FR3097557A1 - Nouvel agent de biocontrole et son utilisation pour la lutte contre des maladies fongiques de plantes - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne un nouvel agent de biocontrôle et son utilisation pour la lutte contre des maladies fongiques de plantes.

Description

NOUVEL AGENT DE BIOCONTROLE ET SON UTILISATION POUR LA LUTTE CONTRE DES MALADIES FONGIQUES DE PLANTES
La présente invention concerne un nouvel agent de biocontrôle et son utilisation pour la lutte contre des maladies fongiques de plantes.
Différentes maladies menacent le blé au cours de sa croissance. Elles peuvent être classées en trois catégories :
  • les maladies de la base des tiges (ex : piétin-verse, fusariose),
  • les maladies des feuilles (ex : oïdium, septoriose, helminthosporiose, rouille jaune et rouille brune) ;
  • et les maladies des épis (ex : fusariose de l’épi, oïdium de l’épis et septoriose).
Suivant les variétés de plantes et les conditions climatiques, des pertes quantitatives importantes des récoltes sont possibles, comme avec la septoriose qui réduit l’activité photosynthétique de la plante. De plus, d’autres maladies peuvent altérer la qualité de la récolte, telle la fusariose de l’épi qui produit des mycotoxines.
Plus précisément :
[1] Laseptoriose, dont l’agent pathogène estSeptoria tritici(=Mycosphaerella graminicola), est, sur le blé tendre, la maladie la plus fréquente et la plus dommageable quantitativement avec par exemple 17 q/ha de baisse de rendement moyen à l’échelle du territoire sur les dix dernières années. La « septoriose du blé » désigne deux maladies :
  • la septoriose des épis causée par le champignonPhaeosphaeria nodorum(anamorphe / forme asexuée :Stagonospora nodorum) qui attaque les feuilles mais aussi les épis et les grains de blé ; et
  • la septoriose des feuilles causée par le champignonMycosphaerella graminicola(anamorphe / forme asexuée :Septoria tritici, récemment renomméeZymoseptoria tritici) qui attaque les feuilles et les gaines de blé.
La septoriose àP. nodoruma été l’espèce prédominante en France jusque dans les années 80, de nos jours la forme majoritaire est la septoriose àM. graminicola, sans doute pour des raisons écologiques (Bearchell, S. J., Fraaije, B. A., Shaw, M. W., & Fitt, B. D. L. (2005). Wheat archive links long-term fungal pathogen population dynamics to air pollution.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(15), 5438–42.).
[2] Lafusariose, dont l’agent pathogène estGibberella zeae(=Fusarium graminearum), est un terme générique qui désigne un groupe de maladies cryptogamiques. Dans le cas du blé, cette maladie peut dévaster une culture quelques semaines avant la récolte. Outre le blé, elle est également retrouvée sur d’autres espèces comme le maïs et l’orge. Contrairement à la septoriose, la fusariose peut infecter toutes les parties de la plante, depuis les racines jusqu’aux épis, et ceci à tous les stades de développement. Le terme « fusariose » des céréales regroupe trois types de symptômes (Parry, D. W., Jenkinson, P., & McLeod, L. (1995). Fusarium ear blight (scab) in small grain cereals, a review.Plant Pathology, 44(2), 207–238.) :
  • la fusariose des semences ;
  • la fusariose du collet ; et
  • la fusariose de l’épi.
Cette dernière, la fusariose de l’épi est associée à un complexe d’espèces de champignons appartenant aux genresFusariumetMicrodochium. Le genreFusariuma été décrit pour la première fois en 1809 par Link et doit son nom du latin «fusus» (fuseau) en rapport à l’allure fusiforme de ses spores. Il appartient à la division des ascomycètes, à l’ordre desHypocrealeset à la famille desNectriaceae. Parmi la vingtaine d’espèces du genreFusariumpouvant causer la fusariose de l’épi,F. graminearum,est l’une des espèces la plus problématique en France de par sa production de mycotoxines dont le trichothécène déoxynivalenol (DON).
[3] Larouille brune du blé, dont l’agent pathogène estPuccinia recondita, est une maladie qui apparaît généralement assez tardivement au printemps. Elle peut provoquer d'importants dégâts si elle est mal contrôlée. Le champignon hiverne essentiellement sur les repousses de céréales et les cultures à semis précoces sous forme d’urédospores. Ces urédospores germent en présence d’eau libre et pour des températures comprises entre 15 et 25°C. La période de sporulation est de 5 à 25 jours selon les températures et les variétés. En conditions favorables, plus de 3000 urédospores peuvent être produites par pustule, ce qui explique le caractère explosif de la maladie. Les spores sont disséminées principalement par le vent (Ali, S., Gladieux, P., Leconte, M., Gautier, A., Justesen, A. F., Hovmøller, M. S., Enjalbert, J., de Vallavieille-Pope, C. (2014). Origin, Migration Routes and Worldwide Population Genetic Structure of the Wheat Yellow Rust PathogenPuccinia striiformis f.sp. tritici.PLoS Pathogens, 10(1), e1003903 ; De Vallavieille-Pope, C., Ali, S., & Leconte, M. (2012). Special Report Virulence Dynamics and Regional Structuring ofPuccinia striiformis f. sp. triticiin France Between 1984 and 2009.).
[4] Larouille jaune du blé, dont l’agent pathogène estPuccinia striiformis, est une maladie qui peut être très nuisible sur des variétés sensibles en cas d’attaques précoces. Les conditions fraîches et humides sont favorables à son développement. La rouille jaune passe l’hiver sous forme de mycélium ou de spores actives sur les repousses de céréales ou les cultures semées tôt à l’automne. Ce champignon résiste à des températures négatives et survit généralement à l’hiver sur des plants infectés. Au printemps, la rouille jaune commence à se développer et produit des spores actives, et ce d’autant plus que le temps est frais et humide. Les conditions optimales pour la germination des spores sont réunies lorsque les températures sont comprises entre 10 et 13°C avec un taux d’humidité relative à 100 %. Les spores sont disséminées principalement par le vent (Rossi, V., Racca, P., Giosue’, S., Pancaldi, D., & Alberti, I. (1997). A simulation model for the development of brown rust epidemics in winter wheat.European Journal of Plant Pathology, 103(5), 453–465.).
Parmi les différentes méthodes de lutte disponibles pour lutter contre ces maladies, notamment la septoriose et la fusariose et leurs conséquences, il existe la lutte chimique (fongicides), la résistance variétale, les stimulateurs de défenses des plantes (SDN ou « éliciteurs »), la lutte agronomique (travail du sol, précédents culturaux, gestion des résidus de culture ou des repousses, date et densité de semis, fertilisation azotée…). Toutefois, celles-ci présentent soit des inconvénients environnementaux liés à la pollution de sols et des nappes phréatiques, soit impliquent un coût humain et temporel important.
