TW202346566A - 人工淋巴結生物反應器 - Google Patents
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Abstract
一種用於高密度細胞培養支持的系統和方法，其利用兩個循環迴路：細胞培養迴路和培養基調節迴路。
Description
[相關申請的交叉引用]
本申請要求2022年4月7日提交的美國專利申請序號63/328,382的優先權，其內容據此通過引用以其整體併入。
本發明涉及人工淋巴結生物反應器系統。更具體地，該系統被設計成用於高密度哺乳動物細胞培養，特別是原代免疫細胞的擴增和維持，其利用兩個循環迴路：與細胞分離裝置集成的細胞培養迴路和培養基調節迴路。
在各種類型的細胞培養反應器和用於分離的離心系統的形式上存在創新。在許多細胞培養反應器中，細胞必須在受控的條件下生長，包括被懸浮或灌注在細胞培養基中，其中例如，必須控制細胞培養基的內容物以優化細胞生長和生物反應器的性能。因此，培養基調節系統與生物反應器組合使用或集成到生物反應器中，以調節其中的培養基。通常，培養基調節在中空容器或容器（例如，燒杯或瓶子）中進行，該中空容器或容器具有控制培養基的組成的複雜的探針系統、混合培養基的一個或多個攪拌器、以及圍繞容器的某種類型的溫度控制夾套。
已經使用了許多容器形式，諸如T形瓶、皮氏培養皿、細胞工廠、細胞堆疊容器或滾瓶，並且這些形式限制了可以達到的細胞密度。在攪拌罐、中空纖維生物反應器和填充床生物反應器系統中進行的微載體培養已經被用於嘗試增加細胞密度。例如，包含用於截留細胞的載體或基質系統的填充床的填充床生物反應器系統已經先前在美國專利第4,833,083號、第5,501,971號和第5,510,262號中公開，並且這些生物反應器通常用作再迴圈流通式生物反應器。
灌注培養是一種用於利用由細胞分泌的抗體生產生物藥物的細胞培養方法。灌注培養是這樣的培養方法，其中含有細胞的培養溶液被連續地過濾並排出，而含有營養組分的新鮮培養基被連續地供應到培養罐中。在灌注培養中，死亡細胞、細胞碎片、DNA（去氧核糖核酸）、HCP（宿主細胞蛋白）、抗體和廢產物被排出，因此所用的培養基的量增加。參見JP 2010-29109 A、JP 2011-211961（2015-53892）。
由於細胞是基於細胞的療法和基因療法的產物，並且許多過程（如灌注或活性細胞內疫苗）需要完整的細胞，因此許多現有技術的分離技術不適用於本技術。大多數用於生物製造的離心技術是基於管狀轉鼓或圓盤堆疊分離器。管狀轉鼓技術可以產生高的離心力，從而產生固體的糊狀物。圓盤堆疊和逆流（例如kSep、Elutra和Rotea）離心機不將細胞緊密堆積，而是形成漿料。在WO2022046572A1中描述了自動化的離心系統，該離心系統用於以漿料形式連續地排放固體，但為一次性使用的系統。
本發明描述了一種用於高密度細胞培養支持的系統，其包括第一循環迴路和第二循環迴路，第一循環迴路包括含有細胞的迴路和第一保持容器以及一個或多個用於連續循環含有細胞的培養基的泵，第二循環迴路是無細胞培養基調節迴路並且包括第二保持容器以及一個或多個用於循環培養基的泵；和控制器，用於引導第一數量的培養基通過第一循環迴路的循環和第二數量的培養基通過第二循環迴路的循環。
在另一實施例中，該系統包括在第一循環迴路和第二循環迴路之間的細胞分離裝置。
在該系統的另一實施例中，細胞分離裝置被配置為使用離心力從培養基中連續地分離細胞。
在該系統的另一實施例中，第二保持容器可操作地連接至細胞分離裝置，其中細胞分離裝置被配置為將濃縮細胞返回至第一保持容器，以用於完成第一循環迴路。
在該系統的另一實施例中，細胞分離裝置被配置為將分離的無細胞培養基遞送至第二保持裝置以用於重新調節培養基，其中重新調節的培養基然後被返回至第一保持裝置以用於完成第二循環迴路。
