madre pluripotentes) que tenga una superficie interna diseñada de manera que las células madre pluripotentes cultivadas en el mismo no puedan adherirse o fijarse a una superficie de este tipo (por ejemplo, un recipiente no tratado con histocultivo, para evitar la adherencia o fijación a la superficie). Preferiblemente, para obtener un cultivo escalable, el cultivo según algunas realizaciones de la invención se efectúa usando un sistema de cultivo controlado (preferiblemente un sistema de cultivo controlado por ordenador) en el que los parámetros de cultivo, tales como la temperatura, la agitación, el pH y el oxígeno, se monitorizan y controlan automáticamente usando un dispositivo adecuado. Una vez determinados los parámetros de cultivo deseados, el sistema puede configurarse para el ajuste automático de los parámetros de cultivo según sea necesario para potenciar la expansión y diferenciación de las células madre pluripotentes.
Las células madre pluripotentes pueden cultivarse en condiciones dinámicas (es decir, en condiciones en las que las células madre pluripotentes están sujetas a un movimiento constante mientras se encuentran en el cultivo en suspensión) o en condiciones no dinámicas (es decir, un cultivo estático) mientras se conserva su capacidad proliferativa, capacidad pluripotente y estabilidad del cariotipo durante múltiples pases.
Para el cultivo no dinámico de células madre pluripotentes, las células madre pluripotentes pueden cultivarse en placas de Petri, frascos T, HyperFlasks (Corning), CellStacks (Corning) o Cell Factories (NUNC) recubiertos o no recubiertos. Para el cultivo dinámico de células madre pluripotentes, las células madre pluripotentes pueden cultivarse en un recipiente adecuado, tal como frascos centrifugadores o matraces de Erlenmeyer, recipientes agitadores o de tanque agitado de acero inoxidable, de vidrio o de plástico de un solo uso. El recipiente de cultivo puede conectarse a una unidad de control y, por tanto, presentar un sistema de cultivo controlado. El recipiente de cultivo (por ejemplo, frasco centrifugador o matraz de Erlenmeyer) puede agitarse de manera continua o intermitente. Preferiblemente, el recipiente de cultivo se agita lo suficientemente como para mantener a las células madre pluripotentes en suspensión.
Las células madre pluripotentes pueden cultivarse en cualquier medio que proporcione suficientes nutrientes y estímulos ambientales para fomentar el crecimiento y la expansión. Los medios adecuados incluyen E8, IH3 y mTesR1 o TesR2. El medio puede cambiarse periódicamente para renovar el suministro de nutrientes y retirar los subproductos celulares. Según algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo se cambia diariamente. FUENTES DE CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES
Puede usarse cualquier célula madre pluripotente en los métodos dados a conocer en el presente documento. Los tipos de células madre pluripotentes a modo de ejemplo, dados a conocer en el presente documento como referencia, incluyen líneas establecidas de células pluripotentes derivadas del tejido formado después de la gestación, incluyendo tejido preembrionario (tal como, por ejemplo, un blastocisto), tejido embrionario o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, normalmente pero no necesariamente, antes de aproximadamente 10 a 12 semanas de gestación. Ejemplos no limitativos, dados a conocer en el presente documento como referencia, son líneas establecidas de células madre embrionarias humanas (hESC) o células germinales embrionarias humanas, tales como, por ejemplo, líneas de células madre embrionarias humanas H1, H7 y H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, EE.UU.). También son adecuadas las células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivadas en ausencia de células alimentadoras.
También son adecuadas las células pluripotentes inducibles (iPS) o las células pluripotentes reprogramadas que pueden derivarse de células somáticas adultas usando la expresión forzada de una serie de factores de transcripción pluripotentes relacionados, tales como OCT4, NANOg , Sox2, KLF4 y ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet 2011, 12:165-185). Las células madre embrionarias humanas dadas a conocer en el presente documento como referencia también pueden prepararse tal como describen Thomson et al. (patente estadounidense n.° 5.843.780; Science, 1998, 282:1145-1147; Curr Top Dev Biol 1998, 38:133-165; Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1995, 92:7844-7848). También son adecuadas las líneas de células madre embrionarias humanas mutantes, tales como, por ejemplo, BG01v (BresaGen, Athens, Ga.), o células derivadas de células somáticas humanas adultas, tales como, por ejemplo, las células dadas a conocer en Takahashi et al, Cell 131: 1-12 (2007). Además, las células madre pluripotentes adecuadas pueden derivarse según los métodos descritos en Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009); Maherali et al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007); Stadtfeld et al. (Cell Stem Cell 2: 230-240); Nakagawa et al. (Nature Biotechnology 26: 101-106, 2008); Takahashi et al. (Cell 131: 861-872, 2007); y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2011-0104805. Otras fuentes de células madre pluripotentes incluyen las células pluripotentes inducidas (IPS, Cell, 126(4): 663-676). Otras fuentes adecuadas de células incluyen células derivadas del tejido de cordón umbilical humano, células derivadas del líquido amniótico humano, células derivadas de la placenta humana y partenotes humanas. Las células derivadas del tejido de cordón umbilical pueden obtenerse usando los métodos según la patente estadounidense n.° 7.510.873, las células derivadas del tejido de la placenta pueden obtenerse usando los métodos según la publicación de solicitud estadounidense 2005/0058631, las células derivadas del líquido amniótico pueden obtenerse usando los métodos según la publicación de solicitud estadounidense n.° 2007/0122903.
Los expertos en la técnica conocen bien las características de las células madre pluripotentes, y se siguen identificando características adicionales de las células madre pluripotentes. Los marcadores de células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o todos) de los siguientes: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, t Ra -1-60, TRA-1-81. En una realización, las células madre pluripotentes adecuadas para su uso en los métodos de la invención expresan uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o todos) de CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81, y carecen de expresión de un marcador de diferenciación CXCR4 (también conocido como CD184) tal como se detecta mediante citometría de flujo. Además, las células madre pluripotentes adecuadas para su uso en los métodos de la invención pueden expresar uno o más (por ejemplo, 1, 2 o todos) de CD9, NANOG y POU5F1/OCT4 tal como se detecta mediante RT-PCR.
Las células madre pluripotentes a modo de ejemplo, dadas a conocer como referencia, incluyen la línea de células madre embrionarias humanas H9 (código NIH: WA09), la línea de células madre embrionarias humanas H1 (código NIH: WA01), la línea de células madre embrionarias humanas H7 (código NIH: WA07) y la línea de células madre embrionarias humanas SA002 (Cellartis, Suecia). En una realización, las células madre pluripotentes son células madre embrionarias humanas. Un ejemplo de referencia son las células hES H1. En realizaciones alternativas, se usan células madre pluripotentes de origen no embrionario.
Diferenciación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático a partir de células madre pluripotentes
Expansión de células madre pluripotentes
La presente divulgación se refiere, por ejemplo, tal como se describe a continuación, al aislamiento y al cultivo de células madre, en particular al cultivo de agrupaciones de células madre, que conservan la pluripotencia en un sistema de cultivo en suspensión dinámico. Las agrupaciones de células pluripotentes pueden diferenciarse para producir células p funcionales.
Las células madre pluripotentes usadas en los métodos de la presente invención se expanden preferiblemente en un cultivo en suspensión dinámico antes de su diferenciación hacia un punto final deseado. Ventajosamente, se ha encontrado que las células madre pluripotentes pueden cultivarse y expandirse como agrupaciones de células en suspensión en un medio adecuado sin pérdida de pluripotencia. Tal cultivo puede tener lugar en un sistema de cultivo en suspensión dinámico en el que las células o las agrupaciones de células se mantienen en movimiento lo suficientemente como para evitar la pérdida de pluripotencia. Los sistemas de cultivo en suspensión dinámicos útiles incluyen sistemas equipados con medios para agitar el contenido del cultivo, tales como, por ejemplo, mediante agitación, sacudida, recirculación o burbujeo de gases a través del medio. Tal agitación puede ser intermitente o continua, siempre que se mantenga un movimiento suficiente de las agrupaciones de células para facilitar la expansión y evitar la diferenciación prematura. Preferiblemente, la agitación comprende una agitación continua, tal como mediante un impulsor que gira a una velocidad determinada. El impulsor puede tener un fondo redondeado o plano. La velocidad de agitación del impulsor debe ser tal que las agrupaciones se mantengan en suspensión y se minimice la sedimentación. Además, el ángulo de la pala del impulsor puede ajustarse para ayudar al movimiento ascendente de las células y las agrupaciones para evitar la sedimentación. Además, el tipo, el ángulo y la velocidad de rotación del impulsor pueden coordinarse de manera que las células y las agrupaciones se encuentren en lo que parece una suspensión coloidal uniforme.
El cultivo en suspensión y la expansión de las agrupaciones de células madre pluripotentes puede lograrse mediante la transferencia de células madre cultivadas en condiciones estáticas a un sistema de cultivo dinámico apropiado, tal como un recipiente de plástico desechable, de plástico reutilizable, de acero inoxidable o de vidrio, por ejemplo, un frasco centrifugador o un matraz de Erlenmeyer. Por ejemplo, las células madre cultivadas en un entorno estático adherente, es decir, en la superficie de una placa, pueden retirarse en primer lugar de la superficie mediante el tratamiento con un agente quelante o una enzima. Las enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, colagenasa de tipo I, Dispase™ o una formulación comercialmente disponible que se comercializa con el nombre comercial Accutase™. Accutase™ es una disolución de desprendimiento celular que comprende enzimas colagenolíticas y proteolíticas (aisladas de crustáceos) y no contiene productos derivados de mamíferos o bacterias. Por tanto, en una realización, la enzima es una enzima colagenolítica y/o una enzima proteolítica o una disolución de desprendimiento celular que comprende enzimas colagenolíticas y proteolíticas. Los agentes quelantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido etilendiaminotetraacético e DTa . Los cultivos de células madre pluripotentes pueden incubarse con la enzima o el agente quelante, preferiblemente hasta que los bordes de las colonias comiencen a curvarse y levantarse, pero antes del completo desprendimiento de las colonias de la superficie del cultivo. Los cultivos celulares pueden incubarse a temperatura ambiente. Además, las células pueden incubarse a una temperatura de más de 20°C, más de 25°C, más de 30°C o más de 35°C, por ejemplo, a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 40°C, entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 40°C, entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 40°C, por ejemplo, aproximadamente 37°C. Las células pueden incubarse durante al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20 minutos, por ejemplo, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 minutos, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30 minutos, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 minutos, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 minutos, por ejemplo, aproximadamente 20 minutos. El método puede implicar la etapa de retirar la enzima o el agente quelante del cultivo celular después del tratamiento. El cultivo celular puede lavarse una, dos o más veces, después de la retirada de la enzima o el agente quelante. El cultivo celular puede lavarse con un medio de cultivo apropiado, tal como mTeSR®1 (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canadá). Además, se da a conocer un inhibidor de la Rho-cinasa (por ejemplo, Y-27632, n.° de catálogo de Axxora ALX-270-333, San Diego, CA). El inhibidor de la Rho-cinasa puede estar en una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 |iM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 90 |iM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 80 |iM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 70 |iM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 |iM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 |iM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 |iM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 |iM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 |iM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 |iM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 |iM, o de aproximadamente 10 |iM. El inhibidor de la Rho-cinasa puede añadirse en al menos 1 |iM, al menos 5 |iM o al menos 10 |iM. Las células pueden levantarse de la superficie del sistema de cultivo estático con un raspador o una varilla de policía de caucho. Los medios y las células pueden transferirse a un sistema de cultivo dinámico usando una pipeta de vidrio u otro medio adecuado. En una realización preferida, el medio en el sistema de cultivo dinámico se cambia diariamente.
En el contexto de la invención se dan a conocer métodos de cultivo y expansión de células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión tridimensional. En particular, los métodos contemplan el cultivo y la expansión de células madre pluripotentes mediante la formación de agrupaciones de células agregadas de estas células madre pluripotentes. Las agrupaciones de células pueden formarse como resultado de tratar los cultivos de células madre pluripotentes con una enzima (por ejemplo, una proteasa neutra, por ejemplo, Dispase) o un agente quelante antes de cultivar las células. Las células pueden cultivarse preferiblemente en un sistema de cultivo en suspensión con sacudida o con agitación (dinámico). En una realización, la invención contempla además la formación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático a partir de tales agrupaciones de células madre pluripotentes.
Preferiblemente, las agrupaciones de células son células madre pluripotentes agregadas. Las células madre agregadas expresan uno o más marcadores de pluripotencia, por ejemplo, uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o todos) de los marcadores CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81, y carecen de expresión de uno o más marcadores de diferenciación, por ejemplo, carecen de expresión de CXCR4. En una realización, las células madre agregadas expresan los marcadores de pluripotencia CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81, y carecen de expresión de un marcador de diferenciación CXCR4.
Una realización es un método de cultivo de células madre pluripotentes como agrupaciones de células en cultivo en suspensión. Las agrupaciones de células son células madre pluripotentes agregadas, cultivadas en un sistema de cultivo en suspensión con sacudida o con agitación dinámica. Las agrupaciones de células pueden transferirse desde un cultivo adherente plano usando una enzima, tal como una proteasa neutra, por ejemplo, Dispase, como agente de levantamiento de células hasta un sistema de cultivo en suspensión con sacudida o con agitación (dinámico). Las enzimas adecuadas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, colagenasa de tipo IV, Dispase™ o Accutase™. Las células mantienen la pluripotencia en un sistema de cultivo en suspensión con sacudida o con agitación, en particular en un sistema de cultivo en suspensión con agitación.
Además, se da a conocer un método de cultivo de células madre pluripotentes como agrupaciones de células en cultivo en suspensión, en el que las agrupaciones de células son células madre pluripotentes agregadas transferidas desde un cultivo adherente plano usando un agente quelante, por ejemplo, EDTA, y cultivadas en un sistema de cultivo en suspensión con sacudida o con agitación (dinámico). Las agrupaciones de células mantienen la pluripotencia en un sistema de cultivo en suspensión con sacudida o con agitación, en particular en un sistema de cultivo en suspensión con agitación (agitado en condiciones dinámicas).
Otra realización de la invención es un método de cultivo de células madre pluripotentes como agrupaciones de células en cultivo en suspensión, en el que las agrupaciones de células son células madre pluripotentes agregadas transferidas desde un cultivo adherente plano usando la enzima Accutase™ y cultivadas en un sistema de cultivo en suspensión con sacudida o con agitación (dinámico). Las agrupaciones de células mantienen la pluripotencia en el sistema de cultivo en suspensión agitado en condiciones dinámicas.
Las agrupaciones de células de la invención pueden diferenciarse en células del mesodermo tales como células cardiacas, células del ectodermo tales como células neurales, células positivas para hormonas individuales o células del endodermo pancreático. El método puede incluir además la diferenciación, por ejemplo, la diferenciación de las células del endodermo pancreático, en células precursoras pancreáticas y en células que expresan hormonas pancreáticas. En otra realización, las células precursoras pancreáticas se caracterizan por la expresión de los factores de transcripción de células p PDX1 y NKX6.1.
La etapa de diferenciación puede llevarse a cabo después de al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, al menos 120 horas, al menos 144 horas, al menos 168 horas, al menos 196 horas o más, preferiblemente de aproximadamente 48 horas a aproximadamente 72 horas, en el sistema de cultivo en suspensión. La diferenciación puede llevarse a cabo usando una progresión gradual de los componentes del medio, tal como la descrita en los ejemplos (por ejemplo, véanse la tabla A y las tablas 1a y 1c).
Puede producirse una agrupación de células tridimensional haciendo crecer células madre pluripotentes en un cultivo adherente plano; expandiendo las células madre pluripotentes a agrupaciones de células agregadas; y transfiriendo las agrupaciones de células madre pluripotentes desde el cultivo adherente plano hasta un cultivo en suspensión dinámico usando una enzima o un agente quelante. Además, se da a conocer un método de expansión y diferenciación de células madre pluripotentes en un sistema de cultivo en suspensión agitado en condiciones dinámicas haciendo crecer células madre pluripotentes en un cultivo adherente plano; expandiendo las células madre pluripotentes a agrupaciones de células agregadas; y transfiriendo las agrupaciones de células madre pluripotentes desde el cultivo adherente plano hasta un cultivo en suspensión dinámico usando una enzima o un agente quelante; y diferenciando las agrupaciones de células pluripotentes en un sistema de cultivo en suspensión con agitación dinámica para generar una población de células precursoras pancreáticas.
Además, se da a conocer un producto celular derivado de células madre trasplantables que comprende células madre diferenciadas preparadas a partir de una suspensión de agrupaciones de células madre pluripotentes expandidas que se diferencian a células precursoras pancreáticas. Más particularmente, se produce un producto derivado de células madre trasplantables haciendo crecer células madre pluripotentes en un cultivo adherente plano; expandiendo las células madre pluripotentes a agrupaciones de células agregadas; y transfiriendo las agrupaciones de células madre pluripotentes desde el cultivo adherente plano hasta un cultivo en suspensión dinámico usando una enzima o un agente quelante; y diferenciando las agrupaciones de células pluripotentes en un sistema de cultivo en suspensión agitado en condiciones dinámicas. El producto celular derivado de células madre trasplantables se usa preferiblemente para tratar la diabetes.
Tal como se da a conocer, el método puede incluir el trasplante a un animal diabético para su posterior maduración in vivo para dar células endocrinas pancreáticas funcionales.
Además, se da a conocer un método de expansión y diferenciación de células madre pluripotentes en un sistema de cultivo en suspensión que comprende hacer crecer células madre pluripotentes en un cultivo adherente plano; retirar las células madre pluripotentes del cultivo adherente plano usando una enzima; adherir las células madre pluripotentes a microportadores en cultivo estático; expandir las células pluripotentes en un sistema de cultivo en suspensión agitado en condiciones dinámicas; y diferenciar las células pluripotentes en un sistema de cultivo en suspensión agitado en condiciones dinámicas para generar una población de células precursoras pancreáticas. Los microportadores pueden ser de cualquier forma conocida en la técnica para adherir células, en particular, los microportadores pueden ser perlas. El microportador puede estar compuesto por materiales de origen natural o sintético. Los ejemplos incluyen microportadores basados en colágeno, microportadores basados en dextrano o microportadores basados en celulosa. Por ejemplo, las perlas microportadoras pueden ser perlas de poliestireno modificadas con trimetilamonio catiónico unido a la superficie para dotar al microportador de una superficie con carga positiva. El diámetro de las perlas puede oscilar entre aproximadamente 90 y aproximadamente 200 |im, alternativamente entre aproximadamente 100 y aproximadamente 190 |im, alternativamente entre aproximadamente 110 y aproximadamente 180 |im, alternativamente entre aproximadamente 125 y aproximadamente 175 |im de diámetro. Las perlas microportadoras también pueden ser una capa delgada de colágeno desnaturalizado acoplada químicamente a una matriz de dextrano reticulado. Las perlas microportadoras pueden ser de vidrio, cerámica, polímeros (tales como poliestireno) o metales. Además, los microportadores pueden no estar recubiertos, o pueden estar recubiertos, por ejemplo, con silicio o una proteína tal como el colágeno. En un aspecto adicional, el microportador puede estar compuesto por o recubierto con compuestos que potencian la unión de la célula al microportador y potencian la liberación de la célula a partir del microportador, incluyendo, pero sin limitarse a, hialuronato de sodio, poli(monoestearoilglicérido-co-ácido succínico), poli-D,L-lactida-co-glicolida, fibronectina, laminina, elastina, lisina, n-isopropilacrilamida, vitronectina y colágeno. Los ejemplos incluyen además microportadores que presentan una microcorriente, tales como microportadores con un par galvánico particulado de zinc y cobre que produce bajos niveles de electricidad biológicamente relevante; o microportadores que son paramagnéticos, tales como microportadores paramagnéticos de alginato de calcio.
La población de células del endodermo pancreático puede obtenerse mediante una diferenciación gradual de agrupaciones de células pluripotentes. En algunas realizaciones, las células pluripotentes son células madre pluripotentes embrionarias humanas. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo puede ser una célula precursora de la línea primitiva. Alternativamente, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo puede ser una célula del mesendodermo.