Dans un souci de respect de l’environnement, il a alors été développé des moyens de lutte biologique naturelle à l’aide de microorganismes. Cette dernière, également appelée lutte microbiologique directe, consiste à introduire des antagonistes microbiens spécifiques dans le sol ou sur le matériel végétal. Ces antagonistes, également appelés agents de lutte biologique ou BCA (Biological Control Agent), peuvent interférer avec la croissance et/ou la survie des agents pathogènes permettant ainsi de les contrôler. Pour ce faire, les agents de lutte biologique ou BCA peuvent contrôler les pathogènes cibles grâce à un ou plusieurs modes d’action :
  1. la compétition, laquelle peut avoir lieu entre le BCA et l’agent pathogène pour l’oxygène, pour l’espace, ou encore pour les nutriments ;
  2. l’antibiose, laquelle correspond aux interactions impliquant au moins un composé diffusible de faible masse moléculaire ou un antibiotique produit par un microorganisme qui inhibe la croissance d’un autre microorganisme;
  3. le parasitisme et la production d’enzymeshydrolytiques et/ou de métabolites antibiotiques au détriment d’un autre organisme hôte ; et/ou
  4. l’induction de résistance chez la plante hôte (« élicitation »)à l’image des bactéries de la rhizosphère, connues sous le nom de PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria), lesquelles sont capables d'induire chez la plante une résistance systémique induite (ISR,Induced Systemic Resistance) qui permet d'accroître la résistance aux pathogènes grâce à un phénomène de potentialisation (oupriming), qui correspond à un état de veille permettant une réponse immunitaire plus rapide et plus intense de la plante.
Le genreTrichodermacomprenant diverses espèces de champignons susceptibles d’être des agents de biocontrôle, leur mode d’action a fait l’objet de nombreux travaux. Ils font notamment état d’une capacité de ce champignon filamenteux à intervenir selon divers mécanismes : mycoparasitisme, antagonisme (compétition), antibiose (production d’antibiotiques), stimulation racinaire, stimulation de la croissance par solubilisation de minéraux fertilisants, stimulation des défenses naturelles des plantes,etc. Ils colonisent les racines des plantes herbacées et ligneuses sans aucun dommage. En outre, ce champignon peut pénétrer dans les racines et favoriser le développement, la nutrition et la résistance aux maladies. Toutefois, les effets sont inégaux d’une espèce à l’autre voire d’une souche à l’autre car un bon agent de lutte biologique doit être un bon colonisateur et un bon antagoniste mais surtout, il doit également être compatible avec la rhizosphère et avec les plantes.
BREF APERÇU
Dans ce contexte de lutte contre des maladies fongiques, telles que la septoriose et la fusariose, un premier but de l’invention consiste donc à la mise à disposition d’une souche efficace, comme un agent de lutte biologique (ou agent de biocontrôle).
Un second but de l’invention est de fournir des compositions phytosanitaires pour la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux.
Un troisième but de l’invention est également de fournir des compositions phytosanitaires d’enrobage où, en association avec une semence de plante, la souche de l’invention est utilisée comme un agent d’accélération de la germination de ladite semence.
Un autre but de l’invention est la mise à disposition des procédés permettant de fabriquer lesdites compositions et de mettre en œuvre la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux, et l’accélération de la germination.
Un premier aspect de l’invention concerne une souche isolée deTrichoderma atroviridedont le gèneech42possède une identité de séquence d’au moins 98% avec la séquence SEQ ID NO : 1 du gèneech42de la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM I-5333.
De manière surprenante, il est apparu que la souche deTrichoderma atrovirideTAL-17 développée par les inventeurs, dont le gèneech42a été séquencé, possède d’excellentes propriétés stimulatrices de croissance, des propriétés antagonistes utiles en agriculture ainsi qu’une grande stabilité en matière de viabilité. De fait, elle constitue un agent de biocontrôle idéal pour lutter efficacement contre des maladies fongiques de plantes.
Par « une identité de séquence d’au moins 98% avec la séquence SEQ ID NO : 1 », on entend une identité de séquence d’au moins 98,5%, d’au moins 99% voire d’au moins 99,5% avec la séquence SEQ ID NO : 1 représentée par la séquence d’acide nucléique suivante :
ACAGTATAAGCATATCGGAGAAATGCCACCACCAGCAACGTTGCTAGACTTGGCGAGGTGCGGCATAGTTCAGTGATATTGCGCCGGGGCATCCCCTGGATATGCTTATCTTCTGAATCTGGGGAACTTGGGAATTCTACGAGTCGACAGCCGCCGAGCCCTGGGCACGGGACAGGGGCCACAAGCTCTTGCACGATGGCACTATTCTAGAGCAGAAGTGAGCATAACGTTGCGATTGACCATGTTGGCAAAGCATGGGTTACATACCTACTCGTGCTAAGAACCCCGAAAGGGAAGCTTCATAAGTTGACTTCAGATTTCGCTGAACAATAGGAGGCTCCACAATCACTTATAAATATGCTGCATATCCTTCCAGCACTTCGGATGAAAATTCCATCCAGCAGCAGCAACTTGGAGAGCTCTTTTCAGCAGCAACTTCTTCCTTTCAAAGCATCTCTTGACAACCTTTGCTGAATCTCAAACACTTCACCATGTTGGGCTTCCTCGGAAAATCCGTGGCCCTGCTTGCTGCGCTGCAGGCCACTCTCATTTCTGCATCTCCTGTAACTGCAAACGACGTCTCTGTTGAGAAGAGAGCCAGTGGATACGCAAACGCCGTCTACTTCACCAACTGGTAAGTGAAGCTGCTTCAGAGTCATGAAAATCAGGACTAACCATTGGTGATTAAAGGGGTATTTACGGCCGCAACTTCCAGCCTCAGAACCTGGTCGCGTCGGACATCACTCATGTCATCTACTCGTTCATGAACTTCCAAGCAGACGGCACTGTGTAAGTTTTGAAGACAAGAGTCAAGATATTCTAATTTCCATATCCAGTGACTAATCTTTTCACTTATAGCGTCTCTGGAGATGCCTACGCCGATTATCAGAAGCACTATGACGACGATTGTATGCTAGCCCTACTCCCTTTGTTCTCTCCTGTTTTTGAGCTCTTCAGGTATACTAACGTCTACAACAGCTTGGAACGACGTCGGTAACAATGCGTACGGCTGTGTGAAGCAGCTGTTCAAGCTGAAGAAGGCCAACCGCAACTTGAAGGTTATGCTTTCCATCGGTGGCTGGACCTGGTCCACCAACTTTCCTTCTGCAGCAAGCACCGATGCCAACCGCAAGAACTTTGCCAAGACTGCCATCACCTTCATGAAGGACTGGGGTTTCGATGGTATTGACGTCGATTGGGAGTACCCCGCCGATGATACCCAGGCCACCAACATGGTTCTTCTGCTCAAGGAGATCCGATCTCAGCTAGATGCCTATGCTGCGCAATACGCTCCGGGCTACCACTTCCTTCTTTCCATTGCTGCCCCCGCTGGCCCAGAGCACTACTCTTTCCTGCACATGTCCGACCTTGGCCAAGTTCTCGACTATGTCAACCTCATGGCCTACGACTATGCTGGTTCTTGGAGCAGCTACTCCGGACACGATGCCAACTTGTTTGCCAACCCGTCCAACCCCAACTCTTCACCATACAACACCGATCAAGCTATCAAGGACTATATCAAGGGAGGTGTTCCCGCAAGCAAGATCGTTCTTGGCATGCCCATCTACGGACGAGCTTTTGAGAGCACCGGTGGCATTGGCCAGACCTACAGTGGAATTGGATCTGGAAGCTGGGAGAACGGTATTTGGGACTACAAGGTTCTTCCCAAGGCCGGCGCCACAGTCCAGTATGACTCTGTCGCACAGGCATACTACAGCTATGACCCCAGCAGCAAGGAGCTCATCTCTTTCGATACCCCTGACATGATCAACACCAAGGTCTCTTACCTCAAGAACCTCGGCCTGGGAGGCAGCATGTTCTGGGAAGCTTCTGCTGACAAGACTGGCTCTGACTCCTTGATCGGAACAAGCCACAGAGCTTTGGGAAGCCTAGACTCCACTCAGAACTTGCTGAGCTACCCCAACTCCCAGTATGATAACATCCGAAGCGGTCTCAACTAGAGATCTTTCTTCTTCTTATCTTTTTCTTTTACTTCCCCTATGGTTGTACCAACATTTCACACACGTTATGCGAAACGATTATGCAGGGAGCGTTATTTTTTAGTAAATAGTTGCCCTTTGAGATATATGAACCTGTACATAAAGAACTACTAGCAGTATATAAGGAGACATGCAGG.
