JPS5816697A - 微生物選別のための自動化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は単位時間当りにチェックされる微生物数を増大
させるためにそれ自体既知のい（つかの単一段階を変形
させそして一緒に使用した微生物の選別のための自動仕
方＠ＩｆＣ関する。

嚢業微生物学においては、微生物の性質を改善する゛こ
とは臨界的重要性を治する課題である。

これは特に抗生物質の産生の収量上昇に対してあてはま
り、そしてこれＫよって製造コストは顕著に低下しそし
て広範囲の使用に対して註物質を利用可能とすることが
可能となった。

収量の改善のためには、その方法は実質的には関連する
株の遺伝物質を変化させることである。その可能性は、
今日では照射、変異原化学試薬または主として「遺伝子
工学」の名称で包含されている手段である。これらの方
法によると、それらのＤＮＡの変化に由来する新しい性
質を示す株が生成される。これらは一般には、所望の効
果に対しては不利である。その理由はそれらが多少とも
偶発的に生ずるからである。有利な方向の改善は１０−
５〜１０−６の大きさの程度で非常Ｋまれに生ずるもの
である。こ九らの株の確認のためには大量の仕事が必要
である。その理由は数千の株を抗生物質産生に関して吟
味（チェック）しなくてはならないからである。

この吟味は一般には小さなフラスコ中で表面下培養（液
内培養）でこれらの株を培養し、そしてその培養液中に
産生された抗生物質湿度を測定することにより行われる
。

選別して包含される仕事を減少させる目的で、瞭天円板
法が導入された［　「Ｆｏｌｉａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
○ｇｉｃａ　Ｊ第１６巻第２１８〜２２４頁（１９７１
）＃照〕。これは寒天栄養培地上に高希釈度で胞子懸濁
液をプレートし、増殖させた後フルクボーラーでまわり
の寒天と共に個々のコａ＝−をパンチ抜きし、そしてそ
れらを個々に培養することを包含している。この方法に
おいては、栄養は使用しつくされ、そして一部分は抗生
物質（これは寒天中に集まっている）に変換され次いで
この寒天円板を供試微生物を接極した栄養培地上に置き
、そして生成された抗生物質の飯を形成された阻止域に
より測定する。このようにして最良の株を確認し、再接
棟しそして巣に培養する。

この方法はストレプトミセスのみならず真菌に対しても
使用される（、Ａ　、Ｔｒｉｌｌｉ氏叫「Ａｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂｉａｌＡＦｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈ
、Ｊ第１３巻第７〜１３頁（１９７８）、１この方法は
阻止域のみならずコロニーのサイズもまた測定しそして
これから活性指数を示すという点で改善された（　「Ｊ
、Ａｐｐｌ、Ｈａｃｔ、Ｊｌｉ　４５巻第６７〜７４頁
（１９７Ｂ）参照〕。

これとは独立して、微生物選別法の機械化および自動化
の実験か行われた。適轟に希釈した微生物懸濁液を振動
ノズルの助けをかりて微細ｚＪ−ｒ−に分散させ、その
小滴を栄誉培地のコーティングを有するフィルム上に＆
＆し、そして形成後のコロニーを写真にとりそして次〜
でコンピューターで評価するいわゆる「回転台」（―ｂ
ｗａｌｔｅｒ　）方式は広く知られている。［ｌ’Ｆｏ
ｒｔｕｎｅＪ１９．７−４年２月号第１００〜１ｏ１ｍ
、および［ｔ４ｅｗＡｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　ｔｂ
ｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＭｉｃｒｏｏ
ｒ−どａｎｉｓｍｓ　ｊ　（１９７５）第３〜１２Ｊｉ
ｊ′〕。

広汎な種々の実験は、これまで知られている選別法に極
めて大なるそして早急な改善の必要性が存在しているこ
とを示している。このことはまた、微生物学的方法のあ
る部分段階に対しては以前は手作業的に実施されていた
方法を引きつぐことのできる単一装置がすでに開発され
ているという事実によっても強調される。しかしながら
すべての試みにもかかわらず、微生物選択法を完全に自
動化することはこれまでは可能ではなかった。

本発明は、一方では方法の機械化および自動化によって
特に注ぎこみによって寒天ディスクを製造することによ
ってその処理値を大幅に上昇させることが可能となるよ
うに、モして／または他方では光学的方法によって菌体
懸濁液の微細分割小滴中に原則として各小滴が実部にた
だ１個だけの胞子または細胞しか含有していないことを
確実ならしめることによる、寒天円板法を改善させた新
規な方法に関する。このことは改善された株を見出す機
会が実質的に増大することを意味する。

