EP3987068A1 - Nouvel agent de biocontrole et son utilisation pour la lutte contre des maladies fongiques de plantes - Google Patents

Nouvel agent de biocontrole et son utilisation pour la lutte contre des maladies fongiques de plantes

Info

Publication number
EP3987068A1
EP3987068A1 EP20732637.2A EP20732637A EP3987068A1 EP 3987068 A1 EP3987068 A1 EP 3987068A1 EP 20732637 A EP20732637 A EP 20732637A EP 3987068 A1 EP3987068 A1 EP 3987068A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
spores
plant
trichoderma atroviride
tal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20732637.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sophie LEPORINI
Julien Fagot
Sinisa Marinkovic
Nicolas Fabre
Christian BELLOY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agro Industrie Recherches et Developpements ARD
Original Assignee
Agro Industrie Recherches et Developpements ARD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agro Industrie Recherches et Developpements ARD filed Critical Agro Industrie Recherches et Developpements ARD
Publication of EP3987068A1 publication Critical patent/EP3987068A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/38—Trichoderma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Definitions

  • TITLE NEW BIOCONTROL AGENT AND ITS USE FOR THE CONTROL OF FUNGAL DISEASES OF PLANTS
  • the present invention relates to a novel biocontrol agent and its use for the control of fungal diseases of plants.
  • ⁇ leaf diseases eg powdery mildew, septoria, helminthosporiosis, yellow rust and brown rust
  • ⁇ and ear diseases eg, fusarium head blight, ear powdery mildew and septoria.
  • “Wheat septoria” refers to two diseases:
  • Phaeosphaeria nodorum anamorph / asexual form: Stagonospora nodorum which attacks the leaves but also the ears and grains of wheat;
  • Fusarium head blight is associated with a complex of fungal species belonging to the genera Fusarium and Microdochium.
  • the genus Fusarium was first described in 1809 by Link and owes its name to the Latin "fusus" (spindle) in relation to the spindle-shaped shape of its spores. It belongs to the division of Ascomycetes, to the order of Hypocreales and to the family of Nectriaceae.
  • F. graminearum is one of the most problematic species in France due to its production of mycotoxins including trichothecene deoxynivalenol (DON).
  • Brown rust of wheat is a disease which usually appears quite late in the spring. It can cause significant damage if poorly controlled.
  • the fungus overwinters mainly on the regrowth of cereals and early sowing crops in the form of uredospores. These uredospores germinate in the presence of free water and at temperatures between 15 and 25 ° C. The sporulation period is 5 to 25 days depending on the temperature and the variety. Under favorable conditions, more than 3000 uredospores can be produced per pustule, which explains the character explosive disease.
  • the spores are dispersed mainly by the wind (Ali, S., Gladieux, P., Leconte, M., Gautier, A., Justesen, AF, Hovmoller, MS, Enjalbert, J., de Vallavieille-Pope, C. ( 2014). Origin, Migration Routes and Worldwide Population Genetic Structure of the Wheat Yellow Rust Pathogen Puccinia striiformis f.sp. tritici. PLoS Pathogens, 10 (1), el003903; De Vallavieille-Pope, C., Ali, S., & Leconte, M. (2012) Special Report Virulence Dynamics and Regional Structuring of Puccinia striiformis f sp. Tritici in France Between 1984 and 2009.).
  • Yellow rust of wheat is a disease which can be very harmful in susceptible varieties if attacked early.
  • the cool and humid conditions are favorable to its development.
  • Yellow rust spends the winter as mycelium or active spores on regrowth of cereals or crops sown in early fall. This fungus is resistant to freezing temperatures and usually survives the winter on infected plants. In the spring, yellow rust begins to develop and produces active spores, especially since the weather is cool and humid.
  • Optimal conditions for spore germination are met when temperatures are between 10 and 13 ° C with 100% relative humidity.
  • the spores are dispersed mainly by the wind (Rossi, V., Racca, P., Giosue ', S., Pancaldi, D., & Alberti, F (1997).
  • control agents biological or BCA can control target pathogens through one or more modes of action:
  • ISR Induced Systemic Resistance
  • Trichoderma comprises various species of fungi that may be biocontrol agents
  • their mode of action has been the subject of much work. They report in particular a capacity of this filamentous fungus to intervene according to various mechanisms: mycoparasitism, antagonism (competition), antibiosis (production of antibiotics), root stimulation, growth stimulation by solubilization of fertilizing minerals, stimulation of natural defenses plants, etc. They colonize the roots of herbaceous and woody plants without any damage.
  • this fungus can penetrate the roots and promote development, nutrition and disease resistance.
  • the effects are uneven from one species to another or even from one strain to another because a good biological control agent must be a good colonizer and a good antagonist, but above all, it must also be compatible with the rhizosphere. and with plants.
  • a first aim of the invention therefore consists in providing an effective strain, such as a biological control agent (or biocontrol agent) .
  • a second aim of the invention is to provide phytosanitary compositions for the prevention and / or treatment of fungal diseases of plants.
  • a third aim of the invention is also to provide phytosanitary coating compositions where, in association with a plant seed, the strain of the invention is used as an agent for accelerating the germination of said seed.
  • Another object of the invention is to provide methods for manufacturing said compositions and for implementing the prevention and / or treatment of fungal diseases of plants, and the acceleration of germination.
  • a first aspect of the invention relates to an isolated strain of Trichoderma atroviride in which the ech42 gene has a sequence identity of at least 98% with the sequence SEQ ID NO: 1 of the ech42 gene of the TAL-17 strain deposited on July 03. 2018 at the CNCM under number CNCM 1-5333.
  • sequence identity of at least 98% with the sequence SEQ ID NO: 1 is meant a sequence identity of at least 98.5%, at least 99% or even at least 99, 5% with the sequence SEQ ID NO: 1 represented by the following nucleic acid sequence:
  • sequence identity is measured by conventional tools for comparing sequences known to those skilled in the art such as the algorithms of the BLAST platform or the MatGat program (Campanella, Bitincka and Smalley, 2003) .
  • one of the objects of the invention is the isolated strain of Trichoderma atroviride deposited on July 3, 2018 at the CNCM under the number CNCM 1-5333 and / or one of its mutants.
  • isolated strain is meant the culture of a single microorganism which has been isolated from various microorganisms present on and / or in the tissues of a leaf fragment. of wheat grown in fields.
  • one of its mutants is meant mutant strains obtained by mutations or genetic manipulations of a reference strain, which in the context of the invention is the isolated strain of Trichoderma atroviride TAL-17 filed on July 3, 2018 at the CNCM under the number CNCM 1-5333. These mutants, however, retain the same physiological properties as the reference strain or even may exhibit improved physiological properties (eg. Improvement in biocontrol capacities).
  • one of the subjects of the invention also relates to an isolated strain of Trichoderma atroviride, the ech42 gene of which has a sequence identity of at least 98% with the sequence SEQ ID NO: 1 of the ech42 gene of the TAL-17 strain deposited on July 3, 2018 at the CNCM under the number CNCM 1-5333 and / or one of its mutants,
  • said isolated strain of Trichoderma atroviride is the TAL-17 strain deposited on July 3, 2018 at the CNCM under the number CNCM 1-5333 and / or one of its mutants, and preferably, said isolated strain of Trichoderma atroviride is the strain TAL-17 filed on July 03, 2018 at the CNCM under number CNCM 1-5333.
  • strains ie TAL-17 and its mutants
  • qPCR real-time Polymerase Chain Reaction
  • the inventors have developed specific tools thereof namely, a TaqMan ® probe GS285741-P1 and a pair of nucleotide primers associated GS285741-F1 and GS285741-R1 (see Table 1), which can amplify a sequence specific to the strains of the invention ⁇ cf. Table 2).
  • FAM 6-carboxyfluorescein
  • MGB minor groove binder
  • Table 2 Target sequence of oligonucleotides and of the TaqMan ® probe in strain TAL-17 and / or its mutants
  • one of the subjects of the invention relates to an isolated strain of Trichoderma atroviride, the ech42 gene of which has a sequence identity of at least 98% with the sequence SEQ ID NO: 1 of the ech42 gene of the TAL- strain. 17 filed on 03 July 2018 at the CNCM under number CNCM 1-5333,
  • said isolated strain of Trichoderma atroviride is the TAL-17 strain deposited on July 3, 2018 at the CNCM under the number CNCM 1-5333.
  • one of the objects of the invention is the isolated strain of Trichoderma atroviride deposited on July 3, 2018 at the CNCM under number CNCM 1-5333.
  • another of the objects of the invention relates to the isolated strain of Trichoderma atroviride of the invention in the form of spores, produced by fermentation in solid or liquid medium, said spores possibly in purified form or in the matrix of production, said production matrix being solid or liquid.
  • spores in the form of spores
  • FMS solid medium
  • liquid fermentation is meant any process allowing the development of the microorganism using a production matrix with the presence of free water.
  • production matrix any natural and / or synthetic substrate, which allows the development of the microorganism and induces the production of biomass, and / or enzymes, and / or primary and / or secondary metabolites.
  • families of enzymes or enzymes produced by the fungus are proteases, chitinases and beta-1,3-glucanase.
  • sporestiti in purified form is meant the concentrated spores following the elimination of the major part of the remainder of the matrix after production which has not been used for the formation of the spores, with the help of 'a sieving process for example.
  • sporestiti in the production matrix is meant the spores that remain in the production matrix at the end of the manufacturing process, without a purification step.
  • Another object of the invention relates to the isolated strain of Trichoderma atroviride of the invention as a biological control agent.
  • biological control agent is meant that a strain of Trichoderma atroviride according to the invention can interfere with the growth and / or the survival of pathogens, thus making it possible to control them, via one or more of the methods. action described above (eg via the development of its biomass and / or its production of enzymes and / or secondary metabolites).
  • one of the means of demonstrating that a strain of Trichoderma atroviride according to the invention is a biological control agent is to carry out a Dual culture test on culture medium in a Petri dish such as those presented among the examples. below.
  • Double culture test is meant a test on a Petri dish in the laboratory on culture medium, where the strain of the microorganism, biological control agent and the strain of the pathogen are cultured on the same dish in order to observe. the effect of one strain on another over time and vice versa.
  • Another object of the invention relates to the isolated strain of Trichoderma atroviride of the invention, as an antifungal agent of plants.
  • plant antifungal agent is meant that a strain of Trichoderma atroviride according to the invention is capable of combating phytopathogenic fungi.
  • one of the means of demonstrating that a strain of Trichoderma atroviride according to the invention is an antifungal agent for plants is to carry out a dual culture test such as those presented among the examples below.
  • one of the objects of the invention relates to the isolated strain of Trichoderma atroviride of the invention as a biological control agent
  • a second aspect of the invention relates to the use of the isolated strain of Trichoderma atroviride of the invention, in particular in the field of malting.
  • the invention relates to the use of said isolated strain of Trichoderma atroviride in the prevention and / or treatment of fungal diseases of plants, in particular of plants belonging to the Poaceae family, in particular wheat and / or corn and / or barley.
  • the invention relates to the use of said isolated strain of Trichoderma atroviride in the prevention and / or treatment of fungal diseases of wheat and / or corn and / or barley.
  • the invention also relates to the use of said isolated strain of Trichoderma atroviride for promoting the germination of a seed of plants belonging to the Poaceae family, in particular wheat and / or corn and / or barley.
  • the invention relates to the use of said isolated strain of Trichoderma atroviride to promote the germination of a seed of wheat and / or corn and / or barley.
  • the germination aid advantageously and at the same time allows the prevention and / or treatment of fungal diseases at the time of sowing. The development of a disease after sowing is thus avoided and the yield is optimized via the biostimulant aspect of the strain of the invention.
  • this aspect also makes it possible to avoid a significant slowdown in the development of the crop if a period of drought occurs some time after sowing (which can happen in spring) and therefore to avoid loss of yields at harvest.
  • a third aspect of the invention relates to a phytosanitary composition
  • a phytosanitary composition comprising: the isolated strain of Trichoderma atroviride of the invention as an active principle; or
  • BCA biological control agent
  • metabolites emitted during the production of the strain or “its metabolites emitted during its production” is meant any molecule produced by the strain of the invention during its development.
  • metabolites can be enzymes produced by the fungus such as proteases, chitinases and beta-1,3-glucanase.
  • biological control agent is meant a microorganism capable of interfering with the growth and / or survival of pathogens, thus making it possible to control them.
  • the strain of the invention TAL-17 (deposited on July 3, 2018 at the CNCM under the number CNCM 1-5333) is an example, but within the meaning of the invention it is a question here of combining the strain of invention to at least one other biological control agent, which is different from the strain of the invention.
  • at least one other biological control agent is meant that the plant protection composition of the invention can contain 2 biological control agents (that of the invention and another), just as it can contain 3, 4 or more. 5 (that of the invention and 2, 3 or 4 others).
  • one of the objects of the invention relates to the phytosanitary composition described above, said phytosanitary composition being initially (on purchase) in the form of a solid or concentrated liquid composition.
  • a solid or concentrated liquid composition can be, for example, obtained by means of a particular formulation of the spores of the isolated strain of Trichoderma atroviride of the invention produced by fermentation in solid or liquid medium, said spores possibly being in purified form or in the production matrix, said production matrix being solid or liquid.
  • concentration composition is meant a composition in which the concentration of the active principle (ie the strain of the invention, which can be in the form of spores) is greater than an effective amount of 10 7 spores / g, i.e. 10 7 CFU / g.
  • concentration of the active principle ie the strain of the invention, which can be in the form of spores
  • concentration of the active principle ie the strain of the invention, which can be in the form of spores
  • concentration of the active principle ie the strain of the invention, which can be in the form of spores
  • concentration of the active principle ie the strain of the invention, which can be in the form of spores
  • greater than an effective amount of 10 7 spores / g is also meant greater than an effective amount of 10 8 spores / g, greater than an effective amount 10 9 spores / g, greater than an effective amount 10 10 spores / g. g, greater than an effective amount of 10 11 spores / g or greater than an effective amount of 10 12 spores / g.