Au sens de l’Invention, l’identité de séquence est mesurée par les outils classiques de comparaison de séquences connues de l’Homme du métier tels que les algorithmes de la plateforme BLAST ou le programme MatGat (Campanella, Bitincka and Smalley, 2003).
Plus particulièrement, un des objets de l’invention est la souche isolée deTrichoderma atroviridedéposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM I-5333.
Par « souche isolée », on entend la culture d’un microorganisme unique qui a été isolée à partir de différents microorganismes présents sur et/ou dans les tissus d’un fragment de feuille de blé cultivé en champs.
De façon très particulière, un des objets de l’invention concerne une souche isolée deTrichoderma atroviridedont le gèneech42possède une identité de séquence d’au moins 98% avec la séquence SEQ ID NO : 1 du gèneech42de la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM I-5333,
en particulier ladite souche isolée deTrichoderma atrovirideest la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM I-5333.
Selon ce même aspect, un autre des objets de l’invention concerne la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention sous forme de spores, produites par fermentation en milieu solide ou liquide, lesdites spores pouvant être sous forme purifiée ou dans la matrice de production, ladite matrice de production étant solide ou liquide.
Par « sous forme de spores », on entend sous forme de conidiospores ou chlamydospore, (plus particulièrement conidiospores) assurant la fonction de multiplication asexuée chez le champignon.
Par «fermentation enmilieusolide (FMS) », on entend tout procédé permettant le développement du micro-organisme à la surface et/ou à l’intérieur d’une matrice de production poreuse solide et humidifiée, en absence d’eau libre.
Par « fermentation liquide », on entend tout procédé permettant le développement du micro-organisme à l’aide d’une matrice de production avec présence d’eau libre.
Par « matrice de production », on entend tout substrat naturel et/ou synthétique, qui permet le développement du micro-organisme et induit la production de biomasse, et/ou d’enzymes, et/ou de métabolites primaires et/ou secondaires. Des exemples de familles d’enzyme ou d’enzyme produites par le champignon sont des protéases, des chitinases et labêta-1,3-glucanase.
Par « spores […] sous forme purifiées », on entend les spores concentrées suite à l’élimination de la majeure partie du reste de la matrice après production n’ayant pas servi à la formation des spores, avec l’aide d’un procédé de tamisage par exemple.
Par « spores […] dans la matrice de production », on entend les spores restées dans la matrice de production à l’issue du process de fabrication, sans étape de purification.
Un autre des objets de l’invention concerne la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention en tant qu’agent de lutte biologique.
Par « agent de lutte biologique », on entend qu’une souche deTrichoderma atrovirideselon l’invention peut interférer avec la croissance et/ou la survie des agents pathogènes permettant ainsi de les contrôler et ce,vial’un ou plusieurs des modes d’action décrits précédemment (e.g. viale développement de sa biomasse et/ou sa production d’enzymes et/ou de métabolites secondaires). Par exemple, un des moyens de mettre en évidence qu’une souche deTrichoderma atrovirideselon l’invention est un agent de lutte biologique est la réalisation d’un testDual culturesur milieu de culture en boîte de Pétri comme ceux présentés parmi les exemples ci-après. Plus précisément par «test Dual culture», on entend un test sur boîte de Pétri en laboratoire sur milieu de culture, où la souche du microorganisme agent de lutte biologique et la souche du pathogène sont mises en culture sur la même boîte afin d’observer l’effet d’une souche sur une autre au cours du temps etvice versa.
Un autre des objets de l’invention concerne la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention, en tant qu’agent antifongique de végétaux.
Par « agent antifongique de végétaux », on entend qu’une souche deTrichoderma atrovirideselon l’invention est capable de lutter contre les champignons phytopathogènes. Par exemple, un des moyens de mettre en évidence qu’une souche deTrichoderma atrovirideselon l’invention est un agent antifongique de végétaux est la réalisation d’un testDual culturecomme ceux présentés parmi les exemples ci-après.
De façon très particulière, un des objets de l’invention concerne la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention en tant qu’agent de lutte biologique,
en particulier en tant qu’agent antifongique de végétaux dirigé contre un champignon pathogène pour végétaux, ledit champignon pathogène étant notamment choisi parmiSeptoria triticiouGibberella zeae(=Fusarium graminearum) ouPuccinia reconditaouPuccinia striiformis.
Un second aspect de l’invention concerne l’utilisation de la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention, en particulier dans le domaine de la malterie.
Plus particulièrement, l’invention concerne l’utilisation de ladite souche isolée deTrichoderma atroviridedans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux, notamment de végétaux appartenant à la famille desPoaceae, en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation de ladite souche isolée deTrichoderma atroviridedans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques du blé et/ou du maïs et/ou de l’orge.
L’invention concerne également l’utilisation de ladite souche isolée deTrichoderma atroviridepour favoriser la germination d’une semence de végétaux appartenant à la famille desPoaceae, en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation de ladite souche isolée deTrichoderma atroviridepour favoriser la germination d’une semence de blé et/ou de maïs et/ou d’orge. Concernant cet aspect particulier, il convient de noter que l’aide à la germination permet avantageusement eten même tempsla prévention et/ou le traitement de maladies fongiques au moment du semis. Le développement d’une maladie après le semis est ainsi évité et le rendement est optimisévial’aspect biostimulant de la souche de l’invention. Avantageusement, cet aspect permet également d’éviter un ralentissement important du développement de la culture si quelques temps après le semis une période de sécheresse se présente (ce qui peut arriver au printemps) et donc d’éviter des pertes de rendements à la récolte.
Un troisième aspect de l’invention concerne une composition phytosanitaire comprenant :
  • la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention en tant que principe actif ; ou
  • les métabolites émis lors de la production la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention en tant que principe actif ; ou
  • la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention et ses métabolites émis lors de sa production en tant que principe actif ; ou
  • la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention en association avec au moins un autre agent de lutte biologique (BCA) en tant que principe actif ; ou
  • la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention et ses métabolites émis lors de la production de la souche en association avec au moins un autre agent de lutte biologique en tant que principe actif.
Par « métabolites émis lors de la production de la souche » ou « ses métabolites émis lors de sa production », on entend toute molécule produite par la souche de l’invention au cours de son développement. Par exemple et de manière non limitative, de tels métabolites peuvent être des enzymes produites par le champignon telles que des protéases, des chitinases et labêta-1,3-glucanase.
Par « agent de lutte biologique », on entend un microorganisme pouvant interférer avec la croissance et/ou la survie des agents pathogènes permettant ainsi de les contrôler. La souche de l’invention TAL-17 (déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM I-5333) en est un exemple, mais au sens de l’invention il s’agit ici de combiner la souche de l’invention à au moins un autre agent de lutte biologique, lequel est différent de la souche de l’invention. Par « au moins un autre agent de lutte biologique », on entend que la composition phytosanitaire de l’invention peut contenir 2 agents de lutte biologique (celui de l’invention et un autre), tout comme elle peut en contenir 3, 4 ou 5 (celui de l’invention et 2, 3 ou 4 autres).
