KR20190082780A - 피씨움 올리간드럼을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물 및 제조 방법 - Google Patents
피씨움 올리간드럼을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물 및 제조 방법 Download PDFInfo
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- C12N1/10—Protozoa; Culture media therefor
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Abstract
피씨움 올리간드럼 미생물의 안정화된 현탁액을 함유한 피씨움 올리간드럼 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물은 0.05 내지 10.0 중량%의, 배양 배지의 함유물, 세포 형태의 이러한 미생물 및 이러한 미생물에 의해 제조된 물질을 갖는 피씨움 올리간드럼 미생물의 배양 바이오매스, 및 90.0 내지 99.95 중량%의 안정화제를 함유하며, 이에 의해, 1 ml의 이러한 생물학적 액체 항진균 산물에서 휴면 난포자의 사전결정된 수는 정상 표준화 후에, 1×103 내지 2×107개이다. 피씨움 올리간드럼 미생물의 안정화된 현탁액을 함유한 피씨움 올리간드럼 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물은 0.05 내지 10.0 중량%의, 배양 배지의 함유물, 세포 형태의 이러한 미생물, 및 이러한 미생물에 의해 제조된 물질을 갖는 피씨움 올리간드럼 미생물의 배양 바이오매스; 79.77 내지 99.95 중량% 안정화제; 및 100 중량%까지의 나머지 양의, 충전제, 아로마 및 비타민을 포함한 군으로부터의 최소 하나의 개질/적용 물질을 함유하며, 이에 의해, 1 ml의 이러한 생물학적 액체 항진균 산물에서 휴면 난포자의 사전결정된 수는 정상 표준화 후에, 2.5×104 내지 1.0×106개이다. 피씨움 올리간드럼 미생물은 브르노의 마사리코바 대학교에 소재하는 체코 미생물 수집소(CCM)에서 피씨움 올리간드럼 M1의 명칭으로 기탁된, 피씨움 올리간드럼 드레치슬러 ATTC 38472 균주이다. 안정화제는 물, 염용액, 오일, 또는 삼투물질의 농축 용액일 수 있다. 이러한 생물학적 액체 항진균 산물의 제조 방법이 청구된다.
Description
본 발명은 피씨움 올리간드럼(Pythium oligandrum) 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물(liquid biological antifungal product)에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 이러한 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
화학적 항진균 산물(chemical antifungal product)은 최근 수십 년 동안, 환경에 대한 이의 부정적인 영향, 및 실제로 사용자의 관점에서 상승하는 공포를 불러일으키고 있다. 그럼에도 불구하고, 이를, 타겟화되고 사려 깊은 방식으로 곰팡이를 제거할 수 있는 미생물을 기반으로 한 효과적인 생물학적 제품으로의 대체가 요망되는 범위까지 진행되지 않는다고 할 수 있다. 2014년에 Gerbore 등에 의한 최근 논문[1]에서 강조된 바와 같이, 매우 집중적인 연구에도 불구하고, EU의 국가들에서 이러한 목적을 위해 단지 14개의 미생물 타입이 현재 등록되었다.
피씨움 올리간드럼 미생물의 항진균 효과를 이용하는 생물학적 제품의 실제적인 적용은 1970년대 이후부터 알려져 왔으며, 여기서, 본 발명자는 본원에서 이러한 미생물의 생물학에 전념하고 이의 진균기생(mycoparasitic) 성질을 기술하는 1943년의 드레치슬러의 문헌[2] 및 1976년에 디콘(Deacon)의 문헌[3]의 고전적인 연구를 지칭할 수 있다. 그때부터, 본 발명자는 특허 US 4,259,317[4](저자, Vesely 및 Hejdanek, 우선일 1978년 5월 7일)에서 확인되었는데, 이는 제품 1 그램 당 최소 1백만개의 난포자의 함량의 난포자를 갖는 사탕 무우 싹으로부터 유래된 곰팡이-관련 질병에 대한 보호를 위해, 피씨움 올리간드럼 드레치슬러의 난포자를 함유한 건조 분말 제품에 관한 것이며, 이에 의해 제품 1 그램 당 5천만 및 5억개 양의 난포자가 최적의 수준으로서 기술되었다. 건조 분말 제품에 대한 적용 가능한 대안으로서, 본 발명의 저자는 난포자의 액체 현탁액을 수용하지만, 이러한 것이 제조하는 적용에 대한 다수의 단점, 특히, 이의 실제 적용을 대략 2주로 제한하는 것으로서, 이러한 제품의 불안정성을 기술한다. 더 긴 시간 후에, 난포자의 출현이 허용되지 않게 감소하는데, 이는 중기생체에 의한 자기분해 또는 오염의 결과로 진균기생 보호 메커니즘의 적용을 위해 필수적인 것이다. 피씨움 올리간드럼의 개별적인 균주의 소스(source)가 관련되는 한, 저자 Baker 및 Lifshitz는 특허 US 4,574,083호[5]에서, 표준 공개된 방법에 따라 토양으로부터 단리(isolation)를 통해 지역적으로 적합한 균주를 얻을 가능성을 지적하였다. 이러한 절차는 이후에, 정당성을 입증하였으며, 상이한 지리적 위치로부터의 균주는 공공 수집소(public collection)에서 입수 가능하다. 하기 생물학적 기준은 주로 분리균(isolate)을 동정하기 위해 그러한 시간에 적용되었다: 성장 속도, 최적의 성장 온도, 즉, 대개, 대략 30℃, 및 생식 주기 및 무성 생식 주기의 개별 생식 형태의 모폴로지. 이러한 관점으로부터, 하기의 특허는 획기적인 것으로 여겨질 수 있다. 여기에서, 발명자 Martin의 US 5,961,971호[6]는 중요한 유전자의 정확한 순차적 프로토콜을 기반으로 한 개별 분리균의 분자 특성을 소개한다. 현장 조건에서 피씨움 올리간드럼 미생물을 적용하는 개별 제형 및 방법은 동일한 특허 문헌에서 상세히 제시되어 있으며, 이에 의해, 산업 폐기물을 기초로 한 값싼 매질 상에서의 성장 후 액체 제형, 및 발효 후에 건조되어 알기네이트가 되거나 건조되고 분쇄된 형태의 바이오매스의 캡슐화에 의해 제조된 분말 제형은 바람직한 제형으로서 언급된다. 습윤 가능한 분말, 표준 분말, 에멀젼화된 오일 및 과립 형태의 제형은 다른 가능한 제형들 중에 있다. 특허 CZ 303 908호 및 상응하는 EP 2 503 892호[7], 문헌[BIOPREPARATY, spol. s.r.o., 2009년판]에서는 피씨움 올리간드럼 미생물을 사용한 작물의 수확후 보호에 중점을 두었다. 기술 섹션에서, 표준 발효조에서 다른 영양소를 첨가하지 않고, 시리얼 함유물을 갖는 액체 배지 상에서 이러한 미생물이 배양에 집중하고 있다. 고갈된 배지 또는 균사체의 잔류물의 존재 없이 난포자의 순수한 농축물을 얻을 수 있는 가능성이 강조되며, 이는 생산 공정의 후기 단계에서 살포 건조 오븐에서 건조 동안에 제거된다. 피씨움 올리간드럼 이외의 유기체의 난포자의 제조 지식은 제한된 정도로 공개되었다. 특허 출원 CN 102 807 957A호[8](Liu X. 등, 2012년)에서, 피토프토라 카프시시(Phytophthora capsici)의 신생 난포자의 제조는 다양한 약물에 대한 내성 및 유전자 연구에 대한 내성을 모니터링하기 위해 기술된다. 식물의 생물학적 보호를 위한 액체 제품은 특허 출원 US 2014/0212387호[9](Lueth, 2014년)에 기술되어 있으며, 이러한 것은 오로지 용매로서 개질된 트리실록산의 폴리에테르를 사용하는 액체 제품이다.
난포자 및 미시적 피씨움 올리간드럼 난균의 다른 생식 형태의 제조 및 안정화는 또한, 비특허 문헌에서 특정 정도로 논의되어 있다. 1990년에, 문헌[McQuilken 등 [10]]에서는 경제적으로 제공 가능한 기질로서 당밀(molass)을 사용하면서 액체 배양물에서 난포자의 제조를 위한 간단하고 재현 가능한 방법이 공개되어 있다. 그러나, 제조된 난포자를 유지시키는 이상적인 방법의 문제는 특허 또는 비특허 문헌에서 만족스럽게 해결되지 않았다. 1992년에, 문헌[McQuilken 등 11]]에서는, -0.5 MPa에서 토양 추출물에 의해 제시된 삼투압과 비교하여 균사의 방사상 확장 속도 및 피씨움 올리간드럼 난균의 난포자의 출현에 대한, 상이한 삼투(osmotic), 예를 들어, 글리세롤, NaCl 및 KCl의 영향이 관찰되었다. 삼투물질의 첨가는 방사상 확장 속도를 감소시켰지만, 대략 -2.0 MPa의 값으로의 출현에 대한 영향을 미치지 않았다. 저자는, 적용된 난포자의 양호한 효과가 최적의 온도, 일반적으로, 30℃, 및 pH 6.0 내지 7.5의 산도의 관점으로부터 조건이 충족되는 조건에서 적용 장소에서의 정상적으로 일어나는 삼토 조건 하에서 예상될 수 있다고 결론지었다. 얻어진 난포자의 저장능력의 관점으로부터, 냉장고에서 4℃에서의 증류수 중에 정상적으로 제조된 현탁액을 유지시킬 때 최대 379일의 기간 동안 이의 높은 효과는 2013년에 저자 Takenaka 및 Ishikawa의 문헌[12]에서 언급되었다.
전문가들에 따르면, 생물학적 방어 제품의 더 큰 확산에 대한 주된 장애는 상당히 명확하게, 특정 적용 조건에 대한 유효성의 의존성, 및 일상적인 농업 작업에서 식물을 보호하기 위한 생물학적 제품의 유지 및 제조와 관련된 실제적인 문제이다. 이러한 이유로, 피씨움 올리간드럼 난포자의 간단하고 효과적인 저장 및 적용과 관련된 실제적인 문제를 해결하는 것은 생물학적 제품의 상업적 성공에 결정적이다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 심지어 표준 저장 조건 하에서도 높은 장기 안정성을 가지면서, 액체 상태에서의 생물학적 보호의 수단을 개발하는 것이 요망될 것이다. 그러나, 지금까지 공개된 해법은 수년간의 집정적인 노력 후에도 성공적으로 제거되지 못한 여러 단점을 겪고 있다. 식물을 보호하기 위한 생물학적 제조물의 실험실 제조와 관련된 대부분의 절차는 복잡하고, 단지 실험실 수준에서 관리 가능한데, 이는 산업적 생산을 위해 이러한 절차의 사용을 상당히 제한한다. 지금까지, 체코 생명공학 회사 Biopreparaty, spol s.r.o.(Polyversum®, Polygandron, BIOREPEL®)에 의해 제작되고 전세계로 시판되는 제품에서 적용된, 습윤화 가능한 분말 형태의, 바람직한 적용 방법은 방어 개입을 타겟으로 하고 사용자를 보호한다는 관점으로부터 이 자체의 문제(complication)가 없는 것은 아니다. 지금까지, 산업에서 용이하게 사용될 수 있는 단순한 형태의, 피씨움 올리간드럼 미생물 또는 난포자의 제조된 생식 형태의 충분한 저장능력을 갖는 제형을 위한 단순하고, 잘 시험되고, 일관되게 규정된 절차가 공개된 적이 없다.
지금까지 적용된 생물학적 항진균 산물의 특정 단점은 본 발명 하에서 제거되거나 제한되며, 이의 본질(essence)은 독립항 제1항에 따른 피씨움 올리간드럼 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물이다. 지금까지 적용된 생물학적 항진균 산물의 특정된 단점은 본 발명에서 제거되거나 제한되며, 이의 본질은 0.05 내지 10.0 중량%의, 배양된 배지의 함유물, 세포 형태의 이러한 미생물, 및 이러한 미생물로부터 생성된 물질을 갖는 피씨움 올리간드럼 미생물의 배양 바이오매스, 및 9.0 내지 99.95 중량%의 안정화제를 함유한 피씨움 올리간드럼의 안정화된 현탁액을 포함하고, 이에 의해, 앞으로 요망되는 이러한 생물학적 액체 항진균 산물 1 ml에서 휴면 난포자의 수는 정상 표준화 후에 1×103 내지 2×107개의 범위인, 독립 청구항 제1항에 따른 피씨움 올리간드럼 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물이다.
