CN110072392A - 含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品和制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品，其含有寡雄腐霉微生物的稳定悬浮液，稳定悬浮液含有0.05％重量至10.0％重量的寡雄腐霉微生物的培养生物质，培养生物质具有培养基、细胞形态的该微生物和由该微生物产生的物质，以及90.0％重量至99.95％重量的稳定剂，其中，在正常标准化之后，预定的1ml该液体生物抗真菌制品中的休眠卵孢子的数量范围为1×103至2×107。一种含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品，所述液体生物抗真菌制品含有寡雄腐霉微生物的稳定悬浮液，悬浮液含有0.05％重量至10.0％重量的寡雄腐霉微生物的培养生物质，培养生物质具有培养基、细胞形态的该微生物和由该微生物产生的物质，以及79.77％重量至99.95％重量的稳定剂，以及剩余物，至100％重量，选自填充物、香料和维生素中的至少一种改性/应用物质；其中，在正常标准化之后，预定的1ml该液体生物抗真菌制品中的休眠卵孢子的数量范围为2.5×104至1.0×106。寡雄腐霉微生物是寡雄腐霉Dreschler ATTC 38472菌株，其保藏在布尔诺的Masaryk大学的捷克微生物保藏中心(CCM)中的寡雄腐霉M1名目下。稳定剂可以是水、盐溶液、油或渗透物的浓缩溶液。要求保护该液体生物抗真菌制品的制备方法。

Description

含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品和制备方法
技术领域
本发明涉及含有寡雄腐霉(Pythium oligandurm)微生物的液体生物抗真菌制品。
本发明还涉及产生该制品的方法。
背景技术
近几十年来，化学抗真菌制品从它们对环境的负面影响以及实质上对使用者负面影响的角度引起了越来越多的担忧。尽管如此，可以说将这些制品替代为基于能够以有针对性和周到的方式消除霉菌的微生物的有效生物制品并未达到所期待的程度。尽管研究非常深入，目前只有14种微生物类型在欧盟国家注册用于此目的，正如Gerbore等人[1]在2014年最近发表的文章中所强调的那样。
自20世纪70年代以来，已经知道使用寡雄腐霉微生物的抗真菌作用的生物制品的实际应用，就此我们在此可以参考Dreschler[2]在1943年和Deacon[3]在1976年致力于这种微生物的生物学和描述其真菌寄生性质的经典工作。从那时起，我们拥有专利US 4,259,317[4]，作者Vesely和Hejdánek，优先日期为1978年7月5日，以致力于研究含有寡雄腐霉Dreschler卵孢子的干粉制品，用于防止甜菜芽发生与霉菌有关的疾病，甜菜芽具有每克制品至少100万个卵孢子的卵孢子含量，其中每克制品5千万至5亿个卵孢子的量被指定为最佳水平。作为干粉制品的适用替代品，此发明的作者接受卵孢子的液体悬浮液，但为它们制备的应用指出了许多缺点，特别是这些制品的不稳定性，将它们的实际应用限制在约2周。在较长一段时间后，卵孢子的出现因为自溶或由重寄生物污染而不可接受地减少，而卵孢子对于寄生保护机制的应用是必不可少的。就个体菌株寡雄腐霉的来源而言，作者Baker和Lifshitz在其专利US 4,574,083[5]中指出了根据标准公开方法通过从土壤中分离获得区域合适菌株的可能性。此过程已被证明是正确的，并且来自不同地理位置的菌株现在可在公共保藏中获得。当时主要应用以下生物学标准来鉴定分离株：生长速度、最佳生长温度-通常约30℃、以及有性和无性循环的个体再生形式的形态。从这个角度来看，随后的专利可以被认为是开创性的；在此，发明人Martin在US 5,961,971[6]中介绍了基于关键基因的精确顺序方案的个体分离株的分子特征。在同一专利文献中详细给出了在田间条件下应用寡雄腐霉微生物的个体制剂和方法，其中液体制剂随后在基于工业废料的廉价培养基上生长并且通过将生物质包封制备成粉末制剂，所述生物质在发酵后干燥以成为海藻酸盐或以干燥和研磨制品的形式作为优选的制剂被提及。可湿性粉剂、标准粉末、乳化油和颗粒形式的制剂是其他可能的制剂。专利CZ 303 908和相应的EP 2 503 892[7](捷克公司，2009年)重点关注使用寡雄腐霉微生物对作物的收获后保护。在技术部分，它专注于在具有谷物含量的液体培养基上在标准发酵罐中培养该微生物，而不添加其他营养素。增加了获得纯的卵孢子浓缩物的可能性，而不存在排出的培养基或菌丝体的残留物，其在制备过程的后期阶段在喷雾干燥炉中干燥期间被除去。已经有限程度地公开了关于除了寡雄腐霉以外的生物体的卵孢子的制备的知识。在专利申请CN 102 807957A[8](Liu X.等人，2012年)中描述了辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)微生物的新兴卵孢子的制备，以监测对各种药物的抗性和用于遗传研究。用于植物的生物学保护的液体制品在专利申请US 2014/0212387[9](Lüth，2014年)中详述，尽管这些仅是使用改性三硅氧烷的聚醚作为溶剂的液体制品。
在非专利文献中也在一定程度上讨论了卵孢子和其他再生形式的微小寡雄腐霉卵菌(oomycete)的制备和稳定。在1990年，McQuilken等人[10]公开了一种使用糖蜜作为经济上可负担的基质在液体培养基中制备卵孢子的简单且可重复的方法。然而，在专利或非专利文献中尚未令人满意地解决保存制备的卵孢子的理想方法的问题。在1992年，McQuilken等人[11]通过与由土壤提取物在-0.5MPa下施加渗透压进行比较，观察了不同渗透物(如甘油、NaCl和KCI)对菌丝径向延伸速度和寡雄腐霉卵菌的卵孢子出现的影响。渗透物的添加降低了径向延伸的速度，但对约-2.0MPa的值的出现没有影响。作者得出结论，在满足最佳温度(通常为30℃)和pH为6.0到7.5的酸度的条件下，在应用位置的正常发生的渗透条件下，可以预期应用的卵孢子的良好效果。从获得的卵孢子的可储存性的角度来看，作者Takenaka和Ishikawa[12]在2013年提到了它们在正常制备的4℃冰箱中保存的蒸馏水悬浮液中的高效期限达379天。
根据专家，生物防御制品更广泛传播的主要障碍显然是有效性对特定应用条件的依赖性以及在日常农业工作中保存和制备生物制品以保护植物的实际问题。因此，解决与寡雄腐霉卵孢子的简单且有效储存和应用相关的实际问题对于生物制品的商业成功至关重要。为了解决这个问题，希望开发液态生物保护方式，其即使在标准储存条件下也具有高的长期稳定性。然而，到目前为止公开的解决方案存在许多缺点，即使经过多年的着重努力，这些缺点仍未成功消除。实验室制备用于保护植物的生物制剂的大多数过程是复杂的并且仅在实验室水平上可管理，这显著限制了将这种过程用于工业制造。直到现在，优选的应用方法为可湿性粉末的形式(其被应用于捷克生物技术公司Biopreparáty制造的制品(Polygandron、)并在全球范围内销售)，其无论从针对防御性干预还是保护使用者的角度都有其自身的并发症。到目前为止，还没有公开一种简单的、经过充分测试的和一致定义的方法用于具有足够的制备再生形式的寡雄腐霉微生物或卵孢子的可存储性的为可以在工业中容易地使用的形式的制剂。