Además, se da a conocer un método de diferenciación gradual de células pluripotentes que comprende cultivar células de la etapa 3-5 en un cultivo en suspensión dinámico. La población del endodermo pancreático generada puede trasplantarse a animales diabéticos para su posterior maduración in vivo para dar células endocrinas pancreáticas funcionales. También se dan a conocer sistemas o kits para su uso en los métodos de la invención. Además, se da a conocer una célula o población de células que puede obtenerse mediante un método de la invención. También se da a conocer una célula o población de células obtenida mediante un método de la invención. Además, se dan a conocer métodos de tratamiento. En particular, se dan a conocer métodos para tratar a un paciente que padece o corre el riesgo de desarrollar diabetes.
También se da a conocer una célula o población de células que puede obtenerse u obtenida mediante un método de la invención para su uso en un método de tratamiento. En particular, se da a conocer una célula o población de células que puede obtenerse u obtenida mediante un método de la invención para su uso en un método de tratamiento de un paciente que padece o corre el riesgo de desarrollar diabetes. La diabetes puede ser de tipo 1 o de tipo 2.
El método de tratamiento puede comprender implantar las células obtenidas o que pueden obtenerse mediante un método de la invención en un paciente.
Además, el método de tratamiento puede comprender diferenciar las células madre pluripotentes in vitro en células de la etapa 1, etapa 2, etapa 3, etapa 4 o etapa 5, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, e implantar las células diferenciadas en un paciente.
El método puede comprender además la etapa de cultivar células madre pluripotentes, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, antes de la etapa de diferenciar las células madre pluripotentes.
El método puede comprender además la etapa de diferenciar las células in vivo, después de la etapa de implantación.
El paciente puede ser un mamífero, preferiblemente un ser humano.
Las células pueden implantarse como células dispersas o formando agrupaciones que pueden infundirse en la vena porta hepática. Alternativamente, las células pueden proporcionarse en soportes poliméricos degradables biocompatibles, en dispositivos porosos no degradables o encapsuladas para protegerlas de la respuesta inmunitaria del huésped. Las células pueden implantarse en un lugar apropiado de un receptor. Los sitios de implantación incluyen, por ejemplo, el hígado, el páncreas natural, el espacio subcapsular renal, el epiplón, el peritoneo, el espacio subseroso, el intestino, el estómago o una bolsa subcutánea.
Para potenciar una diferenciación, supervivencia o actividad adicional de las células implantadas in vivo, pueden administrarse factores adicionales, tales como factores de crecimiento, antioxidantes o agentes antiinflamatorios, antes de, simultáneamente con o después de la administración de las células. Estos factores pueden secretarse por las células endógenas y exponerse a las células administradas in situ. Puede inducirse la diferenciación de las células implantadas mediante cualquier combinación de factores de crecimiento administrados de manera endógena y exógena conocidos en la técnica.
La cantidad de células usadas en la implantación depende de diversos factores, incluyendo el estado del paciente y la respuesta a la terapia, y puede determinarla un experto en la técnica.
El método de tratamiento puede comprender además incorporar las células en un soporte tridimensional antes de la implantación. Las células pueden mantenerse in vitro sobre este soporte antes de su implantación en el paciente. Alternativamente, el soporte que contiene las células puede implantarse directamente en el paciente sin necesidad de un cultivo in vitro adicional. El soporte puede incorporarse opcionalmente con al menos un agente farmacéutico que facilite la supervivencia y función de las células trasplantadas.
En el contexto de los métodos de la invención pueden usarse uno o más de los siguientes.
Tabla A:
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La presente invención se ilustra adicionalmente, pero no está limitada, por los siguientes ejemplos.
Ejemplos
La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitativos. Los materiales y reactivos utilizados en estos ejemplos, incluyendo sus abreviaturas, se identifican en la tabla 20.
Ejemplo de referencia 1
Suspensión y agrupación de células madre embrionarias humanas de la línea celular H1 con Dispase/proteasa neutra
Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, (células WA01, WiCell, Madison WI) en el pase 41 se lavaron una vez con PBS (n.° de catálogo 14190, Invitrogen) y se trataron con una disolución 1 mg/ml de Dispase™ (proteasa neutra, n.° de catálogo de Sigma 12604-013, St. Louis, MO) en DMEM/F12 (n.° de catálogo de Invitrogen 11330, Grand Island, NY). Las células se incubaron a 37°C durante 15-25 minutos hasta que los bordes de las colonia comenzaron a curvarse y levantarse, pero antes de que las colonias se desprendieran completamente de la superficie del cultivo. A continuación se retiró Dispase y se lavó la placa de cultivo dos veces con medio mTeSR1® (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) que contenía y-27632 10 pM (n.° de catálogo de Axxora ALX-270-333, San Diego, CA). A continuación, el medio mTeSR1® que contenía y-27632 10 pM se añadió a la placa de cultivo a 5 ml/60cm2 y las células se levantaron de la superficie con un raspador o una varilla de policía de caucho. A continuación, se transfirieron los medios y las células a un tubo cónico de 50 ml usando una pipeta de vidrio y se centrifugaron las agrupaciones a 90 g (rcf) durante 3 minutos.
Después de la centrifugación, se aspiró el medio y las células volvieron a suspenderse suavemente y se trituraron brevemente en 12 ml de medio mTeSR1® que contenía y-27632 10 pM por 225-240 cm2 de cultivo plano total (equivalente a un frasco T225 o cuatro placas de 10 cm, aproximadamente 90 millones de células). A continuación, la suspensión celular se transfirió (1 ml/pocillo) a placas de 6 pocillos de cultivo de unión ultra baja (Corning, n.° de catálogo 3471, Corning, NY) que contenían 2 ml/pocillo de medio mTeSR1® recién preparado con y-27632 10 pM. Las células levantadas de esta manera parecían fragmentos de monocapa, con un diámetro promedio de los fragmentos levantados de aproximadamente 20-30 micrómetros (figura 1a), consistiendo cada uno en grupos de células. Estos fragmentos de monocapa se incubaron en suspensión durante 2 horas, (el tiempo de incubación puede oscilar entre 0,5 y 4 horas), momento en el que se observaron agregados de fragmentos. A continuación, los agregados se trituraron brevemente con una pipeta de vidrio de 10 ml y se incubaron durante la noche (los agregados pueden pasar directamente a la suspensión) en la placa de baja unión (los agregados también pueden incubarse en plástico de cultivo celular no tratado y en plástico convencional tratado para el histocultivo).
Después de la incubación durante la noche (18-24 horas), las células y el medio se transfirieron directamente a un frasco centrifugador de 125 ml (Corning, n.° de catálogo 4500-125, Corning NY) que contenía 25 ml de medio mTeSR1® con agitación a 50 rpm (puede oscilar entre 30-80+ rpm) para conseguir un volumen final de aproximadamente 75 ml. El medio se cambió diariamente durante 4 días. Se determinó la pluripotencia después de 4 días de cultivo y los resultados de citometría de flujo mostraron una alta expresión de los marcadores de pluripotencia (CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81) con casi ninguna expresión de un marcador de diferenciación (CXCR4). Véase la figura 1b. Estos datos demuestran que las células hES H1 pueden transferirse con éxito como agrupaciones de células a un cultivo en suspensión desde un formato de cultivo adherente plano con Dispase como agente de levantamiento celular y mantener la pluripotencia en un sistema de cultivo en suspensión con agitación (dinámico). Este ejemplo también puede llevarse a cabo en sistemas de suspensión con sacudida en lugar de con agitación con placas y matraces de Erlenmeyer con resultados comparables.
Después de 4 días en cultivo en suspensión (la diferenciación también puede comenzar 24-120 horas después de la formación de los agregados, preferiblemente cultivo durante 2-3 días antes de comenzar la diferenciación), los agregados de células pluripotentes se diferenciaron con una progresión gradual de los componentes del medio para inducir a las células a formar un destino pancreático. Para la diferenciación de los agregados se aumentó la agitación del centrifugador hasta una velocidad de 65 rpm. Los medios y los componentes se muestran en la tabla 1a.
Al final de la etapa 1 se ejecutaron muestras para citometría de flujo y PCR. Los cultivos diferenciados en suspensión formaban una población uniforme y homogénea de células en agregados sueltos al final de la etapa 1 (figura 1c), con la expresión de un marcador de pluripotencia (CD9) casi eliminada, mientras que los marcadores de diferenciación del endodermo definitivo eran bastante elevados, el 97,2% positivo para CXCR4 (CD184) y el 97,3% positivo para CD99 (figura 1d). Estos resultados se correlacionaron con los resultados de la qRT-PCR, que mostraron una drástica disminución de la expresión de los genes de pluripotencia (CD9, NANOG y POU5F1/OCT4) y un gran aumento de los genes asociados con el endodermo definitivo (CXCR4, CERBERUS, GSC, FOXA2, GATA4, GATA6, MNX1 y SOX17) frente a células hES WA01 indiferenciadas (figura 1e).
Las agrupaciones de endodermo definitivo se diferenciaron adicionalmente a un intestino anterior primitivo eliminando el miembro de la familia de TGF-p, GDF8, y añadiendo FGF7 al medio. Después de tres días de cultivo con FGF7, las agrupaciones se diferenciaron a un destino pancreático que expresaba PDX1 mediante la adición de ácido todo-trans-retinoico a un medio que contenía alta glucosa (25 mM) y baja concentración de albúmina sérica bovina rica en lípidos (Albumax) o un medio que contenía una concentración relativamente baja de glucosa (8 mM) y albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos al 2%. La adición detallada de los componentes a estos medios se indica en la tabla 1a. Al final de la diferenciación se analizaron las muestras para determinar la expresión de marcadores de células precursoras pancreáticas. Se observó que las agrupaciones diferenciadas con cualquiera de las dos condiciones, baja glucosa FAF-BSA al 2% (A) o alta glucosa Albumax al 0,1% (B), tal como se miden mediante citometría de flujo, expresaban altos niveles de NKX6.1, un factor de transcripción necesario para las células p funcionales, y altos niveles de marcadores pancreáticos endocrinos tales como sinaptofisina y cromogranina (tabla 1b). Estos resultados fueron compatibles con los resultados de la RT-PCR que mostraron altos niveles de múltiples genes precursores pancreáticos expresados en las muestras de ambas condiciones A y B (datos no mostrados).
Las morfologías típicas de las agrupaciones de células a medida que progresan a través de la diferenciación desde endodermo definitivo (ED) (figura 1c) a intestino primitivo y al endodermo pancreático (figura 1f) demostraron cambios morfológicos visibles en las células y las agrupaciones de células. Normalmente, las agrupaciones pluripotentes aparecen densas y oscuras por microscopía de contraste de fases, y luego se vuelven más sueltas de aspecto a medida que las células progresan a intestino anterior primitivo en la etapa 2. Esta morfología se invierte tras el tratamiento con ácido todo-trans-retinoico y las agrupaciones vuelven a ser más densas y uniformes con un borde de la agrupación suave.
Las células diferenciadas según la condición B hasta la etapa 4 se mantuvieron durante 5 días adicionales en un medio de etapa 5 que contenía un inhibidor de ALK5 (véase la tabla 1c). Esta maduración adicional en cultivo dio como resultado un aumento significativo de la expresión de marcadores endocrinos: INS, GCG, SST, PPY y PCSK1. A continuación, las agrupaciones de células se implantaron en la cápsula renal de ratones SCID-Bg según el protocolo de estudio aprobado por el IACUC, y se controlaron los ratones durante 20 semanas con mediciones de péptido c en ayunas/estado posprandial cada de 2 a 4 semanas. Después de 4 semanas tras la implantación, tras un ayuno de 20 horas y luego estimulación con glucosa, el péptido c no era detectable. A las 6 semanas, 2 de los 5 ratones positivos mostraban algo de péptido c humano (0,087 y 0,137 ng/ml), y a las 10 semanas, 5 de los 5 ratones eran positivos (0,085 - 0,291 ng/ml) para el péptido c. A las 16 semanas, tras 20 horas de ayuno y estimulación con glucosa, los 4 ratones (4/4) eran positivos (0,377 - 3,627 ng/ml) para la expresión del péptido c.
Estos resultados indican que puede formarse un agregado de células pluripotentes y luego diferenciarse en cultivo en suspensión para generar una población de células precursoras pancreáticas caracterizada por la expresión de factores de transcripción de células p como PDX1 y NKX6.1. Además, las agrupaciones de células diferenciadas que se implantaron y se dejaron madurar in vivo expresaron insulina en respuesta a la exposición a glucosa a niveles fisiológicamente apropiados.
Tabla 1 a: Protocolo de diferenciación
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Tabla 1b: Resultados de citometría de flujo para marcadores seleccionados de diferenciación
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Tabla 1c: Protocolo de diferenciación
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Ejemplo de referencia 2
Suspensión y agrupación de células madre embrionarias humanas de la línea celular H1 con EDTA
Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, (células WA01, WiCell, Madison WI) en el pase 41 se lavaron una vez con PBS (n.° de catálogo 14190, Invitrogen) y se trataron con EDTA, un agente no enzimático de levantamiento/pase de células (Lonza, n.° de catálogo 12604-013, St. Louis, MO). Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 8 minutos. A continuación, se retiró el EDTA y, después de 1 ó 2 minutos más (9-10 minutos de exposición total a EDTA), se enjuagó la placa con medio mTeSR1® que contenía y-27632 10 pM (n.° de catálogo de Axxora ALX-270-333, San Diego, CA) y se recogieron las células desprendidas en un tubo cónico de 50 ml usando una pipeta de vidrio. Se realizó un enjuague adicional de la placa con medio mTeSR1® que contenía y-27632 10 pM y se agrupó con las células desprendidas. Se observa que algunas células permanecieron en la placa después de 9-10 minutos de exposición a EDTA a temperatura ambiente, y las células levantadas no se desagregaron completamente a una suspensión unicelular. En su lugar, las células se retiraron de la superficie como pequeños agregados. A continuación, los medios y las células se transfirieron a un tubo cónico de 50 ml usando una pipeta de vidrio y se realizó un recuento celular (NucleoCounter-Chemetec, n.° de cat. YC-T100, Dinamarca). Se añadió medio mTeSR1® adicional que contenía y-27632 10 pM según fuera necesario para lograr una concentración de células de 1,0 a 1,5 millones de células/ml.
Las células no se centrifugaron, ya que las agrupaciones estaban poco agregadas y se disociarían en células individuales si se centrifugan para dar un sedimento y vuelven a suspenderse con una pipeta. En su lugar, se agitaron suavemente los medios y las células en el tubo hasta que se formó una suspensión uniforme. Si se desea, también puede alargarse el periodo de tratamiento con EDTA y llevar las células hasta casi una suspensión unicelular. A continuación, la suspensión celular se transfirió a dos placas de 6 pocillos no tratados para histocultivo (Becton Dickinson, n.° de catálogo Falcon 351146, Franklin Lakes, NJ) en una incubadora a 37°C humidificada con el 5% de CO2 a 3 ml/pocillo con una pipeta de vidrio. Las células se incubaron en suspensión durante 2 horas, momento en el que se observaron los agregados. A continuación, los agregados se trituraron mediante un suave pipeteo con una pipeta de vidrio para romper los agregados grandes y crear una suspensión de agrupaciones homogénea y uniforme, y luego se incubaron sin romperlos durante la noche.
A continuación, 18-24 horas después, las células y el medio se centrifugaron en tubos cónicos de 50 ml a 90 g (rcf) durante 3 minutos. El sobrenadante del medio gastado se desechó, los agregados celulares se suspendieron en mTeSRI® recién preparado y la suspensión se transfirió a un frasco centrifugador (Corning, n.° de catálogo 4500­ 125, Corning NY) con agitación a 55 rpm en una incubadora a 37°C humidificada con el 5% de CO2. El medio se cambió diariamente durante 2 días. La pluripotencia se determinó después de 2 días en cultivo en suspensión con agitación antes de la transición al cultivo de diferenciación. Los resultados de citometría de flujo para la expresión de CD9, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 y CXCR4 se muestran en formato de gráfico de dispersión en la figura 2a. Estos datos muestran una alta expresión de los marcadores de pluripotencia (CD9, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81) y una baja o nula expresión de un marcador de diferenciación (CXCR4). Estos resultados indican que las células hES H1 pueden transferirse a un cultivo en suspensión desde un formato de cultivo adherente plano usando un método de levantamiento no enzimático y mantener la pluripotencia en un sistema de cultivo en suspensión con agitación dinámico.
Después de 2 días en cultivo en suspensión, los agregados de células pluripotentes se diferenciaron con una progresión gradual de los componentes del medio para inducir a las células a formar un destino pancreático. La agitación del centrifugador se mantuvo a una velocidad de 55 rpm. Los medios y los componentes se muestran en la tabla 2a.
Al final de la etapa 1, se ejecutaron las muestras para citometría de flujo y PCR. Los cultivos diferenciados en suspensión formaban una población uniforme y homogénea de células en agregados sueltos al final de la etapa 1 (figura 2b), con una expresión de un marcador de pluripotencia (CD9) casi eliminada, mientras que CXCR4 (CD184), un marcador de diferenciación del endodermo definitivo, era bastante alta, el 95,9% ± 1,8 D.E. (figura 2c) en los tres frascos centrifugadores. Estos resultados se correlacionaron con los resultados de la qRT-PCR, que mostraron una drástica disminución de la expresión de los genes de pluripotencia (CD9, NANOG y POU5F1/OCT4) y un gran aumento de los genes asociados con el endodermo definitivo (CXCR4, CERBERUS, g Sc , FOXA2, GAtA4, GATA6, MNX1 y SOX17) frente a células hES WA01 indiferenciadas (figura 2d).
Las agrupaciones de endodermo definitivo de los frascos centrifugadores se agruparon y se distribuyeron en o bien otro frasco centrifugador o bien un matraz de Erlenmeyer (sistema de agitación con sacudida) y se dirigieron para una diferenciación adicional hacia un intestino anterior primitivo mediante la retirada de GDF8 y la adición de FGF7 a los medios. Después de tres días de cultivo con FGF7, las agrupaciones se diferenciaron a un destino pancreático que expresaba PDX1 mediante la adición de ácido todo-trans-retinoico a un medio que contenía una concentración de glucosa relativamente baja (8 mM) y albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos al 2%. La adición detallada de los componentes a estos medios se indica en la tabla 2a. Al final de la diferenciación, se analizaron las muestras para determinar la expresión de los marcadores de las células precursoras del páncreas. Mediante citometría de flujo, se observaron altos niveles de NKX6.1, un factor de transcripción necesario para las células p funcionales, y altos niveles de marcadores pancreáticos endocrinos tales como sinaptofisina y cromogranina (tabla 2b y figura 2e) con ambos formatos de suspensión. Estos resultados fueron compatibles con los resultados de la rT-PCR que mostraron altos niveles muy similares de múltiples genes precursores pancreáticos expresados en las muestras generadas en formato de frasco centrifugador o en formato de matraz de Erlenmeyer (figura 2f).
Estos resultados demuestran que puede formarse un agregado de células pluripotentes y luego diferenciarse en cultivo en suspensión en múltiples formatos de cultivo en suspensión, incluyendo un sistema con agitación o un sistema de suspensión con sacudida, para generar una población de células precursoras pancreáticas caracterizadas por la expresión de factores de transcripción de células p tales como PDX1 y NKX6.1.
Tabla 2a: Componentes de los medios y protocolo de diferenciación
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Tabla 2b: Resultados de citometría de flujo para marcadores seleccionados de diferenciación
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Ejemplo de referencia 3
Agrupación en suspensión y pase en suspensión en serie de células madre embrionarias humanas de la línea celular H1
Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, (células WA01, WiCell, Madison WI) en el pase 40 que se hicieron crecer en poliestireno tratado con histocultivo y recubierto con Matrigel® se lavaron dos veces con PBS (n.° de catálogo 14190, Invitrogen) y se trataron con una disolución de Accutase™ diluida a la mitad (una parte de PBS con respecto a una parte de Accutase, Sigma, n.° de catálogo 12604-013, St. Louis, MO). Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 3 A minutos. (Accutase™ es una disolución de desprendimiento celular que se compone de enzimas colagenolíticas y proteolíticas (aisladas de crustáceos) y no contiene productos derivados de mamíferos o bacterias). A continuación, se retiró Accutase™ y, después de 3 minutos más (6 A minutos de exposición total a Accutase), se enjuagó la placa con medio mTeSR1® que contenía y-27632 10 pM y se recogieron las células desprendidas en un tubo cónico de 50 ml usando una pipeta de vidrio. Se realizó un enjuague adicional de la placa con medio mTeSR1® que contenía y-27632 10 pM y se agrupó con las células desprendidas. Algunas células permanecieron en la placa después de la exposición a Accutase™ y las células levantadas no se desagregaron completamente hasta formar una suspensión unicelular. Más bien las células se retiraron de la superficie como pequeños agregados (figura 3a). A continuación, se transfirieron los medios y las células a un tubo cónico de 50 ml usando una pipeta de vidrio y se realizó un recuento celular. Se añadió medio mTeSR1® adicional que contenía y-27632 10 pM según fuera necesario para lograr una concentración de células de 1,0 a 1,5 millones de células/ml.
