WO2019103588A1

WO2019103588A1 - Production, formulation et recyclage d' un produit biofongicide et biostimulant à base de trichoderma asperellum

Info

Publication number: WO2019103588A1
Application number: PCT/MA2018/000023
Authority: WO
Inventors: Abdellatif OUAZZANI CHAHDI; Amina OUAZZANI TOUHAMI; Wafae KHIRALLAH; Rachid BENKIRANE; Allal DOUIRA
Original assignee: Université Ibn Tofail
Priority date: 2017-11-24
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2019-05-31
Also published as: MA41534A1; MA41534B2

Abstract

La présente invention concerne un produit biofongicide et biostimulant à base d'une souche marocaine de Trichoderma asperellum. Il est destiné aux traitements foliaire et racinaire de différentes espèces végétales contre un large spectre de pathogènes. Les résultats montrent une efficacité importante du produit. La technique de la production à grande échelle se fait sur un substrat végétal en pellets, humidifié avec l'eau distillée et inoculé par la suspension conidienne de Trichoderma. La formulation visqueuse du produit se fait par neuf additifs permettant de maintenir la souche en vie et lui garder son pouvoir antagoniste de 9 à 12 mois à différentes températures. Les déchets de production sont recyclés par compostage avec le sol de la Mamora permettant l'obtention d'un compost riche en conidies de Trichoderma qui servira en pépinières. Mots clés : Trichoderma asperellum, biofongicide, biostimulant, production en masse, substrat, inoculum, formulation, additifs, compost, fertilisant, sol, recyclage.

Description

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DESCRIPTION :

Domaine technique :

La présente invention concerne les domaines de la lutte biologique contre les champignons phytopathogènes et de la fertilisation du sol.

Etat de la technique antérieure

Dans le but de chercher une méthode alternative à la lutte chimique, efficace, moins coûteuse, facile à manipuler et qui ne présente pas d’effets secondaires sur l’homme, les animaux et l’équilibre des écosystèmes, plusieurs travaux sont consacrés au développement des produits biologiques à base de microorganismes ou de leurs métabolites.

Il est connu que Trichoderma harzianum présente un pouvoir antagoniste important contre une large gamme d’agents pathogènes et sur de nombreuses plantes hôtes. En effet, (Mouria B., Ouazzani-Touhami A. et Douira A. 2007. Effet de diverses souches de Trichoderma sur la croissance d’une culture de tomate en serre et leur aptitude à coloniser les racines et le substrat. Phytoprot., 88 (3), 103-110) ont montré que l’inoculation des plantes de tomate par différentes souches de T. harzianum a montré qu’elles ont toutes stimulées la croissance des plantes et ont amélioré l’état phytosanitaire du feuillage. De même, Lincorporation de la souche Tcomp au sol de culture de la tomate a permis la réduction de la verticilliose due à Verticillium dahliae et la pulvérisation des feuilles des plants de tomate a réduit la pourriture grise due à Botrytis cinerea (Mouria B., 2009. Contribution à la lutte biologique contre la pourriture grise et la verticilliose de la tomate cultivée sous serre par utilisation du compost et les Trichoderma spp. seul ou en combinaison. Thèse de Doctorat National. Université Ibn Tofail. Faculté des Sciences, Kénitra, Maroc, 295 p.).

La colonisation des racines par Trichoderma sp. peut augmenter la croissance et le développement des racines, le rendement des cultures, la résistance aux stress abiotiques et l’absorption et l’utilisation des nutriments (Harman G. E., Howell C. R., Viterbo A., Chet I. et Lorito M., 2004. Trichoderma species - Opportunistic, avirulent plant symbionts. Nat. Rev. Microbiol., 2, 43-56).

Le brevet US6753295 présente un mélange de peptaibols et d’alkyl-_cyclopenténones produits par le T. harzianum SK-_5-5 (N IBH 13327) stimulant la croissance et la défense des plantes.

L’importance Trichoderma dans la lutte biologique a été décrite bien avant une centaine d’années (CN 101273729 A). Il est reconnu comme un antagoniste de champignons, mais aussi décrit comme un antagoniste de certaines bactéries pathogènes (WO 1997016974 Al). Le genre Trichoderma est un groupe agronomiquement important car il comprend des champignons agents de biocontrôle dont le mode d’action a fait l’objet de nombreux travaux. Des études récentes font en effet état d’une capacité de ce champignon filamenteux à intervenir selon divers mécanismes : mycoparasitisme, antagonisme (compétition), antibiose (production d’antibiotiques), stimulation racinaire, stimulation de la croissance par solubilisation de minéraux fertilisants, stimulation des défenses naturelles des plantes, etc (EP1876232A1). Les trois modes d’actions de Trichoderma sont décrits par Camporota (Camporota, P. (1985). Antagonisme in vitro de Trichoderma spp. vis-à-vis de Rhizoctonia solani Kuhn. Agronomie . 5(7): 613-620).

La colonisation des racines par Trichoderma sp. peut augmenter la croissance et le développement des racines, le rendement des cultures, la résistance aux stress abiotiques et l’absorption et l’utilisation des nutriments (Harman G.E. et al, Nature Reviews / Microbiology, 2, 43-56, 2004).

