CN106431661A - 一种寡雄腐霉菌肥的制备方法及应用 - Google Patents

一种寡雄腐霉菌肥的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种寡雄腐霉菌肥的制备方法及应用，所述制备方法先取寡雄腐霉菌种或寡雄腐霉卵孢子进行固体扩繁，得到扩繁菌种；再对扩繁菌种进行液体发酵得到发酵液，将发酵液与液体发酵使用的液体培养基混合均匀得到混合液；将混合液与粉碎并灭菌的载体材料混合为混合料，在混合料上覆盖塑料薄膜并堆制20~30天，制得寡雄腐霉菌肥。本发明寡雄腐霉菌肥能够促进农作物、蔬菜和果树生长，促进植物生长量一般增加7.0%，且能防治疫霉属、灰霉菌属、轮枝菌属、格链孢属、葡萄孢属、丝核病菌属、腐霉属等病原真菌引起的植物真菌病害，防治效果60%左右，促生防病效果优于现有的卵孢子制剂。

Description

一种寡雄腐霉菌肥的制备方法及应用
技术领域
本发明属于土壤肥料技术领域，具体涉及一种寡雄腐霉菌肥的制备方法及应用。
背景技术
肥料是庄稼的粮食，施用化肥是提高作物产量的重要手段，但长期大量施肥会造成一系列生产和环境问题，如肥料浪费，利用率降低，肥效递减，病害严重，土壤板结，环境污染等。目前，我国化学氮肥的利用率一般不超过35％，磷肥利用率更低。施用菌肥促进作物生长，保持或降低肥料用量是提高肥效的重要手段之一。目前，我国主要生产固氮、溶磷、解钾的菌肥，但成本高，功能单一，促生减肥效果欠佳。提高菌肥肥效的关键在于选用优良菌株，降低生产成本，增加施入土壤的活菌数量。
在我国农业中，真菌引起的作物病害分布广泛，发病率高，危害严重，影响作物产量、质量和经济效益。目前，化学农药是我国防治作物真菌病害的主要手段。但是，病原真菌的小种繁多，对化学农药的敏感性不一样，且容易产生抗药性，化学农药对作物真菌病害的防治效果随施药时间的延长而降低。此外，化学农药一般对人畜有害，影响农产品安全性，污染环境。所以，在农业生产中，迫切需要安全、高效地防治作物病害。
寡雄腐霉(Pythium oligandrum)能促进植物生长；抑制疫霉属、灰霉菌属、轮枝菌属、格链孢属、葡萄孢属、丝核菌属、腐霉属等多种病原真菌的生长繁殖；且对人畜无毒，环境安全。捷克斯洛伐克已利用Pythium oligandrum DV74菌株制备出的寡雄腐霉卵孢子制剂，并在欧美等国大量施用。我国也从捷克斯洛伐克进口寡雄腐霉卵孢子制剂，由于价格昂贵，一般只用于绿色水果和蔬菜生产，存在一定的价格劣势。需要指出是，现有多直接将寡雄腐霉卵孢子制剂适用于土壤中，寡雄腐霉卵孢子制剂的效果取决于孢子的萌发和菌丝生长，但田间条件复杂多变，难于提供卵孢子萌发和菌丝生长的适宜环境，不能生成足够多数量的菌丝，进而达到的促进植物生长和抑菌生长不佳。此外，寡雄腐霉卵孢子制剂的孢子含量为5×106/g左右，大约相当于每克土壤可培养微生物的数量，一般用量仅20g/667m2。因此，施入土壤的孢子数相对于土壤微生物微不足道，不能有效竞争土著微生物，综上原因，现有用寡雄腐霉卵孢子制剂作为菌肥使用存在一定的不足之处。菌肥效果与菌株的生物学特性、活菌数量和与其他环境微生物的竞争能力密切相关，故有待改进寡雄腐霉制剂生产工艺，降低成本价格，使制得的菌肥制剂中有效微生物数量多，以提高促生防病效果和稳定性。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术中寡雄腐霉卵孢子制剂难以在田间土壤中萌发和生长菌丝、稳定性差，且卵孢子制剂中孢子数少，不能与土壤中微生物产生有效竞争，进而促进植物生长和抑制微生物效果差的技术问题，而提供一种富含有寡雄腐霉卵孢子和菌丝且制备成本低廉的寡雄腐霉菌肥的制备方法及应用，克服了现有菌肥制剂稳定性差、效果欠佳、功能单一的缺陷。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种寡雄腐霉菌肥的制备方法，包括如下步骤：