본 발명의 두번째 독립항에 따른 피씨움 올리간드럼(Pythium oligandrum) 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물의 본질은 피씨움 올리간드럼의 안정화된 현탁액을 포함하고, 0.05 내지 10.0 중량%의, 배양 배지의 함유물, 세포 형태의 이러한 미생물, 및 이러한 미생물에 의해 형성된 물질을 갖는 피씨움 올리간드럼 미생물의 배양 바이오매스; 79.77 내지 99.95 중량% 안정화제; 100 중량%까지의 잔류 양의 충전제, 아로마, 비타민 E를 포함하는 군으로부터의 적어도 하나의 개질/적용 물질을 함유하며, 이에 의해 미리 요망되는 이러한 생물학적 액체 항진균 산물 1 ml에서 휴면 난포자의 수는 정상 표준화 후 2.5×104 내지 1.0×106개의 범위라는 사실을 기초로 한 것이다.
브로노의 마사리코바 대학교에 있는 체코 미생물 수집소(CCM)에서 피씨움 올리간드럼 M1의 명칭으로 기탁된, 피씨움 올리간드럼 미생물의 피씨움 올리간드럼 드레치슬러 ATTC 38472 균주가 바람직하다.
본 발명의 주요 장점은 장기 사용 및 이의 장기 및 상당한 안정화 효과의 달성을 위해 적합한 신규한 생물학적 액체 항진균 산물로서, 이에 의해, 사용되는 안정화제가 입수 가능하고 미생물 오염으로부터 피씨움 올리간드럼 미생물의 함유된 바이오매스를 보호하는 데 추가 장점을 제공한다. 난포자 형태에서 상기 특정된 미생물의 휴면 세포의 청구된 내용은 실질적으로 시험되고 경제적으로 적합한 범위를 제공하며, 이는 광범위한 요망되는 적용을 위해 간단한 투약을 용이하게 한다. 이는 적합한 제조를 이용하여 처리된, 상이한 타입의 바이오매스를 사용할 수 있다. 저농도의 휴면 난포자, 예를 들어, 수십개 또는 수백개의 휴면 난포자는 또한, 결과를 제공하지만, 이러한 산물의 효과는 낮다. 휴면 난포자의 사전결정된 수는 요망되는 경우에, 정상 표준화에 의해, 즉, 요망되는 값까지 희석시키거나 농축시킴으로써 조정될 수 있다.
안정화제가 물, 염용액, 오일 또는 폴리올 용액일 수 있는 삼투물질, 사카라이드, 또는 사카라이드 알코올 타입의 용액, 또는 염용액을 포함하는 군으로부터의 적어도 하나의 성분을 함유하는 것이 유리하다. 폴리올 용액은 최대 10개의 사카라이드 단위 및 최소 2개의 사카라이드 단위를 함유한 다양한 올리고사카라이드의 대사 가능하거나 대사 가능하지 않은 용액을 함유한 군으로부터 선택될 수 있으며, 예를 들어, 말토데카오스 또는 말토노나오스 또는 말토옥타오스 또는 말토헬파오스 또는 말토헥사오스 또는 말토펜타오스 또는 스타키오스 또는 라피오스 또는 수크로오스 또는 수크랄로오스, 또는 분지된 사카라이드가 사용될 수 있다.
이상적인 실행예에서, 안정화제는 예를 들어, 30.0 내지 99.9 중량% 양의 물, 또는, 예를 들어, 99.9 중량% 양의 염용액, 또는 예를 들어, 60.0 내지 64.95 중량% 양의 수크로오스 형태의 삼투물질, 또는 예를 들어, 79.77 내지 99.9 중량% 양의 파라핀 오일, 미네랄 오일, 글리세롤, 해바라기 오일을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 오일이다.
생물학적 액체 항진균 산물은 특정 사용 영역을 위한 다른 개질 또는 적용 물질, 예를 들어, 예를 들어, 16.0 중량% 양의 서방출 생분해성 매트릭스, 예를 들어, 피씨움 올리간드럼 미생물의 난포자의 담체, 예를 들어, 폴리비닐 알코올; 또는 예를 들어, 16.0 중량% 양의 산화규소를 기반으로 한 충전제; 또는 예를 들어, 0.96 중량% 양의 다른 적용/개질 물질, 예를 들어, 세이지 또는 민트 아로마; 또는 예를 들어, 0.4 중량% 양의 비타민 E를 함유할 수 있다.
이러한 적용/개질 물질의 사용은 생물학적 항진균 산물의 적용에 따른다.
그 결과, 피씨움 올리간드럼 미생물의 난포자의 안정화된 현탁액은 친수성 또는 소수성 특징의 광범위한 안정화제, 예를 들어, 일반적인 물 또는 오일 또는 다른 적절한 삼투물질의 용액을 사용할 수 있다.
삼투물질은 이의 화학적 특성을 통해, 요구되는 적용에 완벽하게 채택될 수 있는데, 왜냐하면, 삼투물질이 상이한 염의 용액과 같으 이온 특성을 가지거나 폴리올 용액과 같이 비이온 특성을 가질 수 있는 것으로 보이기 때문이다. 폴리올이 예를 들어 상이한 규정된 올리고사카라이드의 대사 가능한 또는 대상 가능하지 않은 용액에 의해 표현될 수 있다는 사실은 여러 적용에 대해 유익한데, 왜냐하면, 적요망되는 성질의 적합한 천연 또는 합성 물질들의 혼합물이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있기 때문이다. 일반적으로 입수 가능한 물질, 예를 들어, 수크로오스는 또한, 본 발명의 이점을 위해 사용될 수 있지만, 요망되는 경우에, 심지어 통상적으로 입수 가능한 대사 가능하지 않은 유사체가 사용될 수 있다. 액체 현탁액의 조성물은 항산화제 물질, 천연 활성화제 및 비타민, 예를 들어, 충전제로서 산화규소, 비타민 E 아세테이트 및 다른 물질 형태의, 이의 유용성 성질 또는 이의 적용을 변경시키는 광범위한 다른 물질과 혼화 가능하다.
다소 놀랍게도, 제조 종료 후 고체 또는 액체 배양에 의해 생산된 세포 백분율(cell percentage)이 현탁액, 또는 농축된 현탁액의 형태로 넣어지는 경우에, 피씨움 올리간드럼 미생물의 생식 형태가 일반적으로 실험실 온도에서 저장되는 경우에 적어도 6개월 동안 이러한 현탁액 중에서 본래의 출현(original emergence)을 유지한다는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 본 발명자가 공개된 문헌에 제시된 재현 불가능하고 가변적인 결과를 고려할 때 훨씬 더 두드러지게 된다. 예를 들어, 증류수 중에서 제조되고 188 또는 384일의 기간 동안 저장된 난포자의 현탁액은 냉장고에서 4℃에서 저장될 때 본래의 출현을 유지할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 기술된 제제를 제조하는 방법이 전혀 없는 설명은 4℃의 저장 온도가 농장에서의 작업 조건 하에서도 이용 가능할 수 없을 때, 실제 적용 가능성을 언급할 수 없을 뿐만 아니라 이의 과학적 타당성을 평가하는 것은 거의 불가능하게 만든다.
피씨움 올리간드럼 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물은 본 발명에 따른 생산 방법을 이용하여 얻어지며, 이의 본질은 시리얼, 사탕수수 당밀의 추출물 및 다른 필수 영양소를 함유한 액체 배지가 액체 상에서의 피씨움 올리간드럼 난균의 호기성 배양에 의해 스팀 멸균기에서 멸균된다는 사실에 있다. 냉각 후에, 이는 선택된 피씨움 올리간드럼 균주들 중 하나로 접종된다. 바이오매스는 배양의 종료 후에 취득되고 처리되며, 이는 수일, 우선적으로, 13일에 취득된다. 액체 상의 피씨움 올리간드럼의 배양 단계의 종료 후에, 바이오매스는, 현탁액에서 최소 95%의 입자가 0.050 내지 0.300 mm, 우선적으로, 0.125 mm이도록 액체 배지로 균질화된다. 난포자의 수에 의해 특징되는 균질한 현탁액은 생물학적 항진균 산물에서 난포자의 사전 결정된 농도까지 용액에서 난포자의 수에 따라 농축되거나 희석된다. 현탁액은, 우선적으로, 균질화 및 농축 또는 희석의 단계 후에 여과된다.
수성 현탁액은 균질화 동안 삼투물질의 첨가제로 안정화되고, 8℃보다 낮은 온도에서 큰 멸균 용기에 저장된다.
피씨움 올리간드럼 미생물의 무수 현탁액의 경우에, 배양 단계의 종료 후에 고체 기질 상에서 또는 액체상으로 얻어진 물질은 현탁액에서 입자의 최소 95%의 값이 0.050 내지 0.300 mm, 우선적으로, 0.125 mm에 도달할 때까지 균질화된다. 난포자의 수에 의해 특징되는 얻어진 균질한 현탁액은 원심분리된다. 상청액의 제거 후에, 원심분리된 물질에는, 생물학적 항진균 산물에서 난포자의 최종 농도가 요망되는 농도에 해당하는 양으로 생물학적 항진균 산물의 생산을 위한 난포자의 사전결정된 농도를 달성하기 위해 오일이 보충되며, 이러한 방식으로 얻어진 물질은 후속하여 균질화에 의해 재현탁된다.
제시된 해결안(resolution)은 피씨움 올리간드럼 미생물을 제조하는 생물공학적 공정의 유의미한 단순화 및 이에 따라, 이러한 산물의 제조를 위한 운용 비용의 유의미한 감소의 관점으로부터도 적합한 것으로 나타날 것이다. 생산 배지로부터 배양된 바이오매스의 여과 또는 분리, 이의 건조, 및 요망되는 크기의 입자로의 후속 분쇄는 에너지 및 기술에 대해 상대적으로 부담이 크고, 오염 가능성을 조절하기 어렵고 오염되기 쉽고, 최종 결과로서, 정확하게 규정되고 산업적으로 요구되는 조건 하에서 수행되지 않는 경우에, 얻어진 산물을 상당히 손상시킬 수 있는 여러 공정을 수반한다. 반대로, 삼투물질의 조밀하고 점성의 용액에서 얻어진 바이오매스의 기술적으로 단순한 현탁액은 소정 범위의 실제적인 적용을 위해 즉시 적합한 매우 안정한 산물을 야기시킨다. 실제적인 관점으로부터, 피씨움 올리간드럼 미생물의 제조된 현탁액이 거의 폐기물 없이 배양 접시 또는 발효조로부터 이동될 수 있고, 이의 세정 및 유지 보수 비용을 최소화하고 또한 산물이 생산 현장의 작업 환경으로 누출될 가능성을 최소화한다는 것이 큰 장점이다. 또한, 이러한 방식으로 얻어진 산물이 심지어 정상 온도에서 저장 동안에도 장기간에 걸쳐 안정적이라는 사실은 또한, 운용 비용을 상당히 감소시키고, 산물을 취급하기 더 용이하게 한다.
또한, 놀랍게도, 삼투물질의 농축된 용액의 안정화 효과와는 별개로, 생산 및 일반적인 실무로부터 널리 알려진, 이러한 용액의 보전 효과는 본 발명자가 시험한 미시적 난균 피씨움 올리간드럼의 난포자의 현탁액의 특정 경우에서 상당하다는 것이 발견되었다. 이에 따라, 이러한 방식으로 저장된 산물은 요망되지 않는 미생물에 의한 오염으로부터 보호되며, 이는 이러한 안정화된 현탁액의 침투가 매우 희박한 경우에도, 제안된 화학적 환경에서 재생산할 없고, 이에 따라, 최종 산물을 오염시키지 못할 수 있다. 이러한 장점은 현 생산 실무에서, 특히, 살충제, 살생물제, 및 화장품에서 우발적인 오염 수준에 대한 더 엄격한 요건을 고려하여, 기본적인 것이다.