La présente invention a pour objet un nouveau produit à base de Trichoderma asperellum enregistré sous le code Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMisl KU987252 RAB 95369 ainsi que la procédure de production, de formulation et de recyclage des déchets. La production en masse est réalisée en utilisant la betterave sucrière surpressée, déshydratée en pellets, humidifiée avec de l’eau distillée et inoculée avec la souche Trichoderma asperellum Bankltl 902509 SMisl KU987252 RAB 95369. L’inoculum préparé est formulée avec l’ajout précis et ordonné de divers additifs (Saccharose, CaCl₂, Tween 20, Gélatine, Glycérine, Paraffine, Talc).

Le produit obtenu est un biopesticide et biostimulant destiné au traitement foliaire et racinaire contre une large gamme de pathogènes et sur différentes espèces de plantes. Il est caractérisé par une bonne viscosité variant de 1.49 Pa.s à 2.05 Pa.s à 30°C et un pH optimal pour la viabilité des conidies variant entre 4.5 et 5.9.

Les déchets résultant de la production en masse sont recyclés pour obtenir un biofertilisant portant des conidies de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369. La culture des plantules de tomate et de fraisier en utilisant ces déchets comme compost, a montré que ce dernier a favorisé les paramètres agronomiques des plantules (longueur et de la partie aérienne, longueur de la partie racinaire, nombre de feuilles vraies, nombre de feuilles cotylédonaires, poids frais et poids sec de la partie aérienne et racinaire) après 10 semaines sous la serre. Exposé de l’invention

Description de la souche

Un des objectifs de l’invention est l’isolement de la souche Trichoderma asperellum, connue par son pouvoir antagoniste contre plusieurs pathogènes, à partir du compost. Cette souche est déposée à la Mycothèque du Laboratoire de Botanique, Biotechnologie et Protection des Plantes (Université Ibn Tofail, Faculté des sciences de Kénitra). Elle est également inscrite sous la référence {Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369).

Sur le milieu PDA (Potato Dextrose Agar : 40 g/L) ou PSA (Potato Saccharose Agar : 200 g de pomme de terre + 20 g de saccharose + 15 g d’Agar-agar / 1000 mL d’eau distillée), la souche de Trichoderma asperellum Bankltl 902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 est caractérisée par une colonie verdâtre avec une rapidité de germination et de sporulation. Elle est caractérisée en plus par la formation des formes de résistance (chlamydospores) en cas de stress biotique ou abiotique.

La souche de Trichoderma est isolée à partir du compost ramené de la région de Missour, et identifiée au Laboratoire du Botanique, Biotechnologie et Protection des plantes.

Identification génétique de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369

L’amplification par PCR a montré une seule bande d’environ 600 pb pour la souche de Trichoderma asperellum SMis 1 RAB 95369. La souche a été identifiée grâce à l’analyse des séquences ITS (ITS 1 / ITS4).

Préparation de l’inoculum

Sur un milieu PSA (Potato Saccharose Agar : 200 g de pomme de terre + 20 g de saccharose + 15 g d’Agar-agar / 1000 mL d’eau distillée), une bouture de la culture de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 est placée au centre de la boite de Pétri puis incubée à 28°C et à l’obscurité pendant 7 jours. Sous la hotte et dans les conditions stériles, la surface chargée de conidies est raclée puis filtrée à l’aide de la mousseline. La concentration est ajustée à 10⁷ spores/mL par l’eau distillée stérile.

Sélection de substrat de la production en masse

Dans des boites de Pétri, 10 g de 12 substrats (PSA, Rondelles de papier, Maïs broyé, Farine de maïs, Farine d’orge, Farine d’avoine, Bagasse de la canne à sucre, Son de blé faiblement broyé, Son de blé bien broyé, Pain rassis, Pâte de pomme de terre et Pulpe de betterave sucrière en pellets) sont mis en essai sous forme solide, par humidification avec 10 mL d’eau distillée stérile, autoclavage à 120°C pendant 20 mn et inoculation avec 0.2 mL de la suspension conidienne de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369. Les milieux semi-solides (50g de substrat bouillis dans un litre d’eau distillée pendant 20 mn, autoclavés à l20°C pendant 20 mn) sont coulés à raison de 20 mL par boite de Pétri. 0.2 mL de la suspension conidienne est étalée, puis l’incubation est réalisée à 28°C et à l’obscurité pendant 7 jours (Tableau 1).

La comparaison de ces divers substrats montre une différence significative au niveau de la quantité de l’inoculum récupéré.

De point de vue économique, le substrat solide à base de la pulpe de betterave sucrière reste le plus rentable (Tableau 2, Figure 1).

Préparation et inoculation de substrat

Une quantité de 60 à 100 g de la pulpe de la betterave sucrière surpressée et déshydratée en pellets (de 6 à 7 mm de diamètre) est mise dans un plateau en inox de (30 x 15 x 6) cm de dimensions, humidifiée avec 90 mL d’eau distillée stérile puis autoclavée à 120°C pendant 20 mn. Le substrat est inoculé avec 1 mL de la suspension conidienne de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 à une concentration de 10⁷ spores/mL sous hotte puis incubé à 28°C et à l’obscurité pendant 7 jours.

Le substrat chargé de conidies est submergé avec 300 mL d’eau distillée stérile, filtré à l’aide de la mousseline afin d’éliminer les fragments de mycélium et les particules de substrats. La concentration de la suspension obtenue peut varier de 2xl0⁹ à 4xl0⁹ spores/mL. Ce substrat à base de la betterave sucrière se compose de 13% de l’humidité, 6 - 10% de protéines, 13 - 20% de cellulose, 5 - 8% de la matière grasse, 4 - 10% de la matière minérale, 7 - 11% de sucres totaux, NDF «neutral detergent fiber» 40 - 46%, ADF «acid detergent fiber» 19 - 23%, ADL «acid detergent lignin» 1.5 - 2%.