在另一實施例中，其中第二保持容器包括這樣的循環迴路，該循環迴路被配置為通過中空纖維人工肺的管腔側遞送無細胞培養基，並且其中人工肺迴路被配置為對第二保持容器中的無細胞培養基進行充氧。
在該系統的另一實施例中，第二保持容器包括一個或多個感測器，用於連續測量pH、氧、葡萄糖、乳酸鹽、氨及其組合中的至少一種。
在另一實施例中，其中第一循環迴路包括一個或多個探針，用於測量第一保持容器內的培養基的pH、溶解氧或其組合，和/或其中第一保持容器被配置為連續地監測與第一保持容器內的培養基的體積相關的容器的重量。
本發明還描述了一種用於高密度細胞培養支持的方法，其包括：在第一保持容器中濃縮哺乳動物細胞的團塊，並通過在第一循環迴路中從濃縮的哺乳動物細胞的團塊中去除無細胞培養基來分離濃縮的團塊；將無細胞培養基的團塊遞送至第二循環迴路；調節在第二環路中的第二保持容器中的無細胞培養基的團塊；在第二迴路中從無細胞培養基的團塊中去除廢產物；以及將無細胞培養基的經調節的團塊返回到第一循環迴路。
在該方法的另一實施例中，在第二保持容器中的調節包括通過人工肺中空纖維筒裝置在高速再循環迴路中對無細胞培養基進行再充氧。
在該方法的另一實施例中，調節進一步包括調節一種或多種代謝參數，這些代謝參數包括pH、葡萄糖、乳酸鹽、谷氨醯胺、氨或其組合。
在該方法的另一實施例中，細胞在第一容器中從耗盡的培養基中分離是連續過程，並且進一步包括在連續過程或半分批過程中的一種中使用離心力從細胞中去除無細胞培養基的級分。
在該方法的另一實施例中，經調節的培養基從第二保持容器返回到第一保持容器，替換從離心裝置中的細胞去除的廢培養基的體積。
在該方法的另一實施例中，通過調節細胞在離心機中的停留時間、離心機的速度（rpm）、反向淘析泵的速率中的一種或多種，並調節細胞的再循環速率以維持第一保持容器中培養基的預定水準，在第一循環迴路和第二循環迴路之間的離心裝置中分離細胞。
在該方法的另一實施例中，該方法包括從第二保持容器中提取無細胞培養基的樣本；分析葡萄糖、谷氨醯胺、氨、乳酸或滲透壓中的一種或多種；以及通過調節培養基、葡萄糖和谷氨醯胺遞送泵或廢物去除泵的一個或多個參數，響應於分析來調節葡萄糖、谷氨醯胺、氨、乳酸或滲透壓中的一種或多種。
在又一種方法中，本發明包含組合的分批補料和灌注培養方法，其包括進行用於以第一濃度接種細胞的第一分批補料過程，允許細胞生長至第一體積，並通過添加經調節的培養基將細胞濃度調節回第一濃度，並且在整合容器中重複分批補料過程，直到達到第一選定體積；接合第一循環迴路和第二循環迴路以灌注整合容器中的細胞，並增加第一選定體積內的細胞密度；通過經由整合容器中的取樣端口從循環迴路中採集的樣本監測細胞數量和細胞存活力；以及添加來自第二循環迴路的經調節的培養基以用於維持恆定的體積。
在組合的分批補料和灌注培養方法的方法的另一實施例中，其中灌注包括：啟動灌注循環，包含將細胞從整合容器移動至產生離心力的旋轉容器，並從細胞中分離無細胞培養基；將較重的細胞返回到整合容器；以及將無細胞培養基遞送至第二循環迴路中的第二保持容器，以用於調節無細胞培養基。
在組合的分批補料和灌注培養方法的方法的另一實施例中，使用中空纖維筒接合透析迴路作為第二保持容器的一部分，以從無細胞培養基中去除乳酸和其他代謝廢物。
在組合的分批補料和灌注培養方法的方法的另一實施例中，並且進一步包含連續地監測無細胞培養基的氧水準，並且如果氧水準降低到低於預先選擇的設定點，則增加經調節的培養基的遞送速率，同時成比例地增加從第一循環迴路中的細胞去除和廢物去除的速率。
在組合的分批補料和灌注培養方法的方法的另一實施例中，並且進一步包含使用比例-積分-微分控制器（PID）控制迴路調節第二容器中的pH，以用於降低人工肺中CO
2的濃度，並用空氣或N
2氣體替換CO
2；以及當CO
2水準達到零時，向第二保持容器中加入新鮮的無細胞培養基或緩衝液，以提高無細胞培養基的pH。