Las células no se centrifugaron, ya que las agrupaciones estaban poco agregadas y se disociarían en células individuales si se centrifugan para dar un sedimento y se vuelven a suspender con una pipeta. En su lugar, los medios y las células del tubo se agitaron suavemente hasta que se formó una suspensión uniforme. A continuación, la suspensión celular se transfirió a dos placas de 6 pocillos de cultivo de unión ultrabaja en una incubadora a 37°C humidificada con el 5% de CO2 a 3 ml/pocillo con una pipeta de vidrio. Las células se incubaron en suspensión durante 90 minutos, momento en el que se observaron los agregados. A continuación, los agregados se trituraron brevemente y se transfirieron directamente a un frasco centrifugador de 125 ml que contenía 25 ml de medio mTeSR1® con agitación a 55 rpm (el volumen final total fue de aproximadamente 75 ml). El medio se cambió diariamente durante 3 días, y la pluripotencia se determinó al tercer día de cultivo. Las imágenes de microscopio de contraste de fases de las agrupaciones muestran una población uniforme y esférica de agrupaciones que se formó después de 90 minutos en cultivo estático en suspensión y se expandió a lo largo de tres días en cultivo (figura 3b). Al final de los tres días de cultivo en suspensión, se analizó la pluripotencia de las células mediante resultados de citometría de flujo para los marcadores CD9, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 y CXCR4. Las células mantuvieron una alta expresión de marcadores de pluripotencia (CD9, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81) y casi ninguna expresión de CXCR4, un marcador de diferenciación (tabla 3). Estos datos demuestran que las células hES H1 pueden transferirse a un cultivo en suspensión desde un formato de cultivo adherente plano usando un método de levantamiento enzimático, tal como Accutase™, y que mantendrán la pluripotencia en un sistema de cultivo en suspensión con agitación dinámico.
A continuación, las agrupaciones pluripotentes se pasaron en serie usando la disociación con Accutase™ durante 20 pases adicionales. En cada pase, 50 millones de células se sedimentaron por gravedad durante 2 minutos en un tubo cónico de 50 ml, se lavaron dos veces con PBS y se trataron con una disolución de Accutase™ diluida a la mitad en un baño de agua a 37°C, agitando suavemente el tubo a los dos y cuatro minutos después de la adición de Accutase™. Después de seis minutos de incubación, se aspiró Accutase™ del tubo sin romper el sedimento celular. A continuación, las células se incubaron 3 minutos más (9 minutos de exposición total a Accutase™). A continuación, se enjuagó el tubo con medio mTeSR1® que contenía y-27632 10 pM, se trituró dos veces con una pipeta de vidrio y las células suspendidas se pasaron a través de un filtro celular de 70 micrómetros (BD Falcon, n.° de cat. 352350, Franklin Lakes, NJ). Se realizaron dos enjuagues adicionales del tubo con medio mTeSR1® que contenía y-27632 10 |iM y se pasaron a través del filtro celular.
Los medios y las células en el tubo se removieron suavemente hasta que se formó una suspensión uniforme. A continuación, la suspensión celular se transfirió a placas de 6 pocillos de cultivo de unión ultrabaja en una incubadora a 37°C humidificada con el 5% de CO2 con una pipeta de vidrio y se incubó en suspensión durante 2 horas (se sometió a prueba 0-28 horas), momento en el que los agregados se transfirieron a un frasco centrifugador de vidrio con un volumen final de 80 ml de medio. Alternativamente, la suspensión celular podía colocarse directamente en un frasco centrifugador con agitación a 55 rpm o en un matraz de Erlenmeyer con agitación a 40 rpm, y se formaron agrupaciones en la suspensión con agitación (figura 3c) en un volumen final de 80 ml de medio.
Usando este método de pases en serie, las células se pasaron 20 veces, con una razón de división aproximada de 1:3 en cada pase. La pluripotencia se midió en cada pase mediante citometría de flujo y el cariotipo se determinó mediante un ensayo de hibridación in situ fluorescente (FISH) para los cromosomas 12 y 17, dos cromosomas identificados como potencialmente inestables en las células hES. Los resultados de citometría de flujo para la expresión de CD9, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 y CXCR4 se muestran en formato de gráfico de dispersión y muestran una alta expresión de los marcadores de pluripotencia y una baja o nula expresión de un marcador de diferenciación (CXCR4), mientras que los ensayos FlSH para los cromosomas 12 y 17 mostraron un número de copias normal. Estos datos indican que las células hES H1 pueden mantenerse en cultivo en suspensión con pases en serie rutinarios usando Accutase™, un método de disociación celular enzimática no mamífero, y mantendrán la pluripotencia y el cariotipo estable en un sistema de cultivo en suspensión con agitación dinámico, generando 1*109 células por cada célula original de entrada en el transcurso de 20 pases. (También puede usarse EDTA para esta suspensión en serie durante 6 pases).
Tabla 3: Citometría de flujo para la pluripotencia de las células en función del tiempo, basándose en los resultados de los marcadores CD9, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 y CD184 (CXCR4)
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Ejemplo de referencia 4
Diferenciación dirigida de células madre embrionarias humanas cultivadas en suspensión de la línea celular H1 Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, (células WA01, WiCell, Madison WI) en el pase 40 se levantaron a partir de un cultivo adherente plano usando Accutase™ y se transfirieron al formato de cultivo en suspensión. Las células se mantuvieron en un sistema de cultivo en suspensión con agitación dinámico durante 30 pases usando el método descrito en el ejemplo 3.
La pluripotencia se confirmó durante los primeros 20 pases, tal como se muestra en la tabla 3, con altos niveles estables de marcadores de pluripotencia mantenidos en todo el cultivo, tal como se mide mediante citometría de flujo. Para confirmar la pluripotencia y demostrar su capacidad para proporcionar una fuente de células para el tratamiento de la diabetes, las células se diferenciaron a un precursor pancreático en un sistema de cultivo en suspensión con agitación dinámico mediante una progresión gradual de diferentes medios que contenían morfógenos o factores de crecimiento destinados a recapitular el desarrollo pancreático normal. Este proceso da lugar a una población de células precursoras pancreáticas caracterizada por una alta coexpresión de PDX1 y NKX6.1. Cuando estas células se trasplantaron, maduraron adicionalmente a tejido funcional secretor de insulina estimulado por glucosa, que puede secretar insulina en respuesta a la glucosa y mantener una glucemia normal en un modelo de diabetes inducido por estreptozotocina. Véase la figura 4C y la tabla 4c.
Con el fin de generar estas células precursoras pancreáticas, las células madre embrionarias humanas H1 que se habían expandido y mantenido en un sistema de cultivo en suspensión con agitación dinámico durante 16 pases se diferenciaron usando el método descrito en el ejemplo 3. En resumen, las células se expandieron durante 30 pases, se sometió a prueba la pluripotencia durante los primeros 20 de estos pases; las células se diferenciaron en el 16° pase. Las células pluripotentes en formato de agrupación se transfirieron desde el medio mTeSRI® hasta la disolución de FBC (tabla 4a) a 4°C durante 3 horas. A continuación, las agrupaciones de células se trasladaron a un biorreactor de suspensión de vidrio de 3 litros regulado por una unidad de control Sartorius Stedim Biostat B-DCU (Goettingen, Alemania) y se suspendieron en medios de diferenciación a 0,55 millones de células/ml según la tabla 4b. Las células se mantuvieron 14 días en el biorreactor de suspensión estéril cerrado y regulado para la temperatura, el pH y el oxígeno disuelto (OD) (electrodo de pH Fermprobe 225 mm, n.° de modelo F-635, y sensor de oxígeno disuelto Oxyprobe 12 mm, número de modelo D-145 de Broadley James, Irvine CA).
En toda la ejecución, los niveles de bicarbonato de los medios se mantuvieron a 3,64g/l con un pH mantenido a pH 7,4 mediante la regulación del flujo de CO2 en un volumen total de medios de <1,6 litros. El espacio de cabeza del biorreactor se perfundió continuamente con CO2, aire y O2, bajo el control del sistema de control Sartorious con un punto de ajuste del 20% de oxígeno disuelto para la etapa 1 y un punto de ajuste del 30% de oxígeno disuelto para la etapa 2 en adelante con un flujo de gas constante de 150 cc/minuto. El flujo de oxígeno se reguló en respuesta al contenido de oxígeno disuelto y el flujo de CO2 se reguló en respuesta al pH. La temperatura se mantuvo a 37°C en toda la ejecución mediante una camisa calentada eléctricamente. Al inicio de la ejecución y para cada intercambio del medio (se retiró el 93% de los medios por intercambio) se detuvo el impulsor (un impulsor de palas de acero inoxidable de 3” que funcionaba a 70 rpm) y se retiró o se añadió el medio mediante una bomba peristáltica a través de un tubo de inmersión en el biorreactor conectado a un tubo C-flex™ usando un soldador de tubos Terumo™ para mantener un sistema cerrado. Se tomaron imágenes de las células/agrupaciones al final de cada etapa de diferenciación, y se recogieron muestras de citometría de flujo y se analizó la expresión de CXCR4 en el día 3 de la etapa 1, y 3 días después al final de la etapa 2 (figura 4a). Se observó una transición poblacional casi total desde una población de células pluripotentes negativas para CXCR4 al inicio de la diferenciación (tabla 3, pase 16) hasta una población de células que expresan CXCR4 (98,5% de células positivas para CXCR4, figura 4b). Estas células luego pasaron a un estado casi negativo para CXCR4 3 días después, al final de la etapa 2 (7,0% de células positivas para CXCR4), y al final de la etapa 3 las células habían pasado casi completamente a un estado positivo para CD56. Al final del proceso de diferenciación, en el día 4 de la etapa 4, las células eran positivas en el 88,5% para la expresión de PDX1 (figura 4b) y mostraban un patrón de expresión compatible con una mezcla de células endocrinas pancreáticas (33,5% positivas para cromogranina) y células progenitoras pancreáticas (65,7% positivas para NKX6.1). Este patrón de expresión de los marcadores específicos de cada etapa indica una diferenciación eficiente gradual desde una población pluripotente a células pancreáticas. Al final del proceso de diferenciación se generaron 2,77 millones de células/ml (4,1 mil millones de células en 1,5 litros), lo que indica una expansión en masa total de 5 células diferenciadas por cada célula hES de entrada.
Al final de la ejecución, se retiraron 500 ml para centrifugación y lavado y se sometieron a prueba en un modelo animal de injerto, maduración y función. Los 1000 ml restantes de suspensión celular se procesaron en un sistema k-Sep 400 (k-Sep systems, Durham NC) para lavar, filtrar y concentrar el producto celular en un sistema de circuito cerrado. El producto celular se concentró desde un volumen inicial de 1 litro hasta 50 ml de células concentradas a una concentración final de 41 millones de células/ml. A continuación, estas células concentradas se dispensaron en 24 viales con un volumen de llenado de 1,2 ml usando una máquina de llenado de viales automatizada (Fill-It, TAP, Hertfordshire, RU) y se congelaron colocándolas en un congelador de nitrógeno líquido.
Las células diferenciadas de 500 ml que se lavaron y se concentraron mediante centrifugación convencional se trasplantaron a una dosis de 5 millones de células por ratón SCID-Bg colocadas o bien directamente debajo de la cápsula renal, o bien colocadas dentro de un dispositivo de macroencapsulación inmunoprotector (Theracyte™, Irvine CA) que se implantó subcutáneamente (6 animales por condición). A las 12 semanas tras la implantación, las células implantadas expresaban niveles significativos de péptido C humano circulante (>0,1 ng/ml) tal como se detecta mediante ELISA (ELISA para péptido c humano personalizado, n.° de cat. de Mercodia 10-1141-01) en respuesta al ayuno y luego a la alimentación y a las 16-20 semanas los animales tenían más de 1 ng/ml de péptido c circulante (tabla 4c).
A las 27 semanas (190 días) tras la implantación, dos animales con injertos inmunoprotegidos encapsulados en el dispositivo se trataron cada uno con una única dosis alta de estreptozoticina (STZ) para destruir selectivamente todas las células p endógenas de los islotes del ratón e inducir la diabetes (250 mg/kg). Durante las dos semanas siguientes a un tratamiento con STZ suficiente para inducir una diabetes franca en un animal de control, los niveles de glucemia de los animales injertados se mantuvieron dentro del intervalo normal (<150 mg/dl). A las 29 semanas de la implantación y dos semanas después de la administración de STZ, a continuación los dos animales fueron sometidos a pruebas de secreción de insulina sensible a la glucosa (GSIS) y mostraron un marcado aumento del péptido c humano circulante en respuesta a la administración de glucosa. Además, cuando se retiró cada uno de los injertos el día 209 (29,5 semanas) después de la implantación, los niveles de glucemia de los animales aumentaron drásticamente hasta >500 mg/dl.
Estos resultados demuestran que puede prepararse un producto celular derivado de células madre embrionarias humanas para tratar la diabetes a partir de una suspensión de células madre expandidas y diferenciadas. El producto puede generarse en un sistema de biorreactor escalable, con agitación y de bucle cerrado, y el producto celular puede procesarse con un lavado y una concentración de bucle cerrado, tal como se requiere para la fabricación comercial cGMP. Este producto celular derivado de células madre embrionarias humanas puede tratar la diabetes en un modelo animal de diabetes ampliamente utilizado, como lo demuestra la competencia de GSIS, la capacidad de regular la glucemia y la vuelta al estado diabético tras la retirada de la terapia celular.
Tabla 4a: Composición de la disolución de FBC
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a USP = Farmacopea de los Estados Unidos
b NF = Formulario Nacional
c FCC = Código de productos químicos de los alimentos
d NA = No aplicable
e ACS = Sociedad Química Americana
Tabla 4b: Componentes de los medios y protocolo de diferenciación
Figure imgf000028_0001
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(Nomenclatura: Tiempo 0= primera alimentación de la nueva etapa; Tiempo 24, 48 ó 96
horas = tiempo después de los medios de la nueva etapa)
Tabla 4c: Expresión del péptido C (ng/ml)
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Ejemplo de referencia 5
Diferenciación dirigida en formato de suspensión de células madre embrionarias humanas cultivadas de manera adherente de la línea celular H1
Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, (células WA01, WiCell, Madison WI) en el pase 41 se levantaron a partir de un cultivo adherente plano usando EDTA y se transfirieron al formato de cultivo en suspensión usando el método descrito en el ejemplo 2.
La pluripotencia de los agregados celulares se midió mediante citometría de flujo, tal como se muestra en la figura 5a, y se observó una alta expresión de los marcadores de pluripotencia CD9, SSEA4, TRA-1-61 y TRA-1-80, lo que indica que las células eran altamente pluripotentes. A continuación, estas células pluripotentes se diferenciaron a un precursor pancreático en un sistema de cultivo en suspensión agitado en condiciones dinámicas mediante una progresión gradual de diferentes medios que contenían moléculas pequeñas y factores de crecimiento destinados a recapitular los impulsores morfogénicos del desarrollo pancreático normal. Este proceso produce una población de células precursoras pancreáticas caracterizada por la coexpresión de los factores de transcripción de las células pancreáticas, PDX1 y NKX6.1. Cuando estas células se trasplantan, maduran hasta convertirse en tejido funcional secretor de insulina estimulado por glucosa, que puede corregir una alta glucemia en un modelo de diabetes inducido por estreptozotocina.
Con el fin de generar la población de células precursoras pancreáticas, las células pluripotentes en formato de agrupación mantenidas en medio mTeSR1® se transfirieron a un biorreactor de suspensión con agitación de vidrio de 0,2 litros (Dasgip, n.° de catálogo SR0200, Shrewsbury, MA) con la temperatura, el pH y el oxígeno disuelto regulados por un controlador. Las agrupaciones de células pluripotentes se cultivaron en el biorreactor durante dos días. En ese momento (día 0 de la etapa 1) se cambiaron los medios y se inició la diferenciación, ya que los agregados celulares se suspendieron a aproximadamente 0,7 millones de células/ml en medios de diferenciación según la tabla 5a. Las células se mantuvieron en este biorreactor de suspensión estéril cerrado durante 14 días. En toda la diferenciación, los niveles de bicarbonato del medio se mantuvieron a 3,64 g/l con un pH mantenido a 7,4 mediante la regulación del flujo de CO2 en un volumen total de 0,3 litros. El espacio de cabeza del biorreactor se burbujeó con CO2 y aire bajo el control del sistema de control Dasgip con un punto de ajuste del 30% de oxígeno disuelto bajo un flujo de gas constante de 5 litros/hora. El flujo de aire se reguló en respuesta al contenido de oxígeno disuelto y el flujo de CO2 se reguló en respuesta al pH.
Tabla 5a: Componentes de los medios y protocolo de diferenciación
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La temperatura se mantuvo a 37°C en toda la ejecución. Al inicio de la ejecución y para cada intercambio del medio (se retiró el 95% de los medios por intercambio) se detuvo el impulsor y se retiró el medio y luego se añadió mediante una bomba peristáltica a través de un tubo de inmersión del biorreactor conectado a un tubo C-flex™ usando un soldador de tubos Terumo™ para mantener un sistema cerrado.
Se sometieron a prueba varias configuraciones diferentes de alimentación durante la etapa 1: (a) cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación, sin cambio del medio a las 48 horas; (b) cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación y adición de bolo de glucosa a las 48 horas; y (c) sin cambio del medio durante la etapa 1 con adición de bolo de glucosa y GDF824 horas después del inicio de la diferenciación, y luego adición de un bolo de glucosa a las 48 horas tras el inicio.
Se tomaron recuentos celulares al inicio, a la mitad y al final del proceso para cada reactor, tal como se indica en la tabla 5b. Al final de la etapa 1, se tomaron muestras de las células para determinar los patrones de expresión de proteínas mediante citometría de flujo. Las células diferenciadas en la condición A, cambio del medio a las 24 horas después del inicio de la diferenciación a endodermo definitivo, luego sin cambio del medio durante las siguientes 48 horas, mostraron los mejores resultados medidos por la inducción de marcadores de diferenciación (CD99 y CXCR4) y la reducción de la expresión del marcador de pluripotencia (CD9) (figura 5b). La mayor expresión de CXCR4 y CD99 en combinación con la menor expresión de CD9 al final de la formación de endodermo definitivo se correlacionó con la mayor expresión de genes pancreáticos y la menor expresión de genes indicativos de destinos de órganos alternativos más adelante en la diferenciación (figuras 5d y 5e1-4). Específicamente, uno o ambos de no cambiar el medio en toda la primera etapa de diferenciación y/o añadir glucosa al medio en la etapa 1 en un formato de alimentación a granel dio como resultado niveles más bajos de CXCR4 al final de la etapa 1, lo que se correlacionó con morfologías de agregados muy diferentes al final de la diferenciación de la etapa cuatro (figura 5c). Específicamente, las condiciones B y C tenían una menor expresión de genes pancreáticos (NKX6.1 y CHGA) y una mayor expresión de genes no pancreáticos (CDX2 y SOX2) al final de la etapa 4, tal como se mide mediante citometría de flujo (figura 5d y tabla 5b). Estos hallazgos se confirmaron mediante qRT-PCR (figura 5e1-5e4), ya que la condición A mostró una expresión significativamente mayor de genes pancreáticos que la condición C, con la condición B intermedia a la A y la C. Además, la condición C expresó niveles significativamente mayores de genes indicativos de un destino alternativo no pancreático, por ejemplo, CDX2, AFP y albúmina (figura 5e4). Estos datos indican que un endodermo definitivo (ED) homogéneo y con alta expresión de CXCR4, generado sin cambio del medio durante las últimas 48 horas de formación del ED, puede convertirse posteriormente en una población de endodermo pancreático puro.