1)取寡雄腐霉菌种或寡雄腐霉卵孢子在固体培养基上进行固体扩繁，得到扩繁菌种；
2)对液体培养基进行灭菌后冷却至29～31℃，将步骤1)得到的扩繁菌种接种于灭菌后的液体培养基中，在24～28℃、20～40转/分搅拌的条件下通气培养72～144小时后，以600～800转/分的搅拌速率搅拌3～5分种，得到发酵液；其中，所述扩繁菌种的接种量每升液体培养基大于5个菌落形成单位，所述通气为在培养的前两天通空气量20～25mL/L·min，第3天通空气量30～50mL/L·min，第4天以后通空气量75～100mL/L·min；
3)选用谷壳、小麦颖壳、豆荚、高纤维含量的作物秸秆、高木质素含量有机原料、蛭石或珍珠岩作为载体材料，将所述载体材料粉碎至0.25～0.50mm并用塑料薄膜覆盖，取过氧乙酸对载体材料熏蒸灭菌，灭菌后揭去塑料薄膜，将灭菌后的载体材料置于开放环境中翻抛，以除去载体材料中残留的过氧乙酸；
4)对与步骤2)相同的液体培养基灭菌处理，将灭菌冷却后的液体培养基与步骤2)得到的发酵液按照2～10：1的体积比混合均匀为混合液，将所述混合液添加入步骤3)处理后的载体材料中，混合均匀得到混合料，在所述混合料上覆盖塑料薄膜并堆制20～30天，制得所述寡雄腐霉菌肥；其中，所述载体材料与所述混合液的质量体积比为1000kg：350～400L；堆制过程中每隔8～12天对所述混合料翻堆处理1次。
本发明还提供上述制备方法制得的寡雄腐霉菌肥用于促进作物生长、抑制植物真菌病害方面的应用。
相比现有技术，本发明具有如下优点：
1、本发明通过改进培养基组成，优化培养条件和生产工艺，对寡雄腐霉菌种或寡雄腐霉卵孢子制剂固体扩繁和液体发酵的方式，大量生产出富含寡雄腐霉卵孢子和菌丝的菌体液体发酵液，并将液体发酵液与载体材料混合、堆制处理，大规模生产出具有促进植物生长且抑制真菌病害的多功能菌肥，该菌肥中有效活菌数量多，具有良好的应用效果。
2、本发明菌肥可促进植物生长，促进植物生长量一般超过7.0％；且能防治疫霉属、灰霉菌属、轮枝菌属、格链孢属、葡萄孢属、丝核病菌属、腐霉属等病原真菌引起的植物真菌病害，防治效果60％左右，促生防病效果优于现有技术卵孢子制剂，且克服了现有微生物制剂功能单一的缺陷，取得了意想不到的技术效果。
3、本发明寡雄腐霉菌肥制备方法低廉且易于操作，易于大规模生产，生产的菌肥成本低，没有价格压力，可以广泛应用于农作物、果蔬生产并大量使用。
4、本发明菌肥中有效活菌数量多，施用到土壤中后受农田环境干扰小，具有稳定性好、受环境影因素影响小等特点，且克服现有微生物菌剂不稳定的缺陷。
5、本发明菌肥安全无毒、人畜无毒，不会污染环境，且不会对施肥人员和消费者造成健康影响，安全性能更好；本发明菌肥还具有储运施用方便的优点，易于推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
本发明选用自主分离获得的、兼具促生防病的寡雄腐霉优良菌株(PythiumoligandrumCQ2010)[保存在重庆市北碚西南大学资源环境学院植物营养实验室]或北京比奥瑞生物科技有限公司从捷克引进的“多利维生·寡雄腐霉”卵孢子制剂(菌株：Pythiumoligandrum DV74，在中国农业部登记号：LS20091213)。
实施例1
一、一种寡雄腐霉菌肥的制备方法，包括如下步骤：
(1)固体扩繁菌种：