在圖1中，術語被定義如下：FR =流量計，CD =紅外細胞密度感測器，W =重量，並且DO=溶解氧。在圖1的實施例中，第一泵，泵1，是灌注泵。泵速率將增加，以將細胞培養迴路53中的DO維持在設定點（泵1+4 =泵2）。泵2的速率=泵3的速率+泵4的速率。
該系統可以是具有主要部件的生物反應器，這些主要部件包含兩個保持容器和兩個獨立的循環迴路。兩個保持容器包括無細胞保持容器，用於調節培養基以調節代謝參數（例如，pH、葡萄糖、乳酸鹽、谷氨醯胺和氨）和用於使用高速中空纖維充氧器進行氧飽和；和用於將哺乳動物細胞培養至高密度（即＞10
7個細胞/ml）的生物反應器容器。無細胞容器具有循環迴路，用於向生物反應器容器連續遞送氧飽和的和代謝調節的培養基。生物反應器容器具有連續的細胞再循環迴路，該細胞再循環迴路使用離心力分離細胞和廢培養基，將細胞返回到生物反應器，並且來自生物反應器迴路的廢培養基被返回到無細胞容器用於重新調節。來自無細胞迴路的重新調節的培養基被返回到生物反應器容器，以替換從細胞再循環迴路中去除的廢培養基。
本發明所述的生物反應器優於其他生物反應器，因為它解決了在培養中向哺乳動物細胞的溶解氧轉移速率不足的問題，該限制阻止了支持高密度細胞培養的能力。
在一些實施例中，生物反應器可以支持超過約1000萬個細胞/ml的細胞密度。在一個實施例中，生物反應器可以支持約1億個/ml的細胞密度。在一些實施例中，這些細胞密度可以在高達8升的體積下被支持，在一個實施例中，在10升或更高的體積下被支持。
本發明的一個方面涉及用於＞ 1×10
7ml的細胞的高密度細胞培養支持的系統。該系統具有第一循環迴路和第二循環迴路，第一循環迴路是含有細胞的迴路並且包括第一保持容器和用於含有細胞的培養基的連續循環的一個或多個泵，第二循環迴路是無細胞培養基調節迴路並且包括第二保持容器和用於循環培養基的一個或多個泵。提供控制器，用於引導第一數量的培養基通過第一循環迴路的循環和第二數量的培養基通過第二循環迴路的循環。
在第一循環迴路和第二循環迴路之間是細胞分離裝置。細胞分離裝置優選地使用離心力從培養基中連續地分離細胞。濃縮的細胞被返回到第一保持容器，同時反向淘析力提取無細胞培養基並遞送到第二保持容器。
第一保持容器可操作地連接到細胞分離裝置。細胞分離裝置將濃縮的細胞返回到第一保持容器，完成第一循環迴路。
細胞分離裝置將分離的無細胞培養基遞送至第二保持容器，在第二保持容器中，培養基被重新調節。然後，重新調節的培養基被返回到第一保持裝置，完成第二循環迴路。
第二保持容器包括這樣的循環迴路，該循環迴路通過中空纖維人工肺的管腔側遞送無細胞培養基。通過使來自第二容器的培養基在高速下循環通過中空纖維人工肺，將包含氧氣、空氣、二氧化碳和氮氣的受控的氣體混合物遞送到中空纖維人工肺的管腔側，溶解氧的濃度可以在短的時間段內達到飽和。以這種方式，人工肺迴路提供了對第二保持容器中的無細胞培養基進行充氧和對培養基pH的校正。此外，受控速率的泵用於將葡萄糖和/或谷氨醯胺和新鮮的培養基遞送至第二保持容器，同時對額外的泵進行程式設計，以在第二容器中維持恆定體積的方式從第二保持容器中去除廢培養基。可以添加額外的迴路以將無細胞培養基從第二容器循環至透析中空纖維裝置的管腔側，以便去除乳酸鹽和氨廢產物。從透析裝置的毛細管外側去除廢培養基。
第二保持容器含有用於連續測量pH、氧、葡萄糖、乳酸鹽和氨的感測器。來自這些感測器的資訊用於對連接到第二保持容器的泵和氣流進行程式設計，以維持經程式設計的設定點。
第一循環迴路包括一個或多個探針，用於測量第一保持容器內培養基的pH、溶解氧或其組合。此外，第一保持容器懸掛在系統上以持續地監測重量，該重量與容器內培養基的體積相關。
溫度控制系統將第一保持容器、第一循環迴路、第二保持容器、細胞分離裝置和第二循環迴路保持在受控的溫度設定點，優選地37℃+/-3℃。