Al final de las cuatro etapas de diferenciación, las células diferenciadas según la condición A se retiraron del biorreactor, se lavaron con medio MCDB131 que contenía FAF-BSA al 0,1% y se implantaron en ratones SCID-Bg. A cada ratón se le trasplantaron 5 millones de células directamente debajo de la cápsula renal. Cada 4 semanas después de la implantación se realizaron extracciones de sangre y se midieron la glucemia y el péptido c en sangre. A las 12 semanas de la implantación, el péptido c humano era detectable por ELISA a niveles superiores a 1 ng/ml, y a las 16 semanas los niveles de péptido c eran un promedio de 2,5 ng/ml (figura 5f). A las 20 semanas tras la implantación, se midió el péptido c en los animales en ayunas y luego en estado posprandial. El tratamiento con glucosa indujo un aumento significativo del péptido c humano circulante, de desde 0,93 ng/ml en ayunas hasta 2,39 ng/ml en estado posprandial (figura 5g), lo que indica que las células trasplantadas habían madurado para dar tejido funcional competente para GSIS. Además, cuando los animales recibieron una administración de estreptozotocina (STZ) (las células p de ratón son más sensibles a STZ y se destruyen preferiblemente mediante STZ en comparación con las células p humanas) para inducir un estado diabético, los animales con un injerto de tejido competente en GSIS funcional mantuvieron una glucemia normal, a diferencia de los controles no tratados que desarrollaron una diabetes franca (figura 5h). Estos resultados demuestran que los animales con un injerto de células diferenciadas hES estaban protegidos de la diabetes inducida por STZ gracias a un injerto de tejido pancreático funcional.
Tabla 5b: Recuentos celulares y datos de citometría de flujo
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Ejemplo de referencia 6
Diferenciación dirigida en formato de suspensión de células madre embrionarias humanas cultivadas de manera adherente en microportador de la línea celular H1
Las perlas microportadoras Cytodex® 3 (C3) (Sigma-Aldrich, n.° de catálogo C3275) se prepararon para el cultivo remojando 400 mg de las perlas en viales de centelleo de vidrio recubiertos de silicona de 20 ml de volumen que contenían 15 ml de PBS de Dulbecco (DPBS), durante 4-24 horas. (Cytodex® 3 consiste en una fina capa de colágeno desnaturalizado acoplada químicamente a una matriz de dextrano reticulado). La capa de colágeno desnaturalizado en Cytodex ®3 es susceptible a digestión por una variedad de proteasas, incluyendo tripsina y colagenasa, y proporciona la capacidad de retirar las células de los microportadores manteniendo la máxima viabilidad, función e integridad celular.
Después del remojo, las perlas se esterilizaron en autoclave, se enjuagaron con DPBS estéril y volvieron a suspenderse en medio condicionado de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF-CM) complementado con Y27632 10 |iM. A continuación, las perlas se transfirieron a frascos centrifugadores de vidrio Corning de 125 ml a una densidad de 100 mg de perlas/frasco. El frasco centrifugador que contenía las perlas y MEF-CM con Y27632 se equilibró en una incubadora humidificada con el 5% de CO2 a 37°C durante al menos 60 minutos.
Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1, (células WA01, WiCell, Madison WI) en el pase 44 se levantaron a partir de un cultivo adherente plano usando TrypLE (incubación de 8 minutos a 37°C para formar una suspensión unicelular). A continuación, se lavaron las células y se suspendieron en MEF-CM con Y27632 y se dejó que 11 millones de células hES se adhirieran a las perlas durante 6 horas en un periodo de incubación estático (inmóvil). A continuación, se añadió MEF-CM con Y27632 a un frasco centrifugador para obtener un volumen final del medio de 75 ml, y las células y las perlas se agitaron en el frasco centrifugador de vidrio a una velocidad del impulsor de 50 rpm. Las células se hicieron crecer de esta manera durante 5 días con un intercambio del medio diario de 50 ml de MEF-CM. Después de 5 días en cultivo, los frascos contenían 53*106 células (±12*106 de D.E.). Como control, también se sembró un millón de células hES H1 en placas de poliestireno de 6 pocillos de histocultivo recubiertas con una dilución 1:30 de Matrigel™ y se mantuvieron con un cambio diario de medio de MEF-CM.
Después de 5 días en cultivo pluripotente, estas células luego se diferenciaron a un precursor pancreático en un sistema de cultivo en suspensión con agitación dinámico mediante una progresión gradual de diferentes medios que contenían una o ambas moléculas pequeñas y factores de crecimiento destinados a recapitular los morfógenos del desarrollo pancreático normal. Se sometieron a prueba dos formulaciones de los medios como método para recapitular el desarrollo pancreático normal; una que usaba activina A y Wnt3A para formar ED, y otra que usaba el compuesto MCX con GDF8 para formar ED (tablas 6a y 6b, respectivamente). Los medios se cambiaron diariamente y las muestras se caracterizaron mediante RT-PCR y citometría de flujo para determinar las propiedades de las células. Se tomaron imágenes de contraste de fases de las células sobre microportadores y en la figura 6a se muestra un curso temporal de la morfología celular como cultivo pluripotente antes de que se iniciara la diferenciación de las células. En la figura 6b se muestra un curso temporal que muestra la diferenciación del cultivo. También se tomó un recuento celular en diversos puntos temporales durante el experimento, y los resultados se presentan en función del área de superficie (células/cm2 en la figura 6c) o del volumen de los medios (células/ml en la figura 6d) para las formulaciones de los medios en un cultivo plano o en un cultivo de microportadores en suspensión.
Las células se caracterizaron en varios puntos del proceso mediante tanto citometría de flujo como RT-PCR. Los resultados de citometría de flujo para la primera etapa de diferenciación, la formación de endodermo definitivo, se muestran como un gráfico de puntos de la expresión celular de CXCR4 (eje Y) y CD9 (eje X) en la figura 6e y los resultados también se expresan como expresión total de cada marcador en la figura 6f. Los resultados indican que en todas las condiciones una mayoría sustancial de las células forman endodermo definitivo, tal como se define por la ganancia de expresión de CXCR4 y la pérdida del marcador de superficie de pluripotencia, CD9. Además, la formación más eficiente de endodermo definitivo se produce en orden de importancia de tratamiento, de microportadores de MCX/GDF8 > MCX/GDF8 plano > microportadores de WNT3A/a A > WNT3A/AA plano. Parece haber un efecto específico de los medios sobre las células, ya que las células tratadas con MCX/GDF8 muestran una menor expresión de CERBERUS (Cer 1), GOOSeCo ID y FGF17 (figura 6g). Sin embargo, todas las condiciones de tratamiento muestran niveles de expresión similares de los genes del endodermo definitivo: CD99, CXCR4, FOXA2, KIT y SOX17 (figura 6g y tabla 6c). Estos procesos generan una población de células precursoras pancreáticas caracterizada por la coexpresión de los factores de transcripción de las células pancreáticas, PDX1 y NKX6.1. Cuando estas células se trasplantan, maduran hasta convertirse en tejido funcional secretor de insulina estimulado por glucosa, que puede corregir una alta glucemia en un modelo de diabetes inducido por estreptozotocina.
Tal como se usa en este ejemplo, el compuesto MCX es 14-prop-2-en-1-il-3,5,7,14,17,23,27-heptaazatetraciclo[19.3.1.1~2,6-~.1~8,12.~]heptacosa-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-non-aen-16-ona, que tiene la siguiente fórmula (fórmula 1):
Figure imgf000032_0001
También pueden usarse otras anilina-piridinotriazinas cíclicas en lugar del compuesto MCX descrito anteriormente. Tales compuestos incluyen, pero no se limitan a 14-metil-3,5,7,14,18,24,28-heptaazatetraciclo[20.3.1.1~2,6~.-1~8,12~]octacosa-1(26),2(28),3,5,8(27),9,11,22,24-nonaen-17-on-a y 5-cloro-1,8,10,12,16,22,26,32-octaazapentaciclo[24.2.2.1~3,7~-1~9,13~.1~14,18~]tritriaconta-3(33),4,6,9(32),10-,12,14(31),15,17-nonaen-23-ona. Estos compuestos se muestran a continuación (fórmula 2 y fórmula 3):
Figure imgf000033_0001
En la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0015711 se dan a conocer compuestos adecuados a modo de ejemplo.
Tabla 6a: Formulaciones de los medios y protocolo de diferenciación
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Tabla 6b: Formulaciones de los medios y protocolo de diferenciación
Figure imgf000033_0004
Tabla 6c
Figure imgf000033_0002
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Ejemplo de referencia 7
Para este ejemplo se usó un subclón de la línea de células hES H1 (WA01), WB0106. WB0106 se derivó del Instituto de Investigación WiCell (Madison, WI) a partir de material de siembra de la línea H1 denominado DDL-13. El subclón WB0106 de la línea H1 se derivó de un vial de DDL-13 descongelado en el pase 23 en medio mTESR1™ en un sustrato de Matrigel™, y posteriormente se pasó usando EDTA. WB0106 se congeló en el pase 28 y se seleccionó para estos estudios partiendo de una base de un cariotipo normal (FISH y banda G), la capacidad de diferenciarse a células progenitoras pancreáticas y la competencia para formar agrupaciones y expandirse en cultivo en suspensión.
A continuación se descongeló un vial de WB0106 del BCT en medio sobre un sustrato de Matrigel™ en un frasco T225 (Corning; Corning, NY) y en el primer pase las células se expandieron en múltiples frascos T225. En el segundo pase, las células de los múltiples frascos T225 se combinaron y se usaron para sembrar un Cell Stack™ de dos capas (CS2). Una vez que el CS2 alcanzó el 70% de confluencia, se conectaron los tapones de montaje de tubos C-flex™ con tubos de bomba adyacentes a los puertos del medio para cerrar el sistema. Una vez cerrado el sistema con los tubos C-flex™, se soldaron las bolsas o botellas mediante el soldador Terumo y se transfirieron los volúmenes de líquido (medio, PBS'/_, Accutase™ o células en suspensión) usando una bomba peristáltica.
Para levantar las células del CS2, se lavaron las células una vez con PBS'/_, luego se trataron con una disolución diluida a la mitad de Accutase™ diluida en PBS'/_ y se incubaron durante de 4 a 5 minutos. A continuación se retiró Accutase y, 3 minutos después de la aplicación de la disolución enzimática, se golpeó a toquecitos el CS2 para favorecer el levantamiento de las células. Se bombeó una botella de medio complementado con BSA al 2% y que contenía 10 micromolar del inhibidor de la Rho cinasa, Y27632, en el CS2 para enjuagar e inactivar Accutase™ residual y luego se recogió el enjuague. Se añadió un segundo volumen de enjuague, se recogió y se juntó con el primer enjuague. A continuación, se transfirieron 2,0-2,5 * 108 células en 200 ml a un CellSTACK™ de 1 capa y se incubaron a 37° durante 2 horas en una incubadora humidificada con el 5% de CO2. Usando un bucle cerrado de tubo C-flex™ con un tubo de bombeo conectado entre los dos puertos del medio de CellSTACK™, la suspensión celular se trituró durante 5 minutos a 75 rpm mediante una bomba peristáltica para homogeneizar los agregados. El tubo de bucle cerrado se sustituyó por filtros estériles de 0,2 micrómetros para permitir el intercambio de gases y el CellSTACK se incubó durante la noche a 37° en una incubadora humidificada con el 5% de CO2. Después de la incubación durante la noche (12-22 horas, 18 horas en condiciones óptimas) las células en el CellSTACK formaron agregados esféricos redondeados (agrupaciones) de células pluripotentes.
El medio complementado con BSA al 2% que contenía las agrupaciones de células en suspensión se transfirió desde el CellSTACK™ hasta un frasco centrifugador desechable de 1 litro (Corning; Corning, nY) junto con 0,4 litros de medio recién preparado complementado con BSA al 2% y se mantuvo a 55-65 rpm. Veinticuatro horas después de la transferencia, se retiró el frasco centrifugador desechable de 1 litro de la incubadora humidificada con el 5% de CO2 y se dejó que las agrupaciones sedimentaran durante 5-10 minutos. A continuación, se aspiró el medio hasta que quedaron 200 ml en el recipiente y se añadieron 400 ml de medio de cultivo recién preparado adicional al frasco centrifugador. Este proceso se repitió al final del día 2 (48 horas después de la transferencia).
Al final del día 3 (72 horas después de la transferencia al frasco centrifugador desde el CS2), las agrupaciones de células se disociaron con el tratamiento con Accutase™ para su pase y posterior expansión. El proceso de pase se inició retirando el frasco centrifugador desechable de 1 litro de la incubadora humidificada con el 5% de CO2. El frasco se colocó en una placa centrifugadora dentro de una cabina de bioseguridad para mantener una suspensión homogénea de células. La suspensión celular se retiró del matraz de centrifugación con una pipeta de 100 ml y se distribuyó uniformemente entre cuatro tubos cónicos de policarbonato de 175 ml (ThermoFisher-Nalgene; Buffalo, NY) y se centrifugó durante 5 minutos a 80-200 rcf. El medio gastado se aspiró sin romper los sedimentos celulares. A continuación, se añadieron 25 ml de DPBS sin calcio ni magnesio (DPBS'/_) a cada tubo, y las células se combinaron en un tubo cónico y se centrifugaron durante 5 minutos a 80-200 rcf. El DPBS'/_ se aspiró del tubo cónico y se añadieron 30 ml de una disolución del 50% de Accutase™/el 50% de DPBS'/_ al tubo. Las agrupaciones de células se pipetearon hacia arriba y hacia abajo 1-3 veces, y luego se agitaron intermitentemente durante 4 minutos, y luego se centrifugaron durante 5 minutos a 80-200 rcf. A continuación, se aspiró Accutase™ lo más completamente posible sin romper el sedimento de células y se golpeó a toquecitos el tubo cónico continua y suavemente durante 3­ 5 minutos hasta que la suspensión de células tuvo un aspecto blanco lechoso uniforme. Se añadieron a la suspensión celular 10 ml de medio complementado con BSA al 2% que contenía el inhibidor de la Rho cinasa 10 micromolar, Y27632, y se trituró 2-4 veces para inactivar la Accutase™ residual. Se añadieron 90 ml de medio complementado con BSA al 2% que contenía inhibidor de la Rho cinasa 10 micromolar, Y27632, a las células y se pasó la suspensión a través de un filtro celular de 40 micrómetros (BD Falcon; Franklin Lakes, NJ).
La densidad celular en el volumen de 100 ml de la suspensión celular filtrada se determinó con un dispositivo NucleoCounter NC-100 (ChemoMetec, Dinamarca) y se añadió medio adicional para obtener una concentración celular final de 1 * 106 células/ml en medio complementado con BSA al 2% que contenía el inhibidor de la Rho cinasa 10 micromolar, Y27632. A continuación, se transfirieron 225 ml (225 millones de células) de la suspensión celular a un frasco centrifugador desechable de 1 litro y se incubó durante 1 hora sin agitación en una incubadora humidificada con el 5% de CO2. A continuación, se retiró el frasco de la incubadora y se agitó a 100 rpm en una placa centrifugadora en una cabina de bioseguridad durante 1-3 minutos. Mientras la suspensión celular se mezclaba, se añadieron a la suspensión celular 225 ml adicionales de medio complementado con BSA al 2% que contenía el inhibidor de la Rho cinasa 10 micromolar, Y27632. A continuación, el frasco centrifugador se devolvió a la incubadora humidificada con el 5% de CO2 durante 30 minutos. A continuación, se retiró el frasco de la incubadora y se agitó a 100 rpm en una placa centrifugadora en una cabina de bioseguridad durante 1-3 minutos. Mientras se mezclaba la suspensión celular, se añadieron 150 ml adicionales de medio complementado con BSA al 2% que contenía inhibidor de la Rho cinasa 10 micromolar, Y27632, a la suspensión celular para obtener un volumen final de 600 ml y el frasco volvió a la suspensión con agitación en la incubadora. Tanto a las 24 como a las 48 horas después de la disociación con Accutase™, se permitió que las agrupaciones de células sedimentaran en el fondo del frasco durante 5-10 minutos. Asegurándose de minimizar cualquier pérdida de agrupaciones, se retiraron 400 ml de medio gastado del frasco por aspiración y se sustituyeron por medio recién preparado. Mediante este proceso, las células H1 se convirtieron desde un cultivo adherente sobre un sustrato hasta un cultivo en suspensión como agrupaciones de células.
72 horas después del tratamiento inicial con Accutase™, se repitió el proceso de disociación de las agrupaciones de células y la siembra en el frasco centrifugador (pase) para mantener las células en suspensión durante múltiples pases (intervalo sometido a prueba: 1-10 pases). Se siguió el proceso anterior con la excepción de que después de las primeras 24 horas no se retiró el medio y se añadieron 200 ml de medio recién preparado. A las 48 horas después de la disociación con Accutase™, se permitió que las agrupaciones sedimentaran en el fondo del frasco durante 5-10 minutos, se aspiraron 600 ml y se añadieron 400 ml de medio recién preparado al frasco.
Estas células que se hicieron pasar y cultivadas en suspensión pudieron entonces crioconservarse y almacenarse para su uso futuro. Para preparar la célula expandida en suspensión para su crioconservación, las agrupaciones de células se disociaron con Accutase™ tal como se describió anteriormente para el pase en suspensión, excepto que las células no se pasaron a través de un filtro celular de 40 micrómetros. Se determinó el recuento celular de la suspensión celular de 100 ml generada en cada frasco desechable de 1 litro. A continuación, se combinaron las suspensiones celulares y se centrifugaron durante 5 minutos a 80-200 rcf. El medio del tubo de centrifugación se retiró entonces lo más completamente posible sin romper el sedimento celular. A continuación, se añadió CryoStor10 frío (<4°C) gota a gota para lograr una concentración final de 150 millones de células por ml y la disolución celular se mantuvo en un baño de hielo durante la transferencia a un vial criogénico Corning de 1,8 ml (Corning; Corning, NY) o a una bolsa criogénica Miltenyi de 15 ml (Miltenyi Biotec Inc. Auburn, CA).
A continuación, las células expandidas en suspensión se congelaron en un vial de alta densidad en un congelador de velocidad controlada de la siguiente manera. La cámara se enfrió previamente hasta 4°C y se mantuvo la temperatura hasta que la temperatura del vial de la muestra alcanzó 6°C. La temperatura de la cámara se redujo entonces 2°C/min hasta que la muestra alcanzó -7°C. Una vez que el vial de la muestra alcanzó -7°C, la cámara se enfrió 20°C/min hasta que la cámara alcanzó -45°C. A continuación, se dejó que la temperatura de la cámara aumentara brevemente a 10°C/min hasta que la temperatura de la cámara alcanzó -25°C, y luego se enfrió la cámara adicionalmente a 0,8°C/min hasta que el vial de la muestra alcanzó -45°C. A continuación, la temperatura de la cámara se enfrió a 35°C/min hasta que la cámara alcanzó -160°C. La temperatura de la cámara se mantuvo entonces a -160°C durante al menos 10 minutos, después de lo cual los viales se transfirieron al almacenamiento en nitrógeno líquido en fase gaseosa.
Con el fin de inocular un biorreactor de tanque agitado, las células crioconservadas de alta densidad se retiraron del almacenamiento en nitrógeno líquido, se descongelaron y se usaron para sembrar un biorreactor de vidrio cerrado de 3 litros (DASGIP; Julich, Alemania). Se retiraron cuatro o cinco viales del almacenamiento en nitrógeno líquido en fase gaseosa y se colocaron directamente en un baño de agua a 37°C durante 105 segundos. A continuación, el contenido del vial descongelado se transfirió mediante una pipeta de vidrio de 2 ml a un tubo cónico de 50 ml. A continuación, se añadieron al tubo 9 ml de medio (IH3 o E8) que contenía BSA al 2% y se complementó con el inhibidor de la Rho-cinasa 10 micromolar, Y27632, gota a gota. A continuación, se centrifugaron las células a 80-200 rcf durante 5 minutos. Se aspiró el sobrenadante del tubo, se añadieron 10 ml de medio recién preparado (IH3 o E8) con BSA al 2% y complementado con un inhibidor de la Rho-cinasa 10 micromolar, Y27632, y el volumen que contenía las células se pipeteó en una botella de transferencia de medios (Cap2V8, Sanisure, Indianápolis, IN). A continuación, el contenido de la botella se bombeó directamente al biorreactor a través de un tubo C-flex estéril soldado por una bomba peristáltica. Como preparación para la inoculación de las células madre pluripotentes, el biorreactor se preparó con 1,5 l de medio (IH3 o E8 complementado con BSA al 2% y que contenía un inhibidor de la Rho cinasa 10 micromolar, Y27632), precalentado hasta 37°, con agitación a 70 rpm, regulado a un pH de 6,8-7,1 por CO2, con un punto de ajuste de oxígeno disuelto del 30% (CO2, aire, O2 y N2 regulados). Inmediatamente después de la inoculación, se tomaron muestras del biorreactor para el recuento celular y se ajustó el volumen del medio según fuera necesario para obtener una concentración celular final de 0,225 * 106 células/ml.