Plus particulièrement, un des objets de l’invention concerne la composition phytosanitaire précédemment décrite, ladite composition phytosanitaire se présentant à la base (à l’achat) sous la forme d’une composition solide ou liquide concentrée. Une telle composition solide ou liquide concentrée peut être, par exemple, obtenue grâce à une formulation particulière des spores de la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention produites par fermentation en milieu solide ou liquide, lesdites spores pouvant être sous forme purifiée ou dans la matrice de production, ladite matrice de production étant solide ou liquide.
Par « composition […] concentrée », on entend une composition dans laquelle la concentration du principe actif (i.e.la souche de l’invention, laquelle peut être sous forme de spores) est supérieure à une quantité efficace de 107spores/g soit 107UFC/g. Aussi, un aspect particulier de l’invention concerne la composition phytosanitaire comprenant la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention en tant que principe actif, ladite composition phytosanitaire se présentant sous la forme d’une composition solide ou liquide concentrée dans laquelle la concentration du principe actif est supérieure à une quantité efficace de 107spores/g.
Par « supérieure à une quantité efficace de 107spores/g », on entend également supérieure à une quantité efficace de 108spores/g, supérieure à une quantité efficace 109spores/g, supérieure à une quantité efficace 1010spores/g, supérieure à une quantité efficace 1011spores/g ou supérieure à une quantité efficace 1012spores/g.
L’utilisateur de la susdite composition doit alors incorporer ou mettre en suspension celle-ci dans un milieu solide (e.g.terreau,etc.) ou aqueux (e.g.eau) pour obtenir une composition diluée comprenant une quantité efficace de 104à 1012spores/g de la soucheTrichoderma atroviridede l’invention, laquelle peut être sous forme de spores. La composition solide ou liquide diluée obtenue peut alors être épandue sur les plantes dont la prévention et/ou le traitement d’une maladie fongique de plante est souhaité.
Au sens de l’Invention, l’épandage de la susdite composition comprend notamment les techniques d’épandage classiques connues de l’Homme du métier, lesquelles servent à répandre sur une zone à traiter des matières solide (e.g.boues d’épuration, fumier,etc.) ou liquide (e.g.pesticides,etc.) présentant un intérêt agronomique.
Plus particulièrement, un des objets de l’invention concerne la composition phytosanitaire précédemment décrite, comprenant une quantité efficace de 104à 1012spores/g, plus particulièrement de 107à 109spores/g,
ladite composition phytosanitaire étant éventuellement obtenue après une étape de préparation (e.g.dilution par mise en suspension ou mélange) la rendant prête à l’épandage.
Par « quantité efficace de spores/g », on entend le nombre de spores capables de former une colonie sur milieu de culture (UFC=unitéformantcolonie) par g (gramme) de produit.
De plus, l’expression « de 104à 1012spores/g » peut également signifier de 104à 105spores/g, de 104à 106spores/g, de 104à 107spores/g, de 104à 108spores/g, de 104à 109spores/g, de 104à 1010spores/g, de 104à 1011spores/g, de 105à 106spores/g, de 105à 107spores/g, de 105à 108spores/g, de 105à 109spores/g, de 105à 1010spores/g, de 105à 1011spores/g, de 105à 1012spores/g, de 106à 107spores/g, de 106à 108spores/g, de 106à 109spores/g, de 106à 1010spores/g, de 106à 1011spores/g, de 106à 1012spores/g, de 107à 108spores/g, de 107à 109spores/g, de 107à 1010spores/g, de 107à 1011spores/g, de 107à 1012spores/g, de 108à 109spores/g, de 108à 1010spores/g, de 108à 1011spores/g, de 108à 1012spores/g, de 109à 1010spores/g, de 109à 1011spores/g, de 109à 1012spores/g, de 1010à 1011spores/g, de 1010à 1012spores/g ou de 1011à 1012spores/g.
Au sens de l’invention, celle-ci concerne également une composition phytosanitaire d’enrobage comprenant la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention et éventuellement au moins un agent de fixation, ladite composition phytosanitaire d’enrobage permettant de produire une semence enrobée. L’invention concerne donc aussi bien une composition phytosanitaire d’enrobage comprenant la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention, ladite composition phytosanitaire d’enrobage permettant de produire une semence enrobée ; qu’une composition phytosanitaire d’enrobage comprenant la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention et au moins un agent de fixation, ladite composition phytosanitaire d’enrobage permettant de produire une semence enrobée.
Un des objets de l’invention concerne par conséquent une semence enrobée comprenant une graine de végétal et ladite composition phytosanitaire d’enrobage, ledit végétal appartenant notamment à la famille desPoaceae, en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne une semence enrobée comprenant une graine de végétal et ladite composition phytosanitaire d’enrobage, ledit végétal étant du blé et/ou du maïs et/ou de l’orge.
Un quatrième aspect de l’invention concerne, l’utilisation de la composition de l’invention.
Plus particulièrement, l’invention concerne l’utilisation de la composition de l’invention dans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux, notamment de végétaux appartenant à la famille desPoaceae, en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation de la composition de l’invention dans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques du blé et/ou du maïs et/ou de l’orge.
L’invention concerne également l’utilisation de la composition de l’invention pour favoriser la germination d’une semence de végétaux appartenant à la famille desPoaceae, en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation de la composition de l’invention pour favoriser la germination d’une semence de blé et/ou de maïs et/ou d’orge.
De façon très particulière, un des objets de l’invention concerne l’utilisation de la souche isolée deTrichoderma atroviridede l’invention ou de la composition phytosanitaire décrite ci-dessus dans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux, notamment de végétaux appartenant à la famille desPoaceae, en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge ; et/ou
pour favoriser la germination d’une semence de végétaux appartenant à la famille desPoaceae, en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
Un cinquième aspect de l’invention concerne un procédé de protection et/ou de traitement d‘un végétal contre une maladie provoquée par un champignon pathogène pour végétaux comprenant l’application de la composition de l’invention sur au moins une partie dudit végétal ou du sol à proximité dudit végétal.
Plus particulièrement, l’invention concerne ledit procédé de l’invention, où ladite partie dudit végétal est une feuille, un fruit, une graine.
De façon très particulière, un des objets de l’invention concerne un procédé de protection et/ou de traitement d‘un végétal contre une maladie provoquée par un champignon pathogène pour végétaux comprenant l’application de la composition de l’invention sur au moins une partie dudit végétal ou du sol à proximité dudit végétal,
en particulier ladite partie dudit végétal est une feuille, un fruit, une graine, et
en particulier ledit végétal appartient à la famille desPoaceae, notamment le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
Toujours selon ce cinquième aspect, l’invention concerne le procédé ci-dessus décrit, dans lequel ladite composition est épandue
  • à raison de 10 à 500 L/ha, en particulier de 50 à 250 L/ha, notamment pour la pulvérisation aérienne ; ou
  • à raison d’une quantité efficace de 1010à 1014spores/ha, en particulier de 1010à 1012spores/ha, notamment pour les épandages aériens de type pulvérisation foliaire.
L’expression « de 10 à 500 L/ha (litre/hectare) » signifie également de 10 à 400 L/ha, de 10 à 300 L/ha, de 10 à 200 L/ha, de 10 à 100 L/ha, de 100 à 500 L/ha, de 200 à 500 L/ha, de 300 à 500 L/ha, de 400 à 500 L/ha, de 50 à 500 L/ha, de 50 à 250 L/ha ou de 250 à 500 L/ha. L’expression « de 1010à 1014spores/ha » signifie également de 1010à 1011spores/ha, de 1010à 1013spores/ha, de 1011à 1012spores/ha, de 1011à 1013spores/ha, de 1011à 1014spores/ha, de 1012à 1013spores/ha, de 1012à 1014spores/ha ou de 1013à 1014spores/ha.