本發明的另一方面涉及一種用於高密度細胞培養支持的方法。細胞在培養中通常達到約1×10
6/ml的密度，其中它們變得進一步擴增受到氧氣的限制。此外，細胞只能以1×10
6/ml的密度維持幾天，因為隨著時間的推移，它們消耗所有可用的營養物並產生有毒的廢產物。氧濃度是由於氣體進入液體的氧轉移速率引起的，當細胞密度達到約1×10
6個細胞/ml時，細胞的氧攝取速率超過氧進入液相的氧轉移速率。
活化的T細胞的氧攝取速率為約100 mmol/10
10個細胞/天或0.1 mol/10
10個細胞/天。在4×10
-5mol O
2/ml下，10
-5mol/10
6個細胞/ml/天。因此，所有O
2在4天內被消耗（假設在時間零點培養基完全飽和）。如果細胞密度增加到1×10
7個細胞/ml，那麼10
-4mol/10
7個細胞/ml/天，所有的O
2在0.4天（9.6 h）內被消耗。如果細胞密度增加到1×10
8個細胞/ml，那麼10
-3mol/10
8個細胞/ml/天，所有O
2在0.04天（0.96 h）內被消耗。為了以1×10
6/ml向4 L的細胞提供足夠的氧氣，需要4 L/4天= 1 L/天或42 ml/hr的灌注速率。在10
7/ml=4 L/0.4天、10 L/天或420 ml/hr。在10
8/ml = 0.4 L/0.04 100 L/天或4200 ml/hr或70 ml/min。
因此，在生物反應器中，在容器中必須存在均勻的氧氣。為了以10
8/ml的密度消耗氧氣的速率供應氧氣，需要以約100×/小時交換反應器的全部容積。
為了克服這種限制，具有高速人工肺的第二容器保持氧飽和培養基的來源，以遞送至含有細胞的第一容器。快速飽和氧氣所需的高速與細胞不相容。高速循環中的任何細胞都會被剪切破壞。具有細胞的第一容器和不具有細胞的第二容器的這種分離通過提供氧飽和培養基的現成來源以遞送至具有細胞的第一容器而解決了該問題。
該方法包含用能量源（諸如葡萄糖和谷氨醯胺），對第二容器中的培養基進行重新調節，並去除廢物，諸如乳酸和氨，以便解決隨著時間的推移營養物的耗盡和廢產物的積累的問題。該方法減少了在高密度培養中支持細胞所需的培養基的總量。
細胞分離裝置將含有細胞的培養基遞送到離心力場中，該離心力場被設計成允許高密度細胞連續地通過第一循環迴路，而無需造粒。與離心力方向相反的反向淘析力（諸如由泵提供的反向淘析力）首先將無細胞培養基拉到出口端口。該泵將產生略大於離心力的力。檢測器裝置（諸如在出口端口處的光子光散射檢測器）將檢測流向出口端口的任何細胞。當檢測到細胞時，反向淘析泵稍微減慢，允許細胞返回第一循環迴路。加速和減慢淘析泵的這一過程將使得細胞能夠在第一循環迴路中連續再循環，並為第二循環迴路去除無細胞培養基。
在第二容器中的調節包含在通過人工肺中空纖維筒裝置的高速再循環迴路中對無細胞培養基進行再充氧。調節進一步包含調節選自包括pH、葡萄糖、乳酸鹽、谷氨醯胺、氨及其組合的組的一種或多種代謝參數。
從耗盡的培養基中分離第一容器中的哺乳動物細胞是連續的過程，並且該方法包含在連續過程或半分批過程中使用離心力從哺乳動物細胞中去除無細胞培養基的級分。
將經調節的培養基從第二保持容器返回到第一保持容器替換了從離心裝置中的細胞去除的廢培養基的體積。
該方法還包含通過調節細胞在離心機中的停留時間、離心機的rpm、反向淘析泵的速率中的一種或多種以及調節細胞的再循環速率，在第一循環迴路和第二循環迴路之間的離心裝置中分離哺乳動物細胞，以維持第一保持容器中培養基的預定水準。從分離裝置去除的相同量的無細胞耗盡的培養基作為重新調節的培養基被返回到第一容器。
在一個或多個實施例中，該方法包含從第二保持容器中提取無細胞培養基的樣本；分析葡萄糖、谷氨醯胺、氨、乳酸和滲透壓中的一種或多種；以及通過調節培養基、葡萄糖和谷氨醯胺遞送泵和廢物去除泵的一個或多個參數，響應於分析來調節葡萄糖、谷氨醯胺、氨、乳酸和滲透壓中的一種或多種。