Protocole de formulation

Divers additifs sont ajoutés précisément et en ordre à la suspension récupérée afin de maintenir la viabilité et le pouvoir antagoniste lors de la période du stockage. L’ajout de chaque additif (Saccharose (1% - 12%), CaCl₂ (1 g/L - 15 g/L), Tween 20 (0.1% - 1.8%), Gélatine (0.1% - 2.2%), Glycérine (1% - 18%), Paraffine (1% - 18%), Talc (1% - 16%)) est suivi toujours d’une homogénéisation (Figure 2).

Le produit préparé est rempli dans des flacons de 200 mL et conservé soit à la température ambiante (l9°C à 27°C) soit à 4°C.

Le produit est un biopesticide et biostimulant destiné au traitement foliaire et racinaire contre une large gamme de pathogènes et sur différentes espèces de plantes.

Caractéristiques physicochimiques du produit

Le produit est caractérisé par une viscosité élevée (1.49 Pa.s à 2.05 Pa.s à 30°C), mesurée à l’aide du viscosimètre à tube capillaire (viscosimètre d'Ostwald). Dans cette mesure, l’éthanol est utilisé comme solvant d’étalonnage et la constante capillaire de l’appareil est k = 0.0933197 (Tableau 3). La viscosité élevée du produit permet le traitement facile sans obturation du matériel agricole (pulvériseurs, canalisation goutte à goutte).

Le pH du produit obtenu durant la période du stockage varie entre 4.5 et 5.9 (Tableau 4). Cette gamme de pFI est recommandée par plusieurs auteurs :

- Jackson AM et al. (Jackson AM, Whipps JM, Lynch JM (1991) Effects of température, pH and water potential on growth of four fungi with disease biocontrol potential. World J Microbiol Biotechnol 7: 494-501.) ont constaté que la production optimale de la biomasse de trois isolats de Trichoderma a eu lieu à des gammes de pH entre 4.6 et 6.8.

- Anuradha Singh et ai, (Singh A, Shahid M, Srivastava M, Pandey S, Sharma A, et al. (2014) Optimal Physical Parameters for Growth of Trichoderma Species at Varying pH, Température and Agitation. Virol Mycol 3: 127. doi:10.4172/2161-0517.1000127) ont montré que les espèces de Trichoderma sont capables de croître dans une large gamme de pH 2.0 à 6.0 avec un taux de croissance maximal de 4.0, la gamme optimale étant de 4.6 à 6.8. Effet inhibiteur du produit contre Verticillium dahliae et Botrxtis cinerea

L’étude du pouvoir germinatif du produit a été faite par l’étalement de 0.1 mL de suspension contenant 100 spores, dans des boites de Pétri contenant l’eau gélosé (15 g d’Agar-agar, 1000 mL d’eau distillée). Le nombre de spores germées est estimé après 24h d’incubation à 28°C et à l’obscurité. Trois répétitions sont réalisées pour chaque traitement.

La formulation des conidies adopté a permis de maintenir la viabilité et le pouvoir antagoniste pendant une longue durée quelque soit les conditions de stockage. D’après les résultats, la conservation est arrivée à 38 semaines avec un pourcentage de germination de 46.33% à 4°C (Tableau 5).

- In vitro, le pouvoir antagoniste du produit est estimé par contact direct ou par antibiose : a- Par contact direct : On place dans une boite de Pétri contenant le milieu PDA, un disque de 5 mm de diamètre constitué par l’inoculum d’une souche de Verticillium dahliae connue par son agressivité sur la tomate (Douira A. et Lahlou H., 1989. Variabilité de la spécificité parasitaire chez Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold frome à microsclérotes. Cryptogamie Mycologie, 10, 19-32.) ou de Botrytis cinerea qui est responsable de la pourriture grise de la fraise. Dans la même boite, on met une rondelle de papier filtre de 5mm de diamètre imbibée du produit de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 à 40 mm du disque du pathogène, symétriquement par rapport au centre de la boite. Un disque mycélien du pathogène est déposé au centre de la boite pour le témoin (Berber F., Ouazzani Touhami A., Badoc A. et Douira A., 2009. Antagonisme in vitro et in vivo de deux Trichoderma à l’égard de quatre espèces de Bipolaris pathogènes sur le Sorgho. Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 148, 93-114) (Tableau 6, Fig. 3 et 4). Après 12 jours d’incubation à 24°C et à l’obscurité, le pourcentage d’inhibition 1 de la croissance mycélienne du pathogène et le pourcentage de colonisation C sont évalués.

Les résultats montrent que le produit de Trichoderma est capable d’inhiber la croissance mycélienne de Verticillium dahliae même après 38 semaines de conservation :

- à la température ambiante, le pourcentage de colonisation est compris entre 79.58% (38 semaines de conservation) et 86.90% (4 semaines de conservation). Le pourcentage d’inhibition est compris entre 39.24% (38 semaines de conservation) et 68.80% (4 semaines de conservation).

- à la température de 4°C, le pourcentage de colonisation est compris entre 81.49% (38 semaines de conservation) et 87.24% (4 semaines de conservation). Le pourcentage d’inhibition est compris entre 44.99% (38 semaines de conservation) et 69.62% (4 semaines de conservation). Les résultats montrent aussi que le produit de Trichoderma est capable d’inhiber la croissance mycélienne de Botrytis cinerea même après 38 semaines de conservation (tableau 6) :

- à la température ambiante, le pourcentage de colonisation est compris entre 62.66% (38 semaines de conservation) et 77.77% (4 semaines de conservation). Le pourcentage d’inhibition est compris entre 43.66% (38 semaines de conservation) et 73.93% (4 semaines de conservation).