안정화제의 역할 및 보전 물질의 역할 이외에, 삼투물질 용액은 또한, 접착제의 역할을 하는데, 이러한 사실은, 액침에 의한 적용으로 또는 미세 입자(소위 미스팅(misting)의 온화한 분산에 의한 적용을 위해 최적의 농도로 난포자의 안정화된 현탁액의 희석 후에 수용액 형태로 존재하는 지와는 무관하게, 여러 작용에서 실제적으로 적용될 수 있다. 이에 따라, 상기에 기수된 적용의 예 모두에서, 폴리올 용액은 효과적인 접착, 및 처리된 구역, 식물 또는 작물에 대한 후속의 고른 적용을 보조한다.
최종적으로, 그러나, 특히, 대사 가능한 삼투물질을 사용하는 경우에, 이러한 물질이 적용 장소에서 직접적으로 타겟 장소의 콜로니화 및 정착(settlement) 동안 중요한 영양소로서 역할을 할 수 있으며, 이에 의해, 이는 특히 난포자의 균사 형태로의 전이와 관련된 제1 단계 동안에 중요한 영양소라는 것이 언급되어야 한다. 이러한 것은 후속하여, 생물공학적 배양 동안 난포자의 생물공학적 성장 및 재생 동안 사용되는 불완전하게 발효된 기질로 표현되는, 더 복잡한 특성의 영양소의 적용 장소에서 미시적 난균 피씨움 올리간드럼의 장기간 성장 및 보존을 위해 중요한 영양소의 역할을 가질 수 있다.
제시된 해법에 따른 현탁액에서 특정 함량의 난포자 및 미시적 난균의 다른 생식 형태의 특정 함량은 종래에 시험되고 시판된 낱개 제품(loose product)과 유사하거나, 이보다 더 높으며, 이는 이러한 방식으로 제조된 제품의 물류 및 유통 경제의 관점에서 중요하다. 그러나, 새로운 제형은 또한, 이전 해법과 비교하여 더 낮은 농도를 사용하는 것을 가능하게 한다.
본 발명자는 실제로, 이러한 방식으로 제형화된 액체 산물의 기능 또는 유효성의 임의의 제한과 관련이 없이, 사용되는 기술적 절차와 관련하여 새로운 생물학적 액체 항진균 산물에서 조성 복잡성의 상당한 감소를 확인하였다. 새로이 제안된 산물의 세포 및 입자 조성에 관한 한, 이는 거의 완전히, 매우 낮은 백분율의 균사 단편, 그라인딩된 수수(ground millet), 및 다른 성분을 갖는 안정화된 난포자를 수반한다. 이러한 성분은 명백하게, 농축된 오스몰(osmole)에 의해 생성된 밀집 환경(dense environment)에서 침강하지 않는데, 이는 놀랍게도 산물의 양호한 균질성을 보장하며, 제조가 그 안에 있는 입자의 크기의 관점에서 매우 불균질할 때, 수성 현탁액 형태으로 적용된 습윤 가능한 분말의 경우에서보다 비교할 수 없을 정도로 더 양호하다. 이는 특히 지금까지 제조된 산물에 함유된 산화규소의 입자에 적용하며, 상반되게, 산화규소는 제출된 발명(연마제로서 사용되는 경우에, 치약을 제외함)에 따른 해법에서 대부분의 경우 존재하지 않는다. 그 결과, 실제 적용의 필요성의 관점에서, 제품의 적용 동안 필터 및 다른 기술 장비가 막히지 않는다.
더 낮은 양의 대사 가능한 삼투물질의 존재가 특정 적용에 해를 끼치는 경우에, 이러한 것은 어떠한 방식으로도 제품의 가장 중요한 성질에 영향을 미치지 않으면서, 화학적으로 유사한 대사 가능하지 않은 삼투물질로 용이하게 대체될 수 있다.
얻어진 제품을 건조하는 것이 기술적 관점에서 더욱 적절한 경우에, 냉동-건조(동결건조)는 여기에서, 고진공 값을 갖는 장치에서, 적합할 것으로 보일 것이며, 왜냐하면, 동결건조 동안 삼투물질의 농축된 용액을 저온보존제 및 보호 물질로서 사용되는 것이 널리 알려져 있고 널리 사용되고 있기 때문이다. 일 예로서, 본 발명자는 예를 들어, 문헌[Wright [15], 2004년]에 기술된 인간 난모세포의 냉동보존을 포함하는, 여러 민감한 적용에서 보호 저온보존제로서 널리 사용되는 삼투물질을 지칭한다.
제출된 발명에 따라 얻어진 산물의 상당한 이점은 이러한 산물이 모든 적용을 위해 적합하다는 것이며, 여기서, 피씨움 올리간드럼 미생물의 항-곰팡이, 진균기생, 유도인자 및 성장 성질을 사용하는 것이 유익한 것으로 나타날 것이다. 이에 따라, 특히, 식물 생물산균제로서, 피씨움 올리간드럼 미생물의 인간 및 수의학적 사용을 위해, 바이오필름의 파괴 및 다양한 의학적 진단의 경우에서 일어나는 장내 불균형의 제거를 위해 및 또한, 생활 및/또는 노동 환경에서 발생하는 곰팡이로부터의 시민 보호를 위해 이러한 산물의 사용. 액체 현탁 농축물에서 사용되는 기질에 따라, 이는 분해성 바이오폴리머의 존재 하에서 식물의 보호 스프레이로서 사용될 수 있으며, 이는 보호 인자로서 그리고 점진적으로 분해 가능한 기질로서 작용하며, 활성 미생물 피씨움 올리간드럼의 난포자와 함께 폴리베르숨(Polyversum) 물질의 "담체"로서 의미를 갖는다.
곰팡이 또는 진균 또는 병원성 박테리아 또는 병원성 효모 또는 미생물 장내 불균형에 의해 영향을 받는 구역에, 희석되지 않거나 희석된 형태의, 이러한 안정화된 농축된 현탁액의 적용으로 이루어진, 피씨움 올리간드럼 미생물의 난포자의 안정화된, 농축된 현탁액을 사용한, 곰팡이, 균류, 병원성 박테리아 및 효모에 대한 보호는 안정화된 액체 농축물에 대한 광범위한 적용 범위를 규정하는 것을 가능하게 한다.
식물 보호 분야에서, 희석되거나 희석되지 않은 형태의 안정화된 농축 현탁액이 수확 전 또는 수확 후에, 예를 들어, 창고에서 식물 또는 이의 환경 또는 종자 또는 작물 또는 열매에 적용되어 곰팡이, 진균 또는 병원성 박테리아 및 효모에 대한 보호를 제공하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 에어로졸, 농축된 현탁액을 함유한 자체-용해성 캡슐, 식물의 하부에서의 추가적인 비옥화(fertilization), 작물 액침, 작물 살포, 작물 침지, 작물 미스팅(misting), 종합 비료의 성분 부분으로서 비료화 및 추가적인 비료화, 및 수경법 형태의 적용을 포함한다.
구강(oral cavity)을 보호할 때, 희석되거나 희석되지 않은 형태의, 안정화된 농축 현탁액은 구강 플라크 또는 치주 질환에 의해 영향을 받는 곳, 감염되어 치유되지 않는 상처의 발생, 특히, 당뇨병에서 감염되어 치유되지 않는 상처의 발생, 피부병 또는 효모-관련 감염성 질환의 발병, 및 피부 및 인간 표면 막의 미생물 장내 불균형과 관련된 다른 증상들의 발병에 의해 영향을 받는 곳에 적용될 수 있다.
시민 보호에서 사용하기 위해, 희석되거나 희석되지 않은 형태의, 안정화된 농축 현탁액은 진균의 발생에 영향을 받는 벽 상에 및 석조부분(masonry)에서의 장소에 적용될 수 있다. 다른 혁신적인 사용 구역은 냉각 장치, 에어-컨디셔닝, 범람 및 홍수에 의해 영향을 받은 구역, 및 피씨움 올리간드럼 미생물에 의해 타겟화된 균류이 흔하게 발생되는 다른 장소의 항진균 보호를 포함한다.
본 발명은 또한 예시적인 구현예에서 상세히 기술되고, 첨부된 개략적 도면에서 더욱 상세히 설명된다.
도 1a, 도 1b, 도 1c는 피씨움 올리간드럼 미생물의 부재 하에서 그리고 그리한 미생물이 존재할 때 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 성장 속도의 비교를 상세히 명시한다.
이러한 도면들은 상세하게 하기를 나타낸다:
도 1a. 휴면 난포자로부터 및 액체 및 고체 배양(별 및 삼각형)로부터의 그 자체(사각형) 및 피씨운 올리간드럼에 의한 동시 접종과 함께 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸의 콜로니의 성장;
도 1b. 사진 4, 휴면 난포자로부터의 피씨움 올리간드럼 미생물이 좌측 측면 상에 접종되고 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸(상부열)이 우측 측면 상에 접종된 페트리 디시의 예, 및 단지 푸사르움 그라미네아룸 균류이 접종된 대조군의 예. 여기서, 성장은 4일 후에 기록됨;
도 1c. 피토파토제닉 균류 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 휴먼 난포자로부터의 피씨움 올리간드럼의 동시 접종 미생물을 갖는 페트리 디시의 사진, 여기서, 성장은 11후에 기록됨.
도 2a, 도 2b, 도 2c는 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸, 피씨움 올리간드럼 미생물 및 이러한 2개의 미생물의 조합의 존재 하에서 밀의 성장의 실험실 실험 결과를 도시한 것이다.
이러한 것은 상세하게 하기와 같이 나타난다:
도 2a. 매우 적은 백색 스폿을 갖는 단지 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸의 존재 하에서 아가 토양 상에서 밀이 성장된 엘른마이어 플라스크. 밀의 싹에서 접종 후 20일에 기록됨.
도 2b. 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸 및 피씨움 올리간드럼 미생물 둘 모두의 존재 하에서 아가 토양 상에 밀이 성장된 엘른마이어 플라스크. 플라스크는 밀의 싹에 동시 접종 후 20일에 기록됨.
도 2c. 단지 피씨움 올리간드럼 미생물의 존재 하에서 아가 토양 상에 밀이 성장된 엘른마이어 플라스크. 플라스크는 밀의 싹에 동시 접종 후 20일에 사진으로 나타냄.
도 3a, 도 3b, 도 3c, 도 3d, 도 3e는 예시적인 구현예에 따른 식물 보호를 위한 항진균 산물의 적용, 및 유전자 발현에 의해 모니터링된 균류의 존재에 대한 반응 및 진균 오염 수준의 유전적 관찰을 포함하는, 밀 및 인접한 토양 상에서의 현장 실험에서 관찰된 피씨움 올리간드럼 미생물의 후속 집단 동적 분석을 도시한 것이다.
이러한 것은 상세하게 하기와 같다:
도 3a. 적용 후 상이한 시점에서 식물 상에서(옅은 회색 컬럼) 및 토양에 인접한 주변부(진한 회색 컬럼)에서의 유전자 시험에 의해 결정된 피씨움 올리간드럼 미생물의 함량;
도 3b. 샘플링 시점에 현장에서 적외선 온도계를 이용하여 측정된 온도의 발달(옅은 회색 컬럼) 및 지방 기상 관측소에서 얻은 온도 기록(진한 회색 컬럼);
도 3c. 6 내지 120 시간에 관찰된 식물의 개별 부분에서 및 주변 토양(So-토양, R-뿌리, St-줄기, L-잎)에서 셀룰라아제(POCELL), 엔도- -글루카나아제(POENDO) 및 세린 및 트레오닌이 풍부한 구조 단백질(POSTRU)에 대한 유전자 발현의 코스. 이에 의해, 유전자 발현 수준은 구성 유전자 -튜불린(POTUBU)의 발현에 대해 표준화되었고, 인용된 방법에 따른 산물의 적용 없이 발현된다[12];
도 3d는 균류의 증폭을 위한 일반적인 증폭 프라이머와 함께 정량적 PCR을 이용하여 측정된 패널 C에서와 동일한 샘플에서 진균 오염 수준이다.
도 3e. 셀룰라아제의 유전자 발현 수준(POCELL)과 진균 오염 수준 간의 상관관계를 모니터링한 상관관계 그래프.
