CZ2017661A3 - Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby - Google Patents

Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby Download PDF

Info

Publication number
CZ2017661A3
CZ2017661A3 CZ2017-661A CZ2017661A CZ2017661A3 CZ 2017661 A3 CZ2017661 A3 CZ 2017661A3 CZ 2017661 A CZ2017661 A CZ 2017661A CZ 2017661 A3 CZ2017661 A3 CZ 2017661A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
microorganism
pythium oligandrum
oospores
suspension
liquid composition
Prior art date
Application number
CZ2017-661A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ308399B6 (cs
Inventor
Martin SUCHÁNEK
Jan MORAVEC
Tomáš VANĚK
Adam ŠTÍPEK
Original Assignee
BIOPREPARÁTY, spol. s r.o.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EP17809170.8A priority Critical patent/EP3525592A2/en
Priority to PCT/CZ2017/000064 priority patent/WO2018068774A2/en
Priority to AU2017344214A priority patent/AU2017344214A1/en
Priority to CZ2017-661A priority patent/CZ308399B6/cs
Priority to MX2019001363A priority patent/MX2019001363A/es
Priority to JP2019517801A priority patent/JP2019530455A/ja
Priority to UAA201905120A priority patent/UA127216C2/uk
Priority to KR1020197013191A priority patent/KR20190082780A/ko
Priority to CA3040613A priority patent/CA3040613A1/en
Priority to CR20190231A priority patent/CR20190231A/es
Priority to EA201990201A priority patent/EA201990201A1/ru
Priority to CN201780052778.9A priority patent/CN110072392A/zh
Application filed by BIOPREPARÁTY, spol. s r.o. filed Critical BIOPREPARÁTY, spol. s r.o.
Priority to PE2019000819A priority patent/PE20191317A1/es
Priority to US16/326,032 priority patent/US20210386073A1/en
Priority to TNP/2019/000120A priority patent/TN2019000120A1/en
Priority to KR1020247001302A priority patent/KR20240017085A/ko
Priority to BR112019007376A priority patent/BR112019007376B1/pt
Priority to ZA2019/02252A priority patent/ZA201902252B/en
Priority to PH12019500797A priority patent/PH12019500797A1/en
Priority to CL2019001006A priority patent/CL2019001006A1/es
Priority to IL265999A priority patent/IL265999B/en
Priority to CONC2019/0004381A priority patent/CO2019004381A2/es
Publication of CZ2017661A3 publication Critical patent/CZ2017661A3/cs
Publication of CZ308399B6 publication Critical patent/CZ308399B6/cs
Priority to AU2022204145A priority patent/AU2022204145A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/22—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing ingredients stabilising the active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem, zahrnující stabilizovanou suspenzi mikroorganismuobsahuje 0,05 až 10,0 % hmotn. kultivační biomasy mikroorganismus obsahem kultivačního média, buněčných forem tohoto mikroorganismu a látek produkovaných tímto mikroorganismem a 90,0 až 99,95 % hmotn. stabilizátoru, přičemž v 1 ml tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředku je, po běžné standardizaci, předem požadovaný počet dormantních oospor v rozsahu 1 x 10až 2 x 10. Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismemzahrnující stabilizovanou suspenzi mikroorganismuobsahuje 0,05 až 10,00 hmotn. kultivační biomasy mikroorganismus obsahem kultivačního média, buněčných forem tohoto mikroorganismu a látek produkovaných tímto mikroorganismem; a 79,77 až 99,95 % hmotn., stabilizátoru, a zbytek do 100 % hmotn. nejméně jedné modifikující/aplikační látky ze skupiny, zahrnující plnidlo, aroma a vitamin; přičemž v 1 ml tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředku je počet dormantních oospor v rozsahu 2,5 x 10až 1,0 x 10. Mikroorganismemje kmenATTC 38472, který byl deponován v České sbírce mikroorganizmů (CCM) Masarykova Univerzita v Brně pod označením. Stablizátorem může být voda, solný roztok, oleje nebo koncentrované roztoky osmolytů. Je nárokován způsob výroby tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředku.

Description

CZ 2017 - 661 A3
Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby
Oblast techniky:
Vynález se týká biologického protiplísňového kapalného prostředku s mikroorganismem Pythium oligandrum.
Vynález se též týká způsobu výroby tohoto přípravku.