- à la température de 4°C, le pourcentage de colonisation est compris entre 75.00% (38 semaines de conservation) et 83.33% (4 semaines de conservation). Le pourcentage d’inhibition est compris entre 45.09% (38 semaines de conservation) et 81.61% (4 semaines de conservation). b- Par antibiose : Elle est mise en évidence par la technique de Dennis et Webster. Dans deux fonds de boite de Pétri contenant un milieu PDA, un disque mycélien de 5 mm de diamètre du pathogène ( Verticillium ou Botrytis ) est ajouté au centre d’un fond et une rondelle de papier filtre de 5 mm de diamètre imbibée du produit de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 est placée au centre de l’autre fond. Les deux fonds juxtaposés (l’antagoniste en bas et le pathogène en haut) sont fermés par la cellophane. Après quatre jours d’incubation à 25°C à l’obscurité, l’inhibition de la croissance mycélienne est estimée comme précédemment (Tableau 7). Le produit agit sur l’agent pathogène au moyen des substances volatiles en agissant sur le cycle de développement du pathogène.

Dans le cas de Verticillium dahliae :

- à la température ambiante, le pourcentage d’inhibition est compris entre 39.84% (38 semaines de conservation) et 68.80% (4 semaines de conservation).

- à la température de 4°C, le pourcentage d’inhibition est compris entre 43.09% (38 semaines de conservation) et 68.80% (4 semaines de conservation).

En plus, le produit entraîne une inhibition totale de la spomlation des agents pathogènes, même après 38 semaines de conservation (Tableau 8).

Dans le cas de Botrytis cinerea,

- à la température ambiante, le pourcentage d’inhibition est compris entre 31.66% (38 semaines de conservation) et 67.96% (4 semaines de conservation).

- à la température de 4°C, le pourcentage d’inhibition est compris entre 35.93% (38 semaines de conservation) et 76.51% (4 semaines de conservation). - In vivo, sur des plantules de tomate ( Lycopersicon esculentum ) appartenant à la variété THURAYA au stade 4 feuilles, âgées de 4 semaines. Le traitement est réalisé au niveau racinaire par irrigation avec 40 mL d’une suspension de concentration de 10⁷ conidies/mL ou bien au niveau foliaire par pulvérisation de 40 mL de la suspension à même concentration. L’effet stimulant du produit est évalué par le calcul du taux de stimulation

(TS) :

PPT * PPT : Paramètre des plantes traitées par le produit

TS (%) = - xlOO

PPTtti * PPTm : Paramètre des plantes témoins

D’après les résultats, le traitement foliaire et/ou racinaire par le produit a permis de stimuler le développement des paramètres agronomiques des plantes de tomate : Le taux de stimulation est de 127.31% pour la partie aérienne, de 220% pour le nombre de fruit et de 687.41% pour le poids de fruit (Tableau 9, Figures 7 et 8).

Les plantes de tomate subissent différents types de traitements et chaque traitement a fait l’objet de trois répétitions :

a- Le premier traitement est fait par l’inoculation des plantes par la suspension conidienne de Verticillium dahliae à une concentration de 10⁶ conidies/mL, ou par traitement par la suspension du produit à une concentration de 10⁷ conidies/mL. Ces plantes ont formé le témoin positif.

b- Le deuxième traitement des plantes se fait par l’eau seule. Ces plantes constituent les témoins négatifs.

c- Dans le troisième traitement, les plantes sont traitées par le produit de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 puis inoculées, après 48h, par la suspension conidienne (10⁶ conidies/mL) de Verticillium dahliae.

Les plantes inoculées et traitées, sont ensuite placées durant 48 h sous des housses en plastique noir, pulvérisées d’eau stérile permettant de maintenir une humidité relative élevée. Le traitement des plantes est fait à intervalle de 4 semaines durant 3 mois.

L’effet protecteur du produit contre Verticillium dahliae est évalué par le calcul de l’indice de rabougrissement (IR), l’indice de l’altération foliaire (IAF) et le pourcentage de réduction de IR et de IAF.

• L’indice de rabougrissement (IR) correspond à la réduction de la taille de l’épicotyle chez les plantes inoculées, inoculées et traitées par le produit de Trichoderma, par rapport aux plantes témoins. Il est calculé selon la relation suivante (Douira A. et Lahlou H., 1989. Variabilité de la spécificité parasitaire chez Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold frome à microsclérotes. Cryptogamie Mycologie, 10, 19-32) :

M - X

IR = - x 100 Où :

M

IR : Indice de rabougrissement ;

X : Taille de l’épicotyle des plantes inoculées ;

M : Taille moyenne des plantes témoins pour chaque substrat.

• Le degré d’altération des feuilles est noté selon le barème de Douira et Lahlou (1989) ci-dessous :

Les notes rapportées au nombre de feuilles constituent l’Indice d’Altération Foliaire (IAF), calculé selon la formule ci-dessous. Un indice moyen est ensuite calculé pour chaque lot de plantes.