도 4a, 도 4b, 도 4c, 도 4d는 도면의 상부 부분에 건강한 개체로부터의 타액을 사용하고, 도면의 하부 부분에 치주 질병에 걸린 개체로부터의 타액의 사용과 함께, 세라믹 하이드록실아파타이트 플레이트 상에서 인공적으로 생성된 바이오필름을 제거하는 이의 능력의 관점으로부터 예시적인 구현예 4에 따른 치약의 유효성의 시험을 도시한 것이다.
이러한 것은 상세하게 하기를 도시한 것이다:
도 4a. 치약 없이, Odol 치약, Enzycal 치약, 피씨움 올리간드럼 미생물이 첨가되지 않은 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 페이스트, 산화규소가 첨가되지 않은 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 페이스트 및 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 전체 페이스트와 함께 브러시를 이용하여 이전에 세정된 세라믹 하이드록시아파타이트의 제거 후에 건강한 개체로부터 타액을 이용한 6-홀 플레이트의 사진.
도 4b. 562 nm의 파장에서 플레이트 분광광도계 상에서 도 1a의 개별 홀에서의 채색 강도의 측정에 의한 바이오필름의 함량의 정량적 평가.
도 4c. 치약 없이, Odol 치약, Enzycal 치약, 피씨움 올리간드럼 미생물이 첨가되지 않은 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 페이스트, 산화규소가 첨가되지 않은 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 페이스트 및 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 전체 페이스트와 함께 브러시를 이용하여 이전에 세정된 세라믹 하이드록시아파타이트의 제거 후에 치주 질병을 갖는 개체로부터 타액을 이용한 6-홀 플레이트의 사진.
도 4d. 562 nm의 파장에서 플레이트 분광광도계 상에서의 도 1c의 개개 홀에서의 채색의 상도를 측정함에 의한 바이오필름의 함량의 정량적 평가.
도 1a, 도 1b, 도 1c는 피씨움 올리간드럼 미생물의 부재 하에서 그리고 그리한 미생물이 존재할 때 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 성장 속도의 비교를 상세히 명시한다.
이러한 도면들은 상세하게 하기를 나타낸다:
도 1a. 휴면 난포자로부터 및 액체 및 고체 배양(별 및 삼각형)로부터의 그 자체(사각형) 및 피씨운 올리간드럼에 의한 동시 접종과 함께 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸의 콜로니의 성장;
도 1b. 사진 4, 휴면 난포자로부터의 피씨움 올리간드럼 미생물이 좌측 측면 상에 접종되고 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸(상부열)이 우측 측면 상에 접종된 페트리 디시의 예, 및 단지 푸사르움 그라미네아룸 균류이 접종된 대조군의 예. 여기서, 성장은 4일 후에 기록됨;
도 1c. 피토파토제닉 균류 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 휴먼 난포자로부터의 피씨움 올리간드럼의 동시 접종 미생물을 갖는 페트리 디시의 사진, 여기서, 성장은 11후에 기록됨.
도 2a, 도 2b, 도 2c는 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸, 피씨움 올리간드럼 미생물 및 이러한 2개의 미생물의 조합의 존재 하에서 밀의 성장의 실험실 실험 결과를 도시한 것이다.
이러한 것은 상세하게 하기와 같이 나타난다:
도 2a. 매우 적은 백색 스폿을 갖는 단지 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸의 존재 하에서 아가 토양 상에서 밀이 성장된 엘른마이어 플라스크. 밀의 싹에서 접종 후 20일에 기록됨.
도 2b. 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸 및 피씨움 올리간드럼 미생물 둘 모두의 존재 하에서 아가 토양 상에 밀이 성장된 엘른마이어 플라스크. 플라스크는 밀의 싹에 동시 접종 후 20일에 기록됨.
도 2c. 단지 피씨움 올리간드럼 미생물의 존재 하에서 아가 토양 상에 밀이 성장된 엘른마이어 플라스크. 플라스크는 밀의 싹에 동시 접종 후 20일에 사진으로 나타냄.
도 3a, 도 3b, 도 3c, 도 3d, 도 3e는 예시적인 구현예에 따른 식물 보호를 위한 항진균 산물의 적용, 및 유전자 발현에 의해 모니터링된 균류의 존재에 대한 반응 및 진균 오염 수준의 유전적 관찰을 포함하는, 밀 및 인접한 토양 상에서의 현장 실험에서 관찰된 피씨움 올리간드럼 미생물의 후속 집단 동적 분석을 도시한 것이다.
이러한 것은 상세하게 하기와 같다:
도 3a. 적용 후 상이한 시점에서 식물 상에서(옅은 회색 컬럼) 및 토양에 인접한 주변부(진한 회색 컬럼)에서의 유전자 시험에 의해 결정된 피씨움 올리간드럼 미생물의 함량;
도 3b. 샘플링 시점에 현장에서 적외선 온도계를 이용하여 측정된 온도의 발달(옅은 회색 컬럼) 및 지방 기상 관측소에서 얻은 온도 기록(진한 회색 컬럼);
도 3c. 6 내지 120 시간에 관찰된 식물의 개별 부분에서 및 주변 토양(So-토양, R-뿌리, St-줄기, L-잎)에서 셀룰라아제(POCELL), 엔도- -글루카나아제(POENDO) 및 세린 및 트레오닌이 풍부한 구조 단백질(POSTRU)에 대한 유전자 발현의 코스. 이에 의해, 유전자 발현 수준은 구성 유전자 -튜불린(POTUBU)의 발현에 대해 표준화되었고, 인용된 방법에 따른 산물의 적용 없이 발현된다[12];
도 3d는 균류의 증폭을 위한 일반적인 증폭 프라이머와 함께 정량적 PCR을 이용하여 측정된 패널 C에서와 동일한 샘플에서 진균 오염 수준이다.
도 3e. 셀룰라아제의 유전자 발현 수준(POCELL)과 진균 오염 수준 간의 상관관계를 모니터링한 상관관계 그래프.
도 4a, 도 4b, 도 4c, 도 4d는 도면의 상부 부분에 건강한 개체로부터의 타액을 사용하고, 도면의 하부 부분에 치주 질병에 걸린 개체로부터의 타액의 사용과 함께, 세라믹 하이드록실아파타이트 플레이트 상에서 인공적으로 생성된 바이오필름을 제거하는 이의 능력의 관점으로부터 예시적인 구현예 4에 따른 치약의 유효성의 시험을 도시한 것이다.
이러한 것은 상세하게 하기를 도시한 것이다:
도 4a. 치약 없이, Odol 치약, Enzycal 치약, 피씨움 올리간드럼 미생물이 첨가되지 않은 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 페이스트, 산화규소가 첨가되지 않은 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 페이스트 및 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 전체 페이스트와 함께 브러시를 이용하여 이전에 세정된 세라믹 하이드록시아파타이트의 제거 후에 건강한 개체로부터 타액을 이용한 6-홀 플레이트의 사진.
도 4b. 562 nm의 파장에서 플레이트 분광광도계 상에서 도 1a의 개별 홀에서의 채색 강도의 측정에 의한 바이오필름의 함량의 정량적 평가.
도 4c. 치약 없이, Odol 치약, Enzycal 치약, 피씨움 올리간드럼 미생물이 첨가되지 않은 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 페이스트, 산화규소가 첨가되지 않은 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 페이스트 및 예시적인 구현예 4에 따른 글리세롤을 함유한 전체 페이스트와 함께 브러시를 이용하여 이전에 세정된 세라믹 하이드록시아파타이트의 제거 후에 치주 질병을 갖는 개체로부터 타액을 이용한 6-홀 플레이트의 사진.
도 4d. 562 nm의 파장에서 플레이트 분광광도계 상에서의 도 1c의 개개 홀에서의 채색의 상도를 측정함에 의한 바이오필름의 함량의 정량적 평가.
본 발명의 예시적인
구현예
생물학적 액체 항진균 산물은 피씨움 올리간드럼 미생물을 함유하며, 모든 예시적인 구현예에서, 피씨움 올리간드럼 미생물은 피씨움 올리간드럼 드레치슬러 ATTC 38472 균주의 피씨움 올리간드럼 미생물으로서, 이는 브르노에 소재한 마사리코바 대학교에서의 체코 미생물 수집소(CCM)에 명칭 피씨움 올리간드럼 M1으로 기탁되었으며, 이는 예시적인 구현예에서 하기에 제시된 이러한 명칭 하에 있다.
ST25_PCT에 따른 이러한 미생물의 서열 프로토콜은 하기와 같다:
실시예
1
높은
중량%의
바이오매스를
갖는 작물을
살포하도룩
의도된 생물학적 액체 항진균 산물
제조:
고체 지지체 상에 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 배양을 통해 수득된 바이오매스를 균질기 용기(산업용 믹서)에서 탈염수와 혼합하고, 균질화하였다. 균질화를 분당 3,000 내지 5,000회 회전수로 3분의 시간 동안 진행하였다. 후속하여, 삼투물질(수크로오스)을 초기, 희석되지 않은 현탁액에 60 중량%의 중량 기준의 최종 농도에 및 난포자의 요망되는 수에 해당하는 양으로 첨가하였다. 이후에, 삼투물질(수크로오스)을 갖는 현탁액을 믹서에서 1분 동안 분당 2,000회 회전수로 균질화하였다. 이후에 현탁액을 멸균, 스테인레스강 탱크에서 8℃ 이하의 온도에서 저장하였다.
고체 배양을 통해 수득된 바이오매스를 산업용 균질기의 용기에서 삼투물질 용액(65% 수크로오스 용액) 중에서 균질화시키는 방식으로, 탈염수 중에서의 균질화의 단계 및 탈염수 중의 삼투물질(수크로오스)의 후속 첨가 단계를 결합시킴으로써 생물학적 액체 항진균 산물을 제조하는 것이 더 유익하였다. 균질화를 분당 3,000 내지 5,000회 회전수로 3분의 시간 동안 진행하였다. 초기 현탁액에서 난포자의 수를 결정한 후에, 이러한 현탁액을 표준 방식으로 삼투물질(65% 수크로오스 용액)로 희석시켜, 생성물 중 난포자의 요망되는 농도를 달성하도록 하였다. 이후에, 현탁액을 멸균, 스테인레스강 탱크에서 8℃ 이하의 온도에서 저장하였다.
휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
생성물의 조성:
안정화제로서의 수크로오스
60 중량%
안정화제로서의 물
30 중량%
배양 바이오매스
10 중량%
피씨움 올리간드럼 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 5×105
성질:
안정성: 25℃ 이하의 온도에서 6개월.
실시예
2
낮은
중량%의
바이오매스를
갖는 작물을
살포하도룩
의도된 생물학적 액체 항진균 산물
제조:
액체 배양에 의해 얻어진 피씨움 올리간드럼 바이오매스를 균질기(산업용 믹서)의 용기에서 삼투물질(수크로오스)와 혼합하고, 난포자의 요망되는 수 및 삼투물질(수크로오스)의 농도를 달성하는 방식으로 균질화하였다. 균질화를 3분의 시간 동안 분당 3,000 내지 5,000회 회전수의 속도로 진행하였다. 이후에 현탁액을 멸균, 스테인레스강 탱크에서 8℃ 이하의 온도에서 저장하였다. 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
안정화제로서의 수크로오스
64 중량%
안정화제로서의 물
35.9 중량%
배양 바이오매스
0.1 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수 1 ml 당 5×105
성질:
안정성: 25℃ 이하의 온도에서 6개월.
실시예
3
곡물/종자 코팅의
침지를
위해 의도된 생물학적 액체 항진균 산물
제조:
고체 지지체 상에 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 배양을 통해 수득된 바이오매스를 균질기 용기(산업용 믹서)에서 탈염수와 혼합하고, 균질화하였다. 균질화를 분당 3,000 내지 5,000회 회전수로 3분의 시간 동안 진행하였다. 후속하여, 삼투물질(수크로오스)을 초기, 희석되지 않은 현탁액에 60 중량%의 중량 기준의 최종 농도에 및 난포자의 요망되는 수에 해당하는 양으로 첨가하였다. 이후에, 삼투물질(수크로오스)을 갖는 현탁액을 믹서에서 1분 동안 균질화하였다.