1)采用自主分离的寡雄腐霉菌种进行固体扩繁菌种：用自来水配制固体培养基(pH6.3)，使配制的培养基中含有2.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/L KH2PO4，1.0g/L MgSO4,0.5g/LCaCl2,0.5g/L天门冬酰胺，20.0g/L葡萄糖，0.2g/L维生素B1，2mL/L微量元素混合液[每1L水溶液含5.0mg MnSO4,5.0mg FeSO4,3.0mg H3BO3,2.0mg ZnCl2，0.3mgCuSO4,0.25mg(NH4)2MoO4]，20g/L琼脂。
2)将配置的固体培养基于121℃、1.5大气压蒸汽灭菌30分钟，冷却至45℃，取直径5cm培养皿，倒入5mL灭菌后的培养基，冷却至室温。取培养皿保存的寡雄腐霉菌种Pythiumoligandrum CQ2010，沿菌落边沿挑取菌丝，接种于固体培养基表面，于25℃暗培养7天备用。得到的扩繁菌种还可以3±1℃的冰箱中暗保存60～70天后作为母钟再次转接。
(2)液体发酵
1)配制1000L液体培养基(用自来水配制培养基，培养基中含有2.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/L KH2PO4，1.0g/L MgSO4,0.5g/L CaCl2,0.5g/L天门冬酰胺，20.0g/L葡萄糖，0.2g/L维生素B1，2mL/L微量元素混合液[每1L水溶液含5.0mg MnSO4,5.0mg FeSO4,3.0mg H3BO3,2.0mg ZnCl2，0.3mg CuSO4,0.25mg(NH4)2MoO4])，置于1吨的发酵罐中，121℃、1.5大气压蒸汽灭菌30分钟，冷却至30±1℃。
2)取固体扩繁的菌种，用接种环将菌落连同培养基切成长宽为2mm小块，接种于发酵罐中的液体培养基中(接种量：每升大于10个菌落形成单位)。在通气(第1-2天：25毫升/升·分钟；第3天：50毫升/升·分钟；第4-5天：75毫升/升·分钟)、搅拌(40转/分)、恒温(27℃±1℃)条件下培养120小时后，700转/分搅拌4分种，得到液体发酵液。
(3)固体菌肥生产：
1)将17吨锯末粉碎至于0.3mm，用质量浓度20％过氧乙酸熏蒸锯末灭菌(每立方米锯末使用1.5g过氧乙酸)1小时，将灭菌后的锯末置于开放条件，每小时翻抛2次，共翻抛5次。
2)取灭菌冷却的液体培养基(用自来水配制培养基，培养基中含有2.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/LKH2PO4，1.0g/LMgSO4,0.5g/L CaCl2,0.5g/L天门冬酰胺，20.0g/L葡萄糖，0.2g/L维生素B1，2mL/L微量元素混合液[每1L水溶液含5.0mg MnSO4,5.0mg FeSO4,3.0mg H3BO3,2.0mg ZnCl2，0.3mg CuSO4,0.25mg(NH4)2MoO4])和步骤(2)制得的发酵液，按5：1混合(体积比)，得到混合液。向步骤1)灭菌并翻抛好的锯末中加入混合液，17吨锯末加混合液5950L混合均匀得到混合料，将混合料在混泥土地面堆置成长条状(底部宽1.0m、高0.4m)，覆盖塑料薄膜，每隔5天翻堆1次，堆制20天，锯末间长满寡雄腐霉菌丝，生产出寡雄腐霉多功能菌肥。
二、寡雄腐霉菌肥的制备方法的应用：
将本实施例生产出的寡雄腐霉多功能菌肥用于烤烟种植中，在移栽时每株施用本实施例生产出的寡雄腐霉多功能菌肥150g(相当于每亩施用165kg)。移栽后75天统计，黑胫病发病率降低61.50％，防治效果72.54％；健康烟株生物量提高12.15％，烟叶亩产增加24.52％。
实施例2