发明内容
到目前为止应用的生物抗真菌制品的具体缺点在本发明中被消除或限制，本发明的实质是含有根据独立权利要求1的寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品，其包括稳定的寡雄腐霉悬浮液，并含有0.05％至10.0％重量的寡雄腐霉微生物的培养生物质，所述培养生物质具有培养基、细胞形态的该微生物和由该微生物产生的物质；以及90.0％至99.95％重量的稳定剂；其中，在正常标准化(normal standardization)之后，1ml的所述液体生物抗真菌制品中的休眠卵孢子的预定数量为1×103至2×107。
根据本发明的第二独立权利要求的含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品的实质是基于如下事实：
其包括稳定的寡雄腐霉悬浮液并含有：0.05％至10.0％重量的寡雄腐霉微生物的培养生物质，所述生物培养质含有培养基、细胞形态的该微生物和由该微生物产生的物质；79.77％至99.95％重量的稳定剂；剩余物，至100％重量，选自填充物、香料、维生素E中的至少一种改性/应用物质；其中，在正常标准化之后，1ml所述液体生物抗真菌制品中的休眠卵孢子的预定数量为2.5×104至1.0×106。
优选的是寡雄腐霉微生物的寡雄腐霉Dreschler ATTC 38472菌株，其保藏在布尔诺的Masaryk大学的捷克微生物保藏中心(CCM)中的寡雄腐霉M1名目下。
本发明的主要优点是新型液体生物抗真菌制品，其适于长期使用并实现其长期和显著的稳定效果，由此所使用的稳定剂是可承受的并且提供了保护寡雄腐霉微生物的所含生物质免受微生物污染的进一步优势。要求保护的以卵孢子形式的上述指定的微生物的休眠细胞含量提供了实际测试且经济上可承受的范围，这有利于简单施加以提供广泛的所需应用。其可以使用合适的制备方法来处理使用不同类型的生物质。较低浓度的休眠卵孢子(例如数十或数百个休眠卵孢子)也会带来效果，尽管该制品的有效性较低。如果需要，可以通过正常标准化即通过稀释或浓缩至所需值来调节预定数量的休眠卵孢子。
当稳定剂含有选自包括水、盐溶液、油或渗透物溶液的至少一种组分时是有利的，渗透物可以是糖或糖醇类的多元醇溶液、或盐溶液。多元醇溶液可选自含有最多10个糖单元和最少2个糖单元的各种寡糖的可代谢或不可代谢的溶液，糖单元例如为麦芽十糖或麦芽九糖或麦芽八糖或麦芽七糖或麦芽六糖或麦芽五糖或水苏糖或棉子糖(rafinose)或蔗糖或三氯蔗糖，或者可以使用支链糖。
在理想的实施中，稳定剂是量例如为30.0％至99.9％重量的水，或者量例如为99.9％重量的盐溶液，或者量例如为60.0％至64.95％重量的蔗糖形式的渗透物，或量例如为79.77％至99.9％重量的选自石蜡油、矿物油、甘油、向日葵油的至少一种油。
液体生物抗真菌制品可以包含用于特定使用领域的其他改性或应用物质，例如缓释的可生物降解的基质，例如寡雄腐霉微生物的卵孢子的载体，例如量例如为16.0％重量的聚乙烯醇；或基于氧化硅的量例如为16.0％重量的填充物；或其他应用/改性物质，例如量例如为0.96％重量的鼠尾草或薄荷香料，或量例如为0.4％重量的维生素E。
这些应用/改性物质的使用取决于生物抗真菌制品的应用。
因此，寡雄腐霉微生物的卵孢子的稳定悬浮液可以使用多种亲水或疏水性质的稳定剂，例如普通水或油或其他可承受的渗透物的溶液。
渗透物可以通过其化学性质完美地适应所需的应用，因为已经证明渗透物可以具有离子性质，例如不同盐的溶液，或非离子性质的溶液，例如多元醇溶液。多元醇可以由例如不同定义的低聚糖的可代谢或不可代谢的溶液代表的事实对于许多应用是有益的，因为具有所需性质的合适的天然或合成物质的混合物可用于此目的。有利地是也可以使用通常可用的物质如蔗糖，但如果需要，甚至可以使用通常可用的不可代谢的类似物。液体悬浮液的组合物与多种其他物质相溶，这些物质以抗氧化物质、天然活化剂和维生素(例如氧化硅作为填充物)、维生素E乙酸酯和其他物质的形式改变其实用性质或其应用。
有些令人惊讶地发现，如果在制备结束后通过固体或液体培养产生的细胞百分比以悬浮液或浓缩悬浮液的形式存在，如果通常在实验室温度下储存，那么再生形式的寡雄腐霉微生物保持以这样的悬浮液的原始形式持续至少六个月。当考虑已公开的文献中展示的不可重复和可变的结果时，该结果变得更加突出。例如，在文献中陈述了在蒸馏水中制备并储存188或384天的时间段的卵孢子的悬浮液在4℃的冰箱中储存时保留了原始的形式。尽管如此，当在农场的工作条件下甚至可能无法获得4℃的储存温度时，由于完全没有描述制备这种所述制剂的方法，使得几乎不可能评估它们的科学有效性，更不用说实际适用性了。
含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品是使用根据本发明的制备方法获得的，其实质在于如下事实：含有谷物提取物、甘蔗糖蜜和其他必需营养素的液体培养基在蒸汽灭菌器中进行灭菌，所述液体培养基用于在液相中的寡雄腐霉卵菌的有氧培养。冷却后，用一种选定的寡雄腐霉菌株接种。在培养结束后取出并处理生物质，这需要几天，优选13天。在液相中的寡雄腐霉的培养阶段结束后，用液体培养基使生物质均质化，使得悬浮液中最少95％的颗粒在0.050mm和0.300mm之间，优选为0.125mm。将由卵孢子数量表征的均质化悬浮液根据溶液中卵孢子的数量浓缩或稀释至生物抗真菌制品中卵孢子的预定浓度。悬浮液优选在均质化和浓缩或稀释的阶段后过滤。
在用渗透物添加剂均质化期间稳定含水悬浮液，并在低于8℃的温度下储存在大的无菌容器中。
在寡雄腐霉微生物的无水悬浮液的情况下，将培养阶段结束后在固体基质上或在液相中获得的物质均质化，直至达到悬浮液中至少95％的颗粒的值在0.050mm和0.300mm之间，优选为0.125mm。将获得的由卵孢子数量表征的均质悬浮液离心。在去除上清液后，向离心的物质中补充油，以达到预定浓度的卵孢子，用于制备生物抗真菌制品，其数量使得生物抗真菌制品中所得的卵孢子浓度对应于所期望的浓度，并且以这种方式获得的材料随后通过均质化重新悬浮。
所展示的方案似乎是合适的，甚至是从大量简化制备寡雄腐霉微生物的生物技术过程的角度来看也是如此，并因此显著降低了这些制品制造商的运营成本。从制品培养基中过滤或分离培养生物质，将其干燥并随后研磨至所期望的尺寸的颗粒需要对能量和技术要求相对较高、难以控制且易受可能的污染的几个过程，如果不是在精确定义和工业要求严格的条件下进行，这可能(如最终结果)会严重损坏所得制品。相比之下，在渗透物的致密和粘胶溶液中获得的生物质的简单技术上的悬浮液产生非常稳定的制品，其正好适用于一系列实际应用。从实际角度来看，显著有利的是，寡雄腐霉微生物的制备悬浮液可以从培养皿或发酵罐中转移而几乎没有浪费，这样最小化其清洁和维护成本，并还最小化制品泄漏到制备场所的工作环境中的可能性。此外，以这种方式获得的制品即使在常温下储存期间也能长期稳定，这也显著降低了操作成本并使得更容易处理制品。