Dosavadní stav techniky
Chemické protiplísňové prostředky vzbuzují v posledních desetiletích vzrůstající obavy z hlediska negativního vlivu na životní prostředí i na samotného spotřebitele. Nicméně je možné konstatovat, že jejich nahrazení účinnými biologickými prostředky založenými na mikrobech schopných likvidovat plísně cíleným a šetrným způsobem zatím neproběhlo v žádoucím rozsahu. V zemích EU je pro tento účel nyní registrováno pouze 14 mikrobiálních druhů i přes velmi intenzivně probíhající výzkum, jak zdůrazňuje nedávný přehledný článek Gerbore a spol. z roku 2014 [1],
Praktická aplikace biologického prostředku využívajícího protiplísňové účinky mikroorganismu Pythium oligandrum je známá již od 70. let minulého století s odkazem na klasické práce Dreschslera [2] z r. 1943 a Deacona [3] z r. 1976 věnované biologii tohoto mikroorganismu a popisující jeho mykoparazitické vlastnosti. Z tohoto období pochází mj. patent US 4,259,317 [4] dvojice autorů Veselý a Hejdánek s prioritním datem 5. 7. 1978, věnovaný suchým práškovým přípravkům s obsahem oospor Pythium oligandrum Drechsler pro ochranu před plísňovými chorobami vzcházejících výhonků řepy cukrové s obsahem oospor nejméně 1 milion oospor na g přípravku, přičemž jako optimální rozsah je uváděno množství mezi 50 až 500 miliony oospor na g přípravku. Autoři tohoto vynálezu připouštějí jako použitelnou alternativu k suchým práškovým přípravkům i kapalné suspenze oospor, pro jimi připravenou aplikační formu však uvádějí řadu nevýhod, zejména nestabilitu takových přípravků limitující jejich praktickou použitelnost na cca 2 týdny. Po delší době dochází k nepřijatelnému snížení vzcházivosti oospor, která je nezbytná pro uplatnění mykoparazitického mechanismu ochrany, v důsledku autolýzy nebo kontaminace hyperparazity. Pokud jde o zdroje jednotlivých kmenů Pythium oligandrum. upozornili autoři Baker a Lifshitz ve svém patentu US 4.574,083 [5] na možnost získání reionálně vhodných kmenů isolací z půdy podle standardní publikované metodiky. Tento postup se mezitím osvědčil a ve veřejných sbírkách tak jsou k dispozici kmeny z různých geografických lokalit. Pro identifikaci isolátů byla v té době aplikována převážně biologická kritéria: rychlost růstu, optimální teplota růstu - bývá kolem 30 °C, a morfologie jednotlivých reprodukčních forem sexuálního i asexuálního cyklu. Z tohoto pohledu je jako průlomový možno označit následný patent, v němž vynálezce Martin US 5,961,971 [6] zavádí molekulární charakterizaci jednotlivých isolátů na základě přesného sekvenčního protokolu kritických genů. V témže patentovém dokumentu jsou detailně uváděny též jednotlivé formulace a způsoby aplikace mikroorganismu Pythium oligandrum v polních podmínkách, přičemž jako preferované formulace jsou zmiňovány jednak kapalná formulace po nárůstu na levných médiích založených na průmyslových odpadních surovinách a jednak prášková formulace připravená enkapsulací biomasy vysušené po fermentaci do alginátů nebo ve formě vysušeného a rozemletého produktu. Mezi dalšími možnými formulacemi je ještě uváděna formulace ve formě smáčítelných prášků, běžných prášků, emulgovaných olejů a granulí. Patent CZ 303 908 a korespondující EP 2 503 892 [7] společnosti BIOPREPARÁTY, spol. s.r.o. z roku 2009 je zaměřený na posklizňovou ochranu plodin s použitím mikroorganismu Pythium oligandrum. Ve své technologické částí se zaměřuje na kultivaci tohoto mikroorganismu v běžných fermentorech na kapalných médiích s obsahem obilovin bez přídavku dalších výživných látek. Akcentována je možnost získání čistého
- 1 CZ 2017 - 661 A3 koncentrátu oospor bez přítomnosti vyčerpaného média nebo zbytků mycelia, které jsou odstraněny během sušení ve sprej ové sušárně v pozdních fázích výrobního procesu. V omezené míře byly publikovány poznatky s přípravou oospor jiných organismů než Pythium oligandrum. V patentové přihlášce CN 102 807 957A [8] Liu X. a spol. z roku 2012 je popsána příprava vzcházejících oospor mikroorganismu Phytophthora capsici pro sledování rezistence vůči různým léčivům a pro genetický výzkum. Kapalné přípravky pro biologickou ochranu rostlin jsou uváděny v patentové přihlášce US 2014/0212387 [9] Luth z roku 2014, přičemž se však jedná výlučně o kapalné prostředky s využitím polyethery modifikovaných trisiloxanů jako solventů.