L’invention concerne plus particulièrement le procédé ci-dessus décrit, dans lequel ledit végétal appartient à la famille desPoaceae, en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne le procédé ci-dessus décrit, dans lequel ledit végétal est le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
L’invention concerne préférentiellement le procédé ci-dessus décrit, dans lequel ledit champignon pathogène estSeptoria triticiouGibberella zeae(=Fusarium graminearum) ouPuccinia reconditaouPuccinia striiformis.
Par «Septoria tritici», on entend l’agent pathogène de la septoriose.
Par «Gibberella zeae(=F. graminearum) », on entend l’agent pathogène de la fusariose.
Par «Puccinia recondita», on entend l’agent pathogène de la rouille brune du blé.
Par «Puccinia striiformis», on entend l’agent pathogène de la rouille jaune du blé.
L’invention concerne plus particulièrement le procédé ci-dessus décrit, dans lequel
  • la protection dudit végétal comprend la pulvérisation de ladite composition au moment du semis ou à la germination dudit végétal ; et/ou
  • le traitement dudit végétal comprend la pulvérisation de ladite composition aux cours de différents stades phénologiques de la plante en prévention d’un risque d’infection dudit champignon pathogène de l’ensemble ou une partie de la plante.
La présente invention est par ailleurs illustrée, sans toutefois s'y limiter, par les figures et exemples suivants.
LISTE DES FIGURES
La figure 1 représente les observations visuelles du testDual culturecontreFusarium graminearum, à gauche des boîtes de Pétri, à 6 (A et B) et 10 (C et D) jours de cultures pour la souche TAL-17 (A et C) et la souche BCA C (B et D), à droite des boîtes de Pétri.
La figure 2 représente l’observation microscopique (grossissement x100) avec un microscope inversé des mycéliums deF. graminearum(flèche noire) et de la souche TAL-17 (flèche blanche) sur boite de Pétri contenant du milieu PDA (pomme de terre,dextrose,agar), après 8 jours de croissance.
La figure 3 représente la surface occupée (en %) et les photographies associées de la face avant d’une boite de Pétri inoculée au râteau avec trois souches de microorganismes (F. graminearum, TAL-17 et BCA C seuls ou en mélanges après 7 jours de croissance. Moyenne ± s.d. Des lettres différentes indiquent une différence significative entre les modalités (ANOVA 1 facteur, p<0,05).
La figure 4 représente l’évolution de la surface occupée par les microorganismes BCA TAL-17 etFusarium graminearumseuls ou en mélange après dépôt de 30 µL au centre d’une boîte de culture avec milieu PDA au bout de 72 h (A) et au bout de 96 h (B) de culture à 25°C sous hotte lumineuse.
La figure 5 représente l’évolution du pourcentage d’inhibition deFusarium graminearumsur boîte en fonction de la formulation utilisée.
La figure 6 représente le pourcentage de tubes CIV présentant des tâches de septoriose en fonction du traitement après 18 jours et 26 jours d’inoculation de la maladie.
La figure 7 représente le pourcentage de grains sains observés à la récolte au cours des essais en salle phytotronique.
La figure 8 représente la masse de grains par épis à la récolte au cours des essais en salle phytotronique.
La figure 9 représente le pourcentage de symptômes visuels de contamination sur épis par la fusariose au cours des essais en salle phytotronique.
La figure 10 représente la masse de grains par épis à la récolte au cours des essais en salle phytotronique.
La figure 11 représente le pourcentage de grains fusariés à la récolte au cours des essais en salle phytotronique réalisés.
La figure 12 représente la germination de plants de maïs après 6 jours de croissance avec un traitement au semis d’une suspension de spores de TAL-17 à 1.105spores UFC/graine ou 1.108spores UFC/graine. Un traitement aérien est réalisé plus tard lors du stade 5 feuilles et ne rentre pas en compte au moment de la mesure de la germination. Moyenne ± s.d. Des lettres différentes indiquent une différence significative entre les différentes modalités (ANOVA 1 facteur, p<0,05).
La figure 13 représente la mesure de la taille en hauteur de plants de maïs après 25 jours de croissance avec un traitement au semis d’une suspension de spores de TAL-17 à 1.105spores UFC/graine ou 1.108spores UFC/graine. Un traitement aérien est réalisé plus tard lors du stade 5 feuilles et ne rentre pas en compte au moment de la mesure de la germination. Moyenne ± s.d. Des lettres différentes indiquent une différence significative entre les différentes modalités (ANOVA 1 facteur, p<0,05).
La figure 14 représente le pourcentage de germination de graines de blé de printemps (Calixo) en présence ou non de spores en suspension deTrichoderma atrovirideTAL-17 au semis. Culture en chambre phytotronique avec photopériode. Moyenne ± s.d. Différence significative entre la modalité eau et la modalité TAL-17 (ANOVA 1 facteur, p<0,05).
La figure 15 comprend des photographies (A) et un graphique (B).
(A) Observations visuelles du testDual culturecontreFusarium graminearum, à droite des boîtes de Pétri, à 6 et 10 jours de co-cultures avec la souche TAL-17 (panel du haut) ou la souche BCA D (panel du centre), à gauche des boîtes de Pétri. Le panel du bas correspond à la culture deFusarium graminearumseule. Les flèches blanches indiquent la zone de recouvrement de la souche TAL-17 surFusarium graminearum.
(B) Représentation graphique de la longueur du recouvrement du pathogèneF. graminearum(F. gram) par le BCA en Dual culturesur gélose PDA (25°C sans photopériode).
(I) Isolement de la souche de Trichoderma atroviride TAL-17
Souche isolée d’une feuille de blé cultivé en champs.
Le prélèvement de feuille de la culture du blé a été broyé puis mis au contact en infiniment mélangé d’une gélose de PDA (Potato Dextrose Agar) à 50°C qui contient des spores deFusarium graminearum. La boîte a été mise en culture à 25°C sous hotte lumineuse. Ainsi seules les souches étant capables de se reproduire en présence deFusarium graminearumse sont développées sur la boîte. Parmi ces souches TAL-17 était présente. Un prélèvement spécifique d’une zone présentant un intérêt dans la boîte et plusieurs repiquages successifs ont permis d’isoler la souche TAL-17, laquelle a ensuite été déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM I-5333.
(II) Etude in vitro de l’efficacité et du mode d’action du TAL-17 contre F. graminearum
Compétitivité, mycoparasitisme et antibiose
1/ Tests Dual-culture côte à côte sur boîte de Pétri
Plusieurs tests deDual-cultureavec les BCAvs F. graminearumont été réalisés en proximité sur milieu PDA (Potato Dextrose Agar). On inocule 30 µL contenant 1.104spores/mL (sp/mL) deF. graminearum, à 2 cm de l’extrémité d’une boîte de Pétri de 8,5 cm de diamètre contenant du milieu PDA, et 30 µL contenant 1.106spores/mL d’un autre microorganisme (TAL-17 ou un autreTrichodermaBCA C) à l’autre extrémité de la boîte de Pétri. Les boîtes de Pétri ont été incubées à 23-27°C sous lumière artificielle (24h/24) (tube fluorescent F36WT8/2084 BriteGro®). Des observations macroscopiques ont été réalisées à 6 jours et 10 jours après l’inoculation (Figure 1). Des témoins deF. graminearumseuls et des BCA seuls ont été réalisés. Les souches testées ont été la souche TAL-17 et une autre souche de référence également référencée comme unTrichoderma atrovirideutilisé dans le Biocontrôle (= BCA C > Référence : ATCC®20476).