すなわち、本発明はそれら自体は既知のいくつかの単一
段階を一緒に使用し、しかもその際（ａ）　　栄養培地
で電化された寒天ディスクを無菌条件下に製造すること
、 （ｂ）　　これら寒天ディスクそれぞれに胞子懸濁液１
滴を接徊するがそれは光学的測定によって原則として各
１滴が１個の胞子だけしか含有しないことを確実ならし
めること、 （Ｃ）　　次いで接種寒天ディスクを胞子にコロニーを
形成させるような条件下のインキュベーター中に保存す
ること、 （ｄ）１胞子コロニーを含有する寒天ディスクを次いで
供試微生物と混合した栄養培地上ＫＶ＜こと、そして （ｅ）　　新たにインキュベーター中に保存した後、コ
ロ早−および阻止域の直径から活性指数をコンピュータ
ーの助けをかりて・計算し、そしてこれから選別を行う
、 単位時間内にチェックされる微生物の数を増大させるた
めの自動化歓生物選別法に関する。

以下においては本発明の好ましい具体例がより絆細に駁
明されている。

本発明の方法の第１段階は寒天ディスクの自動製造を包
含する。この目的のためには、その１端が自動グリッパ
−により把持されうるように成形されそしてチューブを
受答しそして輸送させるための凹部な有する金属ストリ
ップなマガジン中で相互に積み重ねそして滅菌させる。

このマガジンには、各１最下部の輸送ストリップをつか
み、そしてそれを一定時間間隔で引き出す機械が接続さ
れている。その時間間隔は、その各休止の間に、頂部お
よび底部において開放状態のプラスチックチューブが引
き出された輸送ストリップの凹部に挿入されるように！
＃製されている。このチューブは振動によってレザボア
の外に移されそしてシュートをチューブポジショナ−中
に運ばれる。各チューブは実験の開始前に滅菌されてお
りそして輸送ストリップ上で自動的に働く計量装置中Ｋ
Ｗｉ、菌状態子状態れる。

針振装置においては、各チューブは１５〜４重ｔｉｉｉ
ｔｓの寒天および適当な栄養例えば炭水化物、蛋白、栄
養塩、微量元素およびまたビタミンを包含しうる適当な
栄誉培地０．５−で満たされている。この栄養培地は予
めレザボア中で滅菌され、そして次いで温浴中に保たれ
る。（例えば５５℃）。この栄養培地は滅菌条件下に計
量ポンプによって加熱ラインを経て充填ノズルに送られ
る。ホトセル（光電池）がチューブの存在を検査し、そ
してチューブの存在しない時には栄養培地が分配される
のを阻止する すべてのチューブが充填された後栄養培地を固化させる
ために輸送ストリップを冷却区分に送る。

ここで小形寒天ディスクが充填されたチューブ中に生成
されそしてここでこれらは接種されなくてはならない。

これは同級モーターがカニユーレを通して胞子懸濁液を
強制的に送り出す小滴発生装置を使用して実施される。

小滴は矩形１発生装置からのパルスを受けたラウドスピ
ーカーにより離脱せしめられる。その小滴のサイズは周
波数に依存する。胞子密度が適当に調製されている場合
には、その３０〜４０％程度までは１個の胞子のみを含
有しているような小滴を製造することができる。これら
の値はカニユーレ中の胞子の出現をレーザービームを使
用してモニターすることによって夾角的に改善できる。

ラウドスピーカ−を光検知装置、エレクトロニクス制御
およびパルス高さ分析装置によって制岬して各々の場合
に１個の胞子だけが小滴中に存在するよう圧することが
できる。接種はまた、フロー・サイー斗ホトメータ（ｆ
ｌｏｗ　ａｙｔｏｐｈｏｉｏｍｅｔｅｒ）によって、例
えば「システム５０Ｈサイトフルオログラフ」（オルト
・インストルメンツ社製品）、Ｉ−ＦＡＣ８１ＶＪ　（
ヘクトン・テイキンソン製品または「ＴＰ８　ＩＪ（ク
ールター・エレクトロニクス社製品）の各＃ｃｈによっ
て実施することもできる。この方法においては例えば螢
光染料で生榮色することにより、または胞子を発芽させ
そして分離のために発芽胞子および非発芽胞子からの異
ったシグナルを使用するととによって死んだ胞子から発
芽可能な胞子を分離させそして死んだ胞子を捨てること
もまた可能である。