  • the user of the aforesaid composition must then incorporate or suspend it in a solid (eg. Soil, etc.) or aqueous (eg water) medium to obtain a dilute composition comprising an effective amount of 10 4 to 10 12 spores / g of the Trichoderma atroviride strain of the invention, which may be in the form of spores.
  • a solid eg. Soil, etc.
  • aqueous (eg water) medium e.g.
  • the resulting diluted solid or liquid composition can then be applied to plants for which prevention and / or treatment of a fungal plant disease is desired.
  • the spreading of the aforesaid composition comprises in particular the conventional spreading techniques known to those skilled in the art, which are used to spread solid materials (eg sewage sludge, manure over an area to be treated). , etc.) or liquid (eg pesticides, etc.) of agronomic interest.
  • solid materials eg sewage sludge, manure over an area to be treated. , etc.
  • liquid eg pesticides, etc.
  • one of the subjects of the invention relates to the phytosanitary composition described above, comprising an effective amount of 10 4 to 10 12 spores / g, more particularly 10 7 to 10 9 spores / g,
  • said phytosanitary composition optionally being obtained after a preparation step (e.g. dilution by suspending or mixing) making it ready for spreading.
  • a preparation step e.g. dilution by suspending or mixing
  • the expression "from 10 4 to 10 12 spores / g" can also mean from 10 4 to 10 5 spores / g, from 10 4 to 10 6 spores / g, from 10 4 to 10 7 spores / g, from 10 4 to 10 8 spores / g, from 10 4 to 10 9 spores / g, from 10 4 to 10 10 spores / g, from 10 4 to 10 11 spores / g, from 10 5 to 10 6 spores / g, from 10 5 to 10 7 spores / g, from 10 5 to 10 8 spores / g, from 10 5 to 10 9 spores / g, from 10 5 to 10 10 spores / g, from 10 5 to 10 11 spores / g, from 10 5 to 10 12 spores / g, from 10 6 to 10 7 spores / g, from 10 6 to 10 8 spor
  • the latter also relates to a phytosanitary coating composition comprising the isolated strain of Trichoderma atroviride of the invention and optionally at least one fixing agent, said phytosanitary coating composition making it possible to produce a coated seed.
  • the invention therefore also relates to a phytosanitary coating composition comprising the isolated strain of Trichoderma atroviride of the invention, said phytosanitary coating composition making it possible to produce a coated seed; a phytosanitary coating composition comprising the isolated strain of Trichoderma atroviride of the invention and at least one fixing agent, said phytosanitary coating composition making it possible to produce a coated seed.
  • One of the objects of the invention therefore relates to a coated seed comprising a plant seed, said plant seed being coated with said phytosanitary coating composition and said plant belonging in particular to the Poaceae family, in particular wheat and / or corn and / or barley.
  • coated seed is meant a seed selected for sowing, said seed having undergone a particular treatment which has enabled it to be coated in a phytosanitary coating composition.
  • the invention relates to the coated seed as described above, said plant being wheat and / or corn and / or barley.
  • the invention also relates to the coated seed as described above, said coated seed comprising an effective amount of 10 5 to 10 8 (or 10 6 to 10 7 ) spores / coated seed, preferably 10 6 ( or 10 7 ) coated spores / seed.
  • a fourth aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention. More particularly, the invention relates to the use of the composition of the invention in the prevention and / or treatment of fungal diseases of plants, in particular of plants belonging to the Poaceae family, in particular wheat and / or corn. and / or barley.
  • the invention relates to the use of the composition of the invention in the prevention and / or treatment of fungal diseases of wheat and / or corn and / or barley.
  • the invention also relates to the use of the composition of the invention for promoting the germination of a seed of plants belonging to the Poaceae family, in particular wheat and / or corn and / or barley.
  • the invention relates to the use of the composition of the invention for promoting the germination of a seed of wheat and / or corn and / or barley.
  • one of the subjects of the invention relates to the use of the isolated strain of Trichoderma atroviride of the invention or of the phytosanitary composition described above in the prevention and / or treatment of fungal diseases of plants, in particular of plants belonging to the Poaceae family, in particular wheat and / or corn and / or barley; and or
  • a fifth aspect of the invention relates to a method of protecting and / or treating a plant against a disease caused by a pathogenic fungus for plants comprising the application of the composition of the invention to at least part of said plant or soil near said plant.
  • the invention relates to said method of the invention, wherein said part of said plant is a leaf, a fruit, a seed.
  • one of the objects of the invention relates to a method of protecting and / or treating a plant against a disease caused by a pathogenic fungus for plants comprising the application of the composition of the invention to at least part of said plant or of the soil near said plant,
  • said part of said plant is a leaf, a fruit, a seed, and
  • said plant belongs to the Poaceae family, in particular wheat and / or corn and / or barley.
  • the invention relates to the method described above, in which said composition is applied
  • 10 to 500 L / ha also means 10 to 400 L / ha, 10 to 300 L / ha, 10 to 200 L / ha, 10 to 100 L / ha , 100 to 500 L / ha, 200 to 500 L / ha, 300 to 500 L / ha, 400 to 500 L / ha, 50 to 500 L / ha, 50 to 250 L / ha or 250 to 500 L / ha.
  • the expression "from 10 10 to 10 14 spores / ha” also means from 10 10 to 10 11 spores / ha, from 10 10 to 10 13 spores / ha, from 10 11 to 10 12 spores / ha, from 10 11 to 10 13 spores / ha, 10 11 to 10 14 spores / ha, 10 12 to 10 13 spores / ha, 10 12 to 10 14 spores / ha or 10 13 to 10 14 spores / ha.
  • the invention relates more particularly to the process described above, in which said plant belongs to the Poaceae family, in particular wheat and / or corn and / or barley.
  • the invention relates to the process described above, in which said plant is wheat and / or corn and / or barley.
  • Septoria tritici is meant the pathogen of septoria.
  • Gabberella zeae F. graminearum
  • Fusarium wilt the pathogen of Fusarium wilt.
  • Prosinia striiformis is understood to mean the pathogen of yellow rust of wheat.
  • the invention relates more particularly to the method described above, in which
  • the protection of said plant comprises a step of coating the seed with said phytosanitary composition
  • the protection of said plant comprises spraying said composition at the time of sowing or at the germination of said plant;
  • the protection of said plant comprises either a preventive application at soil level before sowing said phytosanitary composition with the addition of organic amendment, or a preventive application at soil level before sowing said phytosanitary composition on the previous crop; and or
  • the treatment of said plant comprises spraying said composition during different phenological stages of the plant to prevent a risk of infection of said pathogenic fungus of the whole or part of the plant.
  • Figure 1 represents the visual observations of the Dual culture test against Fusarium graminearum, to the left of the Petri dishes, at 6 (A and B) and 10 (C and D) days of cultures for the TAL-17 strain (A and C) and the BCA C strain (B and D), to the right of the Petri dishes.
  • FIG. 2 represents the microscopic observation (x100 magnification) with an inverted microscope of the mycelia of F. graminearum (black arrow) and of the TAL-17 strain (white arrow) on a Petri dish containing PDA medium (potato, dextrose, agar), after 8 days of growth.
  • Figure 3 represents the occupied surface (in%) and the associated photographs of the front face of a Petri dish inoculated with a rake with three strains of microorganisms (F. graminearum, TAL-17 and BCA C alone or in mixtures after 7 growing days Average ⁇ sd Different letters indicate a significant difference between the modalities (1-way ANOVA, p ⁇ 0.05).
  • FIG. 4 represents the change in the surface area occupied by the BCA TAL-17 and Fusarium graminearum microorganisms alone or as a mixture after depositing 30 ⁇ L in the center of a culture dish with PDA medium after 72 h (A) and after 96 h (B) of culture at 25 ° C under a light hood.
  • Figure 5 shows the change in the percentage inhibition of Fusarium graminearum on a dish depending on the formulation used.
  • Figure 6 shows the percentage of CIV tubes showing septoria spots as a function of treatment after 18 days and 26 days of disease inoculation.
  • FIG. 7 represents the percentage of healthy grains observed at harvest during the tests in the phytotronic room.
  • FIG. 8 represents the mass of grains per ear at harvest during the tests in a phytotronic room.
  • FIG. 9 represents the percentage of visual symptoms of contamination on ears by Fusarium wilt during the tests in the phytotronic room.
  • FIG. 10 represents the mass of grains per ear at harvest during the tests in a phytotronic room.
  • FIG. 11 represents the percentage of fusarious grains at harvest during the phytotronic room tests carried out.
  • FIG. 12 represents the germination of maize plants after 6 days of growth with a sowing treatment of a suspension of TAL-17 spores at 1.10 5 CFU spores / seed or 1.10 8 CFU spores / seed.
  • An aerial treatment is carried out later during the 5-leaf stage and is not taken into account when measuring germination.
  • Mean ⁇ sd Different letters indicate a significant difference between the different modalities (1-way ANOVA, p ⁇ 0.05).
  • FIG. 13 represents the measurement of the height in height of corn plants after 25 days of growth with a sowing treatment of a suspension of TAL-17 spores at 1.10 5 UFC spores / seed or 1.10 8 UFC spores / seed.
  • An aerial treatment is carried out later during the 5-leaf stage and is not taken into account when measuring germination.
  • Mean ⁇ sd Different letters indicate a significant difference between the different modalities (1-way ANOVA, p ⁇ 0.05).
  • FIG. 14 represents the percentage of germination of seeds of spring wheat (Calixo) in the presence or absence of suspended spores of Trichoderma atroviride TAL-17 at sowing. Culture in a phytotron chamber with photoperiod. Mean ⁇ s.d. Significant difference between the water modality and the TAL-17 modality (1-factor ANOVA, p ⁇ 0.05).
  • Figure 15 includes photographs (A) and a graphic (B).
  • Figure 16 includes photographs (A) and a graphic (B).
  • Line 1 corresponds to BCA alone at the dose of 1.10 4 CFU / mL
  • line 2 corresponds to the BCA / Fusa ratio 2/1 mixture (BCA at 1.10 4 CFU / mL and Fusa at 5.10 3 CFU / mL)
  • line 3 corresponds to the BCA / Fusa ratio 1/1 mixture (BCA at 1.10 4 UFC / mL and Fusa at 1.10 4 UFC / mL)
  • line 4 corresponds to the BCA / Fusa ratio 1/2 mixture (BCA at 1.10 4 CFU / mL and Fusa at 2.10 4 CFU / mL).
  • the bottom panel corresponds to the culture of Fusarium graminearum alone, from left to right, at a dose of 2.10 4 , 1.10 4 and
  • Figure 17 includes photographs (A) and a graphic (B).
  • Line 1 corresponds to BCA alone at a dose of 1.10 4 CFU / mL
  • line 2 corresponds to the BCA / Fusa ratio 2/1 mixture (BCA at 1.10 4 UFC / mL and Fusa at 5.10 3 UFC / mL)
  • line 3 corresponding to the BCA / Fusa ratio 1/1 mixture (BCA at 1.10 4 UFC / mL and Fusa at 1.10 4 UFC / mL)
  • line 4 corresponds to the BCA / Fusa ratio 1/2 mixture (BCA at 1.10 4 UFC / mL and Fusa at 2.10 4 UFC / mL).
  • the bottom panel corresponds to the culture of Fusarium graminearum alone, from left to right, at a dose of 2.10 4 , 1.10 4
  • the leaf sample from the wheat crop was ground and then brought into contact in an infinitely mixed with a PDA (Potato Dextrose Agar) agar at 50 ° C which contains spores of Fusarium graminearum.
  • the dish was cultured at 25 ° C. under a light hood. Thus only the strains being able to reproduce in the presence of Fusarium graminearum developed on the dish.
  • TAL-17 was present.
  • a specific sample from an area of interest in the box and several successive subcultures made it possible to isolate the TAL-17 strain, which was then deposited on July 3, 2018 at the CNCM under number CNCM 1-5333.
  • strains TAL-17 and BCA C both exhibited an ability to occupy space, whereas strain TAL-17 unlike strain BCA C is capable of growing on the mycelium of Fusarium graminearum ( Figure 1).
  • the TAL-17 strain therefore presents a much greater mycoparasitism potential than the other reference strain BCA C.
  • this mixture also contains 0.5% of the Appyphyt formulation, which is an emulsion of vegetable oil esters (Vegetable oil esters : 60- 80%; Biobased emulsifier; 1-5%; Qsp Water).
  • the mixture was inoculated after 2 h of contact.
  • the Petri dishes were incubated at 25 ° C. under artificial light (24 hours a day) (fluorescent tube F36WT8 / 2084 Britegro). Measurements of the growth of F.
  • endophyte comes from two Greek words “endon” and "phuton” which means respectively "inside” and "plant”.
  • the definition of endophyte has changed very often over time.
  • the definition concerned any organism that could live inside a plant.
  • endophytic organisms are organisms having a way of life with the plant known as “endophism”. That is, endophytic species are able to colonize the internal structures of plants asymptomatically (Hardoim, PR, van Overbeek, LS, Berg, G., Pirttilà, AM, Compant, S., Campisano, A ., ... Sessitsch, A. (2015).
  • Endophytes can be microorganisms like fungi. They can colonize the plant at different levels depending on the microorganism.
  • the organs concerned can be, depending on the case: the stem, the roots, the leaf segments, the fruits, the buds, the seeds but also in the dead and hollow hyaline cells of the plants (Stçpniewska, Z., & Kuzniar, A. (2013). Endophytic microorganisms— promising applications in bioremediation of greenhouse gases. Applied Microbiology and Biotechnology, 97 (22), 9589-96.).
  • Cotton blue (LACP-00D-100 Labkem ® ) with lactophenol was used in this study as a dye for the detection of fungi. Samples of 1 x 0.5 cm wheat leaf and 2.5 x 1.5 cm corn were taken for each modality studied. The procedure is as follows for the treatment of sections:
  • the substrate used is a mixture of universal soil and expanded vermiculite (0.5-10 mm) (2: 1 v / v).
  • the substrate was moistened 24 hours before sowing with reverse osmosis water.
  • the seeds were moistened the day before sowing for 24 h at 4 ° C.
  • the pots were placed under a light hood at 25 ° C (16/8 hour photoperiod) and were watered three times a week.