一、一种寡雄腐霉菌肥的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用“多利维生·寡雄腐霉”卵孢子制剂进行固体扩繁：
1)由卵孢子制剂获得寡雄腐霉菌种：
培养基选用pH 5.5的改进马丁氏琼脂培养基，溶剂为水并包括如下浓度的溶质组分：20g/L琼脂、1.5g/L(NH4)2SO4、0.5g/LKH2PO4、0.5g/L MgSO4、0.25g/L CaCl2、0.25g/L天门冬酰胺，10.0g/L葡萄糖、0.1g/L维生素B1、1mL/L微量元素混合液；所述微量元素混合液的溶剂为水，并包括如下浓度的溶质组分：2.5mg/LMnSO4、2.5mg/LFeSO4、1.5mg/L H3BO3、1.0mg/LZnCl2、0.15mg/L CuSO4和0.15mg/L(NH4)2MoO4，100℃溶化摇匀，取5mL培养基于25mL试管中，121℃蒸汽灭菌30分钟，冷却至45℃，每支试管加入16.5μL 1％孟加拉红无菌水溶液和15μL 1％链霉素无菌水液摇匀，随后倾斜放置制备斜面。
2)将“多利维生·寡雄腐霉”卵孢子制剂用无菌水稀释103～105倍，接种入上述制备的培养基斜面上，于25℃暗培养10～12天，挑选出寡雄腐霉菌丝，将挑选出的寡雄腐霉菌丝接种于上述培养基(20g/L琼脂、1.5g/L(NH4)2SO4、0.5g/LKH2PO4、0.5g/LMgSO4、0.25g/LCaCl2、0.25g/L天门冬酰胺，10.0g/L葡萄糖、0.1g/L维生素B1、1mL/L微量元素混合液；所述微量元素混合液的溶剂为水，并包括如下浓度的溶质组分：2.5mg/LMnSO4、2.5mg/L FeSO4、1.5mg/L H3BO3、1.0mg/L ZnCl2、0.15mg/L CuSO4和0.15mg/L(NH4)2MoO4，pH5.5)，于25℃暗培养10～12天扩繁菌丝，在3-5℃条件下菌丝种可保存3个月，多代扩繁，长期自主保存可做为菌种。
3)扩繁菌种：在进行液体发酵时，取出步骤2)扩繁后保存的菌种，接种于培养基(20g/L琼脂、1.5g/L(NH4)2SO4、0.5g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4、0.25g/L CaCl2、0.25g/L天门冬酰胺，10.0g/L葡萄糖、0.1g/L维生素B1、1mL/L微量元素混合液；所述微量元素混合液的溶剂为水，并包括如下浓度的溶质组分：2.5mg/LMnSO4、2.5mg/LFeSO4、1.5mg/L H3BO3、1.0mg/L ZnCl2、0.15mg/L CuSO4和0.15mg/L(NH4)2MoO4，pH5.5)中于25℃暗培养10～12天扩繁(此过程同本申请人的发明专利“寡雄腐霉发酵液的制备方法”，专利号：ZL201210332611.7)。
(2)液体发酵
1)配制1000L液体培养基(用自来水配制培养基，培养基中含有2.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/L KH2PO4，1.0g/L MgSO4,0.5g/L CaCl2,0.5g/L天门冬酰胺，20.0g/L葡萄糖，0.2g/L维生素B1，2mL/L微量元素混合液[每1L水溶液含5.0mg MnSO4,5.0mg FeSO4,3.0mg H3BO3,2.0mg ZnCl2，0.3mg CuSO4,0.25mg(NH4)2MoO4])，置于1吨的发酵罐中，121℃、1.5大气压蒸汽灭菌30分钟，冷却至30±1℃。