Las células inoculadas en el biorreactor de tanque agitado formaron agrupaciones de células en el tanque agitado de manera continua, y se mantuvieron en medio de pluripotencia (IH3 o E8, complementado con BSA al 2%) en el reactor durante tres días en total. El medio se cambió diariamente, y 24 horas después de la inoculación se realizó un intercambio parcial de los medios, ya que se retiraba 1-1,3 litros de medio gastado y se añadían 1,5 litros de medio recién preparado. Cuarenta y ocho horas después de la inoculación, se retiraron 1,5-1,8 litros de medio gastado y se añadieron 1,5 litros de medio recién preparado. A las 72 horas después de la inoculación, se inició la diferenciación de las células pluripotentes retirando >90% del medio gastado y añadiendo medio de diferenciación (tabla 7).
Una vez se inició el proceso de diferenciación gradual, las células se mantuvieron durante 12 o más días en el biorreactor de suspensión estéril cerrado y regulado en cuanto a la temperatura (37°), el pH (7,4 para la diferenciación) y el oxígeno disuelto (punto de ajuste del 10% de OD para la etapa 1 y del 30% de OD en todas las demás ocasiones, y regulado en cuanto a CO2, O2, N2 y aire). En todo el proceso de diferenciación, en cada intercambio del medio, el impulsor se detuvo 5-20 minutos antes de la retirada del medio mediante un tubo de inmersión para permitir que las agrupaciones sedimentaran. El medio en el biorreactor se retiró o se añadió a/desde una botella o bolsa cerradas mediante una bomba peristáltica a través de un tubo de inmersión conectado a un tubo C-flex™ usando un soldador de tubos Terumo™ para mantener un sistema cerrado. El impulsor y el calentador se reactivaron una vez que se añadió suficiente medio al recipiente para sumergir completamente el impulsor.
Con el fin de monitorizar el proceso del biorreactor, se extrajeron diariamente muestras del medio que contenía las agrupaciones de células para determinar el número de células y su viabilidad (NucleoCounter), tal como se muestra en la figura 7. Se observó una expansión general de las células durante el proceso, ya que el inóculo de 0,225 * 106 células viables/ml se expandió hasta generar un promedio de 0,92 * 106 células viables/ml en el día 3 de la etapa 4. Al mantener las células en un punto de ajuste ácido (pH 7,0-6,8) durante la inoculación en el biorreactor y la agrupación y el cultivo de células pluripotentes, la producción promedio de células en el día 3 de la etapa 4 aumentó hasta un promedio de 1,3 * 106 células/ml (figura 7).
Además de los recuentos diarios, las muestras del medio del biorreactor se analizaron con NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical, Waltham, MA). Se observó que, según los puntos de ajuste del reactor, el pH del medio en la etapa 0 era ácido en relación con un pH convencional homeostático de 7,4 común a la mayoría de los medios de cultivo y que el pH del medio del reactor disminuía durante la etapa 0 como resultado del metabolismo celular (figura 8). Estos resultados se correlacionaron con una tendencia al aumento de las concentraciones de ácido láctico y a la disminución de los niveles de glucosa hasta el final del sexto día de diferenciación (figuras 9 y 10). En conjunto, estos datos indicaron que las células del reactor crecían lo más rápidamente y consumían más glucosa durante la etapa 0 y las dos primeras etapas de diferenciación (días 1 a 6). Sin embargo, a partir de la etapa 3, el metabolismo celular (reducción de los niveles de lactato y aumento de los niveles de glucosa) en el reactor disminuyó, correlacionándose con un pico en el número de células en la etapa 3, seguido de una disminución de la densidad celular en el transcurso de la etapa 4.
Con el fin de determinar si los cambios específicos de etapa en el pH y el metabolismo coincidían con los cambios de etapa en los patrones de expresión del ARNm. Se llevó a cabo una prueba de muestras de células de biorreactor usando cuatro matrices de baja densidad Applied Biosystems (Life™, Carlsbad, CA) designadas como pluripotencia, endodermo definitivo (ED), tubo intestinal (GT), o etapa 4 (S4) los resultados se compararon con una muestra histórica de células hES indiferenciadas H1 (WB0106) como control para estandarizar la expresión en todas las ejecuciones y matrices.
Usando estas matrices se determinó la expresión génica para cada etapa de diferenciación. También se observó que las células del material de siembra descongeladas en el biorreactor mostraban un patrón de expresión génica indiferenciada en el día 1 de la etapa 0 y en el día 3 de la etapa 0 (24 y 72 horas después de la inoculación en el biorreactor: figuras 11, 12, 13 y 14). Estos resultados se correlacionaron bien con los resultados de citometría de flujo que mostraron altos niveles de expresión de CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81, y la ausencia de CXCR4/CD184 (figura 15 y tabla 8). Aunque los ensayos de citometría de flujo y qRT-PCR para la expresión génica mostraron patrones de expresión robustos y estables para los genes de pluripotencia (CD9, NANOG, POU5F1, SOX2, TDGF y ZFP42) compatibles con un estado pluripotente estable, también se observó un aumento modesto pero variable en la expresión génica para GATA4, GSC, MIXL1 y T; y un aumento >100x en la expresión de CER1, FGF17, FGF4 y GATA2 en algunas muestras durante el proceso de la etapa 0 antes de la diferenciación dirigida (figuras 16 y 17).
A la finalización de la etapa 0 (72 horas después de la inoculación en el reactor), las células se trasladaron a un medio de diferenciación (tabla 7) que contenía MCX y GDF8. Veinticuatro horas después de este cambio del medio se observaron alteraciones significativas en los patrones de expresión génica (figuras 18 y 19), como un aumento de ~700x en la expresión de FOXA2 y un aumento de 1000x en la expresión de CER1, EOMES, FGF17, FGF4, GATA4, GATA6, GSC, MIXL1 y T. Estos niveles de expresión aumentados indicaban que las células estaban en transición hacia un destino mesendodérmico. También se observó que los niveles de c DX2 eran elevados en el día 1 de la etapa 1 en comparación con las células indiferenciadas (aumento de 470x en la expresión en comparación con el control), sin embargo, este fue un aumento transitorio en la expresión y los niveles de CDX2 disminuyeron un 94% desde el día 1 de la etapa 1 hasta el día 3 de la etapa 1 volviendo a niveles comparables a los observados antes de la inducción de la diferenciación (figuras 14, 19 y 21).
A las 72 horas después de la exposición al medio de diferenciación de ED, las células expresaron un perfil compatible con la especificación a endodermo definitivo, ya que los niveles de CXCR4 alcanzaron su máximo y FOXA2 y SOX17 se expresaron a >1000x con respecto al control histórico. Compatible con el endodermo definitivo, también se observó que los genes CER1, EOMES, FGF17, FGF4, GATA4, GATA6, GSC, MIXL1 y T descendieron desde los elevados niveles observados en el día 1 de la etapa 1 (figuras 20 y 21).
Los cambios en la expresión génica observados mediante qRT-PCR se correlacionaron con los resultados observados mediante citometría de flujo. También se observó una transición casi completa desde una población de células pluripotentes que expresan CD9/negativas para CXCR4 al inicio de la diferenciación (figura 15) a una población homogénea de células que expresan CXCR4 (el 98,3% de células positivas para CXCR4, ± 1,9 de D.E.) al final de la etapa 1 (figura 22).
Tras la finalización de la formación de endodermo definitivo (etapa 1), el medio se cambió a uno que contenía FGF7, un morfógeno usado para inducir la formación del intestino anterior primitivo (etapa 2). Compatible con la formación del intestino anterior primitivo, los niveles de expresión de HNF4a y GATA6 en los días 1 y 3 de la etapa 2 aumentaron, mientras que los genes expresados en niveles altos en el día 3 de la etapa 1 (CXCR4, EOMES, FGF17, FGF4, MNX1, PRDM1, SOX17 y VWF) mostraron una expresión reducida al final de la etapa 2 (figura 23). La expresión de los genes del intestino anterior (AFP, PDX1 y PROX1) aumentó (figura 24).
Después de que las células se hayan cultivado en el medio de la etapa 2 durante 72 horas, se cambió el cultivo a un medio de la etapa 3 (tabla 7). Una vez en este medio, las células expresaron marcadores compatibles con un linaje pancreático endodérmico, tal como se mide mediante la expresión de PDX1 y FOXA2 (el 90,9% positivas para PDX1, ± 11,9 de D.E., y el 99,2% positivas para FOXA2, ± 0,6 de D.E.) mostrados en la figura 25. Estos resultados se confirmaron mediante los datos de las muestras analizadas por qRT-PCR para la expresión génica. La expresión génica de PDX1 aumentó 5 veces en 24 horas desde el final del día 3 de la etapa 2 (38,000x frente a H1) hasta el final del día 1 de la etapa 3 (200,000x frente a H1) y se duplicó de nuevo 48 horas después en el día 3 de la etapa 3 (435,000x frente a H1). Estos datos muestran que las células se estaban especificando para un destino pancreático (figura 26). Esta observación se vio respaldada adicionalmente por los niveles aumentados de una multitud de genes que se expresan habitualmente en el páncreas (ARX, GAST, GCG, INS, ISL1, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, pAX6, PTF1A y SST), tal como se muestra en la figura 26. Además, se observó una expresión muy baja o nula de OCT4/POU5F1 (2-10% del control o Ct de 32-37 muestras por qRT-PCR) y altos niveles de expresión para otros marcadores de linajes endodérmicos AFP, ALB y CDX2-, lo que indica además la especificación y transición de la población celular en el biorreactor desde un destino de tubo intestinal relativamente plástico hasta un destino pancreático.
Al final del proceso de diferenciación en el día 3 de la etapa 4, las células conservaron altos niveles de expresión de PDX1 y FOXA2 y desarrollaron además un patrón de expresión compatible con una mezcla de células endocrinas pancreáticas (el 28,1% positivas para cromogranina, ± 12,5 de D.E.) y células progenitoras pancreáticas (el 58,3% positivas para NKX6.1, ± 9,7 de D.E.) tal como se muestra en la figura 27. Este patrón de expresión de los marcadores específicos de cada etapa indicaba una diferenciación eficiente gradual desde una población pluripotente a células precursoras pancreáticas. Los resultados observados con la citometría de flujo se confirmaron además con los datos de la qRT-PCR. Una multitud de genes comúnmente expresados en el páncreas (ARX, GAST, GCG, IAPP, INS, ISL1, MAFB, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PAX6, PTF1A y SST) mostraron todos niveles de expresión aumentados. (figura 28).
El patrón de expresión observado en la figura 27 se mantuvo constante durante múltiples ejecuciones, ya que se sometieron a prueba múltiples variables de proceso, tales como diferentes materiales de siembra, medio de la etapa 0, pH del medio de la etapa 0 y el uso de antiespumante. Se sometieron a prueba múltiples fuentes de material de siembra y cada una de ellas generó eficazmente un destino endodérmico pancreático con >90% de FOXA2, >75% de PDX1 y >50% de NKX6.1 (figura 29). Además, se observó que no había diferencias significativas en los patrones de expresión del producto del biorreactor cuando las células se cultivaron en la etapa 0 en un medio propio personalizado denominado “IH3” complementado con BSA al 2% o en un medio disponible comercialmente: Essential8™, complementado con BSA al 2% (figura 30). Cuando se examinó el papel del pH en el cultivo de la etapa 0, se observó que las células que se hicieron crecer en la etapa 0 a un pH relativamente bajo (6,8) presentaban una mayor expansión en el biorreactor en relación con la ejecución promedio (figura 7), pero no hubo cambios significativos en el perfil celular del día 3 de la etapa 4 (figura 31). Además, se observó que el uso de la emulsión de antiespumante C (n.° de cat. de Sigma A8011) a 94 partes por millón redujo las burbujas producidas por el burbujeo, pero no pareció afectar al perfil de las células desde el final de células de la etapa 0 hasta el día 3 de la etapa 4 (tabla 9 y figura 32).
Al final de cada diferenciación del biorreactor, las células del producto se crioconservaron. Las células se lavaron en MCDB131 con bicarbonato de sodio 3,63 g/l o MCDB131 con bicarbonato de sodio 3,63 g/l, glucosa (8 mM final) y 1x Glutamax, y luego se transfirieron a un medio de crioconservación frío (<4°C) que se componía del 57,5% de MCDB131 con bicarbonato de sodio 2,43 g/l, el 30% de KSR sin componentes xenógenos, el 10% de DMSO y el 2,5% de HEPES (concentración final 25 mM). A continuación, las células se congelaron en un congelador de velocidad controlada (CRF) usando un perfil de enfriamiento que mantenía las agrupaciones de células en el medio de crioconservación a temperatura ambiente durante un máximo de 15 minutos, se redujeron hasta una temperatura de 4°C durante 45 min, y se redujeron adicionalmente en 2,00°C/min hasta -7,0°C (muestra). A continuación, la muestra se enfrió rápidamente, reduciendo la temperatura de la cámara a una velocidad de 25,0°C/min hasta -45,0°C. A continuación, se proporcionó un aumento de compensación aumentando la temperatura de la cámara 10,0°C/min hasta -25,0°C (cámara). A continuación, la muestra se enfrió a 0,2°C/min hasta que la temperatura alcanzó -40,0°C. A continuación, la cámara se enfrió hasta -160°C a una velocidad de 35,0°C/min y se mantuvo a esa temperatura durante 15 minutos. Las muestras se trasladaron a un recipiente de almacenamiento de nitrógeno líquido en fase gaseosa al finalizar la ejecución del CRF.
Las células pudieron descongelarse retirándolas del almacenamiento en nitrógeno líquido en fase de vapor y transfiriendo el vial a un baño de agua a 37°C. El vial se agitó suavemente en el baño de agua durante menos de 2 minutos hasta que quedó un pequeño cristal de hielo en el vial. A continuación, el contenido del vial se transfirió a un cónico de 50 ml y se diluyó gota a gota durante dos minutos usando el medio MCDB131 con bicarbonato de sodio 2,43 g/l y BSA al 2% hasta alcanzar un volumen final de 20 ml en total. A continuación, se determinó el número total de células mediante un dispositivo Nucleocounter® y se transfirió la suspensión celular a una placa de cultivo de fijación ultrabaja durante 1 hora. A continuación, se aislaron las células del medio en un cónico de 50 ml, se retiró el sobrenadante y volvieron a suspenderse las células en un medio de la etapa 4 para su análisis o estudio in vivo. Alternativamente, después de la descongelación, las células en viales se transfirieron a un frasco centrifugador Corning™ de vidrio de 125 ml vacío (Corning, Corning, NY) y se añadieron al frasco 10 ml de medio MCDB131 que contenía bicarbonato de sodio 2,43 g/l y BSA al 2% gota a gota. El volumen final se ajustó a 80 ml del mismo medio. El número total de células se determinó mediante un dispositivo Nucleocounter® y la suspensión celular se agitó a 40-65 rpm durante la noche (12-28 horas). A continuación, las células se caracterizaron o se usaron para estudio in vivo.
Tabla 7
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Tabla 8
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Tabla 9
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Materiales:
• línea de células madre embrionarias humanas (hES) H1, (células WA01, WiCell, Madison WI)
• PBS (n.° de catálogo 14190, Invitrogen)
• Y-27632 (n.° de catálogo de Axxora ALX-270-333, San Diego, CA)
• EDTA, (Lonza, n.° de catálogo 12604-013, St. Louis, MO)
• NucleoCounter-(Chemetec, n.° de cat. YC-T100, Dinamarca)
• Placas de 6 pocillos no tratados para histocultivo (Becton Dickinson, n.° de catálogo Falcon 351146, Franklin Lakes, NJ)
• Accutase, (Sigma, n.° de catálogo 12604-013, St. Louis, MO)
• Sondas para biorreactores de pH y oxígeno disuelto (OD) (electrodo de pH Fermprobe de 225 mm, modelo F-635 y sensor de oxígeno disuelto Oxyprobe de 12 mm, modelo D-145 de Broadley James, Irvine CA) • Dispositivo de macroencapsulación inmunoprotector (Theracyte™, Irvine CA)
• Mm ELISA PARA PÉPTIDO C HUMANO (n.° DE CAT. DE MERCODIA 10-1141-01)
• Glutamax™, MCDB131 y ITS-X Invitrogen
• FAF-BSA (Proliant)
• Ácido retinoico, glucosa al 45% (2,5 M), SANT (inhibidor de Shh) (Sigma)
• GDF8 (Peprotech)
• MCX (JNJ)
• FGF7 (R&D Systems)
• LDN-193189 (antagonista del receptor BMP) (Stemgent)
• TPPB (activador de la PKC) (ChemPartner)
• MCDB 131 personalizado
Ejemplo de referencia 8
Maduración y función de agrupaciones de progenitores pancreáticos generados en biorreactores y crioconservados Con el fin de generar suficientes células para cada estudio de biorreactor, se descongeló un vial del banco de células maestro de hES H1 (WB0106) de pase 31. Las células se expandieron en condiciones de adherencia en el medio mTeSR1™ durante varios pases en Matrigel™ usando el pase de EDTA hasta que se generaron suficientes células para sembrar cinco CellSTACK™ de 2 capas recubiertos de Matrigel™ (CS2). Una vez que las células adherentes que crecían en el CS2 eran confluentes en el 70%, se colocaron tapas de montaje de tubos C-flex™ con tubos de bomba adyacentes en los puertos del medio para cerrar el sistema. Una vez cerrado el sistema, se soldaron las bolsas o botellas con C-flex™ mediante el soldador Terumo y se transfirieron todos los volúmenes de líquido (medio, PBS'/_, Accutase™ o células suspendidas) usando una bomba peristáltica.
Para levantar las células de los CS2, se lavaron las células una vez con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio (PBS'/_), y luego se trataron con una disolución diluida a la mitad de Accutase™ diluida con una parte igual de PBS'/_ y se incubaron durante 4-5 minutos. A continuación, se retiró la disolución de Accutase™ y, 3 minutos después de la aplicación de la disolución enzimática, se golpearon a toquecitos los CS2 para favorecer el levantamiento de las células. Se bombeó una botella de mTeSR1™ que contenía un inhibidor de la Rho-cinasa 10 micromolar, Y27632, en los CS2 para enjuagar e inactivar la Accutase™ residual y luego se recogió el enjuague. Se añadió un segundo volumen de enjuague, se recogió y se juntó con el primer enjuague. Se recuperaron 1,6-2,0 * 109 células de los CS2 en un volumen final de 2 litros. Se transfirieron 2,0 -2,5 * 108 células por capa a cuatro CS2 u ocho Cell Stacks™ de una capa y se incubaron a 37° durante 2 horas en una incubadora humidificada con el 5% de CO2 en un volumen de 200 ml por capa.
Usando un bucle cerrado de tubo C-flex™ con tubo de bombeo adyacente unidos entre los puertos del medio de CellSTACK™, la suspensión celular se trituró durante 5 minutos a 75 rpm mediante una bomba peristáltica para homogeneizar los agregados. A continuación, los CellSTACK se incubaron durante la noche a 37° durante 18 horas en una incubadora humidificada con el 5% de CO2. Los 2 litros de células y medios de los Cell Stacks se juntaron entonces y se transfirieron, 1 litro cada uno, a dos biorreactores DASGIP de 3 litros junto con 1,5 litros de medio mTeSR™ recién preparado por biorreactor. Las células se mantuvieron durante dos días más con el medio mTeSR™ antes de iniciar la diferenciación, con un intercambio del medio completo 24 horas después de la inoculación del biorreactor. A continuación, se inició la diferenciación y se dirigió tal como se describe en la tabla 10. Las células se mantuvieron 14 ó 15 días en total (2 días de mTeSR ™+ 12 o 13 días de diferenciación gradual) en el biorreactor de suspensión estéril cerrado y regulado para la temperatura (37°), el pH (desviado, o regulado por CO2 a 6,8 ó 7,2 para las células pluripotentes y 7,4 para la diferenciación), y el oxígeno disuelto (punto de ajuste del 30% de OD, regulado por CO2/aire). El impulsor se detuvo durante 5-20 minutos antes de cada intercambio del medio para permitir que las agrupaciones sedimentaran. El medio se retiró o añadió mediante una bomba peristáltica a través de un tubo de inmersión conectado a un tubo C-flex™ usando un soldador de tubos Terumo™ para mantener un sistema cerrado. El impulsor y la camisa de calor volvieron a reactivarse una vez que se añadió suficiente medio para sumergir el impulsor.