  • Fungus mycelium was observed in the leaves and roots of the seedling treated plant in contrast to the untreated control plant.
  • the substrate used is a mixture of universal soil and expanded vermiculite (0.5-10 mm) (2: 1 v / v).
  • the substrate was moistened 24 hours before sowing with reverse osmosis water.
  • the pots were watered three times a week with an increasing volume of RO water as the plant developed.
  • Fungus mycelium was observed in the leaves and roots of the seedling treated plant in contrast to the untreated control plant.
  • Strain TAL-17 resulted in a 63% reduction in the development of Fusarium graminearum in a Petri dish at 72 h and 78% at 96 h. This reduction rose to 77% at 72 h and to 85% at 96 h when combined with the Appyphyt formulation ( Figure 5). It should be noted that at 96 h the Appyphyt formula alone did not show any inhibition on the growth of Fusarium graminearum.
  • the in vitro culture was developed to perform a screening of the selected BCAs potentials against the septoria blight of the wheat Septoria tritici.
  • the standard in vitro culture medium has been modified by removing the sucrose to avoid possible contamination.
  • the disease and BCA were applied simultaneously by spraying under conditions as close to the field as possible.
  • FIG. 6 The percentages of plants exhibiting septoria spots according to the methods are presented in FIG. 6. Two Trichoderma atroviride were tested, including TAL-17. The latter has proved to be the most interesting against this disease. Note the quantity of BCA is in number of viable spores (equivalent to 5.10 11 viable spores / hectare).
  • the phytotronic room has the possibility of increasing to 90% RH humidity during infection at the time of flowering of the ears.
  • the tray allows you to test 30 planters of 15 plants. The tests were carried out with “Calixo” spring wheat.
  • a first test showed an interest for the TAL-17 strain ( Figures 7 and 8). This interest was confirmed thanks to a new test ( Figures 9, 10 and 11). The latter demonstrated an interest in the use of TAL-17 (equivalent to 10 11 UFC spores / ha) with the Appyphyt formulation (equivalent to lL / ha) on wheat for the visual symptoms of the disease and on the mass of grains per ear which are then both statistically different from the contaminated modality to Fusarium graminearum alone. However, the mass of grains per ear when the wheat was treated with TAL-17 and the Appyphyt formula does not reach the mass of uncontaminated control wheat (ie 0.831 g / ears for Figure 8 and 0.77 g / ears for figure 10).
  • the TAL-17 strain showed an interest for an application at the flowering stage of wheat, but in view of its endophytic character, a much earlier application is of interest in the fight against fusarium head blight.
  • the substrate used is a mixture of universal soil and expanded vermiculite (0.5-10 mm) (2: 1 v / v).
  • the substrate was moistened 24 hours before sowing with reverse osmosis water.
  • the pots were watered three times a week with an increasing volume of RO water as the plant developed.
  • witness (A) did not receive any treatment; the sowing treatment (B and C) was carried out with a TAL-17 solution of 1.10 5 or 1.10 8 spores / seed (sp / seed); the spraying treatment at the 5-leaf stage (D and E), ie 21 days of growth, was carried out with a TAL-17 solution of 1.10 11 or 5.10 11 spores / ha.
  • the germination rate tends towards 97% for the modalities having received the sowing treatment at 1.10 5 spores / seed and for those who have not yet received the aerial treatment.
  • the control mode without treatment, increases up to a germination percentage of 93%.
  • the results of the size-in-height measurements of the 25-day-old plants represented are presented in FIG. 13, and demonstrated a statistical difference between the sowing treatment of TAL-17 compared with the aerial spray treatment and the control.
  • the sowing treatments at 1.10 5 and 1.10 8 spores / seed (viable spores) allow plants to grow in the order of 105 cm, while the aerial treatments, carried out 4 days earlier and the control, only allow growth ranging from 97 cm for the control, to 100.5 cm for the aerial treatment at 1.10 11 spores / ha and 101 cm for the treatment at 5.10 11 spores / ha. These values are found in the same statistical group.
  • the substrate used is a mixture of universal soil and expanded vermiculite (0.5-10 mm) (2: 1 v / v). The substrate was moistened 24 hours before sowing with reverse osmosis water.
  • the pots were placed in the phytotronic room (16 / 8h photoperiod) and were watered twice a week.
  • the germination percentage was observed at 4 and 11 days depending on the modalities.
  • the experimental protocol was the same as that described previously.
  • the Dual culture test was performed with 30 m ⁇ of BCA or F. graminearum deposited at the ends of the Petri dish. After 6 and 10 days of culture at 25 ° C on PDA under a light hood with 16 h photoperiod, the dishes were observed ( Figure 15 A) and the length of the pathogen coverage by BCA was measured ( Figure 15B).
  • the TAL-17 strain exhibited the particularity of growing on the mycelium of the pathogen over time, unlike the BCA D.
  • VII probe specificity Assay TaqMan ® GS285741-P1 and the torque associated GS285741 primer-F1-R1 and GS285741 vis-à-vis the strain of the invention (tal- 17 and / or a mutant thereof )
  • An internal control standard is also produced with genomic DNA extracted from the strain of the invention, which has been serially diluted. All qPCR assays were performed using a CFX 96 touch thermal cycler from Biorad ® . The amplification program used is that recommended by the supplier with a temperature hybridization at 60 ° C. For the TaqMan ® method, the Luna ® Universal Probe qPCR Master Mix (NEB ® ) reaction mixture was used. The amplification program is 95 ° C 2 min followed by 40X 95 ° C 15 ”and 60 ° C 30”.
  • SCI strain isolated Trichoderma atroviride present in the Vintec ® product.
  • a Dual culture test was carried out on which 100 ⁇ L of a F. graminearum / T. atroviride (Fusa / BCA) was spread on PDA medium in a Petri dish.
  • BCA / Fusa mixture (ratio 1/2): BCA at 1.10 4 CFU / mL and Fusa at 2.10 4 CFU / mL (lmL mixture of BCA at 2.10 4 CFU / mL + 1mL of fusa at 4.10 4 CFU / mL).
  • BCA / Fusa mixture (ratio 2/1): BCA at 1.10 4 CFU / mL and Fusa at 5.10 3 CFU / mL (lmL mixture of BCA at 2.10 4 CFU / mL + 1mL of fusa at 1.10 4 CFU / mL).
  • the strain of the invention TAL-17 at the same dose combats Fusarium graminearum more. This is clearly visible for the ratio of 2 CFU of Fusa / 1 CFU of BCA. In fact, under these conditions, the SCI strain stalls unlike the TAL-17 strain.
  • the sown plot was divided into 4 micro-plots of the order of 20 m 2 per modality (see Table 4) and the actual test was able to start.
  • two treatments were carried out at the 'ears 6 to 8' (T1) and 'early flowering' (T2) stage with conventional treatments (Onnel ® , Faxer ® , Librax ® ) in the usual dose (0.6 L / ha) or in half-dose (0.3 L / ha) in combination or not with a mixture of BCA (strain TAL-17 [BCA 1] or another strain of T. atroviride [BCA 2]) at a dose of 1.10 11 CFU / ha and Appyphyt at a dose of 1 kg / ha (see Table 4).
  • the statistical analysis was carried out using StatBox ® analysis and statistical processing software. It is paired with Excel ® software and enriched its functions. It made it possible to carry out the ANOVAs which will be presented in the results section. The comparisons of means are carried out according to the Newman-Keuls test at the 5% threshold. Homogeneous statistical groups are determined, the modalities associated with the same letter are not statistically different.
  • BCA 1 ie. Strain TAL-17
  • BCA 2 another strain of Trichoderma atroviride
  • This difference in efficacy is statistically different when comparing modality No. 9 to modality No. 7 of the test and looking at the notes on brown rust.
  • BCA was applied alone to the first treatment and was also applied to the second treatment with a half-dose of conventional Librax ® fungicide.
  • the TAL-17 strain showed in this test a statistical interest on the physical symptoms of brown rust.
  • the TAL 17 strain when it is applied (cf. modality No. 9), it allowed to obtain a brown rust score of the same statistical group as the best modality (cf. modality No. 4) for the brown rust notation.

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Abstract

La présente invention concerne un nouvel agent de biocontrôle et son utilisation pour la lutte contre des maladies fongiques de plantes.

Description

DESCRIPTION
TITRE : NOUVEL AGENT DE BIOCONTROLE ET SON UTILISATION POUR LA LUTTE CONTRE DES MALADIES FONGIQUES DE PLANTES
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne un nouvel agent de biocontrôle et son utilisation pour la lutte contre des maladies fongiques de plantes.
ART ANTERIEUR
Différentes maladies menacent le blé au cours de sa croissance. Elles peuvent être classées en trois catégories :
■ les maladies de la base des tiges (ex : piétin- verse, fusariose),
■ les maladies des feuilles (ex : oïdium, septoriose, helminthosporiose, rouille jaune et rouille brune) ;
■ et les maladies des épis (ex : fusariose de l’épi, oïdium de l’épis et septoriose).
Suivant les variétés de plantes et les conditions climatiques, des pertes quantitatives importantes des récoltes sont possibles, comme avec la septoriose qui réduit l’activité photosynthétique de la plante. De plus, d’autres maladies peuvent altérer la qualité de la récolte, telle la fusariose de l’épi qui produit des my cotoxines.
Plus précisément :
[1] La septoriose. dont l’agent pathogène est Septoria tritici (= Mycosphaerella graminicola ), est, sur le blé tendre, la maladie la plus fréquente et la plus dommageable quantitativement avec par exemple 17 q/ha de baisse de rendement moyen à l’échelle du territoire sur les dix dernières années. La « septoriose du blé » désigne deux maladies :
■ la septoriose des épis causée par le champignon Phaeosphaeria nodorum (anamorphe / forme asexuée : Stagonospora nodorum) qui attaque les feuilles mais aussi les épis et les grains de blé ; et
■ la septoriose des feuilles causée par le champignon Mycosphaerella graminicola (anamorphe / forme asexuée : Septoria tritici , récemment renommée Zymoseptoria tritici) qui attaque les feuilles et les gaines de blé. La septoriose à P. nodorum a été l’espèce prédominante en France jusque dans les années 80, de nos jours la forme majoritaire est la septoriose à M. graminicola , sans doute pour des raisons écologiques (Bearchell, S. J., Fraaije, B. A., Shaw, M. W., & Fitt, B. D. L. (2005). Wheat archive links long-term fungal pathogen population dynamics to air pollution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(15), 5438-42.).
[2] La fusariose. dont l’agent pathogène est Gibberella zeae (= Fusarium graminearum ), est un terme générique qui désigne un groupe de maladies cryptogamiques. Dans le cas du blé, cette maladie peut dévaster une culture quelques semaines avant la récolte. Outre le blé, elle est également retrouvée sur d’autres espèces comme le maïs et l’orge. Contrairement à la septoriose, la fusariose peut infecter toutes les parties de la plante, depuis les racines jusqu’aux épis, et ceci à tous les stades de développement. Le terme « fusariose » des céréales regroupe trois types de symptômes (Parry, D. W., Jenkinson, P., & McLeod, L. (1995). Fusarium ear blight (scab) in small grain cereals, a review. Plant Pathology , 44(2), 207- 238.) :
■ la fusariose des semences ;
■ la fusariose du collet ; et
■ la fusariose de l’épi.
Cette dernière, la fusariose de l’épi est associée à un complexe d’espèces de champignons appartenant aux genres Fusarium et Microdochium. Le genre Fusarium a été décrit pour la première fois en 1809 par Link et doit son nom du latin « fusus » (fuseau) en rapport à l’allure fusiforme de ses spores. Il appartient à la division des ascomycètes, à l’ordre des Hypocreales et à la famille des Nectriaceae. Parmi la vingtaine d’espèces du genre Fusarium pouvant causer la fusariose de l’épi, F. graminearum, est l’une des espèces la plus problématique en France de par sa production de mycotoxines dont le trichothécène déoxynivalenol (DON).
[3] La rouille brune du blé dont l’agent pathogène est Puccinia recondita , est une maladie qui apparaît généralement assez tardivement au printemps. Elle peut provoquer d'importants dégâts si elle est mal contrôlée. Le champignon hiverne essentiellement sur les repousses de céréales et les cultures à semis précoces sous forme d’urédospores. Ces urédospores germent en présence d’eau libre et pour des températures comprises entre 15 et 25°C. La période de sporulation est de 5 à 25 jours selon les températures et les variétés. En conditions favorables, plus de 3000 urédospores peuvent être produites par pustule, ce qui explique le caractère explosif de la maladie. Les spores sont disséminées principalement par le vent (Ali, S., Gladieux, P., Leconte, M., Gautier, A., Justesen, A. F., Hovmoller, M. S., Enjalbert, J., de Vallavieille-Pope, C. (2014). Origin, Migration Routes and Worldwide Population Genetic Structure of the Wheat Yellow Rust Pathogen Puccinia striiformis f.sp. tritici. PLoS Pathogens , 10(1), el003903 ; De Vallavieille-Pope, C., Ali, S., & Leconte, M. (2012). Spécial Report Virulence Dynamics and Régional Structuring of Puccinia striiformis f sp. tritici in France Between 1984 and 2009.).
[4] La rouille jaune du blé dont l’agent pathogène est Puccinia striiformis , est une maladie qui peut être très nuisible sur des variétés sensibles en cas d’attaques précoces. Les conditions fraîches et humides sont favorables à son développement. La rouille jaune passe l’hiver sous forme de mycélium ou de spores actives sur les repousses de céréales ou les cultures semées tôt à l’automne. Ce champignon résiste à des températures négatives et survit généralement à l’hiver sur des plants infectés. Au printemps, la rouille jaune commence à se développer et produit des spores actives, et ce d’autant plus que le temps est frais et humide. Les conditions optimales pour la germination des spores sont réunies lorsque les températures sont comprises entre 10 et 13°C avec un taux d’humidité relative à 100 %. Les spores sont disséminées principalement par le vent (Rossi, V., Racca, P., Giosue’, S., Pancaldi, D., & Alberti, F (1997). A simulation model for the development of brown rust épidémies in winter wheat. European Journal of Plant Pathology, 103(5), 453-465.).