令人惊讶地还发现，除了渗透物浓缩溶液的稳定效果之外，这种溶液的保存效果(在制备和常规实践中是众所周知的)在检查了微观卵菌寡雄腐霉的卵孢子的悬浮液的特定情况下是显著的。因此，以这种方式储存的制品免受不希望的微生物的污染，即使在极不可能的穿透这种稳定的悬浮液的情况下，也不能在所提出的化学环境中繁殖，并且因此不能污染最终制品。该优点在当前的制备实践中是基本的，特别是考虑到对农药、杀生物剂和化妆品中的意外污染水平的更严格要求。
除了稳定剂的作用和保存物质的作用外，渗透物溶液还起到粘合剂的作用，这一事实可以实际应用于许多应用中，无论是在将稳定的卵孢子悬浮液稀释至通过浸泡施用的最佳浓度的水溶液形式或通过温和分散微观颗粒(所谓的雾化)施用均是如此。在上述所有应用的示例中，多元醇溶液因此有助于有效粘合并随后均匀施用于处理过的区域、植物或作物。
最后，但并非最不重要，必须提到的是，在使用可代谢的渗透物的情况下，这些物质可能作为一种营养物质，其在直接在施用地点的目标地点的聚集和沉降时很重要，因此这是一种重要的营养素，特别是在与卵孢子转变到菌丝形式相关的第一阶段。它们可随后对在施用更复杂性质的营养物质的地方长期生长和保存显微卵菌寡雄腐霉发挥重要的营养素作用，更复杂性质的营养物质的地方以生物技术生长和在生物技术培养期间卵孢子的再生过程中使用的不完全发酵的基质为代表。
根据所提出的方案，悬浮液中卵孢子和其他再生形式的微观卵菌的具体含量与之前测试的和销售的松散制品相比相当或更高，这从以这种方式制得的制品的物流和分销经济学的角度来看是重要的。然而，与先前的方案相比，新制剂还使得使用更低的浓度成为可能。
实际上，已经看到新型液体生物抗真菌制品中与所用的技术方法相关的组合物复杂性显著降低，而这与以这种方式配制的液体制品的功能或有效性的任何限制无关。对新提出的制品的细胞和颗粒组合物而言，这几乎完全需要稳定的卵孢子，其具有非常低百分比的菌丝体碎片、碎谷子和其他组分。这些成分显然不会在浓缩的渗透物产生的致密环境中沉淀，当从其中颗粒的大小的角度来看制备非常不均匀时这令人惊讶地保证了制品的良好均一性，制品的均一性比以含水悬浮液形式使用的可湿性粉末显著更好。这特别适用于迄今为止制备的制品中含有的氧化硅颗粒的情况；相反，在大多数情况下在根据所提交的发明的方案中不存在氧化硅(除牙膏之外，其中它用作研磨剂)。因此，从实际应用的需要来看，在应用制品期间不会堵塞过滤器和其他技术设备。
如果较低量的可代谢渗透物的存在对某些应用是有害的，则可以用化学上类似的不可代谢的渗透物容易地替换它们，而不以任何方式影响制品最重要的性质。
如果从技术角度来看干燥得到的制品更合适，那么在具有高真空值的设备中冷冻干燥(冻干)似乎是合适的，因为在冻干期间使用渗透物的浓缩溶液作为冷冻保护剂和保护性物质是众所周知的并且被广泛使用的。举例来说，指的是在许多敏感应用中广泛用作保护性冷冻保存剂的渗透物，包括例如在2004年Wright[15]的文章中描述的人卵母细胞的冷冻保存。
根据所提交的发明获得的制品的显著优点是这样的制品适用于所有应用，其中看起来使用寡雄腐霉微生物的抗霉菌、抗真菌寄生、激发性和生长的特性是有益的。因此，特别是，该制品作为植物生物杀菌剂，用于人和兽医使用的寡雄腐霉微生物用于破坏生物膜和消除在各种医学诊断情况下发生的生态失调，以及用于保护公众免受在生活和/或工作环境中发生的霉菌。取决于液体悬浮液浓缩物中使用的基质，它可以在可降解的生物聚合物(其作为保护因子和逐渐降解的基质)的存在下用作植物的保护性喷雾，这意味着作为多利维生(Polyversum)材料的“载体”具有活性微生物寡雄腐霉的卵孢子。
使用稳定的浓缩寡雄腐霉微生物的卵孢子悬浮液(包括以未稀释或稀释的形式施用这种稳定的浓缩悬浮液)预防霉菌、真菌、病原菌和酵母，由以下组成：在受到霉菌或真菌或病原菌或治病酵母菌或微生物生态失调影响的区域以未稀释的或稀释的形式施用这种稳定的浓缩的悬浮液，以使得可以定义稳定的液体浓缩物的广泛应用。
在植物保护领域，该组合物可用于提供对霉菌、真菌或病原菌和酵母菌的预防，使得以稀释的或未稀释的形式的将稳定的浓缩悬浮液在收获前或收获后例如在仓库中施用于植物或它们的周围环境或种子或作物或水果；这包括以气溶胶、含有浓缩的悬浮液的自溶性胶囊、植物底部的额外施肥、浸泡作物、喷洒作物、种子处理、对作物喷雾、施肥和额外施肥作为综合肥料的组成部分的形式施用以及以水栽法的形式施用。
当保护口腔时，可以以稀释的或未稀释的形式的稳定的浓缩悬浮液应用于受以下影响的地方：口腔菌斑或牙周病、(特别是糖尿病患者的)被感染的不愈合的伤口的发生、皮肤真菌或酵母相关的感染性疾病的发生和与皮肤和人体表面膜的微生物生态失调有关的其他症状的发生。
为了用于公众保护的用途，可以将以稀释或未稀释形式的稳定的浓缩悬浮液应用于受真菌发生影响的墙壁和砖石上。其他创新的使用领域包括冷却设备、空调、受洪水和暴雨影响的地区以及经常发生寡雄腐霉微生物靶向的真菌的其他地方的抗真菌保护。
附图说明
在示例性实施例中进一步详细描述了本发明，并且在所附的示意图中更详细地解释了本发明。
图1A、图1B、图1C更详细地阐明了不存在寡雄腐霉微生物的植物病原真菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的生长速度和存在该微生物时的比较。
其具体示出：
图1A是植物病原真菌禾谷镰刀菌的菌落自身的生长(正方形)，以及同时接种来自休眠卵孢子和来自液体和固体培养物的寡雄腐霉的植物病原真菌禾谷镰刀菌的菌落生长(星形和三角形)；
图1B是培养皿的照片，其上左侧接种来自休眠卵孢子的寡雄腐霉微生物，以及右侧接种植物病原真菌禾谷镰刀菌(上排)，并且仅对照培养皿中接种禾谷镰刀菌真菌，其中4天后记录生长；
图1C是培养皿的照片，其同时接种来自植物病原真菌禾谷镰刀菌的休眠卵孢子的寡雄腐霉的微生物，其中在11天后记录生长。
图2A、图2B、图2C显示了在植物病原真菌禾谷镰刀菌、寡雄腐霉微生物和这两种微生物的组合存在下小麦生长的实验室实验结果。
其具体示出：
图2A是其中仅植物病原真菌禾谷镰刀菌存在下小麦在琼脂土壤上的生长，向小麦芽接种20天后记录小白点的锥形瓶；
图2B是其中在植物致病真菌禾谷镰刀菌和寡雄腐霉微生物的存在下小麦在琼脂土壤上生长的锥形瓶；在小麦芽上同时接种20天后记录瓶子；以及
图2C是其中在仅有寡雄腐霉微生物的存在下小麦在琼脂土壤上生长的锥形瓶；在小麦芽上接种该真菌20天后拍摄瓶子。
图3A、图3B、图3C、图3D、图3E显示了根据示例性实施例1的用于植物保护的抗真菌制品的应用以及随后在小麦和邻近土壤的田间实验中观察到的寡雄腐霉微生物种群动态的分析，包括通过基因表达和遗传观察真菌污染水平监测真菌存在的反应。
其具体示出：
图3A是通过在施用后不同时间对植物(浅灰色柱)和周围相邻土壤(深灰色柱)进行基因测试确定的寡雄腐霉微生物的含量；
图3B是采样时在田间使用的红外线温度计测量的温度(浅灰色柱)和从当地气象站获得的温度记录(深灰色柱)的发展；
图3C是在6至120小时的时间观察到的植物个体部分和周围土壤(So-土壤、R-根、St-茎、L-叶)中纤维素酶(POCELL)、葡聚糖内切酶(POENDO)和富含丝氨酸和苏氨酸的结构蛋白(POSTRU)的基因表达过程，其中基因表达水平被标准化为组成型基因-微管蛋白(POTUBU)的表达，并且表达时没有施用根据引用的方法[12]的制品；