Se iniciaron dos ejecuciones de producción en reactores de 3 litros usando estos métodos. En la primera ejecución del reactor (PRD1205) se sometieron a prueba dos puntos de ajuste de pH diferentes durante los dos primeros días del medio de cultivo pluripotente. El reactor 1 se ajustó a un pH de 7,2 con una tasa de infusión de gas de CO2 fija del 5%, de modo que el pH “se desviaría” a valores inferiores a medida que el entorno del reactor se acidificara con el tiempo debido a la actividad metabólica de las células. El reactor 2 se ajustó a un pH de 7,2 regulado por los niveles de gas de CO2. En el segundo reactor (PRD1207), el pH se ajustó a 6,8 para el reactor 1 y 7,2 para el reactor 2, ambos regulados por los niveles de gas de CO2.
Con el fin de monitorizar el proceso del biorreactor, se tomaron agrupaciones de células al final de cada etapa de diferenciación y se evaluaron mediante citometría de flujo (PRD1205 tabla 11; PRD1207 tabla 12). Se observó una transición casi completa de una población de células pluripotentes que expresaban CD9/negativas para CXCR4 al inicio de la diferenciación a una población homogénea de células que expresaban CXCR4 (96,9-98,1% de células positivas para CXCR4) a la finalización de la formación de endodermo definitivo.
Los resultados observados por citometría de flujo se correlacionaron con los resultados de muestras emparejadas analizadas mediante rt-PCR. Las muestras se sometieron a prueba en todo el proceso para detectar la expresión génica característica de la diferenciación gradual desde la pluripotencia a destino pancreático. Antes del inicio de la diferenciación dirigida, se analizó el ARNm de las agrupaciones de células del biorreactor en una matriz de baja densidad para un panel de genes asociados con la pluripotencia o los destinos de diferenciación temprana.
Se observó que las células del biorreactor conservaban la expresión de los genes característicos de pluripotencia (POU5F1, NANOG, SOX2 y ZFP42) y mostraban una inducción mínima o nula de los genes característicos de diferenciación (AFP y FOXA2 : aumento <50 veces; FOXD3, GATA2, GATA4, GSC, HAND2, MIXL1 y T: aumento <10 veces de la expresión) en comparación con los controles de H1 indiferenciados (figura 33). Sin embargo, una vez que las células entraron en contacto con el medio de diferenciación del día 1 de la etapa 1, los patrones de expresión génica cambiaron drásticamente, ya que los niveles de expresión de CDX2, CER1, FGF17, FGF4, fOxA2, GATA4, GATA6, GSC, MIXL1, MNX1 y Braquiuria (T) aumentaron de 100 a 1000 veces más que los de las células hES H1 indiferenciadas (figura 34). Al final del día 3 de la etapa 1 (formación de endodermo definitivo), la expresión de CD9, CDX2, FGF4, MIXL1, Na NOG, POU5F1 y Braquiuria (T) había disminuido en relación con el día 1 de la etapa 1, mientras que la expresión de los genes característicos del endodermo definitivo, tales como CD99, CER1, CXCR4, FGF17, GATA4, GATA6, KIT, OTX o SOX17 alcanzó su máximo nivel (figura 35).
Al final de la etapa 1, el medio de cultivo celular se cambió de uno que contenía GDF8 a otro que contenía FGF7. Se observaron varios patrones diferentes de expresión génica: un aumento de la expresión de determinados genes en el transcurso de la etapa 2 (AFP, ATOH1, HHEX, OSR1, PDX1, PROX1, SOX2 y SOX9), una disminución de la expresión (HAND1 y SOX17), una expresión alta y estable en todo momento (HNF4a), o una expresión baja/nula (CDX2, g AsT, NKX2.2, NKX6.1 y PTF1a) (figura 36a-e). Estos patrones indicaban que las células del reactor se estaban convirtiendo en intestino anterior (AFP, ATOH1, HHEX, HNF4a, OSR1, PDX1, PROX1, SOX2 y SOX9) y que la expresión de los marcadores del mesodermo (HAND1 y SOX17) había disminuido. Sin embargo, al final de la etapa 2, las células aún no se habían especificado a un destino intestinal o pancreático más maduro (CDX2, GAST, NKX2.2, NKX6.1 y PTF1a).
Al final de la etapa 3, las células se habían especificado a un linaje pancreático, tal como se mide mediante la expresión de PDX1 , demostrada por un aumento >100.000 veces en el ARNm frente a control indiferenciado (figura 36) y el 76-98% de las células que expresaban PDX1 mediante citometría de flujo (tabla 11). También se observó la inducción de otros genes del páncreas (GAST, NKX2.2, NKX6.1, PROX1, PTF1a y SOX9) y del intestino, tales como AFP y CDX2, lo que indica que las células habían comenzado a especificarse a destino más maduro.
Al final del proceso de diferenciación en el día 3 ó 4 de la etapa 4, las células mostraban un patrón de expresión compatible con una mezcla de células endocrinas pancreáticas (47-54% positivas para cromogranina) y células progenitoras pancreáticas (33-52% positivas para NKX6.1), tal como se muestra en las tablas 11 y 12. Este patrón de expresión de los marcadores específicos de cada etapa indica una diferenciación eficiente gradual desde una población pluripotente hasta células progenitoras pancreáticas caracterizada por altos niveles de expresión de PDX1 (inducción >1*106 veces) y otros genes pancreáticos (inducción >1000 veces de ARX, GCG, Ga ST, INS, ISL, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PTF1a y SST) y una pérdida casi total de la expresión de OCT4/POU5F1 en comparación con las células madre embrionarias humanas H1 indiferenciadas (figura 37).
Al final del proceso de diferenciación se generaron 0,08-0,45 * 106 células/ml (figura 38: recuentos celulares diario des células). Las células generadas en este proceso luego se crioconservaron o se implantaron directamente en un animal por vía subcutánea mediante un dispositivo TheraCyte™ o se colocaron debajo de la cápsula renal. Con el fin de crioconservar las células, se transfirieron a un medio de crioconservación que se componía del 57,5% de MCDB131 con bicarbonato de sodio 2,43 g/l, el 30% de KSR sin componentes xenógenos, el 10% de DMSO y el 2,5% de HEPES (concentración final 25 mM). Una vez que las agrupaciones de células se suspendieron en los medios de crioconservación a temperatura ambiental, los crioviales se trasladaron al congelador de velocidad controlada (CRF) en el plazo 15 minutos. A continuación, la temperatura de la cámara se redujo hasta 4°C durante 45 minutos, y se siguió reduciendo en 2,00°C/min hasta -7,0°C (muestra). A continuación, la muestra se enfrió rápidamente, reduciendo la temperatura de la cámara a una velocidad de 25,0°C/min hasta -45,0°C. A continuación, se proporcionó un aumento de compensación aumentando la temperatura de la cámara 10,0°C/min hasta -25,0°C (cámara). A continuación, la muestra se enfrió a 0,2°C/min hasta que la temperatura alcanzó -40,0°C. A continuación, la cámara se enfrió hasta -160°C a una velocidad de 35,0°C/min y se mantuvo a esa temperatura durante 15 minutos. Las muestras se trasladaron a un recipiente de almacenamiento de nitrógeno líquido en fase gaseosa al finalizar la ejecución del CRF.
Después de que las células se hayan almacenado en nitrógeno líquido en fase gaseosa, se descongelaron retirándolas del almacenamiento y transfiriéndolas a un baño de agua a 37°C. El vial se agitó suavemente en el baño de agua durante menos de 2 minutos hasta que quedó un pequeño cristal de hielo en el vial. A continuación, el contenido del vial se transfirió a un cónico de 50 ml y se diluyó gota a gota a lo largo de dos minutos usando el medio MCDB131 con bicarbonato de sodio 2,43 g/l y BSA al 2% hasta un volumen final de 20 ml en total. A continuación, se determinó el número total de células mediante un dispositivo Nucleocounter® y se transfirió la suspensión celular a una placa de cultivo de fijación ultrabaja durante 1 hora. A continuación, se aislaron las células del medio en un cónico de 50 ml, se retiró el sobrenadante y volvieron a suspenderse las células en el medio de la etapa 4. A continuación, las células o bien se implantaron en un animal por vía subcutánea a través del dispositivo TheraCyte™ o debajo de la cápsula renal, o bien las células se incubaron en una placa de cultivo de fijación ultrabaja durante una noche y luego se implantaron en un animal.
Se monitorizaron los animales para determinar los niveles de glucemia y de péptido C cada cuatro semanas tras la implantación del injerto. Los animales tratados con células precursoras pancreáticas no crioconservadas dentro de un dispositivo TheraCyte™ o mediante la colocación directa de las células debajo de la cápsula renal maduraron hasta expresar más de 1 ng/ml de péptido C a las 16 semanas y alcanzaron 2 ng/ml de péptido C a las 20 semanas tras el implante (figura 39a y 39d). Además, cuando se les trató con STZ para suprimir la función de las células p del huésped, los animales injertados mantuvieron la normoglucemia hasta que se retiraron los injertos, lo que indica que los injertos eran competentes para proteger a los animales de la diabetes inducida por una única dosis alta de STZ (figura 39b).
Este patrón también se observó en los animales tratados con células crioconservadas. Los animales tratados mediante injerto de cápsula renal con células precursoras pancreáticas crioconservadas que se habían cultivado durante 1 hora después de la descongelación (1207B) tenían un promedio de 0,56 ng/ml y 1,09 ng/ml de péptido C a las 16 y 20 semanas, respectivamente, mientras que las células cultivadas durante la noche después de la descongelación (1207C) tenían un promedio de 0,81 ng/ml y 1,35 ng/ml de péptido C a las 16 y 20 semanas, respectivamente (figura 39d). Los animales tratados con células precursoras pancreáticas crioconservadas dentro de un dispositivo TheraCyte™ tenían más de 1 ng/ml de péptido C a las 16 semanas y, de manera similar a los controles no crioconservados, pudieron expresar niveles terapéuticos de péptido C una semana después del tratamiento con STZ (0,98 ng/ml, figura 39c). Estos resultados indican que las células precursoras pancreáticas crioconservadas pueden funcionar de manera comparable a los controles no crioconservados cuando se someten a prueba en un modelo animal.
Tabla 10
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Nota:
• El medio basal de la tabla 10 anterior puede incluir opcionalmente glucosa 5 mM en las etapas 1-5 cuando no se usa Glutamax como complemento.
• Opcionalmente, puede añadirse Cypi ([100 nM]) en la etapa 4 de la tabla 10 mostrada anteriormente. Tabla 11
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Tabla 12
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Cálculo de la tensión de corte experimentada por los agregados celulares en un biorreactor de tanque agitado Se determinó la tensión de corte experimentada por los agregados celulares en un biorreactor de suspensión con agitación DASGIP de 2,7 litros mezclado a una velocidad de agitación de 70 rpm en un biorreactor de DASGIP de 3 l. Para calcular los valores de la tensión de corte, se hicieron las siguientes suposiciones.
Suposiciones:
1. La tensión de corte máxima impuesta a los agregados celulares no es resultado de los remolinos turbulentos
2. La tensión de corte máxima impuesta a los agregados celulares no es resultado de la colisión agregadoagregado o agregado-impulsor
3. En estos cálculos no se tienen en cuenta las tensiones de corte impuestas por los deflectores (es decir, tubos de inmersión y sondas)
Para los fines de los cálculos en el presente documento, se usaron la nomenclatura y los parámetros físicos indicados a continuación.
Nomenclatura:
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Parámetros:
Figure imgf000044_0003
Los parámetros del medio y del biorreactor indicados se aplicaron a las ecuaciones siguientes.
Ecuaciones:
Números de Reynolds:
D pNDl
Re = --- ¡-i--Tensión de corte máxima en el agregado (Cherry y Kwon 1990)
i máx 5,33pVa9
Potencia disipada (e) por unidad de masa
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Potencia consumida (P)
Figure imgf000045_0002
El cálculo del número de potencia se basó en la correlación empírica derivada por Nagata (1975) para un tanque agitado sin deflectores.
A 10 1.2fíe 0,6
PN ~ Te K2 10 3,2 Re 0,6
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Donde
W
670(— A 0,6)2 , + 185]
K' = u Wt í A
Kn = 10^
Figure imgf000045_0004
Se calculó una cizalladura máxima de al menos 2,5 dyn/cm2 impuesta a los agregados celulares a una velocidad de agitación de 70 rpm en un biorreactor DASGIP de 2,7 l. Las células que comprenden la capa más externa de las agrupaciones experimentan los niveles más altos de tensión de corte. Estos valores de tensión de corte dependen en gran medida de las suposiciones expuestas.
Ejemplo de referencia 9
Diferenciación de células madre embrionarias humanas de la línea celular WA01 en endodermo definitivo: papel de MCX/GDF8 en el cultivo en suspensión
Las agrupaciones de células madre embrionarias humanas pluripotentes de la línea H1 (código NIH: WA01) se sembraron a densidades celulares que oscilaban entre 0,25*10® y 2*10® células/ml en matraces de Erlenmeyer/agitadores, frascos centrifugadores o placas de ® pocillos no recubiertas de unión ultrabaja y tratadas para histocultivo en medio MCDB-131 que contenían bicarbonato de sodio 3,®4 g/ml y glucosa 5,5 mM (n.° de catálogo A13051 DJ, Invitrogen, CA), que se complementó con BSA al 2% libre de ácidos grasos (n.° de catálogo 68700, Proliant, IA), IX Glutamax™ (n.° de catálogo 35050-079, Invitrogen, CA), glucosa 2,5 mM adicional (n.° de catálogo G87®9, Sigma) e ITS-X a una concentración de reserva de 1:50.000 (n.° de catálogo 5150005®, Invitrogen, CA). El medio MCDB-131 complementado de esta manera se denominará “medio basal de la etapa 1” para los fines de esta solicitud. Las agrupaciones en este medio se trataron el primer día de diferenciación con o bien MCX 3 |iM (un inhibidor de GSK3B, 14-prop-2-en-1-il-3,5,7,14,17,23,27-heptaazatetraciclo[19.3.1.1~2,®~1~8,12~]heptacosa-1(25),2(27),3,5,8(2®),9,11,21,23-nonaen-1®-ona, solicitud de patente estadounidense con número de serie 12/494.789) y GDF-8 100 ng/ml (n.° de catálogo 120-00, Peprotech), o MCX 3 |iM sólo, o WNT-3a 20 ng/ml (n.° de catálogo 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más activina A 100 ng/ml (n.° de catálogo 338-AC, R&D Systems, MN) o bien WNT-3A 20 ng/ml sólo. El día dos, las células se transfirieron a un medio basal de la etapa 1 recién preparado complementado con GDF8100 ng/ml o activina A 100 ng/ml. Se recogieron muestras para citometría de flujo, PCR y análisis de inmunotransferencia de tipo Western en diversos puntos temporales que oscilaban desde el tiempo cero (inmediatamente antes de la adición del medio basal más los complementos) hasta 72 horas después de comenzar la diferenciación.
La eficiencia con la que se generó el endodermo definitivo se determinó después de 3 días de diferenciación en cada condición midiendo el porcentaje de células que expresaban los marcadores de superficie celular CXCR4, CD99 y CD9 mediante citometría de flujo. Los datos (mostrados en los gráficos de FACS de la figura 40a-d y resumidos en la tabla 13) indican que en el cultivo en suspensión, la adición de MCX 3 |iM en ausencia de un miembro de la familia de TGF-p en el día uno de diferenciación genera endodermo definitivo a niveles comparables a los obtenidos cuando las células se tratan con MCX 3 |iM más GDF-8 100 ng/ml o WNT-3a 20 ng/ml más activina A 100 ng/ml el día uno.
Tabla 13
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Ejemplo de referencia 10
Diferenciación de células madre embrionarias humanas de la línea celular WA01 en endodermo definitivo: respuesta a la dosis de la concentración del compuesto MCX en el cultivo en suspensión
Las agrupaciones de células madre embrionarias humanas pluripotentes de la línea H1 (código NIH: WA01) se sembraron a densidades celulares que oscilaban entre 0,25*10® y 2*10® células/ml en matraces de Erlenmeyer/agitadores o frascos centrifugadores en medio basal de la etapa 1, tal como se describe en el ejemplo 9. Las agrupaciones se trataron con medio basal de la etapa 1 que contenía MCX 1,5, 2, 3 ó 4 |iM el día uno de diferenciación y con medio basal de la etapa 1 recién preparado que contenía GDF-8 100 ng/ml el día 2. En el día tres no se realizó ningún intercambio del medio. Se recogieron muestras para citometría de flujo y análisis de PCR al final del día tres de diferenciación.
La eficiencia con la que se generó el endodermo definitivo se determinó entonces midiendo el porcentaje de células que expresaban los marcadores de superficie celular CXCR4, CD99 y CD9 mediante citometría de flujo. Los datos (tal como se muestra en los gráficos de FACS de la figura 41A-D y resumidos en la tabla 14) indican que, en los cultivos en suspensión, la adición de MCX a concentraciones inferiores a 2 |iM da como resultado un número progresivamente menor de células positivas para endodermo definitivo (tal como resulta evidente por un menor porcentaje de células positivas para CXCR4 y un mayor porcentaje de células positivas para CD9). Además, a concentraciones superiores a 4 |iM, MCX muestra un efecto perjudicial sobre las células, que da como resultado una viabilidad celular disminuida. Sin embargo, al aumentar las concentraciones de BSA, los efectos de MCX pueden modularse de manera que pueden usarse concentraciones > 4 micromolar. Por el contrario, pueden usarse concentraciones < 1,5 micromolar para generar endodermo definitivo cuando se usan con concentraciones de BSA más bajas.
Tabla 14
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Ejemplo de referencia 11
Diferenciación de células madre embrionarias humanas de la línea celular WA01 a endodermo definitivo: papel de la frecuencia de intercambio del medio en el cultivo en suspensión
4®
Se sembraron agrupaciones de la línea de células madre embrionarias humanas pluripotentes H1 (código NIH: WA01) a densidades celulares que oscilaban entre 0,25*10® y 2*10® células/ml en matraces de Erlenmeyer/agitadores o frascos centrifugadores en medio basal de la etapa 1, tal como se describe en el ejemplo 9. Las agrupaciones se trataron con medio basal de la etapa 1 que contenía MCX 3 |iM en el día uno de diferenciación y con medio basal de la etapa 1 recién preparado que contenía GDF-8 100 ng/ml en el día 2. Los cultivos de control recibieron un intercambio del medio el día tres; a un recipiente independiente, en el día tres no se le realizó ningún intercambio del medio. Se recogieron muestras para el análisis por citometría de flujo y PCR al final del día tres de diferenciación.
A continuación, se determinó la eficiencia con la que se generó el endodermo definitivo en cada condición midiendo el porcentaje de células que expresaban los marcadores de superficie celular CXCR4, CD99 y CD9 usando citometría de flujo. Los resultados se muestran en los gráficos de FACS de las figuras 42A y B y se resumen en la tabla 15.
Tabla 15
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Ejemplo de referencia 12
Diferenciación de células madre embrionarias humanas de la línea celular WA01 a endodermo definitivo: uso de Glutamax™ en cultivo en suspensión
Se sembraron agrupaciones de la línea de células madre embrionarias humanas pluripotentes H1 (código NIH: WA01) a densidades celulares que oscilaban entre 0,25*10® y 2*10® células/ml en matraces de Erlenmeyer/agitadores o frascos centrifugadores.
El ejemplo se llevó a cabo para determinar si la complementación con Glutamax™ era necesaria para la generación de endodermo definitivo, suspendiendo las agrupaciones en el medio basal de la etapa 1 (descrito en el ejemplo 9) más o menos Glutamax™, que se complementó con MCX 3 |iM en el día uno de diferenciación y con medio basal de la etapa 1 recién preparado que contenía GDF-8 100 ng/ml en el día 2. En el día tres no se realizó ningún intercambio del medio. Se recogieron muestras para análisis por citometría de flujo y PCR al final del día tres de diferenciación.