Parmi les différentes méthodes de lutte disponibles pour lutter contre ces maladies, notamment la septoriose et la fusariose et leurs conséquences, il existe la lutte chimique (fongicides), la résistance variétale, les stimulateurs de défenses des plantes (SDN ou « éliciteurs »), la lutte agronomique (travail du sol, précédents culturaux, gestion des résidus de culture ou des repousses, date et densité de semis, fertilisation azotée...). Toutefois, celles- ci présentent soit des inconvénients environnementaux liés à la pollution de sols et des nappes phréatiques, soit impliquent un coût humain et temporel important.
Dans un souci de respect de l’environnement, il a alors été développé des moyens de lutte biologique naturelle à l’aide de microorganismes. Cette dernière, également appelée lutte microbiologique directe, consiste à introduire des antagonistes microbiens spécifiques dans le sol ou sur le matériel végétal. Ces antagonistes, également appelés agents de lutte biologique ou BCA ( Biological Control Agent ), peuvent interférer avec la croissance et/ou la survie des agents pathogènes permettant ainsi de les contrôler. Pour ce faire, les agents de lutte biologique ou BCA peuvent contrôler les pathogènes cibles grâce à un ou plusieurs modes d’action :
1/ la compétition laquelle peut avoir lieu entre le BCA et l’agent pathogène pour l’oxygène, pour l’espace, ou encore pour les nutriments ;
2/ l’antibiose. laquelle correspond aux interactions impliquant au moins un composé diffusible de faible masse moléculaire ou un antibiotique produit par un microorganisme qui inhibe la croissance d’un autre microorganisme;
3/ le parasitisme et la production d’enzymes hydrolytiques et/ou de métabolites antibiotiques au détriment d’un autre organisme hôte ; et/ou
4/ l’induction de résistance chez la plante hôte (« élicitation ») à l’image des bactéries de la rhizosphère, connues sous le nom de PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria ), lesquelles sont capables d'induire chez la plante une résistance systémique induite (ISR, Induced Systemic Résistance) qui permet d'accroître la résistance aux pathogènes grâce à un phénomène de potentialisation (ou priming ), qui correspond à un état de veille permettant une réponse immunitaire plus rapide et plus intense de la plante.
Le genre Trichoderma comprenant diverses espèces de champignons susceptibles d’être des agents de biocontrôle, leur mode d’action a fait l’objet de nombreux travaux. Ils font notamment état d’une capacité de ce champignon filamenteux à intervenir selon divers mécanismes : mycoparasitisme, antagonisme (compétition), antibiose (production d’antibiotiques), stimulation racinaire, stimulation de la croissance par solubilisation de minéraux fertilisants, stimulation des défenses naturelles des plantes, etc. Ils colonisent les racines des plantes herbacées et ligneuses sans aucun dommage. En outre, ce champignon peut pénétrer dans les racines et favoriser le développement, la nutrition et la résistance aux maladies. Toutefois, les effets sont inégaux d’une espèce à l’autre voire d’une souche à l’autre car un bon agent de lutte biologique doit être un bon colonisateur et un bon antagoniste mais surtout, il doit également être compatible avec la rhizosphère et avec les plantes.
BREF APERÇU
Dans ce contexte de lutte contre des maladies fongiques, telles que la septoriose et la fusariose, un premier but de l’invention consiste donc à la mise à disposition d’une souche efficace, comme un agent de lutte biologique (ou agent de biocontrôle). Un second but de l’invention est de fournir des compositions phytosanitaires pour la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux.
Un troisième but de l’invention est également de fournir des compositions phytosanitaires d’enrobage où, en association avec une semence de plante, la souche de l’invention est utilisée comme un agent d’accélération de la germination de ladite semence.
Un autre but de l’invention est la mise à disposition des procédés permettant de fabriquer lesdites compositions et de mettre en œuvre la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux, et l’accélération de la germination.
DESCRIPTION DETAILLEE
Un premier aspect de l’invention concerne une souche isolée de Trichoderma atroviride dont le gène ech42 possède une identité de séquence d’au moins 98% avec la séquence SEQ ID NO : 1 du gène ech42 de la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333.
De manière surprenante, il est apparu que la souche de Trichoderma atroviride TAL-17 développée par les inventeurs, dont le gène ech42 a été séquencé, possède d’excellentes propriétés stimulatrices de croissance, des propriétés antagonistes utiles en agriculture ainsi qu’une grande stabilité en matière de viabilité. De fait, elle constitue un agent de biocontrôle idéal pour lutter efficacement contre des maladies fongiques de plantes.
Par « une identité de séquence d’au moins 98% avec la séquence SEQ ID NO : 1 », on entend une identité de séquence d’au moins 98,5%, d’au moins 99% voire d’au moins 99,5% avec la séquence SEQ ID NO : 1 représentée par la séquence d’acide nucléique suivante :
AC AG T AT AAG CAT AT C G GAGAAAT G C CAC CAC C AG C AAC G T T G C T AGAC T T G G C GAG G T G C G GCATAGT TCAGTGATAT TGCGCCGGGGCATCCCCTGGATATGCT TATCT TCTGAATCTGGGG AACT TGGGAAT TCTACGAGTCGACAGCCGCCGAGCCCTGGGCACGGGACAGGGGCCACAAGC T C T T G CAC GAT G G CAC T AT T C T AGAG C AGAAG T GAG CAT AAC G T T G C GAT T GAC CAT G T T G G C AAAG CAT G G G T T AC AT AC C TAC T C G T G C T AAGAAC C C C GAAAG G GAAG C T T CAT AAG T T GA C T T CAGAT T T CGC T GAACAATAGGAGGC T CCACAAT CAC T TATAAATAT GC T GCATAT CC T T CCAGCACT TCG GAT G AAAAT TCCATCCAGCAGCAG C AAC T T G G AG AG CTCT T T TCAGCAGCA ACT TCT TCCT T TCAAAGCATCTCT TGACAACCT T TGCTGAATCTCAAACACT TCACCATGT T GGGCT TCCTCGGAAAATCCGTGGCCCTGCT TGCTGCGCTGCAGGCCACTCTCAT T TCTGCAT
CTCCTGTAACTGCAAACGACGTCTCTGT TGAGAAGAGAGCCAGTGGATACGCAAACGCCGTC TAC T T CAC C AAC T G G T AAG T GAAG C T G C T T C AGAG T CAT GAAAAT C AG GAC T AAC CAT T G G T GATTAAAGGGGTATTTACGGCCGCAACTTCCAGCCTCAGAACCTGGTCGCGTCGGACATCAC TCATGTCATCTACTCGTTCATGAACTTCCAAGCAGACGGCACTGTGTAAGTTTTGAAGACAA GAGTCAAGATATTCTAATTTCCATATCCAGTGACTAATCTTTTCACTTATAGCGTCTCTGGA GAT G C C TAC G C C GAT T AT C AGAAG CAC T AT GAC GAC GAT T G T AT G C T AG C C C TAC T C C C T T T GTTCTCTCCTGTTTTTGAGCTCTTCAGGTATACTAACGTCTACAACAGCTTGGAACGACGTC GGTAACAATGCGTACGGCTGTGTGAAGCAGCTGTTCAAGCTGAAGAAGGCCAACCGCAACTT GAAGGTTATGCTTTCCATCGGTGGCTGGACCTGGTCCACCAACTTTCCTTCTGCAGCAAGCA CCGATGCCAACCGCAAGAACTTTGCCAAGACTGCCATCACCTTCATGAAGGACTGGGGTTTC GATGGTATTGACGTCGATTGGGAGTACCCCGCCGATGATACCCAGGCCACCAACATGGTTCT TCTGCTCAAGGAGATCCGATCTCAGCTAGATGCCTATGCTGCGCAATACGCTCCGGGCTACC ACTTCCTTCTTTCCATTGCTGCCCCCGCTGGCCCAGAGCACTACTCTTTCCTGCACATGTCC GACCTTGGCCAAGTTCTCGACTATGTCAACCTCATGGCCTACGACTATGCTGGTTCTTGGAG CAGCTACTCCGGACACGATGCCAACTTGTTTGCCAACCCGTCCAACCCCAACTCTTCACCAT AC AAC AC C GAT C AAG C T AT C AAG GAC TATAT C AAG G GAG GTGTTCCCG C AAG C AAGAT C G T T CTTGGCATGCCCATCTACGGACGAGCTTTTGAGAGCACCGGTGGCATTGGCCAGACCTACAG TGGAATTGGATCTGGAAGCTGGGAGAACGGTATTTGGGACTACAAGGTTCTTCCCAAGGCCG G C G C CAC AG T C C AG T AT GAC T C T G T C G CAC AG G CAT AC T AC AG C T AT GAC C C C AG C AG C AAG GAGCTCATCTCTTTCGATACCCCTGACATGATCAACACCAAGGTCTCTTACCTCAAGAACCT CGGCCTGGGAGGCAGCATGTTCTGGGAAGCTTCTGCTGACAAGACTGGCTCTGACTCCTTGA T C G G AAC AAG C CAC AG AG C T T T G G GAAG C C T AG AC T C CAC T C AG AAC T T G C T GAG C T AC C C C AACTCCCAGTATGATAACATCCGAAGCGGTCTCAACTAGAGATCTTTCTTCTTCTTATCTTT TTCTTTTACTTCCCCTATGGTTGTACCAACATTTCACACACGTTATGCGAAACGATTATGCA G G GAG CGTTATTTTTTAG T AAAT AG TTGCCCTTT GAGAT AT AT G AAC C T G T AC AT AAAGAAC TAC T AG C AG T AT AT AAG GAGAC AT G C AG G .
Au sens de l’Invention, l’identité de séquence est mesurée par les outils classiques de comparaison de séquences connues de l’Homme du métier tels que les algorithmes de la plateforme BLAST ou le programme MatGat (Campanella, Bitincka and Smalley, 2003).
Plus particulièrement, un des objets de l’invention est la souche isolée de Trichoderma atroviride déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333 et/ou un de ses mutants.
Par « souche isolée », on entend la culture d’un microorganisme unique qui a été isolée à partir de différents microorganismes présents sur et/ou dans les tissus d’un fragment de feuille de blé cultivé en champs. Par « un de ses mutants », on entend des souches mutantes obtenues par mutations ou manipulations génétiques d’une souche de référence, laquelle dans le contexte de l’invention est la souche isolée de Trichoderma atroviride TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333. Ces mutants conservent toutefois les mêmes propriétés physiologiques que la souche de référence voire peuvent présenter des propriétés physiologiques améliorées ( e.g . amélioration des capacités de biocontrôle).
Au vu de ce qui précède, on comprend donc qu’un des objets de l’Invention concerne également une souche isolée de Trichoderma atroviride dont le gène ech42 possède une identité de séquence d’au moins 98% avec la séquence SEQ ID NO : 1 du gène ech42 de la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333 et/ou un de ses mutants,
en particulier ladite souche isolée de Trichoderma atroviride est la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333 et/ou un de ses mutants, et de préférence, ladite souche isolée de Trichoderma atroviride est la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333.
L’ensemble de ces souches (i.e. TAL-17 et ses mutants), peuvent par ailleurs être facilement identifiées via la méthode dite de Polymerase Chain Reaction en temps réel (qPCR). Les inventeurs ont en effet développé des outils spécifiques de celles-ci à savoir, une sonde TaqMan® GS285741-P1 et un couple d’amorces nucléotidiques associé GS285741-F1 et GS285741-R1 ( cf Tableau 1), lesquelles permettent d’amplifier une séquence spécifique aux souches de l’invention {cf. Tableau 2).
Nom Séquence SEQ ID NO : Tm (°C)
GS285741-R1 AAC-GAG-ACT-TGA-CAG-TAG-CG 3 60,0
GS285741-P1 FAM-ACG-GCG-TAT-ATT-GTT-GAC-AAA- 4
CAA-GAT-GC-MGB
Tableau 1 : Amorces nucléotidiques (Fl et RI) et Sonde TaqMan® (PI)
FAM : 6-carboxyfluorescéine, MGB : minor groove binder. SEQ ID
Nom Séquence
NO :
Dell 1_285741 GCAATAAC T GC T CGTAT TAC T CCAGAAAAAGGGGCAAGT C TA 5 Ins (251-264) TCAACAGCCGCCGCTGCCAAGAATACGGGCTGGTCCTAGT TC
AAAT TGT TCATCGTCGCT TGGTGCTGCGTAGTCT TGAGCTAA AT GT T TAGCCAAT T C T CAAACGC T T GGCAGATAAAT T T TAT T AT T TAC C C T AGAAT AT G G T CAT T G G C GAAT G C C AGAC GAAT C AATC T GGAT GAT GCC T T CAACAGAT GGCCAT GCATCT TGT T T GTCAACAATATACGCCGT TGATGGGGCGCTACTGTCAAGTCT CGT T T TGATACTCTAGT T TCTCTCTCGTGATATATCAGCCGC CAC C T T AT G T AAAAC AG C C T G C AT CAAT T C T C CAAAT T GAC A T T GT T GTATAAAGAGGAAGGCGC T CATAGAT GC TATACAT CA T GAT T AACAAAGG T T AT T T AC T ACAAT T C T T C T T G T T AT GC T CGCAAT TCTCTACT TCTGATGGAATGTCCACGTGCGTAGCT T GTGTAGTACT
Tableau 2 : Séquence cible des oligonucléotides et de la sonde TaqMan® chez la souche TAL-17 et/ou ses mutants
De façon très particulière, un des objets de l’invention concerne une souche isolée de Trichoderma atroviride dont le gène ech42 possède une identité de séquence d’au moins 98% avec la séquence SEQ ID NO : 1 du gène ech42 de la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333,
en particulier ladite souche isolée de Trichoderma atroviride est la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333.
Plus particulièrement encore, un des objets de l’invention est la souche isolée de Trichoderma atroviride déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333.
Selon ce même aspect, un autre des objets de l’invention concerne la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention sous forme de spores, produites par fermentation en milieu solide ou liquide, lesdites spores pouvant être sous forme purifiée ou dans la matrice de production, ladite matrice de production étant solide ou liquide.