接種した寒天ディスクを有する輸送ストリップを次いで
機械により集め、そして積み重ねてイン中ユベーターに
機械的に送る。このインキュベーターには輸送ストリッ
プを受入れるための棚が設けられている。温度および環
境ｅ＆度が常に一定であることを確実ならしめるためＫ
それは加熱されるかまたは水浴によって冷却されている
。更にファンによって空気を循環させそして時々はトリ
ックリング（ｔｒｌｃｋｌｌｎｇ）装置によってそれを
湿らせる。この設備は水浴から脱イオン水を除去しそし
てそれを滅菌フィルターを経てノズルを通してインキ：
Ｌイータ−中の垂直のトリックリングプレー）Ｋポンプ
で送る。垂直のトリックリングプレートには開口部が設
けられており、これを通して循環空気が導かれる。これ
ら手段の組合せは接種された寒天ディ玄りが乾燥しない
こと、そしてまた凝縮水を集めないことを確実ならしめ
る。寒天ディスクはこのようにして１５〜４５℃好まし
くは２０〜３７℃の温度および約９５嘔相対大気湿度の
インキュベーター中に、１〜１０日好ましくは３〜５日
間保存される。これら条件下には接種された菌体の規則
的増殖が生じうる。

胞子が生長してコロニーを形成した後、そしてこれらが
利用可能な栄養を使用し尽くしてそれを一部分所望の代
謝産物に変換させた後で、コロニーの生産性を代謝産物
の定量的測定によって吟味する。

この目的のためｋは、寒天ディスク上に形成されたコロ
ニーを含有するインキュベーターを自動的に働く他の機
械に取り付ける。この機械は第一にグリッパ一手段によ
って寒天ディスク含有チューブと共に輸送ストリップを
インキ具は一ターから取出しそしてこれらをコンベアー
に送る。このコンにア−は寒天ディスクを有するチュー
ブを供試菌トレイの予め準備された栄養培地上に置く。

適当な供試菌トレイは一般には黒色プラスチックで秒わ
れたアルキニウムより構成されている。その寸法は一度
に比較的多数の寒天ディスクをそれが受入れることがで
きるに充分なだけ大である。個々の寒天ディスク間には
それらが相互して悪影響を及ぼさないように充分に大な
る空間を存在させることが会費である。

このタイプの供試菌トレイは無菌条件下に適当な栄養培
地で充たされる。この培地は勿論これまた滅菌されてい
なくてはならず、そしてこれは供試菌によって１２〜４
重量％の寒天の他に膨水化物（例えば糖、殿粉または高
級アルコール）、窒素源（例えばはプトン、ブイヨン、
肉エキス、アンモニウム塩）、無機塩および微量元素お
よびまたビタミンおよび試験に好ましい効果を有するそ
の他の一般的添加剤を含有している。

滅菌栄養培地を次いで約５０℃に冷却させそして加熱ラ
インを通して混合容器にポンプで送る。ここには自動ポ
ンプによる流入を制御するレベル制動装置がついている
。他の容器には前培養された供試菌例えばスタフィロコ
ッカスの懸濁液が入っており、これはこれまたレベル調
節装置で制御されている計量ポンプによって混合容器に
送られる。そしてここで栄養培地との完全な混合によっ
て均質に混合される。接極された栄養培地を次いで供試
菌トレイ中に＠論的に満たす、３０〜８０−一般に５０
ｓｄが各トレイに充填される。この目的のためには計量
ポンプが使用される。これは機械的に移動可能なテーブ
ル上に位置されているが、これはインキュベーター中の
すべてのトレイが充填されるまでノズルが各充填の後に
次のトレイに動く様に制御されている。次いで温度をそ
の栄養培地が固化するまで低下せしめる。

完全に準備された供試薗トレイで充満されたインキュベ
ーターを次いセ接種寒天ディスクを前進させる機械に接
続させる。グリッパ−によって、供試菌トレイをここで
積み重ねた状態で除去し、そして接種寒天ディスクを機
械的にその上に隼独に置く。次いで供試菌トレイを積み
重ねた状態でインキュベーターに戻す。

接種寒天ディスクを、２０〜４５℃で１２〜４８時間、
好ましくは約１８時間供試菌を混合した栄養培地上で作
用せしめる。この間に寒天ディスクの栄養培地中に集め
られていた抗生物質は供試薗の培地中に拡散し、そして
そこで阻止域の形成を生ずる。これら阻止域のサイズは
形成された抗生物質蓋の尺度である。阻止域がはっきり
出現した後、供試−トレイを再び自動的にインキュベー
ターから堆出しそしてコロニーおよび阻止域の直径の測
定のためのエレクトロニクス像エバリュエーターを有す
るカメラに送る。