Se determinó la eficiencia con la que se generó el endodermo definitivo en cada condición midiendo el porcentaje de células que expresaban los marcadores de superficie celular CXCR4, CD99 y CD9 usando citometría de flujo. Los datos y resultados se muestran en los gráficos de FACS de las figuras 43A y B y se resumen en la tabla 1®.
Tabla 1®
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Ejemplo de referencia 13
Diferenciación de células madre embrionarias humanas de la línea celular WA01 a endodermo definitivo: papel de la concentración de bicarbonato de sodio en el cultivo en suspensión
Se sembraron agrupaciones de la línea de células madre embrionarias humanas pluripotentes H1 (código NIH: WA01) a densidades celulares que oscilaban entre 0,25*10® y 2*10® células/ml en matraces de Erlenmeyer/agitadores o frascos centrifugadores o bien en medio basal de la etapa 1 tal como se describe en el ejemplo 9 (que contenía bicarbonato de sodio 3,®4 g/l) o bien en un medio basal de la etapa 1 modificado que contenía bicarbonato de sodio 2,43 g/l. Las agrupaciones se trataron con un medio basal de la etapa 1 que contenía MCX y GDF-8 tal como se describe en el ejemplo 12. Se recogieron muestras para citometría de flujo al final del día tres de diferenciación. También se capturaron imágenes de contraste de fases en cada día de diferenciación.
A continuación, se determinó la eficiencia con la que se generó el endodermo definitivo midiendo el porcentaje de células que expresaban los marcadores de superficie celular CXCR4, CD99 y CD9 usando citometría de flujo. Los datos se muestran en gráficos de FACS en las figuras 44A y B y se resumen en la tabla 17. En los cultivos en suspensión, los niveles de bicarbonato de sodio, tan bajos como 2,43 g/l, parecen generar endodermo definitivo de manera menos eficiente (en promedio, el 87,4% de las células expresan CXCR4) que cuando las células se diferenciaron en un medio que contenía 3,64 g/l (en promedio, el 97,35% de las células expresan CXCR4). Además, se observó que las diferencias en los niveles de bicarbonato se correlacionaban con las diferencias en las morfologías de las agrupaciones al final de la etapa 1, tal como se observa mediante microscopía de contraste de fases (figuras 44C y D). Además, se observó que las células diferenciadas con niveles altos de bicarbonato formaban agrupaciones más sueltas que las células diferenciadas en bicarbonato 2,43 g/l.
Tabla 17
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Ejemplo 14
Generación de agrupaciones de progenitores pancreáticos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas en un proceso de biorreactor escalable
Las terapias celulares requerirán grandes cantidades (>108) de células por dosis. Este ejemplo demuestra un proceso que puede diferenciar masas de células madre pluripotentes inducidas (células iPS) de 3 a 5 órdenes de magnitud mayores que las posibles con las prácticas de fabricación actuales de terapias celulares.
En este ejemplo, se usó la línea de células iPS UTC (derivada de células de tejido umbilical previamente descritas en la solicitud de patente estadounidense 13/330.931. Las células se derivaron en células alimentadoras embrionarias de ratón usando transfección de plásmidos de una manera libre de “huella” y se crioconservaron en el pase 15.
A partir de estas células crioconservadas, se generó una serie de bancos de células descongelando un vial de material fuente directamente sobre laminina recombinante humana (lamininarh de Biolamina, Estocolmo, Suecia) en medio Essential8™ (E8™) de Invitrogen-Life (Carlsbad, CA) para generar un material de siembra interno. Este material descongelado y expandido se denominó “pre-pre-banco de células maestro” (pre-pre-BCM) que sirvió como material de siembra para futuros bancos. Usando el pre-pre-BCM, se generaron 3 bancos de células secuenciales: un pre-BCM, un BCM y un banco de células de trabajo (BCT). A continuación, se descongeló un vial de BCT y se expandió en lamininarh usando pases con EDTA durante tres pases en E8™. Las células se sembraron en primer lugar a partir de la descongelación en un frasco T225 (Corning; Corning, NY) y luego se pasaron a múltiples frascos T225. A continuación, los múltiples frascos T225 se pasaron y combinaron para sembrar un único CellStack™ de 1 capa (CS1). Una vez que las células en el CS1 eran confluentes, se lavaron las células una vez con PBS'/_, se trataron con una disolución de Accutase™ diluida con PBS'/_ a la mitad y se incubaron durante de 4 a 5 minutos. A continuación, se retiró la Accutase y, 3 minutos después de la aplicación de la disolución enzimática, se golpeó a toquecitos el CS1 para favorecer el levantamiento de las células. Al CS1 se le añadió E8™ complementado con BSA al 2% y que contenía 10 micromolar del inhibidor de la Rho cinasa, Y27632, para enjuagar e inactivar la Accutase™ residual. A continuación, se recogió el enjuague y se añadió un segundo volumen de enjuague, que se recogió y se combinó con el primer enjuague.
Las células se transfirieron en medio complementado con BSA al 2% y que contenía 10 micromolar del inhibidor de la Rho-cinasa, Y27632, a un frasco centrifugador desechable de 1 litro (Corning; Corning, NY) a una concentración de 1x10® células/ml en 225 ml de litro. Se permitió que las células se agruparan en suspensión estática durante 60 minutos en una incubadora humidificada con el 5% de CO2, luego se agitó durante 5 minutos a 55-65 rpm y se añadieron 225 ml de medio adicional complementado con BSA al 2% y que contenía 10 micromolar del inhibidor de la Rho cinasa, Y27632. Se permitió que las células sedimentaran en el cultivo estático durante 30 minutos adicionales y, a continuación, se le añadieron al frasco centrifugador 150 ml de medio adicional complementado con BSA al 2% y que contenía 10 micromolar del inhibidor de la Rho cinasa, Y27632. A continuación, las células se agitaron de manera continua a 50-70 rpm en una incubadora humidificada con el 5% de CO2. Veinticuatro horas después, se sacó el frasco centrifugador de la incubadora y se permitió que las agrupaciones sedimentaran durante 5-10 minutos. A continuación, se aspiró el medio hasta que quedaron 200 ml en el recipiente y luego se añadieron al frasco centrifugador 400 ml de medio de cultivo recién preparado adicional. Este proceso se repitió al final del día 2 (48 horas después de la transferencia).
A continuación, 72 horas después del tratamiento inicial con Accutase™, se repitió el proceso de disociación de las agrupaciones de células y siembra en el frasco centrifugador (pases) para mantener las células en suspensión durante múltiples pases (intervalo sometido a prueba: 1-10 pases).
Usando este proceso, las células UTC iPS se convirtieron de un cultivo adherente sobre un sustrato a un cultivo en suspensión en forma de agrupaciones de células y luego se expandieron en suspensión. A continuación, estas células sometidas a pases y cultivadas en suspensión se crioconservaron y almacenaron para su uso posterior. Con el fin de preparar las agrupaciones de células expandidas en suspensión para su crioconservación, las agrupaciones de células se disociaron con Accutase™ tal como se describió anteriormente, excepto que las células no se hicieron pasar por un filtro celular de 40 micrómetros. A continuación, se contaron las células de cada matraz desechable de 1 litro, se combinaron según fuera necesario y se centrifugaron durante 5 minutos a 80-200 rcf. A continuación, se retiró el sobrenadante lo más completamente posible sin romper el sedimento celular. A continuación se añadió CryoStor10 frío (<4°C) gota a gota para lograr una concentración final de 150 millones de células por ml y se mantuvo la disolución celular en un baño de hielo durante la transferencia a un vial criogénico de 1,8 ml de Corning (Corning, NY) o a una bolsa criogénica de 15 ml de Miltenyi (Miltenyi Biotec Inc. Auburn, CA).
A continuación, las células expandidas en suspensión se congelaron en un vial a alta densidad en un congelador de velocidad controlada de la siguiente manera. La cámara se enfrió previamente hasta 4°C y la temperatura se mantuvo hasta que la temperatura del vial de la muestra alcanzó 6°C. A continuación se redujo la temperatura de la cámara a 2°C/min hasta que la muestra alcanzó -7°C. Una vez que el vial de la muestra alcanzó -7°C, la cámara se enfrió a 20°C/min hasta que la cámara alcanzó -45°C. A continuación, se dejó que la temperatura de la cámara aumentara brevemente a 10°C/min hasta que la temperatura de la cámara alcanzó -25°C, y luego se enfrió adicionalmente la cámara a 0,8°C/min hasta que el vial de la muestra alcanzó -45°C. A continuación, la temperatura de la cámara se enfrió a 35°C/min hasta que la cámara alcanzó -160°C. La temperatura de la cámara se mantuvo entonces a -160°C durante al menos 10 minutos, después de lo cual los viales se transfirieron a almacenamiento en nitrógeno líquido en fase gaseosa.
Con el fin de inocular un biorreactor de tanque agitado, las células crioconservadas de alta densidad se retiraron del almacenamiento en nitrógeno líquido, se descongelaron y se usaron para sembrar un biorreactor de vidrio cerrado de 0,2 litros (DASGIP; Julich, Alemania). Los crioviales se retiraron del almacenamiento en nitrógeno líquido en fase gaseosa y se colocaron directamente en un baño de agua a 37°C durante 105 segundos. A continuación, el contenido del vial descongelado se transfirió mediante una pipeta de vidrio de 2 ml a un tubo cónico de 50 ml. A continuación, se añadieron al tubo, gota a gota, 9 ml de E8 que contenía BSA al 2% complementado con 10micromolar del inhibidor de la Rho cinasa, Y27632. A continuación, las células se centrifugaron a 80-200 rcf durante 5 minutos. Después de eso, se aspiró el sobrenadante del tubo y se añadieron 10 ml de E8 recién preparado que contenía BSA al 2% y complementado con 10 micromolar del inhibidor de la Rho cinasa, Y27632. Este volumen que contenía las células se pipeteó en un frasco de transferencia de medios (Cap2V8, Sanisure, Indianápolis, IN) y el contenido del frasco se bombeó directamente al biorreactor a través de un tubo C-flex estéril soldado por una bomba peristáltica. Como preparación para la inoculación de células madre pluripotentes, el biorreactor se preparó con 0,15 l de E8 complementado con BSA al 2% y 10 micromolar del inhibidor de la Rhocinasa, Y27632, precalentado hasta 37°, con agitación a 70 rpm, regulado a pH 6,8-7,1 mediante CO2, con un punto de ajuste de oxígeno disuelto del 30% (CO2, aire, O2 y N2 regulados). Inmediatamente tras la inoculación, se tomaron muestras del biorreactor para el recuento celular y se ajustó el volumen del medio según fuera necesario para obtener una concentración celular final de 0,225*10® células/ml.
Las células inoculadas en el biorreactor de tanque agitado formaron agrupaciones de células en el tanque agitado de manera continua. Después de la inoculación, las agrupaciones de células se mantuvieron en medio E8, complementado con BSA al 2%, en el reactor durante tres días. El medio se cambió diariamente; 24 horas después de la inoculación, se retiró el 90% del medio gastado y se añadieron 0,15 litros de medio recién preparado. Cuarenta y ocho horas después de la inoculación, se retiró el 90% del medio gastado y se añadieron 0,15 litros de medio recién preparado. A las 72 horas de la inoculación, se inició la diferenciación de las células pluripotentes retirando >90% del medio gastado y añadiendo medio de diferenciación (tabla 18).
Una vez iniciado el proceso de diferenciación gradual, las células se mantuvieron durante 12 o más días en el biorreactor de suspensión estéril cerrado y regulado en cuanto a la temperatura (37°), el pH (7,4 para la diferenciación) y el oxígeno disuelto (punto de ajuste del 10% de OD para la etapa 1 y del 30% de OD en todas las demás ocasiones, y regulado en cuanto a CO2, O2, N2 y aire). En todo el proceso de diferenciación, en cada intercambio del medio, el impulsor se detuvo 5-20 minutos antes de la retirada del medio mediante un tubo de inmersión para permitir que las agrupaciones sedimentaran. El medio en el biorreactor se retiró o se añadió a/desde un frasco o una bolsa cerrados mediante una bomba peristáltica a través de un tubo de inmersión conectado a un tubo C-flex™ usando un soldador de tubos Terumo™ para mantener un sistema cerrado. El impulsor y el calentador volvieron a activarse una vez que se añadió suficiente medio al recipiente para sumergir completamente el impulsor.
Con el fin de monitorizar el proceso del biorreactor, se extrajeron diariamente muestras del medio que contenía las agrupaciones de células para determinar el número de células y su viabilidad (NucleoCounter), tal como se muestra en la figura 45. Se observó una expansión general de las células durante el proceso, ya que el inóculo de 0,225*10® células viables/ml se expandió para generar 0,65*10® células viables/ml en el día 3 de la etapa 4 (figura 45).
Además de los recuentos diarios, las muestras del medio del biorreactor se analizaron mediante NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical, Waltham, MA). Se observó que, según el punto de ajuste del reactor en la etapa 0 (pH 6,8), el pH del medio en la etapa 0 era ácido (pH 6,8) durante toda la etapa 0 (figura 46). El punto de ajuste ácido en la etapa 0 pareció reducir la actividad metabólica de las células, al observarse niveles relativamente bajos de ácido láctico y altos de glucosa en el medio de la etapa 0. Una vez que las células comenzaron la diferenciación hasta el final de la etapa 3, las células consumieron casi toda la glucosa (figura 47) en los medios y generaron altos niveles de ácido láctico (figura 48). Además, se observaron aumentos de la densidad celular durante las etapas 1 y 2 (figura 45).
Con el fin de determinar si los cambios específicos de etapa en el pH y el metabolismo coincidían con los cambios de etapa en los patrones de expresión de ARNm tal como se mide mediante qRT-PCR, se realizó lo siguiente. Se usaron cuatro matrices de baja densidad de Applied Biosystems (Life™, Carlsbad, CA) designados como pluripotencia, endodermo definitivo (ED), tubo intestinal (GT) o etapa 4 (S4). Los resultados se presentan como diferencias en veces frente a la muestra de células UTC iPS indiferenciadas como control para normalizar la expresión en todas las ejecuciones y matrices.
Usando estas matrices, se determinó la expresión génica en cada etapa de diferenciación. A continuación, se observó que las células del material de siembra descongeladas en el biorreactor mostraban un patrón de expresión génica indiferenciada en el día 1,2 y 3 de la etapa 0 (24, 48 y 72 horas después de la inoculación en el biorreactor: figuras 49 y 50). Estos resultados se correlacionaron bien con los resultados de citometría de flujo que mostraron altos niveles de expresión de CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81 y la ausencia de CXCR4/CD184 (figura 51). Estos datos de citometría de flujo y de qRT-PCR mostraron patrones de expresión robustos y estables para los genes de pluripotencia (CD9, NANo G, POU5F1, SOX2, TDg F y ZFP42) y la ausencia de expresión de genes que se expresan característicamente durante la diferenciación (CD99, CDH2, CDX2, CER1, CXCR4, EOMES, FGF17, FGF4, FOXA2, GATA2, GATA4, GATA6, GSC, HAND2, HNF4a, KIT, MNX1, MIXL1, PRDM1, PTHR1R, SOX17, SOX7, T, TMPRSS2 y VWF) compatibles con un estado pluripotente estable.
A la finalización de la etapa 0 (72 horas después de la inoculación en el reactor), las células se trasladaron a un medio de diferenciación (tabla 18) que contenía MCX y GDF8. Veinticuatro horas después de este cambio del medio, se observaron alteraciones significativas en los patrones de expresión génica (figuras 49 y 50, expresión en veces frente a control indiferenciado), tales como un aumento >10x en la expresión de FOXA2, HAND2, PRDM1, PTH1R y SOX17, un aumento >100x en CER1, FGF4, GATA4, GATA6, GSC y MNX1 y un aumento >1000x en la expresión de EOMES, FGF17, MIXL1 y T. Estos niveles de expresión aumentados indicaban que las células estaban en transición hacia un destino mesendodérmico. También se observó que los niveles de CDX2 eran elevados en el día 1 de la etapa 1 frente a células indiferenciadas (aumento de 2700x en la expresión frente al control), sin embargo este fue un aumento transitorio en la expresión y los niveles de CDX2 disminuyeron un 97% en el día 3 de la etapa 1 hasta niveles comparables a los observados antes de la inducción de la diferenciación (figuras 49 y 50, expresión en veces frente a control indiferenciado).
A las 72 horas después de la exposición al medio de diferenciación de la etapa 1, las células expresaban un perfil compatible con la especificación del endodermo definitivo, ya que los niveles de CXCR4 alcanzaron un pico a ~400x con respecto al control histórico, FOXA2 se expresó a 136x con respecto al control y SOX17 se expresó a 470.000x con respecto al control histórico. Compatible con el endodermo definitivo, también se observó que la expresión génica de CER1, EOMES, FGF4, GSC, MIXL1 y T al final de la etapa 1 (día 3) había disminuido con respecto a los elevados niveles observados en el día 1 de la etapa 1 (figuras 49 y 50, expresión en veces frente a control indiferenciado).
Estos cambios en la expresión génica observados con qRT-PCR se correlacionaron con los resultados observados mediante citometría de flujo. Se observó una transición casi completa desde una población de células pluripotentes que expresan CD9/negativas para CXCR4 al inicio de la diferenciación (figura 51) a una población homogénea de células que expresan CXCR4 (el 98,6% de células positivas para CXCR4) al final de la etapa 1 (figura 52).
Tras la finalización de la formación de endodermo definitivo (etapa 1), se cambió el medio a uno que contenía FGF7, un morfógeno usado para inducir la formación del intestino anterior primitivo. Compatible con la formación del intestino anterior primitivo, se observó que los niveles de expresión de HNF4a y GATA6 aumentaron en los días 1 y 3 de la etapa 2, mientras que los genes expresados a niveles altos en el día 3 de la etapa 1 (CXCR4, EOMES, FGF17, FGF4, MNX1, PRDM1, SOX17 y VWF) mostraron una expresión reducida al final de la etapa 2 (figuras 50 y 53, expresión en veces frente a control indiferenciado). La expresión de los genes del intestino anterior (AFP, HHEX, PDX1 y PROX1) aumentó (figura 53, expresión en veces frente a control indiferenciado).
Después de que las células se hubieran cultivado en el medio de la etapa 2 durante 72 horas, se cambió el cultivo a un medio de la etapa 3 (tabla 18). Una vez en este medio, las células expresaron marcadores compatibles con un linaje pancreático endodérmico, tal como se midió mediante el ensayo de qRT-PCR para determinar la expresión génica. La expresión génica de PDX1 aumentó en 60 veces desde 12.000x con respecto al control al final del día 3 de la etapa 2 hasta 739.000x con respecto al control al final del día 3 de la etapa 3. Estos datos indicaban que las células estaban especificándose a un destino pancreático (figura 54). En apoyo de esta observación, se observó un aumento de los niveles de expresión, en comparación con el control indiferenciado, para una serie de genes comúnmente expresados en el páncreas (ARX, GAST, GCG, INS, ISL1, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PAX6, PTF1A y SST), tal como se muestra en las figuras 54 y 55. Curiosamente, también se observó que no había expresión de OCT4/POU5F1 (Ct de 37 muestras mediante qRT-PCR) y altos niveles de expresión para otros marcadores de linajes endodérmicos AFP, ALB y CDX2, lo que indica que la población celular en el biorreactor se diferenció desde una población de células pluripotentes a un destino de tubo intestinal relativamente plástico en primer lugar y luego se diferenció a un destino pancreático (figuras 54 y 55).
Al final del proceso de diferenciación de cuatro etapas, las células conservaron altos niveles de expresión de PDX1 (el 95,6% positivas mediante FACS, inducción de ~1.000.000 veces con respecto al control mediante qRT-PCR) y FOXA2 (el 99,5% positivas mediante FACS). Las células mostraron un patrón de expresión compatible con las células progenitoras pancreáticas (el 39,2% positivas para NKX6.1 mediante FACS) y una población de células endocrinas pancreáticas (el 9,4% positivas para PAX6, el 12,4% positivas para cromogranina, el 15,2% positivas para NKX2.2; todas mediante FACS). Este patrón de expresión de marcadores específicos de etapa indica una diferenciación gradual eficiente desde una población pluripotente a células precursoras pancreáticas. Estos resultados observados con citometría de flujo se confirmaron mediante qRT-PCR. También se observó que una serie de genes comúnmente expresados en el páncreas (ARX, GAST, g Cg , IAPP, INS, ISL1, MAFB, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PAX6, PTF1A y SST) tenían todos niveles de expresión aumentados en el día 3 de la etapa 4 (figura 55). Como referencia, en la figura 56 se muestra una micrografía representativa (4x) de agrupaciones de células al final de cada etapa.