고체 배양을 통해 얻어진 바이오매스를 산업용 균질기의 용기에서 삼투물질 용액(65% 수크로오스 용액) 중에서 균질화하는 방식으로 탈염수 중에서의 균질화 단계 및 탈염수 중의 삼투물질(수크로오스)의 후속 첨가 단계의 결합함으로써 생성물을 제조하는 것이 더욱 유익하였다. 균질화를 분당 3,000 내지 5,000회 회전수로 3분의 시간 동안 진행하였다. 초기 현탁액에서 난포자의 수를 결정한 후에, 이러한 현탁액을 표준 방식으로 삼투물질(65% 수크로오스 용액)로 희석시켜, 생성물 중 난포자의 요망되는 농도를 달성하도록 하였다. 이후에, 현탁액을 멸균, 스테인레스강 탱크에서 8℃ 이하의 온도에서 저장하였다.
이후에, 얻어진 현탁액을 멸균, 스테인레스강 탱크에서 8℃ 이하의 온도에서 저장하고, 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
안정성: 25℃ 이하의 온도에서 6개월
조성:
안정화제로서의 수크로오스
60 중량%
안정화제로서의 물
36 중량%
배양 바이오매스
4 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수 1 ml 당 2.5×106
실시예
4
낮은 물
함량을 갖는 현탁 농축물
로서의
생물학적 액체 항진균 산물
제조:
액체 배양으로부터의 피씨움 올리간드럼 M1 바이오매스를 수확 후 원심분리하였다. 원심분리 후에 상청액을 제거하고, 원심분리된 물질에 파라핀 오일을 보충하여, 난포자의 얻어진 수가 1 ml의 생성물 당 500,000개의 난포자이도록 하였다. 이후에, 혼합물을 산업용 믹서에서 3분 동안 균질화하였다. 현탁액을 멸균 용기에서 8℃ 이하의 온도에서 저장하고, 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
배양 바이오매스
0.1 중량%
안정화제로서의 파라핀 오일
99.9 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수 1 ml 당 5×105
성질:
안정성: 25℃ 이하의 온도에서 6개월.
실시예
5
피씨움
올리간드럼
M1 미생물을 위한
서방출
분해 가능한 기질을 구성하는 나노섬유 형태로 적용된 생물학적 액체 항진균 산물
제조:
액체 배양으로부터의 피씨움 올리간드럼 바이오매스를 수확 후 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 원심분리된 물질에 삼투물지(65% 수크로오스) 및 바이오폴리머를 보충하고, 이후에, 정전기 스피닝의 기술을 이용하여 비독성의 생분해성 폴리머 폴리비닐 알코올(PVA)을 사용하면서 처리하였다. 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
주성분(피씨움 올리간드럼 미생물의 액체 현탁액) 84 중량%
이중:
안정화제로서의 수크로오스
63 중량%
안정화제로서의 물
36 중량%
배양 바이오매스
1 중량%
2.
PVA
담체
분해 가능한 담체로서의 PVA
16 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수 1 ml 당 5.106
성질:
안정성: 25℃ 이하의 온도에서 6개월.
실시예
6
함침
코팅 또는 살포 형태로 적용된 생물학적 액체 항진균 산물
제조:
액체 배양으로부터의 피씨움 올리간드럼 M1 바이오매스를 수확 후 균질화시키고, 입자를 분리시키는 여과 기술을 이용하여 300 ㎛ 이하의 크기로 여과하였다. 원심분리 후에, 이러한 제조된 바이오매스를 저점도의 미네랄 오일과 혼합하여, 1 ml의 생성물에서 난포자의 요망되는 수를 달성하도록 하였다. 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
배양 바이오매스
0.1 중량%
안정화제로서의 미네럴 오일
99.9 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수 1 ml 당 2×105
성질:
안정성: (2차 물질의 타입에 따라) 10 내지 45℃의 온도에서 6개월.
실시예 7
공기-컨디셔닝을 위한 위생 제품으로서 적용된 생물학적 액체 항진균 산물
제조:
액체 배양으로부터의 피씨움 올리간드럼 M1 바이오매스를 수확 후 균질화시키고, 입자를 분리시키는 여과 기술을 이용하여 100 ㎛ 이하의 크기로 여과하였다. 원심분리 후에, 바이오매스를 염용액으로 생성물 1 ml 당 난포자의 요망되는 수까지 희석하였다. 적용 원리는 필터를 세정하거나 살포하거나, 공기-컨디셔닝 또는 냉각 유닛의 파이핑이다. 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 존재는 곰팡이 및 진균 질병에 대한 내성을 보장한다.
꽃가루 필터 청소:
필터를 위생 용액에 침지시키고, 10 내지 30분의 시간 동안에 여기에 잔류시키고, 이후에, 세정하였다. 대안은 이의 작업 위치에서 필터 상에 동일한 용액을 살포하는 것이다. 먼지 및 제제의 나머지를 압축된 공기에 의해 불어낼 것이다.
기화기 및 필터의 위생:
기화기 및/또는 필터를 세정한 후에, 산물의 용액을 세정 없이 적용하였다. 우수한 위생 효과는 산물이 단지 세척 세제로서 사용될 때에도 달성된다. 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
배양 바이오매스
0.1 중량%
안정화제로서 염용액
99.9 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 5×105
성질:
안정성: 10 내지 45℃의 온도에서 6개월(제2 물질의 타입에 따름)
실시예
8
진흙 퇴적물 및 범람 지역을 위한, 침강의 처리를 위한 위생 제품으로서 적용된 생물학적 액체 항진균 산물
제조:
액체 배양으로부터의 피씨움 올리간드럼 M1 바이오매스를 수확 후 균질화시키고, 400 ㎛ 이하의 크기를 갖는 입자를 분리시키는 여과 기술을 이용하여 여과하였다. 원심분리 후에, 바이오매스를 증류수 또는 탈염수를 사용하여 1 ml의 산물 당 요망되는 수의 난포자까지 희석하였다. 작용 원리는 토양 및 땅의 성질을 개선시키기 위해 통합 및 개선 절차로서, 하기 기술된 희석 및 진흙 및 침강의 오염된 퇴적물에 의해 영향을 받는 지역에서의 적용에 따라 물 현탁액의 생성이다. 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라,. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
배양 바이오매스
0.1 중량%
안정화제로서의 증류수
99.9 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 5×105
적용 가능한 유용성은 1 ml 당 500,000 난포자의 농도에서 헥타르 당 250 g이다.
성질:
안정성: 25℃ 이하의 온도에서 6개월
실시예
9
피씨움 올리간드럼 M1의 난포자의 안정화된 수성 현탁액으로서 생물학적 액체 항진균 산물
제조:
액체 배양에 의해 얻어진 피씨움 올리간드럼 M1 바이오매스를 멸균 증류수와 혼합하고, 원심분리(분당 4,000회 회전수, 5분) 및 상청액의 분리 후에 균질화하였다. 균질화를 1분의 시간 동안 고속 회전수(분당 20,000회 회전수)로 진행하였다. 이후에, 현탁액을 제거하고, 본래 배지의 나머지 또는 균사체의 나머지의 존재 없이, 1 ml에 피씨움 올리간드럼 M1의 난포자의 요망되는 수를 함유한 현탁 농축물을 달성할 목적으로 요망되는 경우에 여과하고 농축할 수 있다. 얻어진 현탁액 물질을 멸균 탱크에 1 내지 8℃의 온도에서 저장할 수 있다. 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
안정화제로서의 멸균 증류수
99.9 중량%
배양 바이오매스
0.1 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 5×105
성질:
안정성: 최소 25℃ 이하의 온도에서 6개월.
실시예
10
고농도의 피씨움 올리간드럼 M1의 난포자를 갖는 안정화된 수성 현탁액으로서 생물학적 액체 항진균 산물
제조:
액체 배양을 통해 얻어진 피씨움 올리간드럼 M1 바이오매스를 균질기 용기(산업용 믹서)에서 균질화하였다. 균질화를 3분의 시간 동안 분당 20,000회 회전수로 진행하였다. 이후에, 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 제거한 후에, 바이오매스를 삼투물질(65 % 수크로오스)과 혼합함으로써 1 ml의 산물에서 요망되는 수의 난포자까지 농축하였다. 현탁 농축물을 멸균, 스테인레스강 탱크에서 8℃ 이하의 온도에서 저장하고, 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
안정화제로서의 수크로오스
60 중량%
안정화제로서의 물
35 중량%
배양 바이오매스
5 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 2.107
성질:
안정성: 25℃ 이하의 온도에서 6개월.
실시예
11
글리세롤의 베이스 상에 페이스트 형태의 생물학적 항진균 산물
제조:
1197.1 g의 의약 품질의 글리세롤(글리세롤 99% PharmEur)을 실험실 균질기 내에 붓고, 239.4 g의 산화규소 Sident® 22 S, 43.1 g의 배양 바이오매스, 14.4 g의 비타민 E 및 6 g의 세이지 아로마를 조심스럽게 흩뿌렸다. 혼합물을 실험실 온도에서 10분의 시간 동안 분당 60회 회전수로 혼합하였다. 이후에, 혼합물을 스톱퍼가 장착된 플라스틱 튜브에 넣고, 그 때에, 75 g이었으며, 총 20개의 이러한 튜브를 이러한 방식으로 채웠다. 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
안정화제로서 글리세롤 99% Pharm Eur
79.77 중량%
산화규소의 베이스 상에 충전제로서 SiO2 Sident® 22 S
16.00 중량%
배양 바이오매스 피씨움 올리간드럼 M1
2.87 중량%
적용 물질로서 비타민 E 아세테이트
0.96 중량%
아로마로서 FCO2 Bio 35 % 세이지 아로마
0.40 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 2.5×104
성질:
안정성: 25℃의 온도에서 최소 6개월
실시예
12
올리브 오일의 베이스 상의 페이스트 형태의 생물학적 항진균 산물
제조:
600 g의 천연 올리브 오일을 실험실 균질기에 붓고, 120 g의 산화규소 Sident® 22 S, 21.6 g의 배양 바이오매스, 7.2 g의 비타민 E 및 3 g의 민트 아로마를 조심스럽게 흩뿌렷다. 혼합물을 실험실 온도에서 10분의 시간 동안 분당 20회 회전수로 혼합하였다. 이후에, 혼합물을 스톱퍼가 장착된 플라스틱 튜브에 넣고, 그 때에, 75 g이었으며, 총 10개의 이러한 튜브를 이러한 방식으로 채웠다. 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다.
살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
안정화제로서 정제된 올리브 오일
79.77 중량%
산화규소의 베이스 상에 충전제로서의 SiO2 Sident® 22 S 16.00 중량%
배양 바이오매스 피씨움 올리간드럼 M1
2.87 중량%
적용 물질로서 비타민 E 아세테이트
0.96 중량%
아로마로서 HNA 페퍼민트 에센셜 오일
0.40 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 2.5×104
성질:
안정성: 25℃의 온도에서 6개월
실시예
13
수중 유기체의 보호를 위한 생물학적 액체 항진균 산물
소정 범위의 진균성 질병(특히, 아스페르길루스(Aspergillus) 종)으로부터의 어류 및 유어(잉어, 잉어과 물고기, 도미류)의 예방적 보호를 위해 산물을 설계하였다. 산물을 사육 탱크에서 예방적으로 적용하였다. 산물은 또한, 소정 범위의 진균성 질병(특히, 푸사륨(Fusarium) 종, 아스페르길루스 종)에 의한 공격으로부터 유어의 예방적 보호를 위해 의도된다.
제조:
액체 배양을 통해 얻어진 피씨움 올리간드럼 M1 바이오매스를 균질기 용기(산업용 믹서)에서 균질화하였다. 균질화를 3분의 시간 동안 분당 20,000회 회전수로 진행하였다. 이후에, 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 제거한 후에, 바이오매스를 삼투물질(65% 수크로오스)과 혼합함으로써, 1 ml의 산물에서 요망되는 수의 난포자까지 농축시켰다. 현탁액을 멸균, 스테인레스강 탱크에서 8℃ 이하의 온도에서 저장하고, 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라,. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
안정화제로서의 수크로오스
63 중량%
안정화제로서의 물
36 중량%
배양 바이오매스
1 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 5.106
성질:
안정성: 25℃ 이하의 온도에서 6개월.