本發明的又一方面涉及一種組合的分批補料和灌注培養方法。該方法包含進行第一分批補料過程，以5×10
5個細胞/ml的濃度接種細胞，並允許細胞在第一體積例如1 L中生長至約1×10
6個細胞/ml。隨後通過添加額外的1 L經調節的培養基將細胞濃度調節回5×10
5ml。這種分批補料的過程被持續直到達到期望的體積。一旦在第一容器中達到期望的體積，第一循環迴路和第二循環迴路被接合以灌注第一容器中的細胞，並增加最終達到的體積內的細胞密度。
使用線上細胞密度檢測器監測第一容器中的細胞濃度，並通過經由第一容器中的取樣端口從循環迴路中獲取的樣本監測細胞存活力；添加來自第二循環迴路的經調節的培養基，以平衡在第二循環迴路中去除的無細胞耗盡的培養基，以便維持恆定的體積。
灌注步驟包含啟動灌注循環，包含將細胞從整合容器移動至產生離心力的旋轉容器，並從細胞中分離無細胞培養基；將較重的細胞返回到第一容器中；將無細胞培養基遞送至第二循環迴路中的第二保持容器，用於調節無細胞培養基。
該方法可以進一步包含使用中空纖維筒接合透析迴路作為第二容器的一部分，以從無細胞培養基中去除乳酸和其他代謝廢物。
連續地監測無細胞培養基的飽和氧水準允許進行調整，例如，如果氧水準降低到低於預定的設定點，則增加經調節的培養基的遞送速率，同時成比例地增加從第一循環迴路中的細胞去除和廢物去除的速率調整飽和氧水準。
可以使用降低人工肺迴路中的CO
2濃度的比例-積分-微分控制器（PID）控制迴路，並替換為空氣或N
2氣體，將第二容器中的pH調節至設定點。當CO
2水準達到零時，向第二保持容器或緩衝液中加入新鮮的無細胞培養基可以提高無細胞培養基的pH。
培養基調節迴路（
MCL
）
培養基調節迴路（MCL）20將廢物返回子迴路22連接至無細胞容器24和生物反應器容器26。無細胞容器24可以包含1-15升的攪拌式生物反應器或柔性袋。無細胞容器24可以被控制在大約37℃。MCL 20還包含對溶解的O
2和pH的連續監測，以及可以通過無菌留置探針或外部裝置監測代謝變化的其他探針。MCL 20可以包含用於無菌去除培養基28的取樣端口30，用於葡萄糖、乳酸鹽、NH
4和滲透壓以及其他代謝參數的離線測量。也可以存在用於壓力均衡的無菌0.2-0.45微米空氣篩檢程式。MCL 20還可以包含連續的可調速率的高速充氧迴路30，其從無細胞容器24中去除培養基，並使培養基循環通過中空纖維充氧器34的管腔，並將充氧的培養基返回至無細胞容器24。氣體通過充氧器筒34的額外毛細管空間遞送。筒34被加熱以防止冷凝。品質流量控制器（MFC）36控制氣體的遞送。在優選的實施例中，存在4個MFC38、40、42和44，分別對於空氣、CO
2、O
2和N
2各一個。
為了調節無細胞容器24中的培養基，受控速率泵可以遞送營養物並去除廢產物。在優選的實施例中，四個受控速率泵46、48、50和52，分別用於廢物收集、葡萄糖遞送、谷氨醯胺遞送和培養基遞送。在一個實施例中，可以使用穿過透析筒58的額外高速迴路，以便保留細胞因子、血清和生長因子，同時選擇性地去除代謝廢物，諸如乳酸和氨。
細胞培養迴路（
CCL
）
細胞培養迴路53併入了連續離心裝置56，並將生物反應器容器26連接到其上。離心裝置56濃縮細胞並去除無細胞培養基。在一個實施例中，無細胞培養基被遞送至培養基調節迴路20，該培養基調節迴路使用人工肺34對培養基進行再充氧，並使用人工腎透析裝置58去除廢物。葡萄糖、谷氨醯胺、氨、乳酸和滲透壓的外部取樣和分析通過與培養基、葡萄糖和谷氨醯胺遞送泵和廢物去除泵連接的算法來控制。氣體品質轉移系統可以用於控制pH和氧水準。