Tabla 18
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Tabla 18a
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Tabla 18b
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Materiales:
• línea de células madre embrionarias humanas (hES) H1 (células WA01, WiCell, Madison WI)
• PBS (n.° de catálogo 14190, Invitrogen)
• Y-27632 (n.° de catálogo de Axxora ALX-270-333, San Diego, CA)
• EDTA (Lonza, n.° de catálogo 12604-013, St. Louis, MO)
• NucleoCounter (Chemetec, n.° de cat. YC-T100, Dinamarca)
• Placas de 6 pocillos no tratadas con histocultivo (Becton Dickinson, n.° de catálogo Falcon 351146, Franklin Lakes, NJ)
• Accutase (Sigma, n.° de catálogo 12604-013, St. Louis, MO)
• Sondas de biorreactores para pH y oxígeno disuelto (OD) (electrodo para pH Fermprobe de 225 mm, modelo F-635, y sensor de OD Oxyprobe de 12 mm, modelo D-145, de Broadley James, Irvine CA)
• Dispositivo de macroencapsulación inmunoprotector (Theracyte™, Irvine CA)
• ELISA PARA PÉPTIDO C HUMANO (n.° DE CAT. DE MERCODIA 10-1141-01)
• Glutamax™, MCDB131 e ITS-X (Invitrogen)
• FAF-BSA (Proliant)
• Ácido retinoico, glucosa al 45% (2,5 M), SANT (inhibidor de Shh) (Sigma)
• GDF8 (Peprotech)
• MCX (JNJ)
• FGF7 (R&D Systems)
• LDN-193189 (antagonista del receptor de BMP) (Stemgent)
• TPPB (activador de la PKC) (ChemPartner)
Ejemplo de referencia 15
Diferenciación de células madre embrionarias humanas a partir de la línea celular WA01 a endodermo definitivo: papel de MCX/GDF8 como regulador del ciclo celular en cultivo en suspensión
Las agrupaciones de la línea de células madre embrionarias humanas pluripotentes H1 (código NIH: WA01) se sembraron a 0,5*10® células/ml en matraces agitadores de Erlenmeyer en medio MCDB-131 que contenía bicarbonato de sodio 3,64 g/ml y glucosa 5,5 mM (n.° de catálogo A13051 DJ, Invitrogen, CA), que se complementó con BSA libre de ácidos grasos al 2% (n.° de catálogo 68700, Proliant, IA), 1X Glutamax™ (n.° de catálogo 35050­ 079, Invitrogen, CA), glucosa 2,5 mM adicional (n.° de catálogo G8769, Sigma) e ITS-X a una concentración de reserva de 1:50.000 (n.° de catálogo 51500056, Invitrogen, CA). El medio m Cd B-131 complementado de esta manera se denominará medio basal de la etapa 1 o medio “puro” para los fines de este ejemplo. El inhibidor de GSK3B, 14-prop-2-en-1 -il-3,5,7,14,17,23,27-heptaazatetraciclo[19.3.1.1~2,6~1~8,12~]heptacosa-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-nonaen-16-ona, solicitud de patente estadounidense con número de serie 12/494.789, se denominará “MCX”.
Las agrupaciones se trataron en el primer día de diferenciación con una de seis condiciones: (1) puro, (2) MCX 3 |iM más GDF-8 100 ng/ml (n.° de catálogo 120-00, Peprotech), (3) MCX 3 |iM sólo, (4) GDF-8 100 ng/ml sólo, (5) WNT-3A 20 ng/ml (n.° de catálogo 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más activina A 100 ng/ml (n.° de catálogo 338-AC, R&D Systems, MN) o (6) WNT-3A 20 ng/ml sólo.
Se cambió el medio en cada una de las condiciones a las 24 y 48 horas después del inicio de la diferenciación. En estos momentos, las células en las condiciones 1, 2, 3 y 4 se cambiaron a medio basal de la etapa 1 recién preparado complementado con GDF8 100 ng/ml, mientras que las células en las condiciones 5 y 6 se cambiaron a medio basal de la etapa 1 recién preparado complementado con activina A 100 ng/ml.
Una hora antes del inicio de la diferenciación y 5, 23, 29, 47 ó 71 horas después del inicio de la diferenciación (denominado “tiempo 0”), las muestras en suspensión se transfirieron a una placa de seis pocillos no tratada con histocultivo y se incubaron con EdU (kit Click-iT ®EdU, Life™Technologies, Carlsbad, CA) durante una hora. Después se evaluaron las células incubadas con EdU mediante citometría de flujo a las 0, 6, 24, 30, 48 ó 72 horas después del inicio de la diferenciación para medir el porcentaje de células en las etapas G0/G1, S o G2/M del ciclo celular (figuras 81-87).
Siguiendo este protocolo, se observaron diferencias significativas en el porcentaje de células en las etapas G0/G1, S o G2/M del ciclo celular (figuras 82-87) y se observó que las células tratadas con MCX y MCX+GDF8 tenían una reducción de casi el 40% en la incorporación de EdU en comparación con las otras cuatro condiciones de tratamiento (figura 81). Esta reducción en la incorporación de EdU se correspondía con un aumento del 38% en las células en G0/G1 de la muestra tratada con MCX+GDF8 y un aumento del 54% en las células en G0/G1 para las células tratadas con MCX sólo. Estos cambios en la incorporación de EdU y la transición aumentada a G0/G1 a las 6 horas tras el inicio de la diferenciación no se observaron en células tratadas con GDF8, WNT3A, WNT-3A activina A o medio puro. En su lugar, las células tratadas con GDF8, WNT-3A, WNT-3A activina A o medio puro demostraron una reducción mínima en el porcentaje de células con incorporación de EdU (media, 48,1%, D.E.±1,2) y una disminución promedio del 13% en el número de células en G0/G1 seis horas después del inicio de la diferenciación (desviación estándar, ± 5%) tal como se muestra en las figuras 81 y 82.
Se observaron diferencias similares más adelante en el proceso en la propagación entre los valores de G0/G1 para las células tratadas con MCX o MCX+GDF8 en comparación con las otras condiciones de tratamiento. A las 30 horas después del tiempo 0, se encontró que las células tratadas con MCX o MCX+GDF8 tenían el 43-45% menos de células en G0/G1 en comparación con las células tratadas con WNT-3A activina A, GDF8, WNT-3A o medio puro. Esta diferencia entre el porcentaje de células en G0/G1 se mantuvo a las 48 horas después del inicio de la diferenciación, ya que el 71,9-75,5% de las células tratadas con MCX o MCX+GDF8 estaban en G0/G1 del ciclo celular, mientras que el 48,5% de las células tratadas con GDF8, el 55,8% de las tratadas con WNT3A, el 57,7% de las tratadas con WNT-3A activina A o el 49% de las tratadas con medio puro estaban en G0/G1. Además de las diferencias observadas en la incorporación de EDU y los perfiles G0/G1, las células tratadas con MCX o MCX+GDF8 tenían el 15-33% más de células en la fase S del ciclo celular a las 30 y 48 horas después del tiempo 0 en comparación con las células tratadas con WNT3A activina A, GDF8, WNT-3A o medio puro (figuras 84 y 85).
Los datos (expresión génica para CD99, CD9, CDH1, CDH2, CDX2, CER1, CXCR4, FGF17, FGF4, FOXA2, GATA4, GATA6, GSC, KIT, MIXL1, MNX1, NANOG, OTX2, POU5F1, SOX17, SOX7 y T, mostrados en las figuras 57-80 y 88a-f) indicaron que, en el cultivo en suspensión, la adición de MCX con o sin el miembro de la familia de TGF-p, GDF8, durante el primer día de diferenciación generó un endodermo definitivo comparable al obtenido cuando las células se tratan con WNT-3A 20 ng/ml más activina A 100 ng/ml en el día uno, tal como se mide mediante la expresión génica al final de la formación de endodermo definitivo. Sin embargo, compatible con las diferencias en el ciclo celular observadas durante el proceso de formación de endodermo definitivo, se observaron diferencias intermedias en la expresión génica. En las muestras tratadas con MCX o MCX+GDF8, los genes T (braquiuria), GATA4 y CDX2 se indujeron a niveles sustancialmente superiores a los de las células tratadas con WNT-3A activina A o las otras tres condiciones sometidas a prueba en las primeras 24 horas de diferenciación (figuras 88b, c y d). Por el contrario, la expresión de los genes de pluripotencia (NANOG y POU5F1/OCT4) se redujo drásticamente a las 24 horas en las muestras tratadas con MCX o MCX+GDF8 en comparación con la población celular de partida o las otras cuatro condiciones sometidas a prueba (figura 88e). La magnitud de la inducción de expresión de genes tales como FGF4, FOXA2 y SOX17 fue mucho menor en las muestras tratadas con MCX o MCX+GDF8 en comparación con las otras cuatro condiciones sometidas a prueba a las 24 horas después del inicio de la diferenciación, sin embargo, a las 48 horas todas las muestras expresaban FGF4, FOXA2 y SOX17 a niveles comparables (figuras 88c y e).
Ejemplo de referencia 16
Generación de tejidos ectodérmicos y mesodérmicos usando un proceso de diferenciación en suspensión escalable Este ejemplo demuestra un proceso que puede tanto expandir como diferenciar células madre pluripotentes (PSC) para lograr un proceso de fabricación escalable para la generación de tejidos ectodérmicos o mesodérmicos.
Se expandieron en suspensión dos líneas celulares para proporcionar material de siembra para estos estudios: un subclón de la línea de células hES H1 (WA01), WB0106, y una línea de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) generada a partir de células de tejido umbilical (UTC). Tal como se describió en los ejemplos anteriores, las células expandidas en suspensión se congelaron a alta densidad en un congelador de velocidad controlada, y luego se descongelaron para inocular un biorreactor de vidrio cerrado de 3 litros (DASGIP; Julich, Alemania) o un biorreactor desechable de 3 litros de un solo uso (Mobius, EMD Millipore) a una concentración celular final de 0,225*10® células/ml. Las células inoculadas en el biorreactor de tanque agitado formaron agrupaciones de células en el tanque agitado de manera continua, y se mantuvieron en medio de pluripotencia (E8™, complementado con BSA al 2%) en el reactor durante tres días en total. A las 72 horas después de la inoculación, se inició la diferenciación de las células pluripotentes transfiriendo las agrupaciones de células a matraces de Erlenmeyer desechables de plástico (matraces de PETG de 125 ml, n.° de cat. 4112, Thermo Scientific Rochester NY) en su medio de diferenciación respectivo (tabla 19) para formar tejido mesodérmico/cardiaco (1) o tejido ectodérmico/neural (2).
Una vez iniciado el proceso de diferenciación gradual, las células se mantuvieron durante diez (10) días a 100 rpm en una incubadora humidificada con el 5% de CO2 en una plataforma agitadora (MAXQ 416hp, Thermo Scientific, Rochester NY). Al 1 día, a los 3 días, 5 días y 7 días después del inicio de la diferenciación, se intercambió el medio del matraz por un medio recién preparado elaborado tal como se describe en la tabla 19. Se tomaron muestras de qRT-PCR antes de iniciar la diferenciación como referencia y luego 3, 5, 7 y 10 días después de iniciar la diferenciación.
Con el fin de determinar si los cambios específicos ectodérmicos o mesodérmicos en los patrones de expresión de ARNm podían detectarse mediante qRT-pCR, se usaron tres matrices de baja densidad de Applied Biosystems (Life™, Carlsbad, CA) designadas como pluripotencia, endodermo definitivo (ED) y etapa 6 (S6), y los resultados se compararon con la muestra de células madre pluripotentes indiferenciadas apropiada como control para normalizar la expresión.
Usando estas matrices, se determinó el patrón de expresión génica de las células pluripotentes cultivadas en medio de diferenciación ectodérmica (figura 89) o mesodérmica (figura 90). Se observó que las células diferenciadas en frascos agitadores en cualquiera de las dos condiciones demostraron una expresión génica pluripotente reducida para genes de pluripotencia tales como NANOG, POU5F1/OCT4, TDGF1 y ZFP42 durante un cultivo prolongado desde el día 3 hasta el día 10, tal como se mide mediante la matriz de pluripotencia. La expresión de CXCR4 aumentó en las muestras de células hES o iPS diferenciadas o bien a ectodermo o bien a mesodermo. Estos resultados se correlacionaron con los datos de qRT-PCR que mostraban una alta expresión génica característica de la diferenciación. Las células tratadas con el medio de diferenciación ectodérmica expresaron mayores niveles de ARX, NEUROD, NKX6.1, PAX6 (>100 veces) y ZlC1 (>1000 veces) mediante qRT-PCR desde 3 hasta 10 días después del inicio de la diferenciación (figura 91). Estos datos se confirmaron mediante matriz de FACS, que mostró que tres (3) días después de comenzar el inicio de la diferenciación a un destino ectodérmico tanto las células iPSC como las hES mantuvieron una alta expresión de SOX2 (un gen requerido tanto para las células madre de pluripotencia como para las neurales), pero perdieron la expresión de POU5F1/OCT4 (un gen requerido para la pluripotencia) mientras que ganaron la expresión de PAX6 (un gen de diferenciación neural y endocrina) (figura 92).
También se observó una cinética de diferenciación similar en las células tratadas con el medio de diferenciación mesodérmica. Como la expresión de los genes pluripotentes disminuyó en el transcurso de los 10 días de diferenciación (figura 90), se observó una inducción temprana para los genes característicos del destino mesendodérmico temprano y transitorio (CER1, EOMES, CKIT y VWF) en el día 3, y los niveles de expresión de estos genes disminuyeron hasta casi los niveles de nivel inicial en el día 10 (figura 93). También se observó que la expresión de los genes característicos del mesodermo a los 3, 5, 7 y 10 días después del inicio de la diferenciación mostró una expresión génica temprana y creciente (CDH2, CDX2, GATA6, HNF4a, MNX1, PRDM1 y SOX17 en la figura 93). Se observó el mismo patrón de inducción génica tanto en las muestras de células iPS como en las de hES, lo que indica que el proceso de diferenciación era dirigido y no de naturaleza espontánea.
Estos cambios en la expresión génica observados mediante qRT-PCR se correlacionaron con los resultados observados mediante microscopía de contraste de fases y criocortes inmunoteñidos de agrupaciones. En el día 10, en el cultivo en suspensión diferenciado a mesodermo, aproximadamente 1 de cada 10 agrupaciones comenzó a “latir” espontáneamente, lo que sugiere que las células se habían diferenciado a tejido miocárdico (figura 94, panel izquierdo, día 10, barras blancas). Los cortes transversales teñidos de algunas agrupaciones mostraron un patrón de tinción de p-tubulina estriado, de extremo a extremo, indicativo de la formación de músculo (figura 94, panel derecho).
Se observó un patrón morfológico sorprendentemente diferente para las agrupaciones diferenciadas a un destino ectodérmico (figura 95, panel izquierdo) en comparación con las agrupaciones diferenciadas a mesodermo (figura 94). Las agrupaciones durante la diferenciación ectodérmica eran más grandes y más densas que las células diferenciadas a un destino mesodérmico, y las células diferenciadas ectodérmicas expresaban menos p-tubulina total. Las células que sí expresaban p-tubulina mostraron un patrón de tinción más dendrítico (figura 95, panel derecho, flechas blancas) característico de las neuronas.
Estos resultados, en combinación con los datos de qRT-PCR y FACS, indican que las células almacenadas en bancos y expandidas en suspensión pueden diferenciarse en cultivo en suspensión a destinos mesodérmicos o ectodérmicos de manera dirigida y reproducible.
Tabla 19
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Tabla 20
Materiales:
células derivadas del tejido de cordón umbilical humano (tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.° 7.510.873)
células madre pluripotentes inducibles
partenotes
línea de células madre embrionarias humanas (hES) H1 (células WA01, WlCell, Madison Wl)
PBS (n.° de catálogo 14190, Invitrogen)
Y-27632 (n.° de catálogo de Axxora ALX-270-333, San Diego, CA)
EDTA (Lonza, n.° de catálogo 12604-013, St. Louis, MO)
NucleoCounter (Chemetec, n.° de cat. YC-T100, Dinamarca)
Placas de 6 pocilios no tratadas con hlstocultlvo (Becton Dlcklnson, n.° de catálogo Falcon 351146, Franklin Lakes, NJ)
Accutase (Slgma, n.° de catálogo 12604-013, St. Louis, MO)
Sondas de biorreactor para pH y oxígeno disuelto (OD) (electrodo para pH Fermprobe de 225 mm, n.° de modelo F-635, y sensor de OD Oxyprobe de 12 mm, n.° de modelo D-145, de Broadley James, Irvlne CA) Dispositivo de macroencapsulaclón ¡nmunoprotector (Theracyte™, Irvine CA)
ELISA PARA PÉPTIDO C HUMANO (N.° DE CAT. DE MERCODIA 10-1141-01)
Glutamax™, MCDB131 e ITS-X (Invitrogen)
FAF-BSA (Proliant)
Ácido retlnolco, glucosa al 45% (2,5 M), SANT (Inhibidor de Shh) (Slgma)
GDF8 (Peprotech)
MCX (JNJ)
IWP-4 (Inhibidor de WNT3) (Stemgent)
Medio MCDB131
Medio MCDB131 (personalizado), modificado para elevar el nivel de NaC03 hasta 3,64 g/l.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método de producción de agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales y, opcionalmente, de diferenciación de las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales que comprende las etapas de: a. hacer crecer células madre pluripotentes en un cultivo adherente plano,
b. expandir las células madre pluripotentes a agrupaciones de células agregadas, y
c. transferir las agrupaciones de células madre pluripotentes desde el cultivo adherente plano hasta un cultivo en suspensión dinámico usando una enzima,
en el que se forman las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales, en el que las agrupaciones de células pluripotentes se cultivan y expanden en el cultivo en suspensión dinámico sin perder la pluripotencia, y en el que el método opcionalmente comprende además diferenciar las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales.
2. El método según la reivindicación 1, que comprende además expandir las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales.
3. El método según la reivindicación 2, en el que las células conservan su capacidad proliferativa, capacidad pluripotente y estabilidad del cariotipo.
4. El método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que:
i) las agrupaciones de células se transfieren desde un cultivo adherente plano hasta el cultivo en suspensión usando una enzima seleccionada de proteasa neutra o Accutase, preferiblemente proteasa neutra;
ii) la agrupación de células es indiferenciada;
iii) las células madre pluripotentes se seleccionan del grupo que consiste en células madre pluripotentes inducidas, células derivadas del tejido de cordón umbilical humano, partenotes, células madre embrionarias humanas (hES) y células derivadas del líquido amniótico; o
iv) las células agregadas expresan CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81, y carecen de expresión de CXCR4.
5. El método según las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además diferenciar las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales, en el que la diferenciación comprende:
a. mantener las agrupaciones de células en un sistema de cultivo en suspensión agitado en condiciones dinámicas, en el que las agrupaciones de células madre expresan CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81, y carecen de expresión de CXCR4; y
b. diferenciar las agrupaciones de células pluripotentes en un sistema de cultivo en suspensión con agitación dinámica para generar una población de células precursoras pancreáticas, una población de células precursoras neurales o una población de precursores de cardiomiocitos.
6. El método según la reivindicación 5, en el que:
i) el método genera células precursoras pancreáticas que expresan factores de transcripción de células P; o ii) el método genera células precursoras pancreáticas que expresan los factores de transcripción PDX1 y/o NKX6.1.
7. El método según la reivindicación 5, que comprende diferenciar las agrupaciones de células pluripotentes en una población de células precursoras neurales.
8. El método según la reivindicación 5, que comprende diferenciar las agrupaciones de células pluripotentes en una población de precursores de cardiomiocitos.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales se diferencian en un sistema de cultivo en biorreactor que comprende: las agrupaciones de células pluripotentes tridimensionales mantenidas en medios de suspensión, en el que las agrupaciones de células expresan CD9, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81, y carecen de expresión de CXCR4;
un biorreactor de suspensión con agitación de vidrio;
medios de diferenciación; y
controles para regular la temperatura, el pH y el oxígeno.
10. El método según la reivindicación 9, en el que el medio de suspensión es un medio mTeSR.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las células pluripotentes son células pluripotentes humanas.
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