2)取固体扩繁的菌种，将菌落连同培养基切成长宽为2mm小块，接种于发酵罐中的液体培养基中(接种量：每升大于50个菌落形成单位)。在通气(第1-2天：25毫升/升·分钟；第3天：50毫升/升·分钟；第4-5天：75毫升/升·分钟)、搅拌(40转/分)、恒温(27℃±1℃)条件下培养120小时后，700转/分搅拌4分种，得到液体发酵液。
(3)固体菌肥生产：
1)将17吨小麦颖壳粉碎至于0.3mm，用质量浓度20％过氧乙酸熏蒸灭菌(每立方米锯末1.5g过氧乙酸)1小时，将灭菌后的锯末置于开放条件，每小时翻抛2次，共翻抛5次。
2)取灭菌冷却的液体培养基(用自来水配制培养基，培养基中含有2.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/LKH2PO4，1.0g/LMgSO4,0.5g/L CaCl2,0.5g/L天门冬酰胺，20.0g/L葡萄糖，0.2g/L维生素B1，2mL/L微量元素混合液[每1L水溶液含5.0mg MnSO4,5.0mg FeSO4,3.0mg H3BO3,2.0mg ZnCl2，0.3mg CuSO4,0.25mg(NH4)2MoO4]和步骤(2)制得的发酵液，按5：1混合(体积比)，得到混合液。向步骤1)灭菌并翻抛好的小麦颖壳中加入混合液，17吨小麦颖壳加混合液5950L混合均匀得到混合料，将混合料在混泥土地面堆置成长条状(底部宽1.0m、高0.4m)，覆盖塑料薄膜，每隔5天翻堆1次，堆制24天，小麦颖壳间长满寡雄腐霉菌丝，生产出寡雄腐霉多功能菌肥。
二、寡雄腐霉菌肥的制备方法的应用：
将本实施例生产出的寡雄腐霉多功能菌肥用于烤烟种植，在移栽时每株施用本实施例生产出的寡雄腐霉多功能菌肥150g(相当于每亩施用165kg)。移栽后75天统计，黑胫病发病率降低60.1％，防治效果64.15％；健康烟株生物量提高9.05％，烟叶亩产增加15.27％。
实施例3
一、一种寡雄腐霉菌肥的制备方法，包括如下步骤：
(1)固体扩繁菌种：
1)采用自主分离的寡雄腐霉菌种进行固体扩繁菌种：用自来水配制固体培养基(pH6.35)，使配制的培养基中含有1.0g/L(NH4)2SO4，0.5g/LKH2PO4，0.5g/L MgSO4,0.25g/LCaCl2,0.25g/L天门冬氨酰胺，10.0g/L葡萄糖,0.1g/L维生素B1，1mL/L微量元素混合液[每1L水溶液含5.0mg MnSO4,5.0mg FeSO4,3.0mg H3BO3,2.0mg ZnCl2，0.3mg CuSO4,0.25mg(NH4)2MoO4]，20g/L琼脂。
2)将配置的固体培养基于121℃、1.5大气压蒸汽灭菌30分钟，冷却至45～50℃，取直径5～7cm培养皿，倒入5～8mL灭菌后的培养基，冷却至室温。取培养皿保存的寡雄腐霉菌种Pythium oligandrum CQ2010，沿菌落边沿挑取菌丝，接种于固体培养基表面，于25℃暗培养10天备用。
(2)液体发酵：
1)配制液500L体培养基(用自来水配制培养基，培养基中含有2.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/LKH2PO4，1.0g/L MgSO4,0.5g/L CaCl2,0.5g/L天门冬酰胺，20.0g/L葡萄糖，0.2g/L维生素B1，2mL/L微量元素混合液[每1L水溶液含5.0mg MnSO4,5.0mg FeSO4,3.0mgH3BO3,2.0mgZnCl2，0.3mg CuSO4,0.25mg(NH4)2MoO4]，置于发酵罐中，121℃、1.5大气压蒸汽灭菌30分钟，冷却至30±1℃备用。