Les souches TAL-17 et BCA C ont toutes 2 présenté une capacité à occuper l’espace, par contre la souche TAL-17 contrairement à la souche BCA C est capable de se développer sur le mycelium deFusarium graminearum(Figure 1). La souche TAL-17 présente donc un potentiel mycoparasitisme beaucoup plus important que l’autre souche de référence BCA C. Des observations au microscope du mycélium de la souche TAL-17 en présence de mycélium deFusarium graminearumont révélé par ailleurs un enroulement du mycélium de la souche TAL-17 autour deFusarium graminearum(Figure 2), lequel phénomène n’a pas été observé avec l’autre souche deTrichoderma atroviride(= BCA C) testée.
Par rapport à la bibliographie existante sur le sujet, le mycoparasitisme du genreTrichoderma, lequel correspond au genre de la souche TAL-17, a été étudié à de nombreuses reprises et sur de nombreuses cibles. Hibaret al.(Hibar, K., Daami-Remadi, M., Khiareddine, H., & Mahjoub, M. El. (2005). Effet inhibiteur in vitro et in vivo duTrichoderma harzianumsurFusarium oxysporum f. sp. Radicis-lycopersici.) ont présenté un effet inhibiteurin vivoetvitrodeTrichoderma harzianumsurFusarium oxysporum, notamment par des observations microscopiques de la zone de contact entre les deux souches qui met en évidence une lyse importante, accompagnée d’un enroulement de la souche deT. harzianumsurF. oxysporum. Steyaertet al.(Steyaert J., Ridgway H., Elad Y., Stewart A. (2003). Genetic basis of mycoparasitism: A mechanism of biological control by species of Trichoderma. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science; 31(4), 281-291) ont mis en évidence le mycoparasitisme d’une souche deTrichoderma atrovirideautour d’un hyphe d’une souche deBotrytis cinerea. Les résultats microscopiques précédemment décrits confirment de ce fait le potentiel mycoparasitisme accru de la souche TAL-17, notamment par rapport à la souche BCA C.
De plus ces essais sur boîtes ont montré une zone d’inhibition créée par la souche TAL-17 signe d’un potentiel effet d’antibiose et un autre test utilisant du filtrat de culture de la souche TAL-17 a montré quant à lui un effet inhibiteur sur la croissance du pathogèneFusarium graminearum(données non montrées).
2/ Essais en mélange dépôt sur l’ensemble de la surface
Un autre test deDual-cultureavec les BCAvs F. graminearuma été réalisé sur milieu PDA, mais cette fois-ci en mélange, avec étalement de 100 µl sur l’ensemble de la boîte de Pétri (diamètre 8,5 cm). Au centre d’une boîte de Pétri de 8,5 cm contenant du milieu PDA, sont étalés en surface 100 µL d’un mélange contenant 1.104spores/mL deF. graminearumet 1.104spores/mL du BCA (ou 0,5.104spores/mL de chaque BCA pour la modalité mélange BCA), de plus pour certaines modalités ce mélange contient également 0,5% de la formulation Appyphyt, laquelle est une émulsion d’esters d’huile végétale (Esters d’huile végétale : 60-80% ; Emulsionnant biosourcé ; 1-5% ; Qsp Eau). Le mélange a été inoculé après 2 h de contact. Les boîtes de Pétri ont été incubées à 25°C sous lumière artificielle (24h/24) (tube fluorescent F36WT8/2084 Britegro). Des mesures de la croissance deF. graminearum(en cm) ont été prises après 48, 72, 96 et 168 h (i.e.de 2 à 7 jours) de culture après l’inoculation. Des témoins deF. graminearumseul et des BCA seuls ont été réalisés. Les souches testées ont été TAL-17 et BCA C.
Lors de ce test le TAL-17 a été le plus performant, son mycoparasitisme permettant de recouvrir 100% de la boîte face avant à 7 jours (Figure 3).
(III) Essais sur plante afin d’observer si le mode d’action du TAL-17 a un caractère endophyte
Le terme endophyte provient de deux mots grecs «endon» et «phuton» qui signifie respectivement « à l’intérieur » et « végétal ». La définition d’endophyte a très souvent changé au cours du temps. Tout d’abord, la définition concernait tout organisme pouvant vivre à l’intérieur d’une plante. Aujourd’hui, les organismes endophytes sont des organismes ayant un mode de vie avec la plante dit « endophisme ». C’est-à-dire que les espèces endophytes sont capables de coloniser les structures internes des végétaux de façon asymptomatique (Hardoim, P. R., van Overbeek, L. S., Berg, G., Pirttilä, A. M., Compant, S., Campisano, A., … Sessitsch, A. (2015). The Hidden World within Plants: Ecological and Evolutionary Considerations for Defining Functioning of Microbial Endophytes.Microbiology and Molecular Biology Reviews, 79(3), 293–320.). Les endophytes peuvent être des microorganismes comme les champignons. Ils peuvent coloniser la plante à différents niveaux selon le micro-organisme. Les organes concernés peuvent être suivant les cas : la tige, les racines, les segments de feuilles, les fruits, les bourgeons, les graines mais aussi dans les cellules hyalines mortes et creuses des plantes (Stępniewska, Z., & Kuźniar, A. (2013). Endophytic microorganisms--promising applications in bioremediation of greenhouse gases.Applied Microbiology and Biotechnology, 97(22), 9589–96.).
Méthode préparation des échantillons pour observation
Le bleu de coton (LACP-00D-100 Labkem®) au lactophénol a été utilisé dans cette étude comme colorant pour la mise en évidence des champignons. Des échantillons de feuille de blé de 1 x 0,5 cm et de maïs de 2,5 x 1,5 cm ont été prélevés pour chaque modalité étudiée. La démarche est la suivante pour le traitement des coupes :
  1. Mordançage à l’eau de javel (3 min)
  2. Lavage dans l’eau ultra pure
  3. Coloration dans le bleu coton lactophénol (3 min)
  4. Rinçage dans le lactoglycérol
  5. Les échantillons sont ensuite placés sous lame et lamelle pour une observation microscopique (x 400).
1/ Essais sur le blé
6 graines de blé ont été semées par pot de 0,5 L et percé au fond pour le drainage. Le substrat utilisé est un mélange de terreau universel et de vermiculite expansée (0,5-10 mm) (2:1 v/v). Le substrat a été humidifié 24 h avant le semis avec de l’eau osmosée. Les graines ont été humidifiées la veille du semis pendant 24 h à 4°C. Une fois le semis réalisé, les pots ont été placés sous hotte lumineuse à 25°C (photopériode 16/8 heures) et ont été arrosés trois fois par semaine.
Différentes traitements ont été réalisés. Pour le traitement au semis, 1 mL de la solution de TAL-17 à la concentration souhaitée a été ajouté sur la graine semée (500 µL avant le dépôt de la graine et 500 µL après). Pour le témoin et les autres conditions testées, les graines n’ont pas reçu de traitement de BCA mais 1 mL d’eau de forage stérile. Le traitement en pulvérisation a été effectué lors du stade 2 feuilles ou lors du stade floraison. Les pots ne recevant pas de traitements au BCA ont été traités avec de l’eau de forage par le même dispositif. Les premières feuilles situées au plus bas de la plante ont été utilisées pour cet essai.