培養基從MCL 20遞送至生物反應器26，並且遞送可以由可調速率泵60控制。分別用於pH和溶解氧（DO）的無菌留置探針62、64位於生物反應器26內部。內容物被控制在可調節的溫度。生物反應器26包含用於空氣壓力均衡或向離心機56移動的受控閥端口、用於細胞計數和存活力的離線測量、表型分析的無菌取樣端口75以及用於無菌添加微珠的端口74。連續離心裝置56連續地從培養基中分離細胞，將細胞返回到生物反應器26，並將廢培養基返回到無細胞容器。培養基被遞送到細胞培養迴路53，到達生物反應器，並從與離心力的方向相反的端口返回到培養基調節迴路20。
生物反應器26可以是1升或更大的發酵罐或氣體可滲透袋，並且在一個實施例中，生物反應器可以是球形8升生物反應器。將含有細胞的培養基從生物反應器中連續去除，並通過受控的離心力場56，該離心力場被設計成維持細胞連續循環出生物反應器26並回到生物反應器26。調節離心力場56，以便從含有細胞的培養基中分離無細胞的培養基。使用泵72將無細胞培養基70返回到無細胞容器24中以用於重新調節，該泵提供與離心機56的離心力向量相反的力。
程序控制迴路的討論
在一個實施例中，使用組合的分批補料和灌注培養方法。使用無菌注射端口將大約5000萬個細胞轉移到生物反應器26容器中。將來自整合容器或培養基調節迴路（MCL）20、無細胞容器24的新鮮充氧的培養基轉移至生物反應器26，以將細胞濃度調節至大約0.5×10
6個細胞/ml。該體積可以由數位重量感測器監測。在一些實施例中，通過生物反應器中的無菌端口74注射單克隆抗體包被的微珠或其他生長因子。
每天通過從無菌取樣端口75獲取的樣本監測細胞數量和存活力。允許細胞不受干擾地孵育3天或直到細胞密度達到1×10
6個細胞/ml。
當細胞密度達到1×10
6個細胞/ml時，通過泵60將來自無細胞容器24的額外的經調節的培養基添加至生物反應器26，以將細胞密度稀釋至0.5×10
6個細胞/ml。每天重複該補料分批過程，直到生物反應器中的總體積達到預定（選定）水準。在優選的實施例中，該水準為8升。
在另一實施例中，每3天通過無菌端口74添加CD3/CD28包被的微珠，以維持1:1的珠:細胞比率。
當體積達到預定（選定）量時，開始灌注循環。細胞通過泵從生物反應器26移動到產生離心力的旋轉容器中。較重的細胞和珠將在力向量的方向上積累，並返回到生物反應器容器中。產生與離心力向量相反的力的泵將去除無細胞培養基並將培養基返回至無細胞容器。相反的向量力泵將振盪，以便在去除任何細胞之前去除最大量的培養基並釋放。這可以通過關閉排氣閥並接合泵以將新鮮的經調節的培養基從整合容器轉移到袋中來實現。打開袋和離心機之間的閥門將允許細胞/珠流入到離心機中。離心力將保留細胞和珠，並且培養基可以被去除並返回到整合容器中以用於調節。
可以通過切換閥和調節回流泵上的流速來調節離心機中的停留時間和培養基去除速率。細胞的再循環速率將增加，以維持生物反應器中的氧設定點接近100%飽和。
隨著生物反應器中細胞密度的增加，乳酸將累積，從而降低pH。
為了將pH維持在設定點（通常在6.8-7.4之間），用PID控制迴路調節遞送到中空纖維充氧器的氣體混合物，使得隨著pH下降，CO
2的百分比降低。在過程開始時，CO
2通常被設定為5%，並且隨著pH的下降而降低。
當pH控制器要求CO
2水準低於0%時，接合廢物泵以從無細胞容器中去除培養基，並泵入新鮮的培養基以替換被去除的培養基。在一個實施例中，使用6000道爾頓截止中空纖維筒接合透析迴路，以去除乳酸，而不是去除和替換完整的培養基。
重新調節的培養基從無細胞容器遞送至生物反應器的速率將作為生物反應器中飽和氧水準的函數以對數方式增加。使用生物反應器中的無菌探針連續地監測飽和氧水準。當水準下降到低於設定點（通常＞ 95%）時，充氧的培養基的遞送速率增加。同時，從生物反應器到離心力裝置的細胞去除的速率和廢物去除的速率成比例地增加。
整合室具有高速迴路，該高速迴路通過中空纖維充氧器的管腔側泵送培養基。速度越高，每單位時間可以溶解的氧氣越多。由於培養基調節迴路（MCL）是無細胞的，因此不存在限制泵速度的剪切問題。增加攪拌速率也可以增加氧轉移的速率。此外，可以調節氣體混合物以增加O