2)取出固体扩繁的菌种，将菌落连同培养基切成长宽为2.5mm小块，接种于发酵罐中的液体培养基中(每升大于100个菌落形成单位)。在通气(第1-2天：25毫升/升·分钟；第3天：50毫升/升·分钟；第4-5天：75毫升/升·分钟)、搅拌(60转/分)、恒温(27℃±1℃)条件下培养120小时后，800转/分搅拌3分钟，得到液体发酵液。
(3)固体菌肥生产
1)将8.5吨玉米秸秆粉碎至于0.4mm，用质量浓度15％过氧乙酸熏蒸灭菌(每立方米锯末1.5g过氧乙酸)2小时，将灭菌后的锯末置于开放条件，每小时翻抛3次，共翻抛6次，挥发残余的过氧乙酸。
2)取灭菌冷却的液体培养基(用自来水配制培养基，培养基中含有2.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/LKH2PO4，1.0g/LMgSO4,0.5g/L CaCl2,0.5g/L天门冬酰胺，20.0g/L葡萄糖，0.2g/L维生素B1，2mL/L微量元素混合液[每1L水溶液含5.0mg MnSO4,5.0mg FeSO4,3.0mg H3BO3,2.0mg ZnCl2，0.3mg CuSO4,0.25mg(NH4)2MoO4])和步骤(2)制得的发酵液，按5：1混合(体积比)，得到混合液。向步骤1)灭菌并翻抛好的锯末中加入混合液，8.5吨玉米秸秆加混合液3400L混合均匀得到混合料，将混合料在垫有塑料薄膜的地面堆置成长条状(底部宽0.8m、高0.3m)，覆盖塑料薄膜，每隔6天翻堆1次，堆制24天，锯末间长满寡雄腐霉菌丝，生产出寡雄腐霉多功能菌肥。
二、寡雄腐霉菌肥的制备方法的应用：
将本实施例生产出的寡雄腐霉多功能菌肥用于大棚辣椒种植，移栽时每穴施用本实施例生产出的寡雄腐霉多功能菌肥75g(相当于每亩105kg)，结果统计盛果期黄萎病发病率降低64.50％，防治效果76.54％，辣椒植株生物量增加14.56％，果实产量提高9.15％。
实施例4
固体扩繁菌种和液体发酵步骤同实施例3，不同之处在于(3)固体菌肥生产步骤，具体如下：
1)将8.5吨锯末粉碎至于0.4mm，用质量浓度15％过氧乙酸熏蒸灭菌(每立方米锯末1.5g过氧乙酸)2小时，将灭菌后的锯末置于开放条件，每小时翻抛3次，共翻抛6次，挥发残余的过氧乙酸。
2)取灭菌冷却的液体培养基(用自来水配制培养基，培养基中含有2.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/LKH2PO4，1.0g/LMgSO4,0.5g/L CaCl2,0.5g/L天门冬酰胺，20.0g/L葡萄糖，0.2g/L维生素B1，2mL/L微量元素混合液[每1L水溶液含5.0mg MnSO4,5.0mg FeSO4,3.0mg H3BO3,2.0mg ZnCl2，0.3mg CuSO4,0.25mg(NH4)2MoO4])和步骤(2)制得的发酵液，按5：1混合(体积比)，得到混合液。向步骤1)灭菌并翻抛好的锯末中加入混合液，8.5吨锯末加混合液3400L混合均匀得到混合料，将混合料在垫有塑料薄膜的地面堆置成长条状(底部宽0.8m、高0.3m)，覆盖塑料薄膜，每隔6天翻堆1次，堆制24天，锯末间长满寡雄腐霉菌丝，生产出寡雄腐霉多功能菌肥。
将本实施例生产出的寡雄腐霉多功能菌肥用于石榴种植，沿成龄石榴树冠滴水线开沟，每株施用本实施例生产出的寡雄腐霉多功能菌肥5000g，结果统计当年枯萎病发病率降低60.75％，防治效果67.1％，果实产量提高18.75％。
实施例5
固体扩繁菌种和液体发酵步骤同实施例3，不同之处在于(3)固体菌肥生产步骤，具体如下：
1)将8.5吨谷壳粉碎至于0.4mm，用质量浓度15％过氧乙酸熏蒸灭菌(每立方米谷壳1.5g过氧乙酸)2小时，将灭菌后的谷壳置于开放条件，每小时翻抛3次，共翻抛6次，挥发残余的过氧乙酸.