실시예
14
벌집을 치료하기 위한 생물학적 액체 항진균 산물
광범위한 균류, 특히 아스페르길루스 및 푸사륨 패밀리의 균류에 의한 공격으로부터 벌집의 예방적 치료하도록 산물을 설계하였다. 산물을 벌집 밖에 저장하도록 의도된 콤(comb) 및 벌에 의해 점유되지 않은 벌집 내부의 콤을 치료하기 위해 사용할 수 있다.
제조:
액체 배양에 의해 얻어진 피씨움 올리간드럼 M1 바이오매스를 균질기(산업용 믹서)의 용기에서 삼투물질(수크로오스)와 혼합하고, 난포자의 요망되는 수 및 삼투물질(수크로오스)의 농도가 달성되는 방식으로 균질화하였다. 균질화를 3분의 시간 동안 분당 20,000회 회전수로 진행하였다. 이후에 현탁액을 멸균, 스테인레스강 탱크에서 8℃ 이하의 온도에서 저장하였다. 휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
조성:
안정화제로서의 수크로오스
64 중량%
안정화제로서의 물
35.9 중량%
배양 바이오매스
0.1 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 1.106
성질:
안정성: 25℃ 이하의 온도에서 6개월.
실시예
15
작물에 살포하도록 의도된 무수 현탁 농축물로서 생물학적 액체 항진균 산물
고체 기질 상에 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 배양을 통해 얻어진 바이오매스를 균질기 용기(산업용 믹서)에서 탈염수와 혼합하고, 균질화하였다. 균질화를 분당 3,000 내지 5,000회 회전수로 3분의 시간 동안 진행하였다. 균질화 후에, 얻어진 현탁액을 무기 담체(Sipernat)와 혼합하고, 건조시키고, 원심분리 밀에서 그라인딩하여 350 ㎛ 이하의 최종 입자 크기를 달성하였다. 담체를 갖는 건조 배양 바이오매스를 산물에 요망되는 농도의 난포자를 달성하기 위해 파라핀 오일과 혼합하였다. 현탁액을 멸균 용기에서 25℃ 이하의 온도에서 저장하였다.
실시예 1에 비해 이러한 산물의 장점은 더 긴 산물의 안정성인데, 이는 물의 존재에 의해 보장된다. 산화규소의 베이스 상의, 무기 담체는 산물에서 고체 입자(바이오매스)의 양호한 현탁능력을 보장한다.
휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 안정성을 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 결정하였다.
조성:
배양 바이오매스
1.5 중량%
무기 담체로서 Sipernat 22
6.5 중량%
안정화제로서의 파라핀 오일
92 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 1.106
성질:
안정성: 25℃ 이하의 온도에서 24개월
실시예
16
농산물의 유기 생산에서 작물에 살포하도록 의도된 무수 현탁 농축물로서의 생물학적 액체 항진균 산물
고체 기질 상에서 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 배양을 통해 얻어진 바이오매스를 균질기 용기(산업용 믹서)에서 탈염수와 혼합하고, 균질화하였다. 균질화를 분당 3,000 내지 5,000회 회전수로 3분의 시간 동안 진행하였다. 균질화 후에, 얻어진 현탁액을 무기 담체(Sipernat)와 혼합하고, 건조시키고, 원심분리 밀에서 그라인딩하여 350 ㎛ 이하의 최종 입자 크기를 달성하였다. 담체를 갖는 건조 배양 바이오매스를 이후에, 산물에서 난포자의 요망되는 농도를 달성하기 위해, 해라바라기 오일과 혼합하였다. 현탁액을 멸균 용기에서 25℃ 이하의 온도에서 저장하였다.
실시예 1에 비해 이러한 산물의 장점은 더 긴 산물의 안정성인데, 이는 물의 존재에 의해 보장된다. 산화규소의 베이스 상에, 무기 담체는 산물에서 고체 입자(바이오매스)의 양호한 현탁능력을 보장한다.
휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 안정성을 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 결정하였다.
조성:
배양 바이오매스
1.5 중량%
무기 담체로서 Sipernat 22
6.5 중량%
안정화제로서 해바라기 오일
92 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 1.106
성질:
안정성: 25℃ 이하의 온도에서 24개월
실시예
17
감소된 농도의 난포자를 갖는 생물학적 액체 항진균 산물
액체 배양에 의해 얻어진 피씨움 올리간드럼 M1 바이오매스를 균질기(산업용 믹서)의 용기에서 삼투물질(수크로오스)와 혼합하고, 난포자의 요망되는 수 및 삼투물질(수크로오스)의 농도가 달성되는 방식으로 균질화하였다. 균질화를 3분의 시간 동안 분당 20,000회 회전수로 진행하였다. 이후에, 산물에서 난포자의 농도가 산물의 요건에 매칭되도록, 현탁액을 삼투물질(65% 수크로오스)과 혼합하였다. 이후에 현탁액을 멸균, 스테인레스강 탱크에서 8℃ 이하의 온도에서 저장하였다.
휴면 난포자의 수를 Sedgewick-Rafter 카운팅 챔버를 이용하여 현미경적으로 결정하고, 2011년의 문헌[Etxeberria 등[13]]에 따라, 안정성을 원형질 분리법을 이용하여 살아있는 난포자의 수의 현미경 관찰을 기초로 하여 측정하였다. 휴면 난포자의 수를 요망되는 경우에 표준 방식으로 안정화하였다.
조성:
안정화제로서의 수크로오스
64.95 중량%
안정화제로서의 물
35 중량%
배양 바이오매스
0.05 중량%
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 휴면 난포자의 수
1 ml 당 1×103
성질:
안정성: 2 내지 8℃의 온도에서 12개월; 25℃ 이하의 온도에서 6개월.
실시예
18
진균기생 실험에서 생물학적 액체 항진균 산물의 유효성의 실험실 시험
예시적인 구현예 1에 따른 현탁 농축물의 휴면 난포자로부터의 피씨움 올리간드럼 M1의 증식 및 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸 상에서의 후속 균기생의 실험실 시험을 맥아 추출물의 베이스에 생 배지(live medium)를 갖는 멸균 아가 플레이트 상에서 수행하였다. 희석된 농축물을 아가 플레이트에 적용 수준으로 적용하였으며, 이는 물 1 리터 당 0.2 ml의 농축물을 의미하며, 발아 후 이러한 플레이트의 일부를 제거하고, 상이한 아가로 옮기고, 이를 푸사르움 그라미네아룸 균류와 동시에 접종하였다.
이러한 시험의 결과는 도 1에 제시되어 있으며, 이는 표준 성장과 비교하여 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 첨가 후에 식물병원성 진균 푸사르움 그라미네아룸의 성장의 중대한 중단을 나타낸다(도 1a). 이러한 상황은 4일 후에 촬영된 일련의 페트리 디시를 이용하여 추가로 예사되는데, 이는 한편으로 두 미생물 모두의 공동 성장, 및 다른 한편으로 식물병원성 진균의 성장을 나타낸다(도 1b). 11일 배양 후에, 식물병원성 진균의 상당한 억제는 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 성장과 함께 명확하다. 살아있는 난포자의 수가 초기 값의 90% 미만으로 떨어지지 않는 경우에, 생성물은 안정한 것으로서 표시되었다.
실시예
19
식물병원성 진균에 대한 항진균 효과는 밀과의 실험실 실험에서
나타났다
작물(밀) 종자를 나트륨 클로라이트 용액(1 내지 5% 용액)에 대한 상품명인 Sava의 용액으로 처리하고, 아가 토양 추출물 상에서 발아하였다. 발아 후에, 싹을 1% Sava 용액을 다시 처리하고, 250 ml 엘른마이어 플라스크에서 한 조각의 식물 아가(phyto agar) 상에 배치시켰다. 플라스크에 하기 버젼에서 1 리터 당 0.2 ml 적용 농도 및 0.2 ml의 부피의 식물병원체 푸사르움 그라미네아룸 또는 피씨움 올리간드럼 M1 미생물(현탁 농축물 중 휴면 난포자)를 갖는 한 조각의 아가(5 mm)를 접종하였다: 1) 식물병원체; 2) 식물병원체 + 피씨움 올리간드럼 M1; 3) 단지 피씨움 올리간드럼 M1; 접종되지 않은 대조 샘플. 플라스크를 셀룰로오스의 얇은 층 및 거지로 시일링하였다. 배양을 방에서 24℃의 온도에서 진행하였다. 식물병원체 및 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 콜로니의 성장을 모니터링하였고, 식물의 상태도 모니터링하였다.
이러한 실험실 실험의 결과는 도 2에 제시되어 있다. 실제 식물병원체의 첨가가 관련되어 있는 한, 성장하는 밀의 주변부에서의 이의 상당한 성장은, 병원체에 의해 야기된 식물에 대한 손상과 같이, 매우 명백하다(도 2a). 식물병원성 진균 이외에, 피씨움 올리간드럼 M1 미생물이 또한 첨가된 경우에, 식물병원체의 존재는 보이지 않았으며, 배양된 식물은 잘 성장하였다(도 2b). 피씨움 올리간드럼 M1 미생물 단독의 존재 하에서 수행된 대조 실험은 어떠한 미생물도 첨가되지 않은 실험과 유사한 밀 식물의 정상 성장을 나타내었다(도 2c).
실시예
20
브라시카
나푸스
(
Brassica
napus
) 유채씨에 대한 온실 실험에서의 예시적인 구현예 2에 따른 작물 상에 살포하도록 의도된 생물학적 액체 항진균 산물의 유효성의 시험
Uherce의 회사 온실에서 성장하고 있는 브라시카 나푸스(Brassica napus) 유채씨, 로하나(Lohana) C1 변형체를 함유한 4개의 섹터를 이용하였으며, 이에 의해, BBCh 15 내지 21에서 적용을 개시하였다. 진균기생 미생물 피씨움 올리간드럼 M1의 낱개 생진균제(Polyversum®)를 섹터 1에서 적용하였으며, 섹터 2에 본 발명의 예시적인 구현예 2에 따른 새로운 액체 항진균제를 적용하고, 섹터 3에 본 발명의 예시적인 구현예 2에 다른 새로운 액체 항진균 산물을 적용하고, 섹터 4에 본 발명의 예시적인 구현예3에 다른 새로운 액체 항진균 산물을 적용하였다. 모든 경우에 적용 농도는 1 리터 당 0.5 g, 또는 1 리터 당 0.5 ml이었으며, 처리된 면적 1 제곱 미터 당 100 ml의 이러한 농축된 산물을 분산시켰다. 식물 및 줄 사이의 토양을 포함하는 샘플의 수집을 위해 각 섹터에서 수집 지점을 표시하였다. 수집 시점에 온실의 사진 문서화 및 온도의 기록을 또한 각 수집 동안 수행하였다. 수집된 샘플을 한 시간 내에 실험실로 옮기고, 분석 시간까지 냉동고에서 -20℃에서 저장하였다. 샘플을 항진균 산물의 적용 전에 수집하고, 이후에, 적용하고, 1시간, 2시간, 7시간, 20시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 11일, 14일, 17일 및 20일 후에 수집하였다.
샘플의 실험실 처리는 개별 식물의 사진 문서화, 잎 및 뿌리의 분리, 샘플의 습윤 중량의 결정, DNA 추출 완충제에서 샘플의 균질화, 원심분리 및 분자 분석의 수행을 포함하였다. 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 존재의 정량적 측정을 ITS 서열을 타겟으로 하는 프로브와 함께 qPCR 방법을 이용하여 수행하였으며, 유채씨의 DNA의 정량적 측정을 Fat(A)A 서열을 타겟으로 하는 프로브와 함께 동일한 방법을 이용하여 수행하였다. 정량 분석은 표준 조건 하에서 50회 사이클의 DNA 증폭의 실행 및 교정 곡선을 이용한 타겟 서열의 농도 계산을 포함하였다. 진균 침입 수준을 표준 프로토콜을 기초로 한 유사한 방식으로 검출하였다.