图3D是使用具有用于扩增真菌的一般扩增引物的定量PCR测量的如小图C中的相同样品中的真菌污染水平。
图3E是监测纤维素酶(POCELL)的基因表达水平与真菌污染水平之间的相关性的相关图。
图4A、图4B、图4C、图4D显示了根据示例性实施例4的牙膏从它们消除在陶瓷羟基磷灰石板上人工产生的生物膜的能力的角度的有效性的测试，其中使用来自附图上部的健康个体的唾液，并且使用来自附图下部的患有牙周病的个体的唾液。
其具体示出：
图4A是六孔板的照片，六孔板使用来自在溶液中释放漂洗过的生物膜并去除先前用刷子在如下情况下清洁的陶瓷羟基磷灰石板之后的健康个体的唾液：没有使用膏；使用Odol牙膏；使用Enzycal牙膏；使用根据示例性实施例4的含有甘油的膏，其中没有添加寡雄腐霉微生物；使用根据示例性实施例4的含有甘油的膏，其中没有添加氧化硅；以及使用根据示例性实施例4的含有甘油的完全膏；
图4B是通过在板分光光度计上在562nm波长下测量图1A的各个孔中的着色强度来定量评价生物膜的含量；
图4C是六孔板的照片，六孔板使用来自在溶液中释放漂洗过的生物膜并去除先前用刷子在如下情况下清洁的陶瓷羟基磷灰板之后的患有牙周病的个体的唾液：没有使用膏；使用Odol牙膏；使用Enzycal牙膏；使用根据示例性实施例4的含有甘油的膏，其中没有添加寡雄腐霉微生物；使用根据示例性实施例4的含有甘油的膏，其中没有添加氧化硅；以及使用根据示例性实施例4的含有甘油的完全膏；以及
图4D是通过在板分光光度计上在562nm波长下测量图1C的各个孔中的着色强度来定量评估生物膜的含量。
具体实施方式
液体生物抗真菌制品含有寡雄腐霉微生物，并且在所有示例性实施例中，寡雄腐霉微生物是寡雄腐霉Dreschler ATTC 38472菌株，其保藏在布尔诺的Masaryk大学的捷克微生物保藏中心(CCM)中的寡雄腐霉M1名目下，并且在下文中示例性实施例中，呈现了在该名目下。
以下是根据ST25_PCT的该微生物的序列方案：
实施例1
用于喷洒具有高生物质重量百分比的作物的液体生物抗真菌制品
制备：
通过在固体基质上培养寡雄腐霉M1微生物获得的生物质在均质化器容器(工业混合器)中与软化水混合并均质化。均质化以每分钟3000至5000转持续3分钟进行。随后，将渗透物(蔗糖)加入到初始未稀释的悬浮液中，其量对应于60％重量的所得浓度并且对应于所需数量的卵孢子。然后将具有渗透物(蔗糖)的悬浮液在混合器中以每分钟2000转进行均质化1分钟。然后将悬浮液储存在温度低于8℃的无菌不锈钢罐中。
通过将软化水中的均质化步骤和随后加入渗透物(蔗糖)的步骤组合成一个步骤制备液体生物抗真菌制品更有利，使得通过固体培养获得的生物质在工业均质化器的容器中在渗透物溶液(65％蔗糖溶液)中均质化。均质化以每分钟3000至5000转持续3分钟进行。在确定初始悬浮液中的卵孢子数后，以标准方式用渗透物(65％蔗糖溶液)稀释该悬浮液，使得达到制品中所需的卵孢子浓度。然后将悬浮液储存在温度低于8℃的无菌不锈钢罐中。
使用赛吉计数板计数室(Sedgewick-Rafter counting chamber)通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
性质：
稳定性：在高达25℃的温度下6个月。
实施例2
用于喷洒具有低重量百分比的生物质的作物的液体生物抗真菌制品
制备：
将通过液体培养获得的寡雄腐霉生物质在均质化器(工业混合器)的容器中与渗透物(蔗糖)混合，并以达到所需数量的卵孢子和渗透物(蔗糖)浓度的方式进行均质化。均质化以每分钟3000至5000转持续3分钟进行。然后将悬浮液储存在温度低于8℃的无菌不锈钢罐中。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
性质：
稳定性：在高达25℃的温度下6个月。
实施例3
意图用做种衣剂(seed coating)的液体生物抗真菌制品
制备：
通过在固体基质上培养寡雄腐霉M1微生物获得的生物质在均质化器容器(工业混合器)中与软化水混合并均质化。均质化以每分钟3000至5000转持续3分钟进行。随后，将渗透物(蔗糖)加入到初始未稀释的悬浮液中，其量对应于60％重量的所得浓度并且对应于所需数量的卵孢子。然后将具有渗透物(蔗糖)的悬浮液在混合器中均质化1分钟。
通过将软化水中的均质化和随后加入渗透物(蔗糖)的步骤组合成一个步骤制备制品更有益，使得通过固体培养获得的生物质在工业均质化器的容器中在渗透溶液(65％蔗糖溶液)中均质化。均质化以每分钟3000至5000转持续3分钟进行。在确定初始悬浮液中的卵孢子数后，以标准方式用渗透物(65％蔗糖溶液)稀释该悬浮液，使得达到制品中所需的卵孢子浓度。然后将悬浮液储存在温度低于8℃的无菌不锈钢罐中。
然后将获得的悬浮液储存在温度低于8℃的无菌不锈钢罐中。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
稳定性：在高达25℃的温度下6个月
组成：
实施例4
作为低含水量的悬浮液浓缩物的液体生物抗真菌制品
制备：
收获后，将来自液体培养的寡雄腐霉M1生物质离心。离心后除去上清液，并且向离心的物质中加入石蜡油，使得所得的卵孢子数为每1ml制品500,000个卵孢子。然后将混合物在工业混合器中均质化持续3分钟。将悬浮液储存在温度低于8℃的无菌容器中。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
培养生物质 0.1％重量
石蜡油作为稳定剂 99.9％重量
寡雄腐霉M1微生物的休眠卵孢子数 每1ml 5×105。
性质：
稳定性：在高达25℃的温度下6个月。
实施例5
以纳米纤维形式施用的液体生物抗真菌制品构成用于寡雄腐霉M1微生物的缓释可降解基质
制备：
收获后，将来自液体培养的寡雄腐霉生物质离心。除去上清液，并且向离心的物质中添加渗透物(65％蔗糖)和生物聚合物，然后使用静电纺丝技术并且使用无毒、可生物降解的聚合物聚乙烯醇(PVA)对其进行处理。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
主要成分(寡雄腐霉微生物的液体悬浮液)84％重量
其中：
蔗糖作为稳定剂 63％重量
水作为稳定剂 36％重量
培养生物质 1％重量
2.PVA载体
PVA作为可降解载体 16％重量
寡雄腐霉M1微生物的休眠卵孢子数 每1ml 5.106
性质：
稳定性：在高达25℃的温度下6个月。
实施例6
液体生物抗真菌制品以浸渍涂层或喷雾的形式施用
制备：
收获后，将来自液体培养的寡雄腐霉M1生物质均质化，并使用过滤技术将尺寸高达300m的颗粒进行过滤。离心后，将该制备的生物质与低粘度的矿物油混合，使得获得1ml制品中所需数量的卵孢子。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
培养生物质 0.1％重量
矿物油作为稳定剂 99.9％重量
寡雄腐霉M1微生物的休眠卵孢子数 每1ml 2×105
性质：
稳定性：在10℃至45℃的温度下6个月(取决于次要物质的类型)。
实施例7
液体生物抗真菌制品用作空调卫生制品