Příprava a stabilizace oospor a jiných reprodukčních forem mikroskopické řasovky Pythium oligandrum je dále diskutována do určité míry v nepatentové literatuře. McQuilken a spol. [10] publikoval v roce 1990 jednoduchou a reprodukovatelnou metodu přípravy oospor v kapalné kultuře s použitím melasy jako ekonomicky nenáročného substrátu. Otázka ideálního způsobu uchování připravených oospor není však v patentové ani nepatentové literatuře uspokojivě vyřešena. McQuilken a spol. [11] z roku 1992 sledovali vliv různých osmotik jako je glycerol. Nad a KC1 na rychlost radiální extenze hyf a vzcházivost oospor řasovky Pythium oligandrum srovnáním s osmotickým tlakem představovaným extraktem půdy ve výši -0,5 MPa. Přídavek osomocytů snižoval rychlost radiální extenze, ale neměl vliv na vzcházivost až do hodnoty cca 2,0 MPa. Autoři uzavírají, že lze předpokládat dobrou účinnost aplikovaných oospor za běžně se vyskytujících osmotických podmínek v místech aplikace za předpokladu, že jsou též splněny podmínky z hlediska optimální teploty, zpravidla 30 °C, a kyselosti pH 6.0 až 7,5. Z hlediska skladovatelnosti získaných oospor je zmiňována autory Takenaka a Ishikawa [12] z roku 2013 jejich vysoká účinnost po dobu až 379 dní při uchování běžně připravené suspenze v destilované vodě v lednici při 4 °C.
Jako hlavní překážka pro větší rozšíření biologických ochranných prostředků je odborníky jasně uváděna zejména závislost účinnosti na konkrétních podmínkách aplikace a praktické problémy s udržováním a přípravou biologických přípravků na ochranu rostlin v každodenní zemědělské praxi. Proto je vyřešení praktických problémů spojených s jednoduchým a účinným skladováním a aplikaci oospor Pythium oligandrum pro obchodní úspěch biologických přípravků kritické. Pro vyřešení tohoto problému by bylo žádoucí vyvinout prostředky biologické ochrany v kapalném stavu s vysokou dlouhodobou stabilitou i za podmínek běžného skladování. Dosud publikovaná řešení však trpí řadou nevýhod, které se nepodařilo ani po letech intenzivního úsilí odstranit. Většina postupů laboratorní přípravy biologických přípravků na ochranu rostlin je složitá a zvládnutelná jen v laboratorním měřítku, což silně omezuje použití těchto postupů pro průmyslovou výrobu. Dosud preferovaný způsob aplikace ve formě smáčitelných prášku, který byl uplatněn u celosvětově prodávaných přípravků produkovaných českou biotechnologickou firmou Biopreparáty, spol s.r.o. (Polyversum®, Polygandron, BIOREPEL®), není bez komplikací z pohledu cílení ochranného zásahu i ochrany uživatelů. Doposud nebyl publikován jednoduchý, dobře vyzkoušený a konzistentně definovaný postup vhodný pro formulaci s dostatečnou skladovatelnosti připravených reprodukčních forem mikroorganismu Pythium oligandrum, zejména oospor, v jednoduché a průmyslově snadno využitelné podobě.
Podstata vynálezu
Uvedené nevýhody dosud uplatňovaných řešení protiplísňových biologických přípravků se odstraní nebo omezí podle tohoto vynálezu, jehož podstata spočívá v tom. biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum podle nezávislého nároku 1, zahrnující stabilizovanou suspenzi Pythium oligandrum. A obsahuje:
0,05 až 10,0 % hmotn. kultivační biomasy mikroorganismu Pythium oligandrum s obsahem kultivačního média, buněčných forem tohoto mikroorganismu a látek produkovaných
-2CZ 2017 - 661 A3 tímto mikroorganismem; a
90,0 až 99,95 % hmotn. stabilizátoru; přičemž v 1 ml tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředkuje, po běžné standardizaci, předem požadovaný počet dormantních oospor v rozsahu 1 x 103 až 2 x 107.