IAF : Indice d’ altération foliaire ;

i : Note d’apparence des feuilles 0 5 ;

X; _: Nombre de feuilles présentant la note i ;

NtF : Nombre total de feuilles. Le traitement des plantes par le produit de Trichoderma asperellum a permis de réduire le développement de la maldie causée par Verticillium dahliae durant toute la période de culture sous la serre (3 mois) :

• L’indice de rabougrissement (IR) des plantes traitées est de -4.73% après 1 mois, de -4.66% après 2 mois et de -6.95% après 3 mois. La réduction de l’IR est 100% par rapport aux plantes inoculées par Verticillium seul.

• L’indice de l’altération foliaire (IAF) est de 0.051% après 1 mois, de 0.059% après 2 mois et 0.147% après 3 mois. La réduction de l’IAF (par rapport aux plantes inoculées par Verticillium seul) est de 75.16% après 1 mois, de 79.06% après 2 mois et de 64.07% après 3 mois (Tableaux 10 et 11, Figure 9).

Le traitement par le produit de Trichoderma a favorisé en plus le développement des paramètres agronomiques des plantes même en présence du pathogène par rapport au témoin. Parmis ces paramètres on cite (Tableau 10, Figure 9) :

• Après un mois, le taux de stimulation (TS) est de 104.73% pour la longueur de la partie aérienne, de 157.72% pour le poids frais de la partie aérienne.

• Après 2 mois, le taux de stimulation est de 104.65% pour la longueur de la partie aérienne, de 135.64% pour le poids frais de la partie aérienne et de 109.47% pour le poids de fruits.

• Après 3 mois, le taux de stimulation est de 106.95% pour la longueur de la partie aérienne, de 124.05% pour le poids frais de la partie aérienne et de 158.65% pour le poids de fruits.

- In vivo, sur des plants à racines nues de la variété de fraisier Fortuna qui sont repiqués dans des pots contenant un sol de la Mamora, puis arrosés jusqu’au stade requis pour l’inoculation par Botrytis cinerea.

L’effet stimulant du produit est évalué comme précédemment par le calcul du taux de stimulation (TS).

Le traitement des plants de fraisiers par le produit de Trichoderma a permis de stimuler le développement de leurs paramètres agronomiques. Le diamètre de la surface foliaire des plants traités est passé de 16.33 cm pour le témoin à 26 cm pour les plantes traitée par le produit avec un taux de stimulation de 159.21%. Le poids de fruits est passé de 92.1 g pour le témoin à 133.2 g pour les plantes traitée par le produit avec un taux de stimulation de 144.62%. Le poids sec des racines est passé de 8.93 g pour le témoin à 14.53 g pour les plantes traitée par le produit avec un taux de stimulation de 162.7% (Tableau 12).

Pour évaluer le pouvoir protecteur du produit contre la pourriture grise causée par Botrytis cinerea, trois types de traitements ont été réalisés sur des plantes de fraisier et chaque traitement a fait l’objet de trois répétitions :

a- Les plantes inoculées par la suspension conidienne (10⁶ conidies/mL) du pathogène et les plantes traitées par le produit de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 seul, constituent les témoins positifs.

b-Les plantes traitées par l’eau seule constituent les témoins négatifs.

c-Les plantes traitées par le produit de Trichoderma asperellum Bankltl 902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 puis inoculées, 48h après par la suspension conidienne (10⁶ conidies/mL).

Les plantes inoculées et traitées, sont ensuite placées durant 48 h sous des housses en plastique noir, pulvérisées d’eau stérile permettant de maintenir une humidité relative élevée. Trois répétitions d’inoculation et de traitement sont réalisées à intervalle de vingt jours (Figure 10).

La notation est faite sept jours après l’inoculation selon l’échelle de notation de Notteghem et al., (Notteghem J.L., Anriatompo G.M., Chatel M., Dechanet R., 1980. Techniques utilisées pour la sélection des variétés de riz possédant la résistance horizontale à la pyriculariose. - Ann. Phytopathol., 12, 199-266.) qui donne une estimation de la sévérité de la maladie à partir du pourcentage de surface foliaire malade :

- 0: absence de la maladie.

1: moins de 1% de la surface foliaire présentant la maladie.

- 2: 1 à 5% de la surface foliaire présentant la maladie.

- 3: 6 à 15 % de la surface foliaire présentant la maladie.

- 4: 16 à 33% de la surface foliaire présentant la maladie.

- 5: 34 à 50% de la surface foliaire présentant la maladie.

- 6: 51 à 100% de la surface foliaire présentant la maladie. Le degré de la maladie est estimé par le calcul de :

IS(%)= (Xi ni/ 6 Nt)* 100

- IS : Indice de sévérité de la maladie.

- Xi : Sévérité de la maladie (Note).

ni : Nombre de feuilles de sévérité i.

- Nt : Nombre total de feuilles observées.

Le pourcentage de réduction de la maladie RM est calculé selon la formule suivante :

RM(%)=(ISm -Isa/ Ism)* 100

- ISm : Indice de sévérité de la maladie noté sur les feuilles inoculées.

- ISa : Indice de sévérité de la maladie noté sur les feuilles inoculées et traitées par le produit.

La sporulation sur l’hôte est estimée par le nombre moyen de conidies produites par unité de surface de lésion (cm²) Hill and Nelson (Hill J. P., and Nelson R. R., 1983. Genetic control of two parasitic fitness attributes of Helminthosporium maydis race T. Phytopathology 73:455-457).