2的百分比。
隨著細胞生長，細胞產生乳酸，乳酸降低培養基的pH。中空纖維充氧器的殼體側的初始氣體混合物是空氣中的5% CO
2。當pH下降到設定點（例如6.9）時，CO
2的百分比降低並被氮氣和氧氣的混合物替換，因此空氣流速和O
2的百分比是恆定的。最終，CO
2水準將達到0。在零CO
2時，添加新的培養基來稀釋乳酸並提高pH。葡萄糖和谷氨醯胺使用來自無菌端口的樣本離線測量。建立設定點，以便添加葡萄糖和谷氨醯胺，並經由受控泵去除廢物，以維持設定點水準。如果離線滲透壓達到設定點，則葡萄糖和谷氨醯胺添加泵被超馳控制，並添加新鮮的培養基。
儘管已經參照優選的實施例對本發明進行了描述，但本領域工作人員將認識到，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，可以對形式和細節進行改變。
1:泵
2:泵
3:泵
4:泵
20:培養基調節迴路
22:子迴路
24:無細胞容器
26:生物反應器容器
28:培養基
30:取樣端口
34:筒
36:品質流量控制器
38:MFC
40:MFC
42:MFC
44:MFC
46:受控速率泵
48:受控速率泵
50:受控速率泵
52:受控速率泵
53:細胞培養迴路
56:離心裝置
58:人工腎透析裝置
60:可調速率泵
62:無菌留置探針
64:無菌留置探針
70:無細胞培養基
72:泵
74:端口
75:端口
圖1為根據本發明所述的一個或多個實施例的系統的實施例的示意圖。
1:泵
2:泵
3:泵
4:泵
20:培養基調節迴路
22:子迴路
24:無細胞容器
26:生物反應器容器
28:培養基
30:取樣端口
34:筒
36:品質流量控制器
38:MFC
40:MFC
42:MFC
44:MFC
46:受控速率泵
48:受控速率泵
50:受控速率泵
52:受控速率泵
53:細胞培養迴路
56:離心裝置
58:人工腎透析裝置
60:可調速率泵
62:無菌留置探針
64:無菌留置探針
70:無細胞培養基
72:泵
74:端口
75:端口
Claims (20)
- 一種用於高密度細胞培養支持的系統，其包括： 第一循環迴路，所述第一循環迴路包括含有細胞的迴路和第一保持容器以及一個或多個用於連續循環含有細胞的培養基的泵； 第二循環迴路，所述第二循環迴路為無細胞培養基調節迴路並且包括第二保持容器以及一個或多個用於循環所述培養基的泵；和 控制器，所述控制器用於引導第一數量的所述培養基通過所述第一循環迴路的循環和第二數量的所述培養基通過所述第二循環迴路的循環。
- 如請求項1所述的系統，進一步包括在所述第一循環迴路和所述第二循環迴路之間的細胞分離裝置。
- 如請求項2所述的系統，其中所述細胞分離裝置被配置為使用離心力從所述培養基中連續地分離細胞。
- 如請求項2所述的系統，其中所述第二保持容器可操作地連接至所述細胞分離裝置，並且其中所述細胞分離裝置被配置為將濃縮細胞返回至所述第一保持容器以用於完成所述第一循環迴路。
- 如請求項2所述的系統，其中所述細胞分離裝置被配置為將經分離的無細胞培養基遞送至所述第二保持容器以用於重新調節所述無細胞培養基，並且其中經重新調節的所述無細胞培養基被返回到所述第一保持容器以用於完成所述第二循環迴路。
- 如請求項1所述的系統，其中所述第二保持容器包括人工肺循環迴路，所述人工肺循環迴路被配置為通過中空纖維人工肺的管腔側遞送無細胞培養基，並且其中所述人工肺循環迴路被配置為用於將充氧的所述無細胞培養基遞送至所述第二保持容器。
- 如請求項1所述的系統，其中所述第二保持容器包括一個或多個感測器，用於連續地測量pH、氧、葡萄糖、乳酸鹽、氨及其組合中的至少一種。