制备：
收获后，将来自液体培养的寡雄腐霉M1生物质均质化，并使用过滤技术将尺寸高达100m的颗粒进行过滤。离心后，用盐溶液将生物质稀释至每1ml制品所需数量的卵孢子。施用原则是冲洗或喷洒空调或冷却装置的过滤器或管道。寡雄腐霉M1微生物的存在保证了对霉菌和真菌疾病的抗性。
清洁花粉过滤器：
将过滤器浸没在卫生溶液中并在其中放置10-30分钟，然后漂洗。替代地，在过滤器上在其操作位置喷涂相同的溶液。药物的污垢和残余物将被压缩空气吹出。
蒸发器和过滤器的卫生：
在清洁蒸发器和/或过滤器之后，施加制品溶液，而不进行清洗。即使该制品仅用作洗涤剂，也可获得优异的卫生效果。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
培养生物质 0.1％重量
盐溶液作为稳定剂 99.9％重量
寡雄腐霉M1微生物的休眠卵孢子数 每1ml 5×105
性质：
稳定性：在10℃至45℃的温度下6个月(取决于次要物质的类型)。
实施例8
用作用于处理沉积物-用于泥浆沉积和洪水区域的卫生制品的液体生物抗真菌制品
制备：
收获后，将来自液体培养的寡雄腐霉M1生物质均质化，并使用过滤技术将尺寸高达400m的颗粒进行过滤。离心后，使用蒸馏水或软化水将生物质稀释至每1ml制品所需数量的卵孢子。作用原则是根据下面规定的稀释度制备水悬浮液，并在受泥浆和沉积物污染沉积物影响的区域中施用，作为改善土壤和土性质的巩固和改进过程。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
性质：
稳定性：在高达25℃的温度下6个月
实施例9
液体生物抗真菌制品作为寡雄腐霉M1的卵孢子的稳定水悬浮液
制备：
将通过液体培养获得的寡雄腐霉M1生物质与无菌蒸馏水混合并在离心(4000转每分钟，5分钟)后均质化并除去上清液。以高转速(20,000转/分钟)持续1分钟进行均质化。此后，可以根据需要过滤和浓缩悬浮液，以达到在1ml中含有所需数量的寡雄腐霉M1的卵孢子的悬浮液浓缩物，而不存在原始培养基的残余物或菌丝体的残余物。获得的悬浮液材料可以在1℃至8℃的温度下储存在无菌罐中。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
无菌蒸馏水作为稳定剂 99.9％重量
培养生物质 0.1％重量
寡雄腐霉M1微生物的休眠卵孢子数量 每1ml 5×105
性质：
稳定性：在高达25℃的温度下至少6个月。
实施例10
作为稳定的含水悬浮液的液体生物抗真菌制品，其含有高浓度的寡雄腐霉M1的卵孢子
制备：
通过液体培养获得的寡雄腐霉M1生物质在均质化器容器(工业混合器)中均质化。均质化以每分钟20,000转持续3分钟进行。然后将悬浮液离心，并且除去上清液后，通过与渗透物(65％蔗糖)混合，将生物质浓缩至1ml制品中所需数量的卵孢子。将悬浮液浓缩物在低于8℃的温度下储存在无菌的不锈钢罐中。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
性质：
稳定性：在高达25℃的温度下6个月。
实施例11
以甘油基质上的膏形式的生物抗真菌制品
制备：
将1197.1g药用品质的甘油(甘油99％PharmEur)倒入实验室均质化器中，并且小心地撒入239.4g氧化硅22S、43.1g培养生物质、14.4g维生素E和6g鼠尾草香料。在实验室温度下将混合物以60转每分钟混合持续10分钟。然后将混合物放入带有塞子的塑料管中，每次75g，以这种方式填充总共20个这样的管。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
性质：
稳定性：在25℃的温度下至少6个月。
实施例12
在橄榄油基质上膏的形式的生物抗真菌制品
制备：
将600g初榨橄榄油倒入实验室均质化器中，并且小心地撒入120g氧化硅22S、21.6g培养生物质、7.2g维生素E和3g薄荷香料。在实验室温度下将混合物以每分钟20转混合持续10分钟。然后将混合物放入带有塞子的塑料管中，每次75g，以这种方式填充总共10个这样的管。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。
如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
性质：
稳定性：在25℃的温度下6个月。
实施例13
用于保护水生生物的液体生物抗真菌制品
该制品设计用于预防性地保护鱼类和幼鱼(鲤鱼、昏白鱼、鲷鱼)免受一系列真菌疾病(特别是曲霉属)的影响。该制品预防性地应用于培育池中。该制品还用于预防性地保护鱼卵免受一系列真菌疾病(特别是镰刀菌属、曲霉属)的攻击。
制备：
通过液体培养获得的寡雄腐霉M1生物质在均质化器容器(工业混合器)中均质化。均质化以每分钟20,000转进行3分钟。然后将悬浮液离心，并且除去上清液后，通过与渗透物(65％蔗糖)混合，将生物质浓缩至1ml制品中所需数量的卵孢子。将悬浮液在低于8℃的温度下储存在无菌的不锈钢罐中。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
性质：
稳定性：在高达25℃的温度下6个月。
实施例14
用于处理蜂巢脾的液体生物抗真菌制品
该制品设计用于预防性地处理蜂巢，使其免受多种真菌、特别是曲霉菌和镰刀菌属的攻击。该制品可用于处理蜂箱外储藏的巢脾和蜂箱内未被蜜蜂占据的巢脾。
制备：
将通过液体培养获得的寡雄腐霉M1生物质在均质化器(工业混合器)的容器中与渗透物(蔗糖)混合，并以达到所需数量的卵孢子和渗透物(蔗糖)浓度的方式进行均质化。均质化以每分钟20,000转进行3分钟。然后将悬浮液储存在温度低于8℃的无菌不锈钢罐中。使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
组成：
性质：
稳定性：在高达25℃的温度下6个月。
实施例15
作为用于喷洒作物的无水悬浮液浓缩物的液体生物抗真菌制品
通过在固体基质上培养寡雄腐霉M1微生物获得的生物质在均质化器容器(工业混合器)中与软化水混合并均质化。均质化以每分钟3000至5000转进行持续3分钟。均质化后，将得到的悬浮液与无机载体(Sipernat)混合、干燥，并在切割碎机中研磨，以获得高达350μm的所得颗粒尺寸。然后将具有载体的干燥培养生物质与石蜡油混合，以达到制品中所需的卵孢子浓度。将悬浮液储存在温度高达25℃的无菌容器中。
该制品优于实施例1的优点是制品的较长稳定性，这通过水的存在来确保。在氧化硅基底上的无机载体确保制品中固体颗粒(生物质)的良好悬浮性。
使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。
组成：
性质：
稳定性：在高达25℃的温度下24个月。
实施例16
用于在农业制品的有机制品中喷洒作物的作为无水悬浮液浓缩物的液体生物抗真菌制品
通过在固体基质上培养寡雄腐霉M1微生物获得的生物质在均质化器容器(工业混合器)中与软化水混合并均质化。均质化以每分钟3000至5000转进行持续3分钟。均质化后，将得到的悬浮液与无机载体(Sipernat)混合、干燥，并在切割碎机中研磨，以获得高达350μm的所得颗粒尺寸。然后将含有载体的干燥培养生物质与向日葵油混合，以达到制品中所需的卵孢子浓度。将悬浮液储存在温度高达25℃的无菌容器中。