Par « sous forme de spores », on entend sous forme de conidiospores ou chlamydospore, (plus particulièrement conidiospores) assurant la fonction de multiplication asexuée chez le champignon. Par « fermentation en milieu solide (FMS) », on entend tout procédé permettant le développement du micro-organisme à la surface et/ou à l’intérieur d’une matrice de production poreuse solide et humidifiée, en absence d’eau libre.
Par « fermentation liquide », on entend tout procédé permettant le développement du micro organisme à l’aide d’une matrice de production avec présence d’eau libre.
Par « matrice de production », on entend tout substrat naturel et/ou synthétique, qui permet le développement du micro-organisme et induit la production de biomasse, et/ou d’enzymes, et/ou de métabolites primaires et/ou secondaires. Des exemples de familles d’enzyme ou d’enzyme produites par le champignon sont des protéases, des chitinases et la bêta- 1,3- glucanase.
Par « spores [...] sous forme purifiées », on entend les spores concentrées suite à l’élimination de la majeure partie du reste de la matrice après production n’ayant pas servi à la formation des spores, avec l’aide d’un procédé de tamisage par exemple.
Par « spores [...] dans la matrice de production », on entend les spores restées dans la matrice de production à l’issue du process de fabrication, sans étape de purification.
Un autre des objets de l’invention concerne la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention en tant qu’agent de lutte biologique.
Par « agent de lutte biologique », on entend qu’une souche de Trichoderma atroviride selon l’invention peut interférer avec la croissance et/ou la survie des agents pathogènes permettant ainsi de les contrôler et ce, via l’un ou plusieurs des modes d’action décrits précédemment (e.g. via le développement de sa biomasse et/ou sa production d’enzymes et/ou de métabolites secondaires). Par exemple, un des moyens de mettre en évidence qu’une souche de Trichoderma atroviride selon l’invention est un agent de lutte biologique est la réalisation d’un test Dual culture sur milieu de culture en boîte de Pétri comme ceux présentés parmi les exemples ci-après. Plus précisément par « test Dual culture », on entend un test sur boîte de Pétri en laboratoire sur milieu de culture, où la souche du microorganisme agent de lutte biologique et la souche du pathogène sont mises en culture sur la même boîte afin d’observer l’effet d’une souche sur une autre au cours du temps et vice versa.
Un autre des objets de l’invention concerne la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention, en tant qu’agent antifongique de végétaux.
Par « agent antifongique de végétaux », on entend qu’une souche de Trichoderma atroviride selon l’invention est capable de lutter contre les champignons phytopathogènes. Par exemple, un des moyens de mettre en évidence qu’une souche de Trichoderma atroviride selon l’invention est un agent antifongique de végétaux est la réalisation d’un test Dual culture comme ceux présentés parmi les exemples ci-après.
De façon très particulière, un des objets de l’invention concerne la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention en tant qu’ agent de lutte biologique,
en particulier en tant qu’ agent antifongique de végétaux dirigé contre un champignon pathogène pour végétaux, ledit champignon pathogène étant notamment choisi parmi Septoria tritici ou Gibberella zeae (= Fusarium graminearum) ou Puccinia recondita ou Puccinia striiformis.
Un second aspect de l’invention concerne l’utilisation de la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention, en particulier dans le domaine de la malterie.
Plus particulièrement, l’invention concerne l’utilisation de ladite souche isolée de Trichoderma atroviride dans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux, notamment de végétaux appartenant à la famille des Poaceae , en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation de ladite souche isolée de Trichoderma atroviride dans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques du blé et/ou du maïs et/ou de l’orge.
L’invention concerne également l’utilisation de ladite souche isolée de Trichoderma atroviride pour favoriser la germination d’une semence de végétaux appartenant à la famille des Poaceae , en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation de ladite souche isolée de Trichoderma atroviride pour favoriser la germination d’une semence de blé et/ou de maïs et/ou d’orge. Concernant cet aspect particulier, il convient de noter que l’aide à la germination permet avantageusement et en même temps la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques au moment du semis. Le développement d’une maladie après le semis est ainsi évité et le rendement est optimisé via l’aspect biostimulant de la souche de l’invention. Avantageusement, cet aspect permet également d’éviter un ralentissement important du développement de la culture si quelques temps après le semis une période de sécheresse se présente (ce qui peut arriver au printemps) et donc d’éviter des pertes de rendements à la récolte.
Un troisième aspect de l’invention concerne une composition phytosanitaire comprenant : la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention en tant que principe actif ; ou
les métabolites émis lors de la production la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention en tant que principe actif ; ou
la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention et ses métabolites émis lors de sa production en tant que principe actif ; ou
la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention en association avec au moins un autre agent de lutte biologique (BCA) en tant que principe actif ; ou la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention et ses métabolites émis lors de la production de la souche en association avec au moins un autre agent de lutte biologique en tant que principe actif.
Par « métabolites émis lors de la production de la souche » ou « ses métabolites émis lors de sa production », on entend toute molécule produite par la souche de l’invention au cours de son développement. Par exemple et de manière non limitative, de tels métabolites peuvent être des enzymes produites par le champignon telles que des protéases, des chitinases et la bêta- 1,3-glucanase.
Par « agent de lutte biologique », on entend un microorganisme pouvant interférer avec la croissance et/ou la survie des agents pathogènes permettant ainsi de les contrôler. La souche de l’invention TAL-17 (déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333) en est un exemple, mais au sens de l’invention il s’agit ici de combiner la souche de l’invention à au moins un autre agent de lutte biologique, lequel est différent de la souche de l’invention. Par « au moins un autre agent de lutte biologique », on entend que la composition phytosanitaire de l’invention peut contenir 2 agents de lutte biologique (celui de l’invention et un autre), tout comme elle peut en contenir 3, 4 ou 5 (celui de l’invention et 2, 3 ou 4 autres).
Plus particulièrement, un des objets de l’invention concerne la composition phytosanitaire précédemment décrite, ladite composition phytosanitaire se présentant à la base (à l’achat) sous la forme d’une composition solide ou liquide concentrée. Une telle composition solide ou liquide concentrée peut être, par exemple, obtenue grâce à une formulation particulière des spores de la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention produites par fermentation en milieu solide ou liquide, lesdites spores pouvant être sous forme purifiée ou dans la matrice de production, ladite matrice de production étant solide ou liquide.
Par « composition [...] concentrée », on entend une composition dans laquelle la concentration du principe actif (i.e. la souche de l’invention, laquelle peut être sous forme de spores) est supérieure à une quantité efficace de 107 spores/g soit 107 UFC/g. Aussi, un aspect particulier de l’invention concerne la composition phytosanitaire comprenant la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention en tant que principe actif, ladite composition phytosanitaire se présentant sous la forme d’une composition solide ou liquide concentrée dans laquelle la concentration du principe actif est supérieure à une quantité efficace de 107 spores/g.
Par « supérieure à une quantité efficace de 107 spores/g », on entend également supérieure à une quantité efficace de 108 spores/g, supérieure à une quantité efficace 109 spores/g, supérieure à une quantité efficace 1010 spores/g, supérieure à une quantité efficace 1011 spores/g ou supérieure à une quantité efficace 1012 spores/g.
L’utilisateur de la susdite composition doit alors incorporer ou mettre en suspension celle-ci dans un milieu solide ( e.g . terreau, etc.) ou aqueux (e.g. eau) pour obtenir une composition diluée comprenant une quantité efficace de 104 à 1012 spores/g de la souche Trichoderma atroviride de l’invention, laquelle peut être sous forme de spores. La composition solide ou liquide diluée obtenue peut alors être épandue sur les plantes dont la prévention et/ou le traitement d’une maladie fongique de plante est souhaité.
Au sens de l’Invention, l’épandage de la susdite composition comprend notamment les techniques d’épandage classiques connues de l’Homme du métier, lesquelles servent à répandre sur une zone à traiter des matières solide (e.g. boues d’épuration, fumier, etc.) ou liquide (e.g. pesticides, etc.) présentant un intérêt agronomique.
Plus particulièrement, un des objets de l’invention concerne la composition phytosanitaire précédemment décrite, comprenant une quantité efficace de 104 à 1012 spores/g, plus particulièrement de 107 à 109 spores/g,
ladite composition phytosanitaire étant éventuellement obtenue après une étape de préparation (e.g. dilution par mise en suspension ou mélange) la rendant prête à l’épandage.
Par « quantité efficace de spores/g », on entend le nombre de spores capables de former une colonie sur milieu de culture (UFC= unité formant colonie) par g (gramme) de produit.
De plus, l’expression « de 104 à 1012 spores/g » peut également signifier de 104 à 105 spores/g, de 104 à 106 spores/g, de 104 à 107 spores/g, de 104 à 108 spores/g, de 104 à 109 spores/g, de 104 à 1010 spores/g, de 104 à 1011 spores/g, de 105 à 106 spores/g, de 105 à 107 spores/g, de 105 à 108 spores/g, de 105 à 109 spores/g, de 105 à 1010 spores/g, de 105 à 1011 spores/g, de 105 à 1012 spores/g, de 106 à 107 spores/g, de 106 à 108 spores/g, de 106 à 109 spores/g, de 106 à 1010 spores/g, de 106 à 1011 spores/g, de 106 à 1012 spores/g, de 107 à 108 spores/g, de 107 à 109 spores/g, de 107 à 1010 spores/g, de 107 à 1011 spores/g, de 107 à 1012 spores/g, de 108 à 109 spores/g, de 108 à 1010 spores/g, de 108 à 1011 spores/g, de 108 à 1012 spores/g, de 109 à 1010 spores/g, de 109 à 1011 spores/g, de 109 à 1012 spores/g, de 1010 à 1011 spores/g, de 1010 à 1012 spores/g ou de 1011 à 1012 spores/g.
Au sens de l’invention, celle-ci concerne également une composition phytosanitaire d’enrobage comprenant la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention et éventuellement au moins un agent de fixation, ladite composition phytosanitaire d’enrobage permettant de produire une semence enrobée. L’invention concerne donc aussi bien une composition phytosanitaire d’enrobage comprenant la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention, ladite composition phytosanitaire d’enrobage permettant de produire une semence enrobée ; qu’une composition phytosanitaire d’enrobage comprenant la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention et au moins un agent de fixation, ladite composition phytosanitaire d’enrobage permettant de produire une semence enrobée.
Un des objets de l’invention concerne par conséquent une semence enrobée comprenant une graine de végétal, ladite graine de végétal étant enrobée par ladite composition phytosanitaire d’enrobage et ledit végétal appartenant notamment à la famille des Poaceae , en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. Par « semence enrobée », on entend une graine sélectionnée pour être semée, ladite graine ayant subi un traitement particulier lequel a permis son enrobage dans une composition phytosanitaire d’enrobage. De manière avantageuse, l’invention concerne la semence enrobée telle que décrit ci-dessus, ledit végétal étant du blé et/ou du maïs et/ou de l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne également la semence enrobée telle que décrit ci-dessus, ladite semence enrobée comprenant une quantité efficace de 105 à 108 (ou de 106 à 107) spores/semence enrobée, préférentiellement 106 (ou 107) spores/semence enrobée.
Un quatrième aspect de l’invention concerne, l’utilisation de la composition de l’invention. Plus particulièrement, l’invention concerne l’utilisation de la composition de l’invention dans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux, notamment de végétaux appartenant à la famille des Poaceae , en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation de la composition de l’invention dans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques du blé et/ou du maïs et/ou de l’orge. L’invention concerne également l’utilisation de la composition de l’invention pour favoriser la germination d’une semence de végétaux appartenant à la famille des Poaceae , en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation de la composition de l’invention pour favoriser la germination d’une semence de blé et/ou de maïs et/ou d’orge.
De façon très particulière, un des objets de l’invention concerne l’utilisation de la souche isolée de Trichoderma atroviride de l’invention ou de la composition phytosanitaire décrite ci-dessus dans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux, notamment de végétaux appartenant à la famille des Poaceae , en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge ; et/ou
pour favoriser la germination d’une semence de végétaux appartenant à la famille des Poaceae , en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
Un cinquième aspect de l’invention concerne un procédé de protection et/ou de traitement d‘un végétal contre une maladie provoquée par un champignon pathogène pour végétaux comprenant l’application de la composition de l’invention sur au moins une partie dudit végétal ou du sol à proximité dudit végétal.
Plus particulièrement, l’invention concerne ledit procédé de l’invention, où ladite partie dudit végétal est une feuille, un fruit, une graine.
De façon très particulière, un des objets de l’invention concerne un procédé de protection et/ou de traitement d‘un végétal contre une maladie provoquée par un champignon pathogène pour végétaux comprenant l’application de la composition de l’invention sur au moins une partie dudit végétal ou du sol à proximité dudit végétal,
en particulier ladite partie dudit végétal est une feuille, un fruit, une graine, et
en particulier ledit végétal appartient à la famille des Poaceae , notamment le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
Toujours selon ce cinquième aspect, l’invention concerne le procédé ci-dessus décrit, dans lequel ladite composition est épandue
à raison de 10 à 500 L/ha, en particulier de 50 à 250 L/ha, notamment pour la pulvérisation aérienne ; ou à raison d’une quantité efficace de 1010 à 1014 spores/ha, en particulier de 1010 à 1012 spores/ha, notamment pour les épandages aériens de type pulvérisation foliaire.
L’expression « de 10 à 500 L/ha (litre/hectare) » signifie également de 10 à 400 L/ha, de 10 à 300 L/ha, de 10 à 200 L/ha, de 10 à 100 L/ha, de 100 à 500 L/ha, de 200 à 500 L/ha, de 300 à 500 L/ha, de 400 à 500 L/ha, de 50 à 500 L/ha, de 50 à 250 L/ha ou de 250 à 500 L/ha. L’expression « de 1010 à 1014 spores/ha » signifie également de 1010 à 1011 spores/ha, de 1010 à 1013 spores/ha, de 1011 à 1012 spores/ha, de 1011 à 1013 spores/ha, de 1011 à 1014 spores/ha, de 1012 à 1013 spores/ha, de 1012 à 1014 spores/ha ou de 1013 à 1014 spores/ha.