유효성 시험 결과는 하기 표 1에 제시되어 있다. 본 발명에 따른 새로운 액체 항진균 산물에 의해 달성된 유효성은 모든 경우에서 고체의 낱개 제품의 유효성과 유사하거나 더 양호한다. 외래 균류는 항상, 적용한 곳에서 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 콜로니화 및 증폭에 따라 억제되었다. 이후에, 균류에 의한 낮은 오염 수준은 실험의 종료 시에 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 농도를 감소시킨 후에도 유지되었다. 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 집단의 동력학을 15일의 기간 동안에만 이러한 집단에서 모니터링하였으며, 그 결과 장기적인 효과에 대한 어떠한 코멘트도 없었다. 그럼에도 불구하고, 산물의 항진균 효과의 관점으로부터, 균류를 억제하는 능력이 중요하고 장기적이라는 것은 의심의 여지가 없다. 적용하고 24시간 후 대략 1차의 이러한 균류의 발생이 감소하였으며, 추가 24시간 후 거의 1차 정도로 추가로 감소하였다.
표 1
실시예
21
트리티쿰 애스티붐(
Triticum aestivum
) 밀에 대한 필드 시험에서 예시적인 구현예 1에 따른 작물 상에 살포하도록 의도된 생물학적 액체 항진균 산물의 유효성 시험
겨울 밀 트리티쿰 애스티붐을 Uherce u Loun의 마을에 가까운 회사 부지에서 2105년 10월에 심었다. 본 발명의 예시적인 구현예 1에 따른 항진균 산물을 2015년 11월에 농업 표준에 따라 1 헥타르 당 100 ml의 양으로 표준 살포 방법을 이용하여 지정된 트랙에 적용하고, 식물 보호를 위한 Polyversum® 항진균 제제에 대한 등록을 승인받았다. 샘플을 적용하기 전에 4개의 지정된 수집 지점으로부터 그리고 적용 후 다른 날에 획득하였으며, 이에 의해, 성장하는 밀 식물 및 샘플 근처의 토양을 수집하였다. 샘플을 수집 직후에 냉동시키고, 분석 시간까지 시일링된 백 또는 시험관에서 -20℃에서 저장하였다. 핵산을 공개된 방법[Klimes R, Suchanek M, Mastalkova L et al /2016/ Comparison of the efficacy of treatment of dermatophytosis by chemical and biological antifungals: soil peronosporomycete Pythium oligandrum is as efficient as the antifungal enilconazole in the guinea pig model, Vet Dermatol, in print]을 이용하여 수집된 샘플로부터 추출하고, 분자 분석을 위해 사용하였다.
예시적인 구현예 1에 따른 액체 산물을 살포한 후에 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 발생의 동력학에 관한 한, 식물 및 주변 토양에서의 표준화된 농도는 유사한 의존성을 나타내었다. 샘플 1 g 당 단지 개별 세포가 적용 전 qPCR 유전자 시험에 의해 동정될 수 있지만, 이러한 수는 정상 표준화 양에 해당하는 액체 산물의 적용 후에 샘플 1 g 당 수백 개의 세포까지 상승하였다. 48시간 후에 적소에서 실험 조건 하에서 피씨움 올리간드럼 M1 미생물이 시각적으로 증식되었으며, 이에 의해 이러한 긍정적인 추세는 2015년 12월 초에 서리 에피소드(frost episode)에 의해 특정 실험 조건 하에서 중단되었으며, 그 후에, 동적 집단 성장이 회복되지 않았다(도 3a 및 도 3b 비교).
많은 양의 귀중한 정보는 실험의 "피크" 단계에서 수행된 RT-qPCR 방법을 이용한 유전자 발현 프로파일의 분석을 통해 얻어졌으며, 피씨움 올리간드럼 M1 미생물이 가장 높은 성장을 나타내었다. 전사체의 농도의 값은 제1 단계(셀룰라아제에 대한 유전자의 상당한 발현)에서의 발생하는 진균 병원체에 대한 빠른 반응을 나타내고, 이후에, 난포자의 출현 증가(엔도글루카나아제 발현)를 나타내었다. 단지 48시간 및 120시간 후에, 포자형성의 특징적인 유전자 마커가 주변 토양 및 뿌리에서 주로 증가하였다(도 3c). 동시에, 적용 후 48시간 후에 관련 함량의 균류의 유의미한 감소를 관찰하는 것이 가능하였으며(도 3d), 이러한 감소는 피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 진균기생 작용 동안 균류에서 표면 사카라이드의 분해를 담당하는 셀룰로오스에 대한 유전자의 발견과 상호간에 상관관계를 나타낸다(도 3e).
실시예
22
기계적 플라크 제거를 이용하는 경구 바이오필름 모델에서 치약의 유효성 시험
제조된 치약의 유효성을 모니터링하기 위하여, 문헌[Verkaik MJ 등[14], 2010년]에 따라 플라크의 기계적 제거를 이용한 경구 바이오필름 모델을 이용한 실험실 시험을 수행하였다. 2시간의 접착, 및 후속 밤새 성장(16시간 바이오필름) 및 기계적 세정으로 이루어진, 버젼(B)의 상기 공개된 프로토콜을 사용하였다. 치아 플라크의 미생물을 제거함에 있어서, 피씨움 올리간드럼 M1 미생물을 함유한 글리세롤 치약 및 올리브 오일과 피씨움 올리간드럼 M1 미생물을 갖는 치약의 유효성을 2가지 타입의 일반적으로 입수 가능한 치약(Odol and Enzycal), 및 대조군으로서, 어떠한 페이스트도 없이 칫솔로의 기계적 세정(마킹된 대조군)과 비교하였다. 어떠한 피씨움 올리간드럼 함유물이 없고 연마제로서 산화규소가 사용되지 않은 동일한 페이스트를 대조 실험에서 사용하였다.
이러한 시험 결과는 도 2의 결과의 표에 기술되어 있다. 이는, 예시적인 구현예 4에 따른 페이스트가 심지어 치주 질병에 의해 영향을 받는 개체들 중에서, 사용되는 대안적인 제품에 비해 치아 바이오필름 및 플라크의 제거에 있어서 상당히 더 높은 유효성을 나타냄을 보이고 있다(도 4a 내지 도 4d). 지금까지 일반적으로 사용된 페이스트가 바이오필름 형성의 강도를 대략 절반까지 감소시키는 반면, 본 발명에 따른 새로운 페이스트는 이를 1/10까지 감소시켰다. 어떠한 피씨움 올리간드럼 M1 미생물 함유물도 가지지 않는 대조군 페이스트에서의 이의 효과는 일반적인 페이스트와 유사하였으며, 이러한 효과는 산화규소가 없는 대조군 페이스트에서 상당히 더 높았다. 치주 질병을 갖는 환자에서 전체 바이오필름 형성 수준은 상당히 높았으며, 또한, 개별 페이스트의 유효성의 차이를 관찰하는 것이 훨씬 더 양호하였다.
실시예
23
진균 포자로부터의
생활 공간을
보호하기 위한 예시적인
구현예
1에 따른 생물학적 액체 항진균 산물의 유효성 시험
예시적인 구현예 1에 따른 항진균 산물을 물로, 적용 용액 1 리터 당 330,000 난포자의 농도로 희석하였으며, 즉, 0.66 ml의 액체 농축물을 1 리터의 용액에 첨가하였다. 대조 용액을 또한, 피씨움 올리간드럼 M1 미생물 함유물이 없고 바이오매스를 물로 대체하는 것을 제외하고 동일한 조건 하에서 제조하였다. 이러한 방식으로 제조된 용액을 분무기를 이용하여 미세한 미스트를 살포하는 형태로 Uherce u Loun No. 2에서의 농장에서 2개의 작고 밀폐된 방에서 적용하였다. 적용 후에, 두 방 모두를 완전히 닫혀졌고, Omeljansky 방법을 이용하여 포자의 함량에 대해 폴아웃 시험(fallout test)을 수행하였다. 결과를 프라하의 체코 공화국 과학 아카데미의 미생물 연구소에서 Dr. Miroslav Kola?ik의 실험실에서 평가하였다.
실험 결과는 하기 표 2에 제시되어 있다. 실험은 어떠한 공기 흐름이 없는 밀폐된 방에서 수행되었고, 이러한 이유로, 관찰된 변화는 더 느렸고, 수 개월 후에만 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 결과로부터, 보조 물질이 적용되는, 대조군 방 1에서, 보조 물질의 적용과 함께, 확인된 포자의 수는 변동되었지만, 임의의 관측 시간에 1 입방 미터의 공기 당 500개의 포자의 WHO(세계 보건 기구 한도) 미만으로 떨어졌다. 반대로, 방 2에 적용하고 3개월 후에 포자가 통계학적으로 유의미하게 감소하였으며, 이는 후속하여, 적용한 날 이후 6개월에 WHO 한도 미만으로 떨어졌다.
표 2
실시예
24
피씨움
올리간드럼
M1을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물의 생산 방법
본 발명에 따른 피씨움 올리간드럼 M1을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물의 상세한 특성은 상기 예시적인 구현예에서 상세히 입증되었다.
본 발명에 따른 피씨움 올리간드럼 M1을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물의 생산 방법의 예는 하기에 제시된다.
시리얼, 사탕수수 당밀 및 다른 필수 영양소를 함유한 배지는 피씨움 올리간드럼 M1 난균의 호기성 배양을 위해 사용된다. 액체 배지는 스팀 멸균기에서 멸균된다. 냉각 후에, 여기에 피씨움 올리간드럼 M1의 선택된 균주들 중 하나가 접종된다. 대략 13일이 소요되는 공정인 배양이 종료된 후에, 바이오매스는 예시적인 구현예에서 상기에 제시된 방식으로 수확되고 가공된다.
곡물, 바람직하게, 껍질 제거한 수수 그레인을 함유한 고체 기질 상에 피씨움 올리간드럼 M1 미생물, 예를 들어, 파니쿰 밀리아세움 L.(Panicum miliaceum L.)을 배양하기 위해 배지가 제조되며, 이는 소정 백분율의 살아있는 액체 배지와 혼합된다. 배지는 스팀 멸균기의 배양 용기에서 멸균된다. 냉각 후에, 배지에는 피씨움 올리간드럼 M1의 선택된 균주들 중 하나가 접종된다. 대략 8일이 소요되는 배양 공정이 종료된 후에, 수확된 바이오매스는 예시적인 구현예에서 상술된 바와 같이, 현탁액 농축액 형태로 추가로 가공된다.
액체상 및 고체상에서 피씨움 올리간드럼의 배양 단계의 종료 후에, 바이오매스는 예를 들어, 산업용 믹서에서 액체 배지와 함께 균질화되며, 이에 따라, 현탁액 중 입자의 최소 95%가 0.05 내지 0.30 mm, 우선적으로, 0.050 내지 0.125 mm가 되게 한다. 균질한 현탁액은 후속하여, 난포자의 수에 의해 특징된다. 현탁액은 고려되는 생물학적 액체 항진균 산물의 제조를 위해 적합한 난포자의 사전-결정된 농도에 대한 난포자의 수에 따라 표준화되고, 즉, 농축되거나 희석된다.
고체 기질 상에서 피씨움 올리간드럼 M1의 배양 단계의 종료 후에, 바이오매스는, 현탁액 중 입자의 최소 95%의 최종 크기가 0.050 내지 0.300 mm의 크기, 우선적으로, 0.050 내지 0.125 mm이도록, 상응하는 부피의 탈염수 중에서, 우선적으로, 산업용 믹서를 이용하여 균질화된다. 균질한 현탁액은 후속하여 난포자의 수에 의해 특징된다. 얻어진 현탁액은 고려되는 생물학적 액체 항진균 산물의 제조를 위해 적합한 난포자의 사전-결정된 농도에 대한 난포자의 수에 따라 농축되거나 희석된다.
현탁액은 관련된 범위 내에서 입자의 최대 허용 크기를 보장하기 위해, 균질화 및 농축 단계 후에, 분리되고, 예를 들어, 여과된다. 대략 0.05 mm 내지 0.125 mm의 입자를 달성하는 경우에, 피씨움 올리간드럼 M1의 난포자의 농축된 현탁액, 또는 거의 순수한 농축된 현탁액을 얻을 가능성이 높다. 상기에 제시된 예시적인 구현예들 대부분은 주로 0.050 내지 0.125 mm의 입자 크기를 갖는다.
수성 현탁액은 균질화 동안 삼투물질의 첨가제로 안정화될 수 있고, 8℃보다 낮은 온도에서 큰, 멸균 용기에서 저장될 수 있다.