Du mycelium de champignon a été observé dans les feuilles et racines de la plante traitée au semis contrairement à la plante témoin non traité au semis.
2/ Essais sur le maïs
3 graines sont semées par pot de 5 L percés au fond pour le drainage. Le substrat utilisé est un mélange de terreau universel et de vermiculite expansée (0,5-10 mm) (2:1 v/v). Le substrat a été humidifié 24 h avant le semis avec de l’eau osmosée. Les pots ont été arrosés trois fois par semaine avec un volume d’eau osmosée croissant en fonction du développement de la plante.
Pour le traitement au semis, 1 mL de la solution de TAL-17 à la concentration souhaitée (105ou 108/mL) a été ajouté sur la graine semée (500 µL avant le dépôt de la graine et 500 µL après). Pour le témoin et les autres conditions testées, les graines n’ont pas reçu de traitement de BCA mais 1 mL d’eau de forage stérile. Le traitement en pulvérisation a été effectué lors du stade 5 feuilles.
Du mycelium de champignon a été observé dans les feuilles et racines de la plante traitée au semis contrairement à la plante témoin non traité au semis.
Finalement, ces tests (cf.exemples II et III) ont montré que la souche TAL-17 est capable d’agir contreFusarium graminearumde différentes façons. Elle cumule compétition, antibiose, mycoparasitisme et est capable de pénétrer dans la plante.
(IV) Stratégie d’inoculation du BCA
Développement de formulations
1/ Essais en mélange avec dépôt au centre
Un autre test deDual-cultureavec les BCAvs F. graminearuma été réalisé sur milieu PDA, mais cette fois-ci en mélange, avec dépôt d’une goutte au centre de la boîte (30 µl). Dans ce test seule TAL-17 a été testée. Des mesures de la croissance deF. graminearum(en cm) ont été prises après 48, 72 et 96 h de culture (Figure 4).
Au centre d’une boîte de Pétri de 8,5 cm contenant du milieu PDA, ont été inoculés 30 µL d’un mélange contenant 1.104spores/mL deF. graminearumet 1.104spores du BCA, de plus pour certaines modalités ce mélange contient également 0,5% de la formulation Appyphyt, laquelle est une émulsion d’esters d’huile végétale (Esters d’huile végétale : 60-80% ; Emulsionnant biosourcé ; 1-5% ; Qsp Eau). Le mélange a été inoculé après 2 h de contact. Les boîtes de Pétri ont été incubées à 23-27°C sous lumière artificielle (24h/24) (tube fluorescent F36WT8/2084 BriteGro®). Des mesures de la croissance deF. graminearumont été réalisées de 2 à 7 jours après l’inoculation. Des témoins deF. graminearumseul et du BCA seul ont été réalisés.
La souche TAL-17 a permis une réduction de l’ordre de 63% du développement deFusarium graminearumsur boîte de Pétri à 72 h et 78% à 96 h. Cette réduction est montée à 77% à 72 h et à 85% à 96 h lorsqu’elle est couplée à la formulation Appyphyt (Figure 5). Il convient de noter qu’à 96 h la formule Appyphyt seule n’a pas montré d’inhibition sur la croissance deFusarium graminearum.
2/ Enrobage de graines
Les résultats précédents, lesquels ont démontré l’aspect endophyte, indiquent un intérêt potentiel à enrober les graines des cultures visés avec la souche TAL-17. Cet intérêt a été confirmé par les essais de bio stimulation sur la germination (voir ci-après).
(V) Effet des BCA sur la protection des plantes
Etude en salle phytotronique
1/ Septoriose
La culturein vitroa été développée pour réaliser unscreeningdes potentiels BCAs sélectionnés contre la septoriose du bléSeptoria tritici. Le milieu de culturein vitrostandard a été modifié en enlevant le saccharose afin d’éviter d’éventuelles contaminations.
Deux tests ont été réalisés.
La maladie et le BCA ont été appliqués simultanément par pulvérisation dans des conditions se rapprochant le plus possible du champ.
Les pourcentages de plants présentant des tâches de septoriose suivant les modalités sont présentés Figure 6. DeuxTrichoderma atrovirideont été testés dont TAL-17. Cette dernière s’est révélée être la plus intéressante contre cette maladie. A noter la quantité de BCA est en nombre de spores viables (équivalent 5.1011spores viables/hectare).
2/ Fusariose
La salle phytotronique a la possibilité de monter à 90% d’humidité HR pendant l’infection au moment de la floraison des épis. Le plateau permet de tester 30 jardinières de 15 plants. Les tests ont été réalisés avec le blé de printemps « Calixo ».
Les traitements avec BCA ont été pour ces tests exclusivement réalisés au moment de la floraison et les BCA utilisés sont :
  • TAL-17 (cf.Exemple I) ;
  • BCA A >Trichoderma asperellum(Réf : ATCC®52438) et
  • BCA B >Trichoderma atroviride(Réf. Interne : BCA B-15).
Un premier test a montré un intérêt pour la souche TAL-17 (Figures 7 et 8). Cet intérêt a été confirmé grâce à un nouveau test (Figures 9, 10 et 11). Ce dernier a mis en évidence un intérêt à l’utilisation du TAL-17 (équivalent 1011spores UFC/ha) avec la formulation Appyphyt (équivalent 1L/ha) sur le blé pour les symptômes visuels de la maladie et sur la masse de grains par épis qui sont alors tous deux statistiquement différents de la modalité contaminée auFusarium graminearumseul. Cependant la masse de grains par épis quand le blé a été traité avec le TAL-17 et la formule Appyphyt n’atteint pas la masse du blé témoin non contaminé (i.e.0,831 g/épis pour la figure 8 et 0,77 g/épis pour la figure 10).
En conclusion la souche TAL-17 a montré un intérêt pour une application au stade floraison du blé mais au vu de son caractère endophyte, une application beaucoup plus précoce présente un intérêt dans la lutte contre la fusariose de l’épi.
De plus une stratégie de traitement avec demi-dose de fongicide est possible.
Etude en salle phytotronique / serre / biostimulation
1/ Essais en serre sur maïs
Trois graines ont été semées par pot de 5 L percés au fond pour le drainage. Le substrat utilisé est un mélange de terreau universel et de vermiculite expansée (0,5-10 mm) (2:1 v/v). Le substrat a été humidifié 24 h avant le semis avec de l’eau osmosée. Les pots ont été arrosés trois fois par semaine avec un volume d’eau osmosée croissant en fonction du développement de la plante.
Les traitements réalisés ont été identiques à ceux de l’Exemple (III), 1/.
Pour rappel, le témoin (A) n’a pas reçu de traitement ; le traitement au semis (B et C) a été réalisé avec une solution de TAL-17 de 1.105ou 1.108spores/graine (sp/graine) ; le traitement en pulvérisation au stade 5 feuilles (D et E), soit 21 jours de croissance, a été réalisé avec une solution de TAL-17 de 1.1011ou 5.1011spores/ha.
Les résultats obtenus pour le pourcentage de germination sur des plants âgés de 6 jours sont représentés sur la figure 12. Les valeurs pour les plants de maïs n’ayant pas (témoin) ou pas encore (pulvérisation aérienne) reçus de traitements au TAL-17 sont statistiquement identiques et de l’ordre de 80%. De même avec le traitement au BCA au semis à 1.105spores/graine, aucune différence significative n’est visible par rapport au témoin non traité. Par contre, avec le traitement au semis de 1.108spores/graine, soit une concentration 1000x supérieures à la précédente, le pourcentage de germination atteint les 100% dès 6 jours après le semis. Après 9 jours de croissance (données non présentées), le taux de germination tend vers 97% pour les modalités ayant reçu le traitement au semis à 1.105spores/graine et pour celles n’ayant pas encore reçu le traitement aérien. La modalité témoin, sans traitement, augmente jusqu’à un pourcentage de germination de 93%.