Sept jours après l’inoculation, les feuilles présentant des lésions sont prélevées et découpées en fragments de 1 cm . Ces fragments sont déposés dans des boîtes de Pétri contenant chacune 2 rondelles de papier filtre stérilisées et imbibées d’eau distillée stérile. Les boîtes sont incubées entre 48 à 72 heures sous lumière continue à température ambiante. Puis trois fragments provenant d’une même plante sont mis dans des tubes à essai contenant 1 mL d’eau distillée stérile. Les tubes sont ensuite agités de manière à détacher les conidies. La richesse des suspensions ainsi obtenues est déterminée à l’aide d’une lame de Malassez et le nombre de conidies est ramené à la surface unitaire de lésion. L’observation est faite au microscope optique au grossissement xlOO. Le comptage des spores est répété trois fois. Le pourcentage d’inhibition de la sporulation sur l’hôte Ish par rapport au témoin est calculé comme suit:

Is h (%)-(Nho-Nhc/ Nh_a)*100 - Nho : Nombre de conidies estimées sur l’hôte inoculé par le pathogène seul.

- Nhc : Nombre de conidies estimées sur l’hôte inoculé par le pathogène et traité par le produit de Trichoderma.

Nombre des fragments contaminés

C {%) = - x 100

Nombre totale des fragments par boite

C(%) : pourcentage de contamination par Botrytis cinerea.

Le traitement des plantes de fraisiers par le produit de Trichoderma asperellum a permis d’améliorer l’état phytosanitaire en réduisant la maladie de la pourriture grise causée par Botrytis cinerea durant toute la période de culture sous la serre (60 jours). Le pourcentage de la réduction de la maladie (RM) calculé d’après les résultats est de 91.19% après 20 jours sous la serre, de 94.54% après 40 jours sous la serre et de 95.22% après 60 jours sous la serre (Tableau 13).

Ce traitement a permis de réduire la sévérité de la maladie de la pourriture grise de 76.92% à 6.79% après 20 jours, de 72.91% à 3.95% après 40 jours et de 70.83% à 3.1% après 60 jours sous la serre.

Recyclage des déchets

Les déchets résultant de la production en masse sont recyclés pour obtenir un biofertilisant portant des conidies de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369. Des couches de sol de la Mamora, de la paille de blé et de déchets de la production sont mises en alternance dans une caisse en bois recouverte par un film en plastique et humidifié avec de l’eau. L’ensemble est maintenu dans un endroit non ensoleillé et aéré. Une humidification permanente est assurée à intervalle de 48 h avec de l’eau de robinet pendant 4 semaines. Après cette période d’incubation, le développement de la population de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 est vérifié en fonction du temps après 4, 8 et 12 semaines. L’estimation de La population de Trichoderma dans le compost montre une stabilité de 100% (Tableau 14, Figure 11).

Il est connu que l'ensemble des sols de la forêt de la Mamora présentent une certaine homogénéité puisqu'ils sont constitués dans leur quasi-totalité par une couche de sable en surface à épaisseur variable (de 50 cm à plus de 4 m) reposant sur une formation argileuse rouge compacte du Quaternaire dont l'épaisseur varie également de 1 mètre au sud-ouest à plus de 10 mètres au niveau du poste forestier de Mechraâ el Kettan. L'ensemble repose sur une assise marno-argileuse imperméable du Tortonien (Bernoussi M., 1982 : Contribution à l’étude de l’écologie et de la productivité du Pin maritime des Landes dans les reboisements artificiels de la Mamora. Mém. 3ème cycle, IAV Hassan II, Rabat. 90 p. + annexes. Blanc Féraud L., Samson C., Aubert G. & Zerubia J., 2000 : Multiphase évolution and variational image classification. Dans Congress SIMAI, Ischia, Italie). Par ailleurs, l’analyse du pH montre que l’ensemble des sols sont acides (Bernoussi M., 1982 : Contribution à l’étude de l’écologie et de la productivité du Pin maritime des Landes dans les reboisements artificiels de la Mamora. Mém. 3ème cycle, IAV Hassan II, Rabat. 90 p. + annexes. Blanc Féraud L., Samson C., Aubert G. & Zerubia J., 2000 : Multiphase évolution and variational image classification. Dans Congress SIMAI, Ischia, Italie). En plus, le sol de la Mamora se caractérise par un pH = 7.53, 0.7% de la matière organique, 0.05% d’azote, 0.239% de P₂O₅, 0.15 meq/100 g de K₂0, 0.20 meq/100 g de Mg, 7351.5 mg/kg de Ca (Chliyeh M., Ouazzani Chahdi A., Selmaoui K., Ouazzani Touhami A., Filali Maltouf A., El Modafar C., Moukhli A., Oukabli A., Benkirane R. et Douira A., 2014. Effect of Trichoderma harzianum and Arbuscular mycorrhizal fungi against Verticillium wilt of tomato, International loumal of Recent Scientific Research Research Vol. 5, Issue, 2, pp.449-459.).

Le développement de la population de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 en fonction du temps est vérifié par la technique de la paille.

L’effet du compost sur les paramètres agronomiques de la tomate et du fraisier

Dans des pots en polyéthylène remplis de sol de la Mamora ou du compost, des plantules de fraisier appartenant à la variété Fortuna au stade quatre feuilles et des gaines de la tomate de la variété THURAYA sont mis en culture puis placés sous la serre.