Podstata biologického protiplísňového kapalného prostředku s mikroorganismem Pythium oligandrum podle 2. nezávislého nároku tohoto vynálezu, spočívá v tom, že zahrnuje stabilizovanou suspenzi Pythium oligandrum. a obsahuje: 0,05 až 10.0 % hmotn. kultivační biomasy mikroorganismu Pythium oligandrum s obsahem kultivačního média, buněčných forem tohoto mikroorganismu a látek produkovaných tímto mikroorganismem;
79,77 až 99.95 % hmotn. stabilizátoru;
zbytek do 100% hmotn. nejméně jedné modifikující/aplikační látky ze skupiny, zahrnující plnidlo, aroma, vitamin E; přičemž v 1 ml tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředkuje, po běžné standardizaci, předem požadovaný počet dormantních oospor v rozsahu 2,5 xlO4 až 1,0x106.
S výhodou je mikroorganismem Pythium oligandrum kmen Pythium oligandrum Drechsler ATTC 38472, který byl deponován v České sbírce mikroorganizmů (CCM) Masarykova Univerzita v Brně pod označením Pythium oligandrum Ml.
Hlavní výhodou tohoto vynálezu je získán nového biologického protiplísňového kapalného prostředku, vhodného pro dlouhodobé použití, a dosažení jeho dlouhodobého a významného stabilizačního účinku, přičemž použité stabilizátory jsou cenově dostupné a poskytují další výhodu při ochraně obsažené biomasy mikroorganismu Pythium oligandrum před mikrobiální kontaminací. Nárokovaný obsah dormantních buněk výše uvedeného mikroorganismu ve formě oospor poskytuje prakticky vyzkoušený a ekonomicky výhodný rozsah, umožňující snadné dávkování pro široký rozsah potřebných aplikací. Mohou se použít různé druhy biomasy, které se zpracují vhodnou přípravou. Nižší koncentrace dormantních oospor, např. v počtu desítek nebo stovek dormantních oospor přináší též výsledky, ale účinnost tohoto prostředkuje nižší. Předem stanovený počet dormantních oospor se může upravovat v případě potřeby běžnou standardizací, tj. zředěním, nebo koncentrováním na požadovanou hodnotu.
Je výhodné, když stabilizátor obsahuje alespoň jednu komponentu ze skupiny, zahrnující vodu, solný roztok, oleje nebo roztoky osmolytů, což mohou být roztoky polyolů, typu sacharidů nebo sacharidových alkoholů nebo roztoky solí. Roztoky polyolů mohou být vybrány ze skupiny, zahrnující metabolizovatelné nebo nemetabolizovatelné roztoky různých oligosacharidů. obsahujících maximálně 10 sacharidových jednotek a minimálně 2 sacharidové jednotky, jako je maltodekaosa nebo maltononaosa nebo maltooktaosa nebo maltoheptaosa nebo maltohexaosa nebo maltopentaosa nebo stachyosa nebo rafmosa nebo sacharóza nebo sukralosa, popřípadě mohou být použité sacharidy větvené.
Ve výhodném provedení je stabilizátorem voda v množství např. 30,0, až 99,9 % hmotn., nebo solný roztok v množsví např. 99,9 % hmotn., nebo osmolyt ve formě sacharózyu v množství např. 60,0 až 64,95 % hmotn., nebo alespoň jeden olej vybraný ze skupiny zahrnující parafinový olej, minerální olej, glycerol, slunečnicový olej v množství např. 79,77 až 99,9 % hmotn.
Biologický protiplísňový kapalný prostředek může obsahovat další modifikující nebo aplikační látky pro dané specifické použití jako je postupně se uvolňující biodegradovatelná matrice jakožto nosič oospor mikroorganismu Pythium oligandrum. jako je polyvinylalkohol. v množství např. 16,0 % hmotn.; nebo plnidlo na bázi oxidu křemičitého, v množsví např. 16,0 % hmotn.; případně další aplikační/modifikující látky, jako je šalvějové nebo mátové aroma, v množství např. 0,96 % hmotn., nebo vitamin E v množství např. 0,4 % hmotn. .
-3 CZ 2017 - 661 A3
Použití těchto aplikačních/modifikujících látek se odvíjí podle aplikací biologického protiplísňového prostředku.
Tudíž, stabilizovaná suspenze oospor mikroorganismu Pythium oligandrum může využít široký rozsah stabilizujících činidel hydrofilní i hydrotobní povahy jako je obyčejná voda nebo olej nebo roztoky různých cenově nenáročných osmolytů.
Osmolyty je možné jejich chemickou povahou ideálně přizpůsobit na míru potřebným aplikacím, neboť se ukázalo, že osmolyty mohou být jak iontové povahy, jako jsou roztoky různých solí, tak i neiontové povahy jako jsou roztoky polyolů. Skutečnost, že polyoly mohou být představovány například metabolizovatelnými nebo nemetabolizovatelnými roztoky různých definovaných oligosacharidů, je pro řadu