该制品优于实施例1的优点是制品的较长稳定性，这通过水的存在来确保。在氧化硅基底上的无机载体确保制品中固体颗粒(生物质)的良好悬浮性。
使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。
组成：
性质：
稳定性：在高达25℃的温度下24个月。
实施例17
具有降低的卵孢子浓度的液体生物抗真菌制品
将通过液体培养获得的寡雄腐霉M1生物质在均质化器(工业混合器)的容器中与渗透物(蔗糖)混合，并以实现所需数量的卵孢子和渗透物(蔗糖)浓度的方式进行均质化。均质化以每分钟20,000转进行3分钟。然后将悬浮液与渗透物(65％蔗糖)混合，使得制品中的卵孢子浓度与制品的要求相匹配。然后将悬浮液储存在温度低于8℃的无菌不锈钢罐中。
使用赛吉计数板计数室通过显微镜确定休眠卵孢子的数量，并且根据Etxeberria等人[13]在2011年的出版物，使用质壁分离法基于显微观察活卵孢子的数量来测量稳定性。如果需要，休眠卵孢子的数量以标准方式稳定。
组成：
性质：
稳定性：在2℃至8℃的温度下12个月；在高达25℃的温度下6个月。
实施例18
在真菌寄生实验中液体生物抗真菌制品的有效性的实验室测试
对根据示例性实施例1的悬浮液浓缩物的休眠卵孢子的寡雄腐霉M1的增殖和随后对植物致病真菌禾谷镰刀菌的真菌寄生的实验室测试利用麦芽提取物基质上的营养素培养基在无菌琼脂板上进行。将稀释的浓缩物以施用水平施加到琼脂板上，意指每1升水0.2ml浓缩物，并且在发芽后除去该板的一部分并转移至不同的琼脂，同时用禾谷镰刀菌真菌接种。
该试验的结果示于图1中，其显示与标准生长相比，加入寡雄腐霉M1微生物后，植物病原真菌禾谷镰刀菌的生长显著中断(图1A)。使用4天后拍摄的一系列培养皿进一步说明了这种情况，一方面显示了两种微生物的联合生长，并且另一方面显示了植物病原真菌的生长(图1B)。培养11天后，清晰显示出寡雄腐霉M1微生物的生长以及对植物病原真菌的显著抑制。如果活卵孢子的数量不低于初始值的90％，则将制品标记为稳定。
实施例19
在用小麦进行的实验室实验中证实了抗植物病原真菌的抗真菌有效性。
将作物(小麦)种子用SAVO(亚氯酸钠溶液(1-5％溶液))溶液处理，并在琼脂土壤提取物上发芽。发芽后，再次用1％Sava溶液处理芽，并置于250ml锥形瓶中的Phyto琼脂层上。用一片琼脂(5mm)接种瓶，所述琼脂具有植物病原体禾谷镰刀菌或具有寡雄腐霉M1微生物(悬浮液浓缩物中的休眠卵孢子)，其在下面的版本中的施用浓度为每升0.2ml，并且体积为0.2ml：1)植物病原体；2)植物病原体+寡雄腐霉M1；3)只有寡雄腐霉M1；对照样品未接种。用薄层的纤维素和纱布密封烧瓶。在温度为24℃的室内进行培养。监测植物病原体菌落和寡雄腐霉M1微生物的生长，以及植物的状况。
该实验室实验的结果如图2所示。就实际植物病原体的添加而言，其在生长的小麦周围的显著增长是非常清楚的，病原体对植物引起的损害也是如此(图2A)。如果还添加了寡雄腐霉M1微生物，除了植物致病真菌之外，植物病原体的存在是不可见的并且栽培植物生长良好(图2B)。在寡雄腐霉M1微生物单独存在下进行的对照实验显示小麦植物的正常生长，这与没有添加任何微生物的实验相当(图2C)。
实施例20
用于根据示例性实施例2的用于喷洒作物的液体生物抗真菌制品在芸苔(Brassica napus)油菜籽的温室试验中的有效性测试
在的公司温室中使用了四个区段，其中含有生长的芸苔油菜籽、Lohana C1品种，其中开始施用在BBCh15-21。使用霉菌寄生微生物寡雄腐霉M1的松散生物杀菌剂应用于第一区段，根据本发明的示例性实施例1的新型液体杀真菌剂应用于区段2，根据本发明的示例性实施例2的新型液体抗真菌制品应用于区段3，并且根据本发明的示例性实施例4的新型液体抗真菌制品应用于区段4。所有情况下的施用浓度为每升0.5g，或每升0.5ml，并且每1平方米处理区域分散100ml这种浓缩制品。在每个区段中标记了收集点，用于收集包含植物和行之间土壤的样本。在每次收集期间，还采集了收集时的摄影文件和温室中的温度读数。将收集的样品在一小时内转移到实验室中并储存在-20℃的冰箱中直至分析时。在施用抗真菌制品之前、以及然后在施用之后1小时、2小时、7小时、20小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、11天、14天、17天和20天收集样品。
样品的实验室处理涉及单个植物的摄像文件、叶和根的分离、样品湿重的确定、DNA提取缓冲液中样品的均质化、离心和进行分子分析。使用qPCR方法用针对ITS序列的探针定量测定寡雄腐霉M1微生物的存在，同时使用与针对Fat(A)A序列的探针相同的方法进行油菜籽DNA的定量测定。定量测定包括在标准条件下进行50个循环的DNA扩增，并使用校准曲线计算靶序列的浓度。基于标准方案以类似方式检测真菌感染水平。
有效性试验的结果列于下表1中。在所有情况下，根据本发明的新型液体抗真菌制品实现的有效性与固体松散制品的有效性相当或更好。取决于施用地点的寡雄腐霉M1微生物的定殖和扩增，外来的真菌总是受到抑制。此后，即使在实验结束时降低了寡雄腐霉M1微生物的浓度之后，仍然保持了低水平的真菌污染。在该实验中监测寡雄腐霉M1微生物的群体的动态仅持续15天，导致对长期效应没有任何评论。尽管如此，从制品的抗真菌有效性的角度来看，毫无疑问，抑制真菌的能力是显著的且长期的：在施用后24小时，这种真菌的发生减少约一个量级，并且在另外的24小时后进一步减少几乎一个量级。
表1
实施例21
用于根据示例性实施例1的用于喷洒作物的液体生物抗真菌制品在小麦(Triticum aestivum)的田间试验中的有效性的测试
冬小麦(Triticum aestivum)于2015年10月在靠近 u Loun村庄的公司田地播种。根据本发明的示例性实施例1的抗真菌制品在2015年11月根据农业标准并且批准注册用于植物保护的抗真菌制剂使用标准喷雾方法以每公顷100ml的量施用于指定的轨迹。在施用之前和施用后不同天数从4个指定的收集点取样品，由此收集生长的小麦植物和样品附近的土壤。收集后立即冷冻样品，并储存在-20℃的密封袋或试管中直至分析。使用公开的方法(R，Suchánek M，L等人/2016/Comparison of theefficacy of treatment of dermatophytosis by chemical and biologicalantifungals:soil peronosporomycete Pythium oligandrum is as efficient as theantifungal enilconazole in the guinea pig model，Vet Dermatol，印刷品)从收集的样品中提取核酸并用于分子分析。