６１１１足抜、供試−トレイはインキュベーターに送り
返されそして評価の間そとに保存される。

コロニーおよび阻止域の直径の測定は例えばライノ（Ｌ
ｅｉｔｚ　）社製造のテクスチャー分析糸（’ｌｌ’Ａ
８　）またはその他の装置により実施されうる。これは
供試−トレイの置き換えおよ′び前進果を評価のために
コンピューター例えばオリベラティＰ６Ｌ１６０に伝達
させることができる。これはプログラム化されていて、
その結果それは測定された値を計算し、チューブ当りの
コロニーの数を検査し、コロニーおよび阻止域の１−径
から活性指数を計算し、その活性指数を測定の結果に従
って分類し、それらを保存しそしてそれから分布曲線（
ヒストグラム）をつくりそしてこれをプリントアウトす
る。このヒストグラムに基いて特定活性指数（ｐｏｔｅ
ｎｃｙ　１ｎｄｅｘ　）群のどのコロニーを選択すべき
であるかを決定することができる。その後で、コンピュ
ーターはまた選ばれたコロニー数をもプリントアウトす
ることかできる。

本明細書に記載された方法は、抗生物質以外の目的に対
しても使用することができる。それはまた、例えば抗代
訓剤、酸素阻害剤、成長促進物質またはビタミンのよう
なその他の代謝産物の産生に定量的変動を有する微生物
の選別に対しても適当である。これに対する前提条件は
適当な微生物の使用、または染色または沈降反応（例え
ば免歿沈降＞ｒｔｃより介分に良好に指示能力のある試
験糸の開発である。しかしながら、それはまた製定の化
ｌ産物を肩する菌の選択に対しても使用することができ
る。

更に、本発明の使用は微生物の選択には限定されておら
ず、それはまた細胞培養の選別にも使用を見出しうる。

シャフト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）それら自体は既知のいくつかの単一段階を一緒に使
   用し、しかもその際 （ａ）　　栄養培地で富化された寒天ディスクを無確条
   件下に製造すること、 （ｂ）　　これら陣天ディスクにそれぞれ胞子懸濁液１
   滴を接極するがそれは光学的測定によって原則として各
   １滴が１個の胞子だけしか含有しないことをＭ爽ならし
   めること、（Ｃ）　　次いで接種寒天ディスクを胞子に
   コロニーを形成させるような条件下のインキュベーター
   中に保存すること、 （ｄ）１胞子コロニーを含有する寒天ディスクを次いで
   供試微生物と混合した栄養培地上に奮くこと、そして （ｅ）　　新たにインキュベーター中に保存した後、コ
   ロニーおよび阻止域の直径から活性指数をａンビュータ
   ーの助けをかりて計算し、そしてこれから選別を行う、 単位時間内にチェックされる微生物の数を増大させるた
   めの自動化做生物選別法。 ２）蝉天ディスクが、ストリップとして設計されている
   キャリア上で、自動的に働きそしてチューブを寒天含有
   栄養培地で満たすような計量装置中に輸送されるチュー
   ブ中で製造される、前記特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３）寒天ディスクに死んだ胞子を同時に除去するような
   フローサイトホトメーター中で卑−胞子を接種する、前
   記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）接種寒天ディスクを、１５〜４５℃好ましくは２０
   〜５７℃の間の温度および約９５チの相対湿度のインキ
   ュベーター中ＶＣ１〜１０日好ましくは５〜５日間保存
   する、前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５）供試菌と混合した栄養培地を供試菌トレイ中で自動
   的に計量させ、そして栄養培地の固化後、その上に胞子
   コロニー含有寒天ディスクを機械的にそれらが相互に影
   響しないように充分の間隔をあげて位置させる、前記特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ６）胞子コロニー含有寒天ディスクを１２〜４８時間好
   ましくは約１８時間、２０〜４５℃で供試菌と混合した
   栄養培地上で作用させる、前記特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ７）培養後の供試菌トレイを自動的にインキュベーター
   から取出し、そしてテクスチャー分析系のようなコンピ
   ューター）（接続されたカメラに送る、前記特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ８）コンピューターがコロニーおよび阻止域の直径から
   活性指数を計算し、結果を分類し、それらを保存しそし
   て活性指数の分布曲線をプリントアウトする、前記％許
   請求の範囲第１項記載の方法。