- Dix semaines plus tard, les plantules germées sont sacrifiées afin de déterminer leurs paramètres agronomiques (longueur de la partie aérienne, longueur de la partie racinaire, nombre de feuilles vraies, nombre de feuilles cotylédonaires, poids frais et poids sec de la partie aérienne et racinaire). L’effet stimulant du compost évalué par le calcul du taux de stimulation (TS) :

PPC * PPC : Paramètre des plantes cultivées sur le compost

TS (%) = -

PPTm * PPTm : Paramètre des plantes témoins

Les résultats de la culture des plantes de tomate et de fraisier sur ce compost, montrent qu’il stimule le développement de leurs paramètres agronomiques par rapport au témoin (Tableau 15, Figures 12 et 13). Parmi ces paramètres on peut citer : • Dans le cas de la tomate : La longueur de la partie aérienne est de 22.16 cm comparée à 7.89 cm du témoin avec un taux de stimulation de 280.86%. Le poids frais de la partie aérienne est de 4316.67 mg comparé à 416.67 mg du témoin avec un taux de stimulation de 1035.99%. Le poids frais des racines est de 764.67 mg comparé à 94 mg du témoin avec un taux de stimulation de 813.47%.

• Dans le cas du fraisier : Le diamètre de la surface foliaire est de 11.35 cm comparé à 10.28 cm du témoin avec un taux de stimulation de 109.66%. Le poids frais de la partie aérienne est de 3780 mg comparé à 3035 mg du témoin avec un taux de stimulation de 124.54%. Le poids frais des racines est de 3226.67 mg comparé à 2403.33 mg du témoin avec un taux de stimulation de 134.25%.

Afin de réisoler Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 de différentes parties de la plante, les racines et l’hypocotyle sont coupées en petits fragments de 2 mm de diamètre, désinfectés superficiellement à l’alcool 95°, rincés à l’eau distillée stérile plusieurs fois puis séchés sur du papier filtre stérile. Les fragments sont déposés sur le milieu PSA. Les observations sont faites après une semaine d’incubation (Tabeau 15, Figures 14 et 15).

Le développement de la population de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 dans le sol est estimé par détermination du pourcentage de colonisation du sol et des fragments de la paille. La technique des « soil plates » de Warcup (1950) (Warcup, J. H., 1950. The soil-plate method for isolation of fungi from soil. Nature, Lond., 166, 117-18) est utilisée par séchage d’une quantité du sol à 30°C, broyage dans un mortier stérilisé. Une quantité de 5 à 15 mg du sol est mise sur le milieu PSA, humidifiée par une ou deux gouttes de l’eau distillée stérile et étalée à l’aide d’un étaloir. Les boites sont incubées à 28°C et à l’obscurité. D’autre part, 2 g des fragments de la paille de blé recueillie du compost, sont lavées sous un courant d’eau, désinfectés superficiellement à l’hypochlorite de sodium pendant 2 min, rincée et découpée en fragments de 5 mm de long. Pour chaque pot, 100 de ces fragments sont mis en culture sur le milieu PSA. Après une semaine d’incubation à 28 °C, le nombre de fragments colonisés est compté et le pourcentage de colonisation est calculé. Trois répétitions sont prévues pour chaque traitement. Les résultats montrent que ce compost est capable de garder la population de Trichoderma à des niveaux élevés dans le sol : 19.73x10 UFC par gramme du sol dans le cas de la tomate et 18.8x10 UFC par gramme du sol dans le cas du fraisier (Tableau 16, Figures 14 et 15). Annexes

Tableau 1 : Sporulation de Trichoderma asperellum sur différents substrats (nombre de spores par gramme de substrat).

Tableau 2 : Etude comparative des différents substrats du point de vue économique.

PSA : Potato Saccharose Agar ; BC : Bagasse de la canne à sucre ; PT : Pomme de terre ; MB : Maïs broyé ; FM : Farine de Maïs ; PB : Pulpe de la betterave sucrière ; PR : Pain rassis ; SBLB : Son de blé légèrement broyé ; SBB : Son de blé broyé ; FA : Farine d’avoine ; FO : Farine d’orge. Tableau 3 : Viscosité du produit de Trichoderma asperellum.

Tableau 4 : Variation du pH du produit lors de la période du stockage.

Tableau 5 : Evolution du pouvoir germinatif du produit en fonction du temps et de la température de conservation

Tableau 6 : Effet antagoniste du produit contre Verticillium dahliae et Botrytis cinerea par évaluation du pourcentage de colonisation (C) et le pourcentage d’inhibition (I), en fonction de du temps et de température de conservation.

Tableau 7 : Effet des substances volatiles produites par Trichoderma asperellum sur la réduction de la croissance mycélienne de Verticillium dahliae et Botrytis cinerea par estimation du pourcentage d’inhibition (%).

Tableau 8 : Inhibition de la sporulation de Verticillium dahliae par le produit.

TA : Température ambiante Tableau 9 : Effet stimulant du produit de Trichoderma asperellum sur les paramètres agronomiques des plantes de tomate.

Tableau 10 : Effet protecteur du produit contre Verticillium dahliae sur la tomate après 1 mois, 2 mois et 3 mois sous la serre.

P : Produit de Trichoderma ; Ver : Verîicillium dahliae ; PA : Partie aérienne ; IR : Indice de rabougrissement ;

IAF : Indice de l’altération foliaire ; TS : Taux de stimulation en présence du pathogène (%)

Tableau 11 : Effet du produit sur la réduction de l’indice de rabougrissement (IR) et l’indice de l’altération foliaire (IAF) causés par Verticillium dahliae sur la tomate après 1 mois, 2 mois et 3 mois sous la serre.

Tableau 12: Effet stimulant du produit (P) de Trichoderma asperellum sur les paramètres agronomiques des plantes de fraisier.