就涉及根据示例性实施例1的液体制品喷雾后出现的寡雄腐霉M1微生物的动态而言，植物和周围土壤中的标准化浓度显示出相似的依赖性。尽管在施用之前通过qPCR基因测试仅可以鉴定每g样品的个体细胞，但是在施用对应于正常标准量的液体制品后，该数量上升至每g样品数百个细胞。在48小时后实验条件下，寡雄腐霉M1微生物有明显的增殖，其中这种积极趋势在2015年12月初霜冻事件的特定实验条件下被中断，此后动态种群增长没有恢复(比较图3A和图3B)。
通过使用在实验的“峰值”阶段进行的RT-qPCR方法分析基因表达谱获得了一定数量的有价值的信息，其中寡雄腐霉M1微生物的生长最高。转录物浓度值显示出对第一阶段发生的真菌病原体的快速反应(纤维素酶基因的显著表达)，随后游动孢子的发生增加(内切葡聚糖酶表达)。只有在48小时和120小时后，孢子形成的特征性基因标记才会增强，主要是在周围的土壤和根部(图3C)。同时，有可能观察到施用后48小时真菌的相对含量显著降低(图3D)，并且这种降低与纤维基因的表达相互关联造成在寡雄腐霉M1微生物的真菌寄生作用期间真菌中表面糖类的降解(图3E)。
实施例22
利用机械去除菌斑的口腔生物膜模型中牙膏的功效测试
根据Verkaik MJ等人[14]在2010年的出版物，使用机械去除菌斑的口腔生物膜模型进行实验室测试，以监测制备的牙膏的有效性。使用上述公开方案的版本(B)，其由以下步骤组成：2小时粘附，随后生长过夜(16小时生物膜)和机械清洁。将含有寡雄腐霉M1微生物的甘油牙膏和含有橄榄油以及寡雄腐霉M1微生物的牙膏去除牙菌斑的微生物的效果与两种常用市售牙膏(Odol和Enzycal)进行比较，并作为对照，使用牙刷进行机械清洁而没有任何膏(标记为对照)。在对照实验中使用相同的膏，其中没有任何寡雄腐霉含量且不使用氧化硅作为研磨剂。
该测试的结果在图2的结果表中描述。这表明，即使在受牙周病影响的个体中，根据示例性实施例4的膏在除去牙齿生物膜和菌斑方面表现出比所使用的替代制品显著更高的有效性(图4A至图4D)。尽管迄今为止通常使用的膏将生物膜形成的强度降低至约一半，但根据本发明的新膏可降低至十分之一。其在没有任何寡雄腐霉M1微生物含量的对照膏中的效果与普通膏相当，而在没有氧化硅的对照膏中效果显著更好。牙周病患者的生物膜形成总体水平显著较高，并且对于观察各个膏的有效性差异也好得多。
实施例23
测试根据示例性实施例1的液体生物抗真菌制品在保护生活空间免受真菌孢子侵害方面的有效性
将根据示例性实施例1的抗真菌制品用水稀释至每升施用溶液330,000个卵孢子的浓度，即将0.66ml液体浓缩物加入1升溶液中。还在相同条件下制备对照溶液，但没有寡雄腐霉M1微生物含量；用水代替生物质。以这种方式制备的溶液使用雾化器以喷雾细雾的形式被应用于位于 u Loun 2号的农庄的两个小的封闭室中。施用后，两个室都是不可渗透的封闭，并使用方法对孢子含量进行了沉降测试。结果在布拉格的捷克共和国科学院微生物研究所的Miroslav博士的实验室进行了评估。
实验结果如下表2所示。实验在封闭的室内进行，没有任何空气流动，并且因此观察到的变化较慢，且仅在几个月后观察到。尽管如此，从结果中可以清楚地看出，在对照室1中，随着辅助物质的应用，确定的孢子数量波动，但在任何观察时间都没有低于WHO(世界卫生组织限制)的每1立方米的空气500孢子的数量。相比之下，在室2中施用后3个月孢子有统计学上显著的下降，并且随后在施用日期后6个月降至WHO限值以下。
表2
实施例24
含有寡雄腐霉M1的液体生物抗真菌制品的制备方法
在前面的示例性实施例中详细说明了根据本发明的含有寡雄腐霉M1的液体生物抗真菌制品的详细性质。
以下给出根据本发明的含有寡雄腐霉M1的液体生物抗真菌制品的制备方法的实施例。
含有谷物提取物、甘蔗糖蜜和其他必需营养素的培养基用于有氧培养寡雄腐霉M1卵菌。液体培养基在蒸汽灭菌器中灭菌。冷却后，用一种选定的寡雄腐霉M1菌株接种。在培养结束后，花费大约13天的过程，收获生物质并以示例性实施例中的上述方式处理。
制备培养基用于在含有谷粒、优选脱壳谷物谷粒(例如糜子(Panicum miliaceumL.))与一定百分比的营养素液体培养基混合的固体基质上培养寡雄腐霉M1微生物。培养基在蒸汽灭菌器中的培养容器中灭菌。冷却后，用一种选定的寡雄腐霉M1菌株接种培养基。在培养过程结束后，进行大约为期8天的步骤，将收获的生物质进一步加工成悬浮液浓缩物的形式，如在上文的示例性实施例中所述。
在液相和固相中的寡雄腐霉培养阶段结束后，将生物质用液体培养基均质化，例如在工业混合器中，使得悬浮液中至少95％的颗粒在0.05mm和0.30mm之间，优选在0.050mm和0.125mm之间。随后，将均质悬浮液由卵孢子的数量表征。将悬浮液标准化-浓缩的或稀释的(根据卵孢子的数量)-至适于制备所讨论的液体生物抗真菌制品的预定浓度的卵孢子。
在固体基质上的寡雄腐霉M1培养阶段结束后，将生物质优选用工业混合器在相应体积的软化水中均质化，使得悬浮液中至少95％的颗粒的所得尺寸在0.050mm和0.300mm之间，优选在0.050mm和0.125mm之间。随后，将均质悬浮液由卵孢子的数量表征。将得到的悬浮液根据卵孢子的数量浓缩或稀释至适于制备所讨论的液体生物抗真菌制品的预定浓度的卵孢子。
在均质化和浓缩或稀释的阶段之后分离悬浮液，例如过滤，以确保颗粒的最大允许尺寸在相关范围内。如果获得约0.05mm至0.125mm的颗粒，则很有可能获得浓缩的悬浮液，或几乎纯的浓缩的寡雄腐霉M1卵孢子的悬浮液。上述大多数示例性实施例具有主要为0.050mm至0.125mm的颗粒尺寸。
在用渗透物添加剂均质化期间可以稳定含水悬浮液，并且可以在低于8℃的温度下将其储存在大的无菌容器中。
在寡雄腐霉M1微生物的无水悬浮液的情况下，将培养阶段结束后在固体基质上或液相中获得的材料均质化，优选用工业混合器均质化，使得悬浮液中至少95％的颗粒的所得尺寸在0.050mm和0.300mm之间，优选在0.050mm和0.125mm之间。随后离心由卵孢子的数量表征的所获得的均质化悬浮液，并且在去除上清液后，将油加入到离心的材料中以达到预定浓度的卵孢子以适合于制备所讨论的液体生物抗真菌制品。随后将所得的材料重新悬浮，例如使用工业混合器。
在上面给出的示例性实施例中指定了具体的可能的制备方法，但不限于这些。
工业实用性
含有卵孢子的稳定悬浮液的新型液体抗真菌制品可以制成相当大的体积，这主要是因为从技术角度来看，发酵制备阶段和配制阶段都是可以很好地控制的。新型液体制品可以应用于已经应用寡雄腐霉的其他形式的显微卵菌并且使用至今的所有领域，特别是在植物的生物保护、保护建筑物和住宅免受真菌污染中以抑制真菌和酵母，并且在人类和兽医应用中建立微生物群落的生理平衡。它用作具有可降解聚合物的植物的保护性喷雾剂，充当保护性因素和作为寡雄腐霉微生物的缓慢释放、可降解的基质“载体”，具有高度创新性。当制品的油组分也导致木材的有效浸渍时，根据本发明的制品也可有利地用于涂覆或喷涂木结构。微生物的存在保证了对真菌和真菌疾病以及对木材“缺陷”的抗性。一个全新的用途是有效保护空气处理设备、空调和冷却装置。使用专门设计用于降低受洪水影响的区域、干涸区域和再生水域周围的真菌污染水平的制品似乎也是有利的。
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<120> 生物制品有限责任公司
<130> PCT/CZ2017/......