- 如請求項1所述的系統，其中所述第一循環迴路包括一個或多個探針，用於測量所述第一保持容器內的所述培養基的pH、溶解氧或其組合，和/或其中所述第一保持容器被配置為連續地監測與所述第一保持容器內的所述培養基的體積相關的所述容器的重量。
- 一種用於高密度細胞培養支持的方法，其包括： 在第一保持容器中濃縮哺乳動物細胞的團塊； 通過在第一循環迴路中從經濃縮的哺乳動物細胞團塊中去除無細胞培養基來分離所述經濃縮的團塊； 將所述無細胞培養基遞送至第二循環迴路； 調節所述第二循環迴路中的第二保持容器中的所述無細胞培養基； 從所述第二循環迴路中的所述無細胞培養基中去除廢產物；以及 將經調節的無細胞培養基返回到所述第一循環迴路。
- 如請求項9所述的方法，其中所述第二保持容器中的所述無細胞培養基的調節包括通過產生經調節的培養基的人工肺中空纖維筒裝置在再充氧再循環迴路中對所述無細胞培養基進行再充氧。
- 如請求項10所述的方法，其中調節進一步包括調節一個或多個代謝參數，所述代謝參數包括pH、葡萄糖、乳酸鹽、谷氨醯胺、氨或其組合。
- 如請求項9所述的方法，其中將所述第一保持容器中的所述細胞與所述無細胞培養基分離包括連續過程，並且進一步包括在連續過程或半分批過程中的一種中使用離心裝置中的離心力從所述細胞中去除所述無細胞培養基的級分。
- 如請求項10所述的方法，進一步包括將所述經調節的無細胞培養基從所述第二保持容器返回到所述第一保持容器，替換從所述離心裝置中的所述細胞去除的一定體積的廢培養基。
- 如請求項11所述的方法，進一步包括通過調節所述細胞在所述離心裝置中的停留時間、所述離心裝置的速度、反向淘析泵的速率中的一種或多種和調節所述細胞的再循環速率，在所述第一循環迴路和所述第二循環迴路之間的離心裝置中分離所述細胞，以維持所述第一保持容器中所述培養基的預定水準。
- 如請求項9所述的方法，進一步包括： 從所述第二保持容器中提取所述無細胞培養基的樣本； 分析葡萄糖、谷氨醯胺、氨、乳酸或滲透壓中的一種或多種；以及 通過調節培養基、葡萄糖或谷氨醯胺遞送泵或廢物去除泵的一個或多個參數，響應於分析來調節葡萄糖、谷氨醯胺、氨、乳酸或滲透壓中的一種或多種。
- 一種組合的分批補料和灌注培養方法，其包括： 進行第一分批補料過程，用於以第一濃度接種細胞，允許細胞生長至第一體積，並通過添加經調節的培養基將細胞濃度調節回所述第一濃度，並在整合容器中重複所述分批補料過程，直到達到第一選定體積； 接合第一循環迴路和第二循環迴路以灌注所述整合容器中的細胞，並增加所述第一選定體積內的細胞密度； 基於通過所述第一整合容器中的取樣端口從所述第一循環迴路獲取的樣本，監測細胞數量和細胞存活力；及 添加來自所述第二循環迴路的所述經調節的培養基以用於維持恆定體積。
- 如請求項16所述的方法，其中灌注包括： 啟動灌注循環，包含將細胞從所述第一整合容器移動到產生離心力的旋轉容器，並將培養基與所述細胞分離以產生無細胞培養基； 將所述細胞返回到所述第一整合容器；以及 將無細胞培養基遞送至所述第二循環迴路中的第二保持容器以用於調節所述無細胞培養基。
- 如請求項16所述的方法，進一步包括使用中空纖維筒接合透析迴路作為第二保持容器的一部分，以從所述無細胞培養基中去除乳酸和其他代謝廢物。
- 如請求項16所述的方法，進一步包括連續地監測所述無細胞培養基的氧水準，並且如果所述氧水準下降到低於預先選擇的設定點，則增加所述經調節的培養基的遞送速率，同時成比例地增加從所述第一循環迴路中的細胞去除和廢物去除的速率。
- 如請求項16所述的方法，進一步包括： 使用比例-積分-微分控制器控制迴路調節第二保持容器中的pH，以用於降低人工肺中CO 2的濃度，並用空氣或N 2氣體替換CO 2；以及 當CO 2水準達到零時，向所述第二保持容器中加入新鮮的無細胞培養基或緩衝液，以提高所述無細胞培養基的pH。
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