L’invention concerne plus particulièrement le procédé ci-dessus décrit, dans lequel ledit végétal appartient à la famille des Poaceae , en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge. De manière avantageuse, l’invention concerne le procédé ci-dessus décrit, dans lequel ledit végétal est le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
L’invention concerne préférentiellement le procédé ci-dessus décrit, dans lequel ledit champignon pathogène est Septoria tritici ou Gibberella zeae (= Fusarium graminearum) ou Puccinia recondita ou Puccinia striiformis.
Par « Septoria tritici », on entend l’agent pathogène de la septoriose.
Par « Gibberella zeae (= F. graminearum ) », on entend l’agent pathogène de la fusariose.
Par « Puccinia recondita », on entend l’agent pathogène de la rouille brune du blé.
Par « Puccinia striiformis », on entend l’agent pathogène de la rouille jaune du blé.
L’invention concerne plus particulièrement le procédé ci-dessus décrit, dans lequel
la protection dudit végétal comprend une étape d’enrobage de la semence avec ladite composition phytosanitaire ; et/ou
la protection dudit végétal comprend la pulvérisation de ladite composition au moment du semis ou à la germination dudit végétal ; et/ou
la protection dudit végétal comprend soit une application préventive au niveau du sol avant le semis de ladite composition phytosanitaire avec l’apport d’amendement organique, soit une application préventive au niveau du sol avant le semis de ladite composition phytosanitaire sur la culture précédente ; et/ou
le traitement dudit végétal comprend la pulvérisation de ladite composition aux cours de différents stades phénologiques de la plante en prévention d’un risque d’infection dudit champignon pathogène de l’ensemble ou une partie de la plante. Par « différents stades phénologiques », on entend de la graine jusqu’à la floraison (BBCH000 à BBCH619 selon l’échelle BBCH des stades phénologiques des légumes dans la famille des Solanacées (Feller et al., 1995 - Phànologische entwicklungsstadien von gemüsepflanzen: II. Fruchtgemüse und hülsenfrüchte ; Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd)).
S’agissant du procédé ci-dessus, il convient de noter que sa mise en œuvre pour le traitement de la fusariose au stade floraison de la plante implique préférentiellement que la souche de l’invention soit active rapidement et en ce sens, que ladite composition soit plutôt sous forme liquide et ne contient pas de « formulants » non compatibles avec la souche qui pourraient gêner le développement et le mode d’action de ladite souche de l’invention. Par « formulants », on entend des adjuvants mouillants ou agents protecteur de conservation.
A tout égard, il convient de noter que les différents aspects de l’invention, tout comme les différents modes de réalisation de celle-ci sont interdépendants. Ces derniers peuvent donc être combinés entre eux à foison pour obtenir des aspects et/ou des modes de réalisation préférés de l’invention non explicitement décrits. Ceci est également valable pour l’ensemble des définitions fourni dans la présente description, lequel s’applique à tous les aspects de l’invention et ses modes de réalisation.
La présente invention est par ailleurs illustrée, sans toutefois s'y limiter, par les figures et exemples suivants.
LISTE DES FIGURES
La figure 1 représente les observations visuelles du test Dual culture contre Fusarium graminearum , à gauche des boîtes de Pétri, à 6 (A et B) et 10 (C et D) jours de cultures pour la souche TAL-17 (A et C) et la souche BCA C (B et D), à droite des boîtes de Pétri.
La figure 2 représente l’observation microscopique (grossissement xlOO) avec un microscope inversé des mycéliums de F. graminearum (flèche noire) et de la souche TAL-17 (flèche blanche) sur boite de Pétri contenant du milieu PDA (pomme de terre, dextrose, agar), après 8 jours de croissance.
La figure 3 représente la surface occupée (en %) et les photographies associées de la face avant d’une boite de Pétri inoculée au râteau avec trois souches de microorganismes (F. graminearum , TAL-17 et BCA C seuls ou en mélanges après 7 jours de croissance. Moyenne ± s.d. Des lettres différentes indiquent une différence significative entre les modalités (ANOVA 1 facteur, p<0,05).
La figure 4 représente l’évolution de la surface occupée par les microorganismes BCA TAL- 17 et Fusarium graminearum seuls ou en mélange après dépôt de 30 pL au centre d’une boîte de culture avec milieu PDA au bout de 72 h (A) et au bout de 96 h (B) de culture à 25°C sous hotte lumineuse.
La figure 5 représente l’évolution du pourcentage d’inhibition de Fusarium graminearum sur boîte en fonction de la formulation utilisée.
La figure 6 représente le pourcentage de tubes CIV présentant des tâches de septoriose en fonction du traitement après 18 jours et 26 jours d’inoculation de la maladie.
La figure 7 représente le pourcentage de grains sains observés à la récolte au cours des essais en salle phytotronique.
La figure 8 représente la masse de grains par épis à la récolte au cours des essais en salle phytotronique.
La figure 9 représente le pourcentage de symptômes visuels de contamination sur épis par la fusariose au cours des essais en salle phytotronique.
La figure 10 représente la masse de grains par épis à la récolte au cours des essais en salle phytotronique.
La figure 11 représente le pourcentage de grains fusariés à la récolte au cours des essais en salle phytotronique réalisés.
La figure 12 représente la germination de plants de maïs après 6 jours de croissance avec un traitement au semis d’une suspension de spores de TAL-17 à 1.105 spores UFC/graine ou 1.108 spores UFC/graine. Un traitement aérien est réalisé plus tard lors du stade 5 feuilles et ne rentre pas en compte au moment de la mesure de la germination. Moyenne ± s.d. Des lettres différentes indiquent une différence significative entre les différentes modalités (ANOVA 1 facteur, p<0,05).
La figure 13 représente la mesure de la taille en hauteur de plants de maïs après 25 jours de croissance avec un traitement au semis d’une suspension de spores de TAL-17 à 1.105 spores UFC/graine ou 1.108 spores UFC/graine. Un traitement aérien est réalisé plus tard lors du stade 5 feuilles et ne rentre pas en compte au moment de la mesure de la germination. Moyenne ± s.d. Des lettres différentes indiquent une différence significative entre les différentes modalités (ANOVA 1 facteur, p<0,05).
La figure 14 représente le pourcentage de germination de graines de blé de printemps (Calixo) en présence ou non de spores en suspension de Trichoderma atroviride TAL-17 au semis. Culture en chambre phytotronique avec photopériode. Moyenne ± s.d. Différence significative entre la modalité eau et la modalité TAL-17 (ANOVA 1 facteur, p<0,05).
La figure 15 comprend des photographies (A) et un graphique (B).
(A) Observations visuelles du test Dual culture contre Fusarium graminearum , à droite des boîtes de Pétri, à 6 et 10 jours de co-cultures avec la souche TAL-17 (panel du haut) ou la souche BCA D (panel du centre), à gauche des boîtes de Pétri. Le panel du bas correspond à la culture de Fusarium graminearum seule. Les flèches blanches indiquent la zone de recouvrement de la souche TAL-17 sur Fusarium graminearum.
(B) Représentation graphique de la longueur du recouvrement du pathogène F. graminearum (F. gram) par le BCA en Dual culture sur gélose PDA (25°C sans photopériode).
La figure 16 comprend des photographies (A) et un graphique (B).
(A) Observations visuelles du test Dual culture contre Fusarium graminearum à 6 jours de co-cultures avec la souche TAL-17 (panel de gauche) ou la souche SCI (panel de droite). La ligne 1 (celle du haut) correspond au BCA seul à la dose de 1.104 UFC/mL, la ligne 2 correspond au mélange BCA/Fusa ratio 2/1 (BCA à 1.104 UFC/mL et Fusa à 5.103 UFC/mL), la ligne 3 correspondant au mélange BCA/Fusa ratio 1/1 (BCA à 1.104 UFC/mL et Fusa à 1.104 UFC/mL) et la ligne 4 correspond au mélange BCA/Fusa ratio 1/2 (BCA à 1.104 UFC/mL et Fusa à 2.104 UFC/mL). Le panel du bas correspond à la culture de Fusarium graminearum seule, de gauche à droite, à la dose de 2.104, 1.104 et 5.103 UFC/mL.
(B) Représentation graphique du pourcentage d’occupation du BCA (TAL-17 ou SCI) et du pathogène F. graminearum (F. gram) à l’issue du test en Dual culture sur gélose PDA (25°C sans photopériode).
La figure 17 comprend des photographies (A) et un graphique (B).
(A) Observations visuelles du test Dual culture contre Fusarium graminearum à 10 jours de co-cultures avec la souche TAL-17 (panel de gauche) ou la souche SCI (panel de droite). La ligne 1 (celle du haut) correspond au BCA seul à la dose de 1.104 UFC/mL, la ligne 2 correspond au mélange BCA/Fusa ratio 2/1 (BCA à 1.104 UFC/mL et Fusa à 5.103 UFC/mL), la ligne 3 correspondant au mélange BCA/Fusa ratio 1/1 (BCA à 1.104 UFC/mL et Fusa à 1.104 UFC/mL) et la ligne 4 correspond au mélange BCA/Fusa ratio 1/2 (BCA à 1.104 UFC/mL et Fusa à 2.104 UFC/mL). Le panel du bas correspond à la culture de Fusarium graminearum seule, de gauche à droite, à la dose de 2.104, 1.104 et 5.103 UFC/mL.
(B) Représentation graphique du pourcentage d’occupation du BCA (TAL-17 ou SCI) et du pathogène F. graminearum (F. gram) à l’issue du test en Dual culture sur gélose PDA (25°C sans photopériode).
EXEMPLES
(I) Isolement de la souche de Trichoderma atroviride TAL-17
Souche isolée d’une feuille de blé cultivé en champs.
Le prélèvement de feuille de la culture du blé a été broyé puis mis au contact en infiniment mélangé d’une gélose de PDA ( Potato Dextrose Agar ) à 50°C qui contient des spores de Fusarium graminearum. La boîte a été mise en culture à 25°C sous hotte lumineuse. Ainsi seules les souches étant capables de se reproduire en présence de Fusarium graminearum se sont développées sur la boîte. Parmi ces souches TAL-17 était présente. Un prélèvement spécifique d’une zone présentant un intérêt dans la boîte et plusieurs repiquages successifs ont permis d’isoler la souche TAL-17, laquelle a ensuite été déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333.
(II) Etude in vitro de l’efficacité et du mode d’action du TAL-17 contre F. sraminearum
Compétitivité, mycoparasitisme et antibiose 1/ Tests Dual-culture côte à côte sur boîte de Pétri
Plusieurs tests de Dual-culture avec les BCA vs F. graminearum ont été réalisés en proximité sur milieu PDA ( Potato Dextrose Agar). On inocule 30 pL contenant 1.104 spores/mL (sp/mL) de F. graminearum , à 2 cm de l’extrémité d’une boîte de Pétri de 8,5 cm de diamètre contenant du milieu PDA, et 30 pL contenant 1.106 spores/mL d’un autre microorganisme (TAL-17 ou un autre Trichoderma BCA C) à l’autre extrémité de la boîte de Pétri. Les boîtes de Pétri ont été incubées à 23-27°C sous lumière artificielle (24h/24) (tube fluorescent F36WT8/2084 BriteGro®). Des observations macroscopiques ont été réalisées à 6 jours et 10 jours après l’inoculation (Figure 1). Des témoins de F. graminearum seuls et des BCA seuls ont été réalisés. Les souches testées ont été la souche TAL-17 et une autre souche de référence également référencée comme un Trichoderma atroviride utilisé dans le Biocontrôle (= BCA C > Référence : ATCC® 20476).
Les souches TAL-17 et BCA C ont toutes 2 présenté une capacité à occuper l’espace, par contre la souche TAL-17 contrairement à la souche BCA C est capable de se développer sur le mycélium de Fusarium graminearum (Figure 1). La souche TAL-17 présente donc un potentiel mycoparasitisme beaucoup plus important que l’autre souche de référence BCA C. Des observations au microscope du mycélium de la souche TAL-17 en présence de mycélium de Fusarium graminearum ont révélé par ailleurs un enroulement du mycélium de la souche TAL-17 autour de Fusarium graminearum (Figure 2), lequel phénomène n’a pas été observé avec l’autre souche de Trichoderma atroviride (= BCA C) testée.
Par rapport à la bibliographie existante sur le sujet, le mycoparasitisme du genre Trichoderma , lequel correspond au genre de la souche TAL-17, a été étudié à de nombreuses reprises et sur de nombreuses cibles. Hibar et al. (Hibar, K., Daami-Remadi, M., Khiareddine, H., & Mahjoub, M. El. (2005). Effet inhibiteur in vitro et in vivo du Trichoderma harzianum sur Fusarium oxysporum f. sp. Radicis-lycopersici .) ont présenté un effet inhibiteur in vivo et vitro de Trichoderma harzianum sur Fusarium oxysporum , notamment par des observations microscopiques de la zone de contact entre les deux souches qui met en évidence une lyse importante, accompagnée d’un enroulement de la souche de T harzianum sur F. oxysporum. Steyaert et al. (Steyaert J., Ridgway H., Elad Y., Stewart A. (2003). Genetic basis of mycoparasitism: A mechanism of biological control by species of Trichoderma. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science ; 31(4), 281-291) ont mis en évidence le mycoparasitisme d’une souche de Trichoderma atroviride autour d’un hyphe d’une souche de Botrytis cinerea. Les résultats microscopiques précédemment décrits confirment de ce fait le potentiel mycoparasitisme accru de la souche TAL-17, notamment par rapport à la souche BCA C.
De plus ces essais sur boîtes ont montré une zone d’inhibition créée par la souche TAL-17 signe d’un potentiel effet d’antibiose et un autre test utilisant du filtrat de culture de la souche TAL-17 a montré quant à lui un effet inhibiteur sur la croissance du pathogène Fusarium graminearum (données non montrées).