Les résultats des mesures de la taille en hauteur des plants âgés de 25 jours représentés sont présentés en figure 13, et ont mis en évidence une différence statistique du traitement au semis du TAL-17 face au traitement en pulvérisation aérienne et au témoin. Les traitements au semis à 1.105et 1.108spores/graine (spores viables) permettent une croissance des plants de l’ordre de 105 cm, tandis que les traitements aériens, réalisé 4 jours plus tôt et le témoin, ne permettent qu’une croissance allant de 97 cm pour le témoin, à 100,5 cm pour le traitement aérien à 1.1011spores/ha et 101 cm pour le traitement à 5.1011spores/ha. Ces valeurs sont retrouvées dans un même groupe statistique.
2/ Essais en salle phytotronique sur blé
Culture :
6 graines de blé ont été semées par pot de 0,5 L et percé au fond pour le drainage. Le substrat utilisé est un mélange de terreau universel et de vermiculite expansée (0,5-10 mm) (2:1 v/v). Le substrat a été humidifié 24 h avant le semis avec de l’eau osmosée.
Pour la disposition des pots dans la salle phytotronique, ils ont été regroupés par groupe de 3 dans une soucoupe de jardinières. 12 « jardinières » ont été ensemencées avec 0,5 mL d’une suspension de spores de TAL-17 à 106spores UFC/graines dans 0,5 mL et 18 jardinières ont été ensemencées avec 0,5 ml d’eau de forage stérile afin de s’affranchir d’un apport d’eau différents suivant les traitements.
Les pots ont été placés dans la salle phytotronique (photopériode 16/8h) et ont été arrosés deux fois par semaine.
Le pourcentage de germination a été observé à 4 et 11 jours suivant les modalités.
Ce pourcentage moyen est calculé par jardinière (soit sur 18 graines) puis l’ensemble des données des jardinières pour chaque modalité a été traité statistiquement par ANOVA (p<0.05).
Il en ressort que les modalités inoculées avec la souche TAL-17 ont présenté un taux de germination supérieur à la modalité témoin eau de 5% à 11 jours (Figure 14). Cette différence est significative statistiquement.
(VI) Comparaison de la souche TAL-17 à d’autres BCA
Tests Dual-culture côte à côte sur boîte de Pétri (suite de la partie (II) 1/)
Le protocole expérimental a été le même que celui décrit précédemment. La souche TAL-17 a été comparée à la souche BCA D (=Trichoderma atroviride, Réf. : I-12137). Le testDual culturea été réalisé avec 30 µl de BCA ou deF. graminearumdéposés aux extrémités de la boite de Pétri. Après 6 et 10 jours de culture à 25°C sur PDA sous hotte lumineuse avec photopériode de 16 h, les boîtes ont été observées (Figure 15A) et la longueur du recouvrement du pathogène par le BCA a été mesuré (Figure 15B).
Dans cet exemple également, la souche TAL-17 a présenté la particularité de se développer sur le mycelium du pathogène au cours du temps, contrairement au BCA D.

Claims (12)

  1. Souche isolée deTrichoderma atroviridedont le gèneech42possède une identité de séquence d’au moins 98% avec la séquence SEQ ID NO : 1 du gèneech42de la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM I-5333,
    en particulier ladite souche isolée deTrichoderma atrovirideest la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM I-5333.
  2. Souche isolée deTrichoderma atrovirideselon la revendication 1, sous forme de spores, produites par fermentation en milieu solide ou liquide, lesdites spores pouvant être sous forme purifiée ou dans la matrice de production, ladite matrice de production étant solide ou liquide.
  3. Souche isolée deTrichoderma atrovirideselon la revendication 1 ou 2, en tant qu’agent de lutte biologique,
    en particulier en tant qu’agent antifongique de végétaux dirigé contre un champignon pathogène pour végétaux, ledit champignon pathogène étant notamment choisi parmiSeptoria triticiouGibberella zeae(=Fusarium graminearum) ouPuccinia reconditaouPuccinia striiformis.
  4. Composition phytosanitaire comprenant :
    • la souche isolée deTrichoderma atrovirideselon l’une quelconque des revendications 1 à 3 en tant que principe actif ; ou
    • les métabolites émis lors de la production la souche isolée deTrichoderma atrovirideselon l’une quelconque des revendications 1 à 3 en tant que principe actif ; ou
    • la souche isolée deTrichoderma atrovirideselon l’une quelconque des revendications 1 à 3 et ses métabolites émis lors de sa production en tant que principe actif ; ou
    • la souche isolée deTrichoderma atrovirideselon l’une quelconque des revendications 1 à 3 en association avec au moins un autre agent de lutte biologique en tant que principe actif ; ou
    • la souche isolée deTrichoderma atrovirideselon l’une quelconque des revendications 1 à 3 et ses métabolites émis lors de la production de la souche en association avec au moins un autre agent de lutte biologique en tant que principe actif.
  5. Composition phytosanitaire selon la revendication 4, comprenant une quantité efficace de 104à 1012spores/g, plus particulièrement de 107à 109spores/g,
    ladite composition phytosanitaire étant éventuellement obtenue après une étape de préparation la rendant prête à l’épandage.
  6. Utilisation de la souche isolée deTrichoderma atrovirideselon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou de la composition phytosanitaire selon la revendication 4 ou 5 dans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux, notamment de végétaux appartenant à la famille desPoaceae, en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge ; et/ou
    pour favoriser la germination d’une semence de végétaux appartenant à la famille desPoaceae, en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
  7. Composition phytosanitaire d’enrobage comprenant la souche isolée deTrichoderma atrovirideselon l’une quelconque des revendications 1 à 3 et éventuellement au moins un agent de fixation.
  8. Semence enrobée comprenant une graine de végétal, ladite graine de végétal étant enrobée par la composition phytosanitaire d’enrobage telle que définie selon la revendication 7 et ledit végétal appartenant notamment à la famille desPoaceae, en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
  9. Procédé de protection et/ou de traitement d‘un végétal contre une maladie provoquée par un champignon pathogène pour végétaux comprenant l’application de la composition selon la revendication 4 ou 5 sur au moins une partie dudit végétal ou du sol à proximité dudit végétal,
    en particulier ladite partie dudit végétal est une feuille, un fruit, une graine, et
    en particulier ledit végétal appartient à la famille desPoaceae, notamment le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
  10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel ladite composition est épandue
    • à raison de 10 à 500 L/ha, en particulier de 50 à 250 L/ha, notamment pour la pulvérisation aérienne ; ou
    • à raison d’une quantité efficace de 1010à 1014spores/ha, en particulier de 1010à 1012spores/ha, notamment pour les épandages aériens de type pulvérisation foliaire.
  11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel ledit champignon pathogène estSeptoria triticiouGibberella zeae(=Fusarium graminearum) ouPuccinia reconditaouPuccinia striiformis.
  12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans lequel
    • la protection dudit végétal comprend la pulvérisation de ladite composition au moment du semis ou à la germination dudit végétal ; et/ou
    • le traitement dudit végétal comprend la pulvérisation de ladite composition aux cours de différents stades phénologiques de la plante en prévention à un risque d’infection dudit champignon pathogène de l’ensemble ou une partie de la plante.
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