P : Produit de Trichoderma asperellum TS : Taux de stimulation

Tableau 13 : L’effet protecteur du produit sur fraisier contre Botrytis cinerea.

BC : Botrytis cinerea ; PT : Produit de Trichoderma ; IS : Indice de sévérité ; RM : Pourcentage de réduction de la maladie ; C : Pourcentage de contamination ; ISh : Pourcentage d’inhibition de la sporulation sur l’hôte

Tableau 14 : Evolution de la population de Trichoderma asperellum dans le compost préparé des déchets de la production.

Tableau 15: Effet stimulant du compost de Trichoderma asperellum sur les paramètres agronomiques des plantes de fraisier et de tomate.

PA : Partie aérienne TS : Taux de stimulation

Tableau 16: Colonisation du sol, de la paille, des racines et l’hypocotyle de la tomate et du fraisier par les spores de Trichoderma asperellum dans le compost.

Claims

Revendications

1- Procédé de production en masse du biofongicide et biostimulant à base de Trichoderma asperellum ayant l’empreinte génétique :

et enregistré sous le code Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMisl KU987252 RAB 95369, caractérisé par le fait que le substrat utilisé pour la production est le pellet de betterave sucrière.

2- Procédé de production en masse du bio fongicide et biostimulant à base de T. asperellum selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la production est réalisée en quatre étapes :

a- Une quantité de 60 à 100 g de la betterave sucrière surpressée et déshydratée en pellets (de 6 à 7 mm de diamètre) est mise dans un plateau en inox de (30 x 15 x 6) cm de dimensions.

b- La betterave est humidifiée avec 90 mL d’eau distillée stérile puis autoclavée à l20°C pendant 20 mn.

c- Le substrat est inoculé avec 1 mL de la suspension conidienne de Trichoderma asperellum Banklt! 902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 à une concentration de 10⁷ spores/mL sous hotte puis incubé à 28°C et à l’obscurité pendant 7 jours d- Le substrat chargé de conidies est submergé avec 300 mL d’eau distillée stérile, filtré à l’aide de la mousseline afin d’éliminer les fragments de mycélium et les particules de substrats.

3- Procédé de production en masse du bio fongicide et biostimulant à base de T. asperellum selon les revendications 1 à 2, caractérisé par le fait que la concentration de la suspension conidienne obtenue dans la synthèse varie de 2xl0⁹ à 4xl0⁹ spores/mL.

4- Procédé de production en masse du bio fongicide et biostimulant à base de T. asperellum selon les revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que pour assurer sa viabilité et son pouvoir antagoniste lors de la période de stockage, les additifs suivants sont ajoutés : Saccharose (1% - 12%), CaCL (1 g/L - 15 g/L), Tween 20 (0.1% - 1.8%), Gélatine (0.1% - 2.2%), Glycérine (1% - 18%), Paraffine (1% - 18%), Talc (1% - 16%).

5- Procédé de production en masse du biofongicide et biostimulant à base de T. asperellum selon les revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la viscosité du produit obtenu est élevée (1.49 Pa.s à 2.05 Pa.s à 30°C) et que son pH durant la période de stockage (à température ambiante ou à 4°C) varie entre 4.5 et 5.9.

6- Procédé de production en masse du bio fongicide et biostimulant à base de T. asperellum selon les revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le pourcentage de germination du produit obtenu est de 46.33% à 4°C après une période de conservation de 38 semaines.

7- Utilisation du biofongicide et biostimulant à base de T. asperellum pour la lutte in vitro contre Verticillium dahliae (pourcentage d’inhibition supérieur à 69.00%) et Botrytis cinerea (pourcentage d’inhibition supérieur à 81.00%).

8- Utilisation du biofongicide et biostimulant de T. asperellum pour la lutte in vivo, sur des plantules de tomate et des plants à racines nues de fraisier, contre Verticillium dahliae et Botrytis.

9- Utilisation du biofongicide et biostimulant de T. asperellum pour stimuler le développement des paramètres agronomiques de la tomate et du fraisier : (longueur de la partie aérienne, nombre de fruits, poids des fruits).

10- Procédé de recyclage des déchets résultant de la production en masse du biofongicide et biostimulant de T. asperellum selon les revendications de 1 à 6, réalisé en deux étapes :

a- Des couches de sol, de la paille de blé et de déchets de la production sont mises en alternance dans une caisse en bois recouverte par un film en plastique et humidifié avec de l’eau. L’ensemble est maintenu dans un endroit non ensoleillé et aéré b- Une humidification permanente est assurée à intervalle de 48 h avec de l’eau de robinet pendant 4 semaines. Le développement de la population de Trichoderma asperellum Bankltl902509 SMis 1 KU987252 RAB 95369 est vérifié en fonction du temps après 4, 8 et 12 semaines.

L’estimation de la population de Trichoderma dans le compost montre une stabilité de 100%.

11- Utilisation du compost (produit de recyclage des déchets) obtenu selon la revendication 10 comme fertilisant, caractérisé par le fait qu’elle permet de:

a- stabiliser la population de Trichoderma à 19.73x10 UFC par gramme du sol dans le cas de la tomate et à 18.8c10³ UFC par gramme du sol dans le cas du fraisier et avec un pourcentage de colonisation de la paille de 100%.

b- favoriser le développement des paramètres agronomiques de la tomate et du fraisier (longueur de la partie aérienne, nombre de fruits, poids des fruits).