2/ Essais en mélange dépôt sur l’ensemble de la surface
Un autre test de Dual-culture avec les BCA us F. graminearum a été réalisé sur milieu PDA, mais cette fois-ci en mélange, avec étalement de 100 mΐ sur l’ensemble de la boîte de Pétri (diamètre 8,5 cm). Au centre d’une boîte de Pétri de 8,5 cm contenant du milieu PDA, sont étalés en surface 100 pL d’un mélange contenant 1.104 spores/mL de A. graminearum et 1.104 spores/mL du BCA (ou 0,5.104 spores/mL de chaque BCA pour la modalité mélange BCA), de plus pour certaines modalités ce mélange contient également 0,5% de la formulation Appyphyt, laquelle est une émulsion d’esters d’huile végétale (Esters d’huile végétale : 60- 80% ; Emulsionnant biosourcé ; 1-5% ; Qsp Eau). Le mélange a été inoculé après 2 h de contact. Les boîtes de Pétri ont été incubées à 25°C sous lumière artificielle (24h/24) (tube fluorescent F36WT8/2084 Britegro). Des mesures de la croissance de F. graminearum (en cm) ont été prises après 48, 72, 96 et 168 h ( i.e . de 2 à 7 jours) de culture après l’inoculation. Des témoins de F. graminearum seul et des BCA seuls ont été réalisés. Les souches testées ont été TAL-17 et BCA C.
Lors de ce test le TAL-17 a été le plus performant, son mycoparasitisme permettant de recouvrir 100% de la boîte face avant à 7 jours (Figure 3).
(III) Essais sur plante afin d’observer si le mode d’action du TAL-17 a un caractère endophyte
Le terme endophyte provient de deux mots grecs « endon » et « phuton » qui signifie respectivement « à l’intérieur » et « végétal ». La définition d’endophyte a très souvent changé au cours du temps. Tout d’abord, la définition concernait tout organisme pouvant vivre à l’intérieur d’une plante. Aujourd’hui, les organismes endophytes sont des organismes ayant un mode de vie avec la plante dit « endophisme ». C’est-à-dire que les espèces endophytes sont capables de coloniser les structures internes des végétaux de façon asymptomatique (Hardoim, P. R., van Overbeek, L. S., Berg, G., Pirttilà, A. M., Compant, S., Campisano, A., ... Sessitsch, A. (2015). The Hidden World within Plants: Ecological and Evolutionary Considérations for Defining Functioning of Microbial Endophytes. Microbiology and Molecular Biology Review s, 79(3), 293-320.). Les endophytes peuvent être des microorganismes comme les champignons. Ils peuvent coloniser la plante à différents niveaux selon le micro-organisme. Les organes concernés peuvent être suivant les cas : la tige, les racines, les segments de feuilles, les fruits, les bourgeons, les graines mais aussi dans les cellules hyalines mortes et creuses des plantes (Stçpniewska, Z., & Kuzniar, A. (2013). Endophytic microorganisms— promising applications in bioremediation of greenhouse gases. Applied Microbiology and Biotechnology, 97(22), 9589-96.).
Méthode préparation des échantillons pour observation
Le bleu de coton (LACP-00D-100 Labkem®) au lactophénol a été utilisé dans cette étude comme colorant pour la mise en évidence des champignons. Des échantillons de feuille de blé de 1 x 0,5 cm et de maïs de 2,5 x 1,5 cm ont été prélevés pour chaque modalité étudiée. La démarche est la suivante pour le traitement des coupes :
1. Mordançage à l’eau de javel (3 min)
2. Lavage dans l’eau ultra pure
3. Coloration dans le bleu coton lactophénol (3 min)
4. Rinçage dans le lactoglycérol
5. Les échantillons sont ensuite placés sous lame et lamelle pour une observation microscopique (x 400).
1/ Essais sur le blé
6 graines de blé ont été semées par pot de 0,5 L et percé au fond pour le drainage. Le substrat utilisé est un mélange de terreau universel et de vermiculite expansée (0,5-10 mm) (2: 1 v/v). Le substrat a été humidifié 24 h avant le semis avec de l’eau osmosée. Les graines ont été humidifiées la veille du semis pendant 24 h à 4°C. Une fois le semis réalisé, les pots ont été placés sous hotte lumineuse à 25°C (photopériode 16/8 heures) et ont été arrosés trois fois par semaine.
Différentes traitements ont été réalisés. Pour le traitement au semis, 1 mL de la solution de TAL-17 à la concentration souhaitée a été ajouté sur la graine semée (500 pL avant le dépôt de la graine et 500 pL après). Pour le témoin et les autres conditions testées, les graines n’ont pas reçu de traitement de BCA mais 1 mL d’eau de forage stérile. Le traitement en pulvérisation a été effectué lors du stade 2 feuilles ou lors du stade floraison. Les pots ne recevant pas de traitements au BCA ont été traités avec de l’eau de forage par le même dispositif. Les premières feuilles situées au plus bas de la plante ont été utilisées pour cet essai.
Du mycélium de champignon a été observé dans les feuilles et racines de la plante traitée au semis contrairement à la plante témoin non traité au semis.
2/ Essais sur le maïs
3 graines sont semées par pot de 5 L percés au fond pour le drainage. Le substrat utilisé est un mélange de terreau universel et de vermiculite expansée (0,5-10 mm) (2: 1 v/v). Le substrat a été humidifié 24 h avant le semis avec de l’eau osmosée. Les pots ont été arrosés trois fois par semaine avec un volume d’eau osmosée croissant en fonction du développement de la plante.
Pour le traitement au semis, 1 mL de la solution de TAL-17 à la concentration souhaitée (105 ou 108/mL) a été ajouté sur la graine semée (500 pL avant le dépôt de la graine et 500 pL après). Pour le témoin et les autres conditions testées, les graines n’ont pas reçu de traitement de BCA mais 1 mL d’eau de forage stérile. Le traitement en pulvérisation a été effectué lors du stade 5 feuilles.
Du mycélium de champignon a été observé dans les feuilles et racines de la plante traitée au semis contrairement à la plante témoin non traité au semis.
Finalement, ces tests ( cf exemples II et III) ont montré que la souche TAL-17 est capable d’agir contre Fusarium graminearum de différentes façons. Elle cumule compétition, antibiose, my coparasitisme et est capable de pénétrer dans la plante. (IV) Stratégie d’inoculation du BCA
Développement de formulations 1/ Essais en mélange avec dépôt au centre
Un autre test de Dual-culture avec les BCA us F. graminearum a été réalisé sur milieu PDA, mais cette fois-ci en mélange, avec dépôt d’une goutte au centre de la boîte (30 mΐ). Dans ce test seule TAL-17 a été testée. Des mesures de la croissance de F. graminearum (en cm) ont été prises après 48, 72 et 96 h de culture (Figure 4).
Au centre d’une boîte de Pétri de 8,5 cm contenant du milieu PDA, ont été inoculés 30 pL d’un mélange contenant 1.104 spores/mL de F. graminearum et 1.104 spores du BCA, de plus pour certaines modalités ce mélange contient également 0,5% de la formulation Appyphyt, laquelle est une émulsion d’esters d’huile végétale (Esters d’huile végétale : 60-80% ; Emulsionnant biosourcé ; 1-5% ; Qsp Eau). Le mélange a été inoculé après 2 h de contact. Les boîtes de Pétri ont été incubées à 23-27°C sous lumière artificielle (24h/24) (tube fluorescent F36WT8/2084 BriteGro®). Des mesures de la croissance de F. graminearum ont été réalisées de 2 à 7 jours après l’inoculation. Des témoins de F. graminearum seul et du BCA seul ont été réalisés.
La souche TAL-17 a permis une réduction de l’ordre de 63% du développement de Fusarium graminearum sur boîte de Pétri à 72 h et 78% à 96 h. Cette réduction est montée à 77% à 72 h et à 85% à 96 h lorsqu’elle est couplée à la formulation Appyphyt (Figure 5). Il convient de noter qu’à 96 h la formule Appyphyt seule n’a pas montré d’inhibition sur la croissance de Fusarium graminearum.
2/ Enrobage de graines
Les résultats précédents, lesquels ont démontré l’aspect endophyte, indiquent un intérêt potentiel à enrober les graines des cultures visés avec la souche TAL-17. Cet intérêt a été confirmé par les essais de bio stimulation sur la germination (voir ci-après). (V) Effet des BCA sur la protection des plantes
Etude en salle phytotronique 1/ Septoriose
La culture in vitro a été développée pour réaliser un screening des potentiels BCAs sélectionnés contre la septoriose du blé Septoria tritici. Le milieu de culture in vitro standard a été modifié en enlevant le saccharose afin d’éviter d’éventuelles contaminations.
Deux tests ont été réalisés.
La maladie et le BCA ont été appliqués simultanément par pulvérisation dans des conditions se rapprochant le plus possible du champ.
Les pourcentages de plants présentant des tâches de septoriose suivant les modalités sont présentés Figure 6. Deux Trichoderma atroviride ont été testés dont TAL-17. Cette dernière s’est révélée être la plus intéressante contre cette maladie. A noter la quantité de BCA est en nombre de spores viables (équivalent 5.1011 spores viables/hectare).
2/ Fusariose
La salle phytotronique a la possibilité de monter à 90% d’humidité HR pendant l’infection au moment de la floraison des épis. Le plateau permet de tester 30 jardinières de 15 plants. Les tests ont été réalisés avec le blé de printemps « Calixo ».
Les traitements avec BCA ont été pour ces tests exclusivement réalisés au moment de la floraison et les BCA utilisés sont :
■ TAL-17 (cf. Exemple I) ;
■ BCA A > Trichoderma asperellum (Réf : ATCC® 52438) et
■ BCA B > Trichoderma atroviride (Réf. Interne : BCA B- 15).
Un premier test a montré un intérêt pour la souche TAL-17 (Figures 7 et 8). Cet intérêt a été confirmé grâce à un nouveau test (Figures 9, 10 et 11). Ce dernier a mis en évidence un intérêt à l’utilisation du TAL-17 (équivalent 1011 spores UFC/ha) avec la formulation Appyphyt (équivalent lL/ha) sur le blé pour les symptômes visuels de la maladie et sur la masse de grains par épis qui sont alors tous deux statistiquement différents de la modalité contaminée au Fusarium graminearum seul. Cependant la masse de grains par épis quand le blé a été traité avec le TAL-17 et la formule Appyphyt n’atteint pas la masse du blé témoin non contaminé (i.e. 0,831 g/épis pour la figure 8 et 0,77 g/épis pour la figure 10).
En conclusion la souche TAL-17 a montré un intérêt pour une application au stade floraison du blé mais au vu de son caractère endophyte, une application beaucoup plus précoce présente un intérêt dans la lutte contre la fusariose de l’épi.
De plus une stratégie de traitement avec demi-dose de fongicide est possible.
Etude en salle phytotronique / serre / biostimulation 1/ Essais en serre sur maïs
Trois graines ont été semées par pot de 5 L percés au fond pour le drainage. Le substrat utilisé est un mélange de terreau universel et de vermiculite expansée (0,5-10 mm) (2: 1 v/v). Le substrat a été humidifié 24 h avant le semis avec de l’eau osmosée. Les pots ont été arrosés trois fois par semaine avec un volume d’eau osmosée croissant en fonction du développement de la plante.
Les traitements réalisés ont été identiques à ceux de l’Exemple (III), 1/.
Pour rappel, le témoin (A) n’a pas reçu de traitement ; le traitement au semis (B et C) a été réalisé avec une solution de TAL-17 de 1.105 ou 1.108 spores/graine (sp/graine) ; le traitement en pulvérisation au stade 5 feuilles (D et E), soit 21 jours de croissance, a été réalisé avec une solution de TAL-17 de 1.1011 ou 5.1011 spores/ha.
Les résultats obtenus pour le pourcentage de germination sur des plants âgés de 6 jours sont représentés sur la figure 12. Les valeurs pour les plants de maïs n’ayant pas (témoin) ou pas encore (pulvérisation aérienne) reçus de traitements au TAL-17 sont statistiquement identiques et de l’ordre de 80%. De même avec le traitement au BCA au semis à 1.105 spores/graine, aucune différence significative n’est visible par rapport au témoin non traité. Par contre, avec le traitement au semis de 1.108 spores/graine, soit une concentration lOOOx supérieures à la précédente, le pourcentage de germination atteint les 100% dès 6 jours après le semis. Après 9 jours de croissance (données non présentées), le taux de germination tend vers 97% pour les modalités ayant reçu le traitement au semis à 1.105 spores/graine et pour celles n’ayant pas encore reçu le traitement aérien. La modalité témoin, sans traitement, augmente jusqu’à un pourcentage de germination de 93%.
Les résultats des mesures de la taille en hauteur des plants âgés de 25 jours représentés sont présentés en figure 13, et ont mis en évidence une différence statistique du traitement au semis du TAL-17 face au traitement en pulvérisation aérienne et au témoin. Les traitements au semis à 1.105 et 1.108 spores/graine (spores viables) permettent une croissance des plants de l’ordre de 105 cm, tandis que les traitements aériens, réalisé 4 jours plus tôt et le témoin, ne permettent qu’une croissance allant de 97 cm pour le témoin, à 100,5 cm pour le traitement aérien à 1.1011 spores/ha et 101 cm pour le traitement à 5.1011 spores/ha. Ces valeurs sont retrouvées dans un même groupe statistique.
2/ Essais en salle phytotronique sur blé
Culture :
6 graines de blé ont été semées par pot de 0,5 L et percé au fond pour le drainage. Le substrat utilisé est un mélange de terreau universel et de vermiculite expansée (0,5-10 mm) (2: 1 v/v). Le substrat a été humidifié 24 h avant le semis avec de l’eau osmosée.
Pour la disposition des pots dans la salle phytotronique, ils ont été regroupés par groupe de 3 dans une soucoupe de jardinières. 12 « jardinières » ont été ensemencées avec 0,5 mL d’une suspension de spores de TAL-17 à 106 spores UFC/graines dans 0,5 mL et 18 jardinières ont été ensemencées avec 0,5 ml d’eau de forage stérile afin de s’affranchir d’un apport d’eau différents suivant les traitements.
Les pots ont été placés dans la salle phytotronique (photopériode 16/8h) et ont été arrosés deux fois par semaine.
Le pourcentage de germination a été observé à 4 et 11 jours suivant les modalités.