2)取灭菌冷却的液体培养基(用自来水配制培养基，培养基中含有2.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/LKH2PO4，1.0g/LMgSO4,0.5g/L CaCl2,0.5g/L天门冬酰胺，20.0g/L葡萄糖，0.2g/L维生素B1，2mL/L微量元素混合液[每1L水溶液含5.0mg MnSO4,5.0mg FeSO4,3.0mg H3BO3,2.0mg ZnCl2，0.3mg CuSO4,0.25mg(NH4)2MoO4])和步骤(2)制得的发酵液，按5：1混合(体积比)，得到混合液。向步骤1)灭菌并翻抛好的锯末中加入混合液，8.5吨谷壳加混合液2975L混合均匀得到混合料，将混合料在垫有塑料薄膜的地面堆置成长条状(底部宽0.8m、高0.3m)，覆盖塑料薄膜，每隔6天翻堆1次，堆制24天，蛭石间长满寡雄腐霉菌丝，生产出寡雄腐霉多功能菌肥。
将本实施例生产出的寡雄腐霉多功能菌肥用于1年生幼龄石榴树时，距离树干30cm开沟，每株施用本实施例生产出的寡雄腐霉多功能菌肥2000g，结果统计当年枯萎病发病率降低62.14％，防治效果68.16％；与不施用菌肥相比，株高增加7.5％。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种寡雄腐霉菌肥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取寡雄腐霉菌种或寡雄腐霉卵孢子在固体培养基上进行固体扩繁，得到扩繁菌种；
2)对液体培养基进行灭菌后冷却至29～31℃，将步骤1)得到的扩繁菌种接种于灭菌后的液体培养基中，在24～28℃、20～40转/分搅拌的条件下通气培养72～144小时后，以600～800转/分的搅拌速率搅拌3～5分种，得到发酵液；其中，所述扩繁菌种的接种量每升液体培养基大于5个菌落形成单位，所述通气为在培养的前两天通空气量20～25mL/L·min，第3天通空气量30～50mL/L·min，第4天以后通空气量75～100mL/L·min；
3)选用谷壳、小麦颖壳、豆荚、高纤维含量的作物秸秆、高木质素含量有机原料、蛭石或珍珠岩作为载体材料，将所述载体材料粉碎至0.25～0.50mm并用塑料薄膜覆盖，取过氧乙酸对载体材料熏蒸灭菌，灭菌后揭去塑料薄膜，将灭菌后的载体材料置于开放环境中翻抛，以除去载体材料中残留的过氧乙酸；
4)对与步骤2)相同的液体培养基灭菌处理，将灭菌冷却后的液体培养基与步骤2)得到的发酵液按照2～10：1的体积比混合均匀为混合液，将所述混合液添加入步骤3)处理后的载体材料中，混合均匀得到混合料，在所述混合料上覆盖塑料薄膜并堆制20～30天，制得所述寡雄腐霉菌肥；其中，所述载体材料与所述混合液的质量体积比为1000kg：350～400L；堆制过程中每隔8～12天对所述混合料翻堆处理1次。
2.根据权利要求1所述寡雄腐霉菌肥的制备方法，其特征在于，步骤1)中取寡雄腐霉菌种进行固体扩繁的具体步骤为：
A、配制pH 5.5～6.5的改进马丁氏(Martin)琼脂培养基，所述培养基溶剂为水并包括如下浓度的溶质组分：15～20g/L琼脂、1.0～2.0g/L(NH4)2SO4、0.5～1.0g/L KH2PO4、0.5～1.0g/L MgSO4、0.25～0.5g/L CaCl2、0.25～0.5g/L天门冬酰胺，10.0～20.0g/L葡萄糖、0.1～0.2g/L维生素B1和1～2mL/L微量元素混合液；所述微量元素混合液的溶剂为水，并包括如下浓度的溶质组分：2.5～7.5mg/L MnSO4、2.5～7.5mg/L FeSO4、1.5～4.5mg/L H3BO3、1.0～3.0mg/LZnCl2、0.15～0.45mg/L CuSO4和0.15～0.3mg/L(NH4)2MoO4；
B、对步骤A配制的改进马丁氏(Martin)琼脂培养基进行灭菌处理后冷却至45～50℃，将寡雄腐霉菌种接种于灭菌冷却后的培养基表面，于20～35℃下暗培养7～10天，得到扩繁菌种。
3.根据权利要求1所述寡雄腐霉菌肥的制备方法，其特征在于，步骤1)中取寡雄腐霉卵孢子进行固体扩繁的具体步骤为：
a、配制pH5.5～6.0的改进马丁氏琼脂培养基，所述培养基溶剂为水并包括如下浓度的溶质组分：15～20g/L琼脂、1.0～2.0g/L(NH4)2SO4、0.5～1.0g/LKH2PO4、0.5～1.0g/LMgSO4、0.25～0.5g/L CaCl2、0.25～0.5g/L天门冬酰胺，10.0～20.0g/L葡萄糖、0.1～0.2g/L维生素B1和1～2mL/L微量元素混合液；所述微量元素混合液的溶剂为水，并包括如下浓度的溶质组分：2.5～7.5mg/LMnSO4、2.5～7.5mg/L FeSO4、1.5～4.5mg/L H3BO3、1.0～3.0mg/L ZnCl2、0.15～0.45mg/L CuSO4和0.15～0.3mg/L(NH4)2MoO4；
b、对步骤a配制的改进马丁氏琼脂培养基进行灭菌处理后冷却至45～50℃，向灭菌冷却后的改进马丁氏琼脂培养基中加入孟加拉红和链霉素混合均匀，倾斜放置制备培养基斜面；
c、取用无菌水稀释102～105倍的寡雄腐霉卵孢子制剂接种于步骤b制备的培养基斜面上，于20～35℃下暗培养7～12天，以获得寡雄腐霉菌丝；
d、步骤c斜面培养后挑选出寡雄腐霉菌丝，按照与步骤a、b相同的方法制备改进马丁氏琼脂培养基斜面，将挑选出的寡雄腐霉菌丝接种于培养基斜面上，于20～35℃下暗培养10～12天扩繁菌丝；
e、按照与步骤a、b相同的方法制备改进马丁氏琼脂培养基斜面，将步骤d扩繁菌丝接种于所述培养基斜面上，于20～35℃下暗培养10～12天再次扩繁菌丝，得到扩繁菌种。
4.根据权利要求1所述寡雄腐霉菌肥的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述液体培养基溶剂为水，并包括如下浓度的溶质组分：1.0～2.0g/L(NH4)2SO4、0.5～1.0g/L KH2PO4、0.5～1.0g/L MgSO4、0.25～0.5g/L CaCl2、0.25～0.5g/L天门冬酰胺，10.0～20.0g/L葡萄糖、0.1～0.2g/L维生素B1和1～2mL/L微量元素混合液；所述微量元素混合液的溶剂为水，并包括如下浓度的溶质组分：2.5～7.5mg/L MnSO4、2.5～7.5mg/L FeSO4、1.5～4.5mg/L H3BO3、1.0～3.0mg/L ZnCl2、0.15～0.45mg/L CuSO4和0.15～0.3mg/L(NH4)2MoO4。
5.根据权利要求1所述寡雄腐霉菌肥的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述高纤维含量的作物秸秆为玉米秸秆、水稻秸秆、小麦秸秆、大豆秸秆或高粱秸秆；高木质素含量有机原料为锯末。
6.根据权利要求1所述寡雄腐霉菌肥的制备方法，其特征在于，步骤3)中取质量浓度15～20％的过氧乙酸溶液对载体材料熏蒸灭菌2～3h；所述翻抛为每小时翻抛2～3次，共翻抛5～6次。
7.如权利要求1～6任一所述制备方法制得的寡雄腐霉菌肥用于促进作物生长、抑制植物真菌病害方面的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，在用于农作物或蔬菜种植时，将所述寡雄腐霉菌肥作为基肥施用，施用量为75～180kg/亩土壤。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，在用于成龄果树种植时，沿果树树冠滴水线处土壤开沟，开沟深度为20～40cm，在沟内施用所述寡雄腐霉菌肥，施用量为2.5～10kg每株果树，施肥后用土将施用的寡雄腐霉菌肥覆盖住。
10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，在用于幼龄果树种植时，则在距离幼龄果树树干20～40cm土壤处开沟，开沟深度为10～20cm，在沟内施用所述寡雄腐霉菌肥，施用量为2～5kg每株果树，施肥后用土将施用的寡雄腐霉菌肥覆盖住。
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