피씨움 올리간드럼 M1 미생물의 무수 현탁액의 경우에, 고체 기질 상에서 또는 액체상에서 배양 단계의 종료 후에 얻어진 물질은 우선적으로 산업용 믹서를 이용하여 균질화되며, 이에 따라, 현탁액 중 입자의 최소 95%의 최종 크기가 0.050 내지 0.300 mm, 우선적으로, 0.050 내지 0.125 mm이게 되도록 한다. 난포자의 수에 의해 특징되는, 얻어진 균질 현탁액은 후속하여 원심분리되며, 상청액의 제거 후에. 오일은 고려되는 생물학적 액체 항진균 산물의 제조를 위해 적절한 경우에, 난포자의 사전-결정된 농도를 달성하기 위해 원심분리된 물질에 첨가된다. 얻어진 물질은 후속하여, 예를 들어, 산업용 믹서를 이용하여 재현탁된다.
특정의 가능한 생산 방법은 상기에 제시된 예시적인 구현예에서 기술되지만, 이러한 것으로 한정되지 않는다.
산업상 이용 가능성
난포자의 안정화된 현탁액을 함유한 신규한 액체 항진균 산물은 주로 발효 생산 단계 및 제형 단계 둘 모두가 기술적 관점에서 잘 관리할 수 있기 때문에, 상당한 부피로 제조될 수 있다. 새로운 액체 산물은 균류로부터 빌딩 및 거주지를 보호하고, 균류 및 효모를 억제하고, 인간 및 수의 적용에서 미생물총의 생리학적 균형을 수립하기 위해, 특히 식물의 생물학적 보호에서, 다른 형태의 피씨움 올리간드럼의 미시적 난균이 지금까지 적용되고 사용된 모든 구역에서의 적용을 발견할 수 있다. 보호 인자로서 및 피씨움 올리간드럼 미생물의 서방출, 분해 가능한 기질 "담체"로서 작용하는, 분해성 폴리머를 함유한 식물에 대한 보호 살포제로서의 이의 용도는 매우 혁신적인 것이다. 본 발명에 따른 산물은 또한, 생성물의 오일 성분이 또한 목재의 효과적인 함침을 유도할 때, 목재 구조물을 코팅하거나 여기에 살포하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 미생물의 존재는 균류 및 진균 질병에 대한 저항성과 나무에 대한 "결함(defect)"에 대한 저항을 보증한다. 완전히 새로운 하나의 용도는 공기-처리 장비, 공기-컨디셔닝 및 냉각 유닛의 효과적인 보존이다. 또한, 홍수에 의해 영향을 받는 지역, 가뭄 지역, 및 물의 재배양된 지역의 주변부에서 진균 오염 수준을 감소시킬 목적을 위해 특별히 설계된 생성물을 사용하는 것이 유리한 것으로 보일 것이다.
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cgcaagactt gaggctgaac gaaggtgagt ctgcgtctat tttggatgcg gatttgctga 120
tgttatttta aacacctatt acttaatact gaactatact ccgaatacga aagtttttgg 180
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catattgcac tttcgggtta tgcctggaag tatgcctgta tcagtgtccg tacatcaaac 360
ttgcctttct ttttttgtgt agtcaaaatt agagatggca gaatgtgagg tgtctcgcgc 420
tgtcttttta aagatggttc gagtcccttt aaatgtacgt tgattctttc ttgtgtctgc 480
gaattgcgat gctatgctct ttgtgatcgg tttagattgc tttgcgctgg tgggcgactt 540
cggttaggac atatggaagc aacctcaatt ggcggtatgt tcggctttgc ctgacgttaa 600
gctaagcgag tgtagttttc tgtcttttcc ttgaggtgta cctgtcgtgt gtgaggttga 660
tttaggctat atggttgctt ggttgtgtgg tttagcgttt tcagacgcct gcttcggtag 720
gtaaaggaga caacaccaat ttgggactga gagtttact 759
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cctgctacat ttgtacatgg agcaactatt gaaattattt ggacaacaat tccagcatta 180
attttattaa ccgtagcagt tccatctttt gctttattat attcaatgga tgaaattatt 240
gatccaatta taactttaaa agtaataggt agtcaatggt actggagtta tgaatattct 300
gataatttag aatttgcaga tgaaccttta atttttgata gttacatggt tcaagataat 360
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aatagccata ttagagtttt aataacagct tctgacgttt tacattcatg ggctataccc 480
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atgccaatag ttgttgaagc agtttcatta gaagattatt tagtttggtt aaaaaacaaa 660
ttaattttga ttttaatgta taa 683
Claims (16)
- 피씨움 올리간드럼(Pythium oligandrum) 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물(biological liquid antifungal product)로서,
피씨움 올리간드럼 미생물의 안정화된 현탁액을 함유하며,
0.05 내지 10.0 중량%의, 배양된 배지의 함유물, 세포 형태의 이러한 미생물, 및 이러한 미생물에 의해 형성된 물질을 갖는 피씨움 올리간드럼 미생물의 배양 바이오매스(culturing biomass), 및
90.0 내지 99.95 중량%의 안정화제를 함유하며,
이에 의해, 1 ml의 이러한 생물학적 액체 항진균 산물에서 휴면 난포자(dormant oospore)의 사전결정된 수는 정상 표준화(normal standardization) 이후에, 1×103 내지 2×107개인 것을 특징으로 하는, 생물학적 액체 항진균 산물. - 피씨움 올리간드럼 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물로서,
피씨움 올리간드럼 미생물의 안정화된 현탁액을 함유하고,
0.05 내지 10.0 중량%의, 배양된 배지의 함유물, 세포 형태의 이러한 미생물, 및 이러한 미생물에 의해 형성된 물질을 갖는 피씨움 올리간드럼 미생물의 배양 바이오매스,
79.77 내지 99.95 중량%의 안정화제, 및
100 중량%까지 나머지 양의, 충전제, 아로마(aroma) 및 비타민 E를 포함하는 군으로부터의 적어도 하나의 개질/적용 물질을 함유하며,
이에 의해, 1 ml의 이러한 생물학적 액체 항진균 산물에서 휴면 난포자의 사전결정된 수는 정상 표준화 이후에, 2.5×104 내지 1.0×106개인 것을 특징으로 하는, 생물학적 액체 항진균 산물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 피씨움 올리간드럼 미생물이 피씨움 올리간드럼 M1의 명칭으로 브르노(Brno)의 마사리코바 대학교(Masaryk University)의 체코 미생물 수집소(Czech Collection of Microorganismsl CCM)에 기탁된, 피씨움 올리간드럼 드레치슬러(Pythium oligandrum Dreschler) ATTC 38472 균주인 것을 특징으로 하는, 피씨움 올리간드럼 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제가 물, 염용액, 오일 또는 삼투물질 용액을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 함유하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 액체 항진균 산물.
- 제4항에 있어서, 안정화제가 30.0 내지 99.9 중량%의 물인 것을 특징으로 하는, 생물학적 액체 항진균 산물.
- 제4항에 있어서, 안정화제가 99.9 중량%의 염용액인 것을 특징으로 하는, 생물학적 액체 항진균 산물.
- 제4항에 있어서, 안정화제가 60.0 내지 64.95 중량%의 수크로오스 형태의 삼투물질인 것을 특징으로 하는, 생물학적 액체 항진균 산물.
- 제4항에 있어서, 안정화제가 79.77 내지 99.9 중량% 양의 파라핀 오일, 미네랄 오일, 글리세롤 또는 해바라기 오일을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 오일인 것을 특징으로 하는, 생물학적 액체 항진균 산물.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 피씨움 올리간드럼 미생물의 난포자의 담체로서, 16.0 중량%의 서방출 생분해성 매트릭스, 예를 들어, 폴리비닐 알코올을 또한 함유하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 액체 항진균 산물.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 베이스 상의 충전제로서, 16.0 중량% 양의 산화규소를 또한 함유하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 액체 항진균 산물.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 0.96 중량%의 세이지(sage) 또는 민트 아로마(mint aroma), 및 0.4 중량%의 비타민 E의 적용/개질 물질을 또한 함유하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 액체 항진균 산물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 피씨움 올리간드럼 미생물의 안정화된 현탁액을 함유한, 피씨움 올리간드럼 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물을 제조하는 방법으로서,
a) 액체 상에서 피씨움 올리간드럼의 난균(oomycete)의 호기성 배양을 위해 시리얼(cereal), 사탕수수 당밀(cane molasses) 및 다른 필수 영양소의 추출물을 함유한 액체 배지를 사용하는 단계;
b) 액체 배지를 멸균시키는 단계;
c) 냉각 후에, 여기에 피씨움 올리간드럼의 선택된 균주들 중 하나를 접종하는 단계;
d) 배양의 종료 후에 바이오매스를 수확하고 가공하는 단계;
e) 후속하여, 액체 상에서 피씨움 올리간드럼의 배양 단계의 종료 후에, 현탁액 중 최소 95%의 입자가 0.050 내지 0.300 mm, 우선적으로, 0.050 내지 0.125 mm이도록, 바이오매스를 액체 배지로 균질화하는 단계;
f) 난포자의 수에 의해 특징되는, 얻어진 균질화된 현탁액을 이후에, 고려되는 생물학적 액체 항진균 산물에 대한 난포자의 사전결정된 농도까지 표준화(standardize)하는, 즉, 난포자의 수에 따라, 농축하거나 희석하는 단계를 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 피씨움 올리간드럼 미생물의 안정화된 현탁액을 함유한, 피씨움 올리간드럼 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물을 제조하는 방법으로서,
g) 소정 백분율의 살아있는 액체 배지(live liquid medium)와 혼합된, 시리얼 그레인(cereal grain), 바람직하게, 껍질 벗긴 수수 그레인(hulled millet grain), 예를 들어, 파니쿰 밀리아세움(Panicum miliaceum L.)을 함유한 고체 기질 상에서 피씨움 올리간드럼 미생물을 배양하기 위해 배지를 제조하는 단계;
h) 배지를 배양 용기에서 멸균시키는 단계;
i) 냉각 후에, 배지에 피씨움 올리간드럼의 선택된 균주들 중 하나를 접종하는 단계;
j) 배양 공정의 종료 후에 수확된 바이오매스를 현탁 농축물의 형태로 가공하는 단계;
k) 고체 기질 상에 피씨움 올리간드럼의 배양 단계의 종료 후에, 현탁액 중 최소 95%의 입자의 최종 크기가 0.050 내지 0.300 mm, 우선적으로, 0.050 내지 0.125 mm이도록 바이오매스를 상응하는 부피의 탈염수 중에서 균질화하는 단계;
l) 난포자의 수에 의해 특징된, 얻어진 균질화된 현탁액을 이후에, 고려되는 생물학적 액체 항진균 산물의 제조를 위해 적절한 난포자의 사전결정된 농도까지 표준화하는, 즉, 농축하거나 희석하는 단계를 특징으로 하는 방법. - 제12항 또는 제13항에 있어서,
m) 현탁액에서 최소 95%의 입자의 최종 크기가 0.050 내지 0.300 mm, 우선적으로, 0.050 내지 0.125 mm이도록, 피씨움 올리간드럼 미생물의 무수 현탁액의 경우에, 고체 기질 상에 또는 액체 상에서 배양 단계의 종료 후에 얻어진 물질을 균질화하는 단계;
n) 난포자의 수에 의해 특징되는, 얻어진 균질한 현탁액을 후속하여 원심분리하는 단계;
o) 상청액의 제거 후에, 고려되는 생물학적 액체 항진균 산물의 제조를 위해 적절한 경우 난포자의 사전결정된 농도를 달성하기 위해 오일을 원심분리된 물질에 첨가하는 단계; 및
p) 얻어진 물질을 후속하여 재현탁시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 피씨움 올리간드럼 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물을 제조하는 방법. - 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 균질화, 및 표준화, 즉, 농축 또는 희석 후에, 현탁액이 0.050 내지 0.300 mm, 우선적으로, 0.050 내지 0.125 mm의 피씨움 올리간드럼 미생물의 입자의 최대 허용 크기(maximum admissible size)를 보장하기 위해 입자의 사전 결정된 크기로 분리되고, 예를 들어, 여과되는 것을 특징으로 하는, 피씨움 올리간드럼 미생물을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물을 제조하는 방법.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 현탁액이 균질화 동안 삼투물질의 첨가제로 안정화되고, 8℃ 미만의 온도에서 큰, 멸균 용기에서 저장되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
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