Ce pourcentage moyen est calculé par jardinière (soit sur 18 graines) puis l’ensemble des données des jardinières pour chaque modalité a été traité statistiquement par ANOVA (p<0.05). Il en ressort que les modalités inoculées avec la souche TAL-17 ont présenté un taux de germination supérieur à la modalité témoin eau de 5% à 11 jours (Figure 14). Cette différence est significative statistiquement.
(VI) Comparaison de la souche TAL-17 à d’autres BCA
Tests Dual-culture côte à côte sur boîte de Pétri (suite de la partie (II) 1/)
Le protocole expérimental a été le même que celui décrit précédemment. La souche TAL-17 a été comparée à la souche BCA D (= Trichoderma atroviride, Réf. : 1-12137). Le test Dual culture a été réalisé avec 30 mΐ de BCA ou de F. graminearum déposés aux extrémités de la boite de Pétri. Après 6 et 10 jours de culture à 25°C sur PDA sous hotte lumineuse avec photopériode de 16 h, les boîtes ont été observées (Figure 15 A) et la longueur du recouvrement du pathogène par le BCA a été mesuré (Figure 15B).
Dans cet exemple également, la souche TAL-17 a présenté la particularité de se développer sur le mycélium du pathogène au cours du temps, contrairement au BCA D.
(VII) Essai de spécificité de la sonde TaqMan® GS285741-P1 et du couple de primer associé GS285741-F1 et GS285741-R1 vis-à-vis de la souche de l’Invention (TAL- 17 et/ou un de ses mutants)
Protocole
Afin de tester la spécificité des outils moléculaires (sonde TaqMan® GS285741-P1 et le couple de primer associé GS285741-F1 et GS285741-R1), il a été mis en œuvre une analyse classique par Polymerase Chain Reaction en temps réel (qPCR) sur 3 souches distinctes, à savoir :
la souche de Trichoderma viride de l’espèce T. asperellum (TV) ;
la souche Trichoderma atroviride TAS ; et
la souche Trichoderma atroviride de l’invention (TAL-17).
Un étalon interne contrôle est également réalisé avec de F ADN génomique extrait de la souche de l’invention, lequel a été dilué en série. L’ensemble des essais de qPCR ont été réalisés en utilisant un thermocycleur CFX 96 touch de Biorad®. Le programme d’amplification utilisé est celui recommandé par le fournisseur avec une température d’hybridation de 60°C. Pour la méthode TaqMan®, le mélange réactionnel Luna® universel Probe qPCR Master Mix (NEB®) a été utilisé. Le programme d’amplification est de 95°C 2 min suivi de 40X 95°C 15” et 60°C 30”.
Résultats
Les résultats de cette analyse sont présentés dans le Tableau 3 ci-après.
Cq Mean
Echantillon (nombre de cycle d'amplification nécessaire pour obtenir un signal fluorescent caractéristique) dilution 1 23,66
dilution 2 26,84
Etalon interne
dilution 3 29,99
(5 ng)
(dilution en série dilution 4 33,36
d’ADN génomique dilution 5 37,4
de la souche TAL- dilution 6 38,28
17)
dilution 7 N.D. (pas assez d’ADN)
dilution 8 N.D. (pas assez d’ADN)
puits 1 N.D.
Souche TV
puits 2 N.D.
(5 ng)
puits 3 N.D.
puits 1 N.D.
Souche TAS
puits 2 N.D.
(5 ng)
puits 3 N.D.
puits 1 21,46
Souche TAL-17
puits 2 21,46
(5 ng)
puits 3 21,46
Tableau 3 : Détection spécifique par qPCR de la souche de l’Invention
Conclusion
La sonde TaqMan® GS285741-P1 et le couple de primer associé GS285741-F1 et GS285741- R1 n’ont permis de détecter que la souche TAL-17. Ces outils permettent donc bien la détection et l’identification dans un échantillon de la présence de la souche de l’Invention TAL-17 et/ou un de ses mutants. (VIII) Comparaison de l’efficacité de la souche TAL-17 versus celle de la souche SCI
Tests Dual-culture en mélange sur boîte de Pétri
L’effet biocontrôle de la souche TAL-17 sur le développement de F graminearum a été comparé à celui de la souche SCI (= Trichoderma atroviride isolée présente dans le produit Vintec®). Pour cela, un test Dual culture a été réalisé sur lequel 100 pL d’un mélange F. graminearum/T. atroviride (Fusa/BCA) a été étalé sur milieu PDA en boite de Pétri.
Les mélanges utilisés ont été les suivants :
■ Mélange BCA/Fusa (ratio 1/2) : BCA à 1.104 UFC/mL et Fusa à 2.104 UFC/mL (mélange lmL de BCA à 2.104 UFC/mL + lmL de fusa à 4.104 UFC/mL).
■ Mélange BCA/Fusa (ratio 1/1) : BCA à 1.104 UFC/mL et Fusa à 1.104 UFC/mL (mélange lmL de BCA à 2.104 UFC/mL + lmL de fusa à 2.104 UFC/mL).
■ Mélange BCA/Fusa (ratio 2/1) : BCA à 1.104 UFC/mL et Fusa à 5.103 UFC/mL (mélange lmL de BCA à 2.104 UFC/mL + lmL de fusa à 1.104 UFC/mL).
Après 6 et 10 jours de culture à 25°C sur PDA sous hotte lumineuse avec photopériode de 16 h, les boîtes ont été observées (Figures 16A et 17 A) et une évaluation visuelle du pourcentage d’occupation de l'espace par les différentes souches a été réalisées (Figure 16B et 17B). Ce dernier correspond à l'intensité de sporulation du BCA (TAL-17 ou SCI) sachant que le témoin = 100%. Celui de F graminearum est estimé en soustrayant la surface totale de la boite moins la surface estimée d’occupation en BCA.
In fine , comparé à la souche Trichoderma atroviride SCI, la souche de l’invention TAL-17 à la même dose combat d’avantage Fusarium graminearum. Ceci est d’ailleurs nettement visible pour le ratio 2 UFC de Fusa / 1 UFC de BCA. En effet, dans ces conditions, la souche SCI décroche contrairement à la souche TAL-17.
(IX) Essai en champs et comparaison de l’efficacité de la souche TAL-17 versus celle d’une souche de T. atroviride sur la rouille brune du blé
Protocole
Après le semis de la variété de blé Pakito, la parcelle semée a été divisée en 4 microparcelles de l’ordre de 20 m2 par modalité ( cfi Tableau 4) et l’essai à proprement parler a pu débuter. Pour cela, deux traitements ont été réalisé au stade‘épis 6 à 8’ (Tl) et‘début floraison’ (T2) avec des traitement conventionnel (Onnel®, Faxer®, Librax®) en dose usuelle (0,6 L/ha) ou en demi-dose (0,3 L/ha) en combinaison ou non avec un mélange de BCA (souche TAL-17 [BCA 1] ou une autre souche de T. atroviride [BCA 2]) à la dose de 1.1011 UFC/ha et d’ Appyphyt à la dose de 1 kg/ha ( cf Tableau 4).
Tableau 4. Conditions testées lors de cet essai en champ
Un mois après le dernier traitement, l’évaluation du développement de la rouille brune (i.e. Puccinia recondita ) a été mesuré.
Analyse statistique
L’analyse statistique a été réalisée grâce au logiciel d’analyse et de traitement statistique StatBox®. Il se couple au logiciel Excel® et en enrichi les fonctionnalités. Il a permis de réaliser les ANOVA qui seront présentées dans la partie résultats. Les comparaisons de moyennes sont effectuées selon le test de Newman-Keuls au seuil 5%. Des groupes statistiques homogènes sont déterminés, les modalités associées à la même lettre ne sont pas statistiquement différentes.
Résultats
(voir tableau ci-après)
Moyenne générale 97,2 44,33 44,33 6, 18
Ecart-type résiduel 1,69 0,72 0,72 0,87
Coefficient de
variation 1,7 1,6 1,6 14
Tableau 5. Effet des traitements appliqués sur le rendement et l’évolution de la rouille brune
S’agissant de la note évaluant la rouille brune, plus la note est élevée moins il y a de maladie (échelle 1 à 10 : 10 = zéro symptômes de maladie). Les lettres symbolisent les statistiques calculées.
Conclusion
Le BCA 1 ( i.e . souche TAL-17) s’est montré efficace pour lutter contre la rouille brune (i.e. Puccinia recondita ) contrairement à la souche BCA 2 (autre souche de Trichoderma atroviride). Cette différence d'efficacité est statistiquement différente quand on compare la modalité No. 9 à la modalité No. 7 de l’essai et que l’on regarde les notes sur la rouille brune. En effet, pour ces deux modalités le BCA a été appliqué seul au premier traitement et a également été appliqué au second traitement avec une demi-dose fongicide conventionnel Librax®. Ainsi la souche TAL-17 a montré dans cet essai un intérêt statistique sur les symptômes physique de la rouille brune.
De plus, la souche TAL 17 lorsqu’elle est appliqué ( cf. modalité No. 9), elle a permis d’obtenir une note de rouille brune du même groupe statistique que la meilleure modalité ( cf. modalité No. 4) pour la notation de rouille brune.
Finalement, l’ensemble de ces essais a montré une efficacité statistique contre la rouille brune en microparcelle de la souche de l’invention TAL-17 par rapport à une autre souche de T. atroviride avec un traitement en Tl et un traitement en T2 complété avec une demi-dose de Librax®. PCT
(original sous forme électronique)
(Cette feuille ne fait pas partie de la demande internationale ni ne compte comme une feuille de celle-ci)
RESERVE A L'OFFICE RECEPTEUR
RÉSERVÉ AU BUREAU INTERNATIONAL

Claims

REVENDICATIONS
1. Souche isolée de Trichoderma atroviride dont le gène ech42 possède une identité de séquence d’au moins 98% avec la séquence SEQ ID NO : 1 du gène ech42 de la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333 et/ou un de ses mutants,
en particulier ladite souche isolée de Trichoderma atroviride est la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333 et/ou un de ses mutants, et
de préférence, ladite souche isolée de Trichoderma atroviride est la souche TAL-17 déposée le 03 juillet 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5333.
2. Souche isolée de Trichoderma atroviride selon la revendication 1, sous forme de spores, produites par fermentation en milieu solide ou liquide, lesdites spores pouvant être sous forme purifiée ou dans la matrice de production, ladite matrice de production étant solide ou liquide.
3. Souche isolée de Trichoderma atroviride selon la revendication 1 ou 2, en tant qu’ agent de lutte biologique,
en particulier en tant qu’ agent antifongique de végétaux dirigé contre un champignon pathogène pour végétaux, ledit champignon pathogène étant notamment choisi parmi Septoria tritici ou Gibberella zeae (= Fusarium graminearum) ou Puccinia recondita ou Puccinia striiformis.
4. Composition phytosanitaire comprenant :
la souche isolée de Trichoderma atroviride selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 en tant que principe actif ; ou
les métabolites émis lors de la production la souche isolée de Trichoderma atroviride selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 en tant que principe actif ; ou la souche isolée de Trichoderma atroviride selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 et ses métabolites émis lors de sa production en tant que principe actif ; ou la souche isolée de Trichoderma atroviride selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 en association avec au moins un autre agent de lutte biologique en tant que principe actif ; ou
la souche isolée de Trichoderma atroviride selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 et ses métabolites émis lors de la production de la souche en association avec au moins un autre agent de lutte biologique en tant que principe actif.
5. Composition phytosanitaire selon la revendication 4, comprenant une quantité efficace de 104 à 1012 spores/g, plus particulièrement de 107 à 109 spores/g,
ladite composition phytosanitaire étant éventuellement obtenue après une étape de préparation la rendant prête à l’épandage.
6. Utilisation de la souche isolée de Trichoderma atroviride selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou de la composition phytosanitaire selon la revendication 4 ou 5 dans la prévention et/ou le traitement de maladies fongiques de végétaux, notamment de végétaux appartenant à la famille des Poaceae , en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge ; et/ou
pour favoriser la germination d’une semence de végétaux appartenant à la famille des Poaceae , en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
7. Composition phytosanitaire d’enrobage comprenant la souche isolée de Trichoderma atroviride selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 et éventuellement au moins un agent de fixation.
8. Semence enrobée comprenant une graine de végétal, ladite graine de végétal étant enrobée par la composition phytosanitaire d’enrobage telle que définie selon la revendication 7 et ledit végétal appartenant notamment à la famille des Poaceae , en particulier le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
9. Procédé de protection et/ou de traitement d‘un végétal contre une maladie provoquée par un champignon pathogène pour végétaux comprenant l’application de la composition selon la revendication 4 ou 5 sur au moins une partie dudit végétal ou du sol à proximité dudit végétal,
en particulier ladite partie dudit végétal est une feuille, un fruit, une graine, et
en particulier ledit végétal appartient à la famille des Poaceae , notamment le blé et/ou le maïs et/ou l’orge.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel ladite composition est épandue
à raison de 10 à 500 L/ha, en particulier de 50 à 250 L/ha, notamment pour la pulvérisation aérienne ; ou
à raison d’une quantité efficace de 1010 à 1014 spores/ha, en particulier de 1010 à 1012 spores/ha, notamment pour les épandages aériens de type pulvérisation foliaire.
11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel ledit champignon pathogène est Septoria tritici ou Gibberella zeae (= Fusarium graminearum) ou Puccinia recondita ou Puccinia striiformis.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans lequel
la protection dudit végétal comprend une étape d’enrobage de la semence avec ladite composition phytosanitaire ; et/ou
la protection dudit végétal comprend la pulvérisation de ladite composition au moment du semis ou à la germination dudit végétal ; et/ou
la protection dudit végétal comprend soit une application préventive au niveau du sol avant le semis de ladite composition phytosanitaire avec l’apport d’amendement organique, soit une application préventive au niveau du sol avant le semis de ladite composition phytosanitaire sur la culture précédente ; et/ou
le traitement dudit végétal comprend la pulvérisation de ladite composition aux cours de différents stades phénologiques de la plante en prévention à un risque d’infection dudit champignon pathogène de l’ensemble ou une partie de la plante.
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