<160> 2
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> Pythium oligandrum strain M1
<220>
<221> ITS rRNA gene
<400> 1
atcattacca cacctaaaaa ctttccacgt gaaccgttat aactatgttc tgtgcttcgt 60
cgcaagactt gaggctgaac gaaggtgagt ctgcgtctat tttggatgcg gatttgctga 120
tgttatttta aacacctatt acttaatact gaactatact ccgaatacga aagtttttgg 180
ttttaacaat taacaacttt cagcagtgga tgtctaggct cgcacatcga tgaagaacgc 240
tgcgaactgc gatacgtaat gcgaattgca gaattcagtg agtcatcgaa attttgaacg 300
catattgcac tttcgggtta tgcctggaag tatgcctgta tcagtgtccg tacatcaaac 360
ttgcctttct ttttttgtgt agtcaaaatt agagatggca gaatgtgagg tgtctcgcgc 420
tgtcttttta aagatggttc gagtcccttt aaatgtacgt tgattctttc ttgtgtctgc 480
gaattgcgat gctatgctct ttgtgatcgg tttagattgc tttgcgctgg tgggcgactt 540
cggttaggac atatggaagc aacctcaatt ggcggtatgt tcggctttgc ctgacgttaa 600
gctaagcgag tgtagttttc tgtcttttcc ttgaggtgta cctgtcgtgt gtgaggttga 660
tttaggctat atggttgctt ggttgtgtgg tttagcgttt tcagacgcct gcttcggtag 720
gtaaaggaga caacaccaat ttgggactga gagtttact 759
<210> 2
<211> 683
<212> DNA
<213> Pythium oligandrum strain M1
<220>
<221> Mitochondrial COXII cytochrome oxidase
<400> 2
atggaaggta ttattaactt tcatcatgat ttagtatttt ttttaattat tgtgactgtt 60
tttgtttgtt ggttattatt tagagtaatc gtattattcg atgaaaaaaa aaacccaata 120
cctgctacat ttgtacatgg agcaactatt gaaattattt ggacaacaat tccagcatta 180
attttattaa ccgtagcagt tccatctttt gctttattat attcaatgga tgaaattatt 240
gatccaatta taactttaaa agtaataggt agtcaatggt actggagtta tgaatattct 300
gataatttag aatttgcaga tgaaccttta atttttgata gttacatggt tcaagataat 360
gacttagaaa taggacaatt taggttatta gaagtagaca accgtgttgt tgtaccaact 420
aatagccata ttagagtttt aataacagct tctgacgttt tacattcatg ggctataccc 480
tctttaggtt taaaattaga tgcttgtcca ggtcgtttaa atcaaacttc aatgtttatt 540
aaaagagaag gtgtatttta cggtcaatgt agtgaaatat gtggtataaa tcatggtttt 600
atgccaatag ttgttgaagc agtttcatta gaagattatt tagtttggtt aaaaaacaaa 660
ttaattttga ttttaatgta taa 683

Claims (16)

1.一种含有寡雄腐霉(Pythium oligandrum)微生物的液体生物抗真菌制品，其特征在于
所述制品含有所述寡雄腐霉微生物的稳定悬浮液并含有
0.05％重量至10.0％重量的所述寡雄腐霉微生物的培养生物质，所述培养生物质具有培养基、细胞形态的所述微生物和由所述微生物产生的物质；以及
90.0％重量至99.95％重量的稳定剂；
其中，在正常标准化之后，1ml的所述液体生物抗真菌制品中的休眠卵孢子的预定数量为1×103至2×107。
2.一种含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品，其特征在于
所述制品含有所述寡雄腐霉微生物的稳定悬浮液并含有0.05％重量至10.0％重量的所述寡雄腐霉微生物的培养生物质，所述培养生物质具有培养基、细胞形态的所述微生物和由所述微生物产生的物质，
79.77％重量至99.95％重量的稳定剂，以及
剩余物，至100％重量的选自填充物、香料和维生素E中的至少一种改性/应用物质，
其中，在正常标准化之后，1ml所述液体生物抗真菌制品中的休眠卵孢子的预定数量为2.5×104至1.0×106。
3.根据权利要求1或2所述的含有所述寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品，其特征在于
所述寡雄腐霉微生物是寡雄腐霉Dreschler ATTC 38472菌株，其保藏在布尔诺的Masaryk大学的捷克微生物保藏中心(CCM)的寡雄腐霉M1名目下。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的液体生物抗真菌制品，其特征在于，所述稳定剂含有选自水、盐溶液、油或渗透物溶液中的至少一种组分。
5.根据权利要求4所述的液体生物抗真菌制品，其特征在于
所述稳定剂是水，其在30.0％重量和99.9％重量之间。
6.根据权利要求4所述的液体生物抗真菌制品，其特征在于
所述稳定剂是盐溶液，其为99.9％重量。
7.根据权利要求4所述的液体生物抗真菌制品，其特征在于
所述稳定剂是在60.0％重量至64.95％重量之间的蔗糖形式的渗透物。
8.根据权利要求4所述的液体生物抗真菌制品，其特征在于
所述稳定剂是选自石蜡油、矿物油、甘油或向日葵油中的量为79.77％重量至99.9％重量的至少一种油。
9.根据权利要求2或3所述的液体生物抗真菌制品，其特征在于
所述制品还含有16.0％重量的缓释生物可降解基质作为所述寡雄腐霉微生物的卵孢子的载体，例如聚乙烯醇。
10.根据权利要求2或3所述的液体生物抗真菌制品，其特征在于
所述制品还含有基于氧化硅的量为16.0％重量的填充物。
11.根据权利要求2或3所述的液体生物抗真菌制品，其特征在于
所述制品还含有0.96％重量的鼠尾草或薄荷香料和0.4％重量的维生素E的应用/改性物质。
12.一种制备含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品的方法，所述液体生物制品含有根据权利要求1至11中任一项所述的寡雄腐霉微生物的稳定悬浮液，其特征在于
a)含有谷物提取物、甘蔗糖蜜和其他必需营养素的液体培养基用于有氧培养液相中的寡雄腐霉的卵菌；
b)所述液体培养基被灭菌；
c)冷却后，接种一种选定的寡雄腐霉的菌株；
d)在培养结束后收获并处理所述生物质；
e)随后，在液相中的寡雄腐霉的培养阶段结束后，用所述液体培养基使所述生物质均质化，使得所述悬浮液中至少95％的颗粒在0.050mm和0.300mm之间，优选在0.050mm和0.125mm之间；
f)然后将由卵孢子数量表征的所获得的均质化悬浮液根据卵孢子的数量标准化-浓缩或稀释至所讨论的所述液体生物抗真菌制品中卵孢子的预定浓度。
13.一种制备含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品的方法，所述液体生物抗真菌制品含有根据权利要求1至11中任一项所述的寡雄腐霉微生物的稳定悬浮液，其特征在于，
g)制备培养基用于在固体基质上培养所述寡雄腐霉微生物，所述固体基质含有谷粒、优选壳粒小米谷物例如糜子，其与一定百分比的营养液体培养基混合；
h)所述培养基在培养容器中灭菌；
i)冷却后，用一种选定的寡雄腐霉的菌株接种所述培养基；
j)在所述培养过程结束后收获的生物质以悬浮液浓缩物的形式处理；
k)在固体基质上的寡雄腐霉的培养阶段结束后，将所述生物质在相应体积的软化水中均质化，使得所述悬浮液中至少95％的颗粒的所得尺寸在0.050mm和0.300mm之间，优选在0.050mm和0.125mm之间；
l)然后将由卵孢子数量表征的所获得的均质化悬浮液标准化-浓缩或稀释至适于制备所讨论的所述液体生物抗真菌制品的预定浓度的卵孢子。
14.根据权利要求12或13所述的制备含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品的方法，其特征在于
m)在所述寡雄腐霉微生物的无水悬浮液的情况下，将培养阶段结束后在固体基质上或液相中获得的物质均质化，使得悬浮液中至少95％的颗粒的所得尺寸在0.050mm和0.300mm之间，优选在0.050mm和0.125mm之间；
n)随后将由卵孢子数量表征的所获得的均质化悬浮液离心；
o)并且在除去上清液后，将油加入到离心的材料中以达到预定浓度的卵孢子以适合于制备所讨论的所述液体生物抗真菌制品；
p)获得的材料随后重新悬浮。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的制备含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品的方法，其特征在于以下事实：
在均质化和标准化-浓缩或稀释后，将所述悬浮液分离，例如过滤至预定尺寸的颗粒，以确保所述寡雄腐霉微生物的颗粒的最大允许尺寸在0.050mm至0.300mm之间，优选为0.050mm至0.125mm。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的制备方法，其特征在于以下事实：含水悬浮液在用渗透物添加剂均质化期间稳定，并在低于8℃的温度下储存在大的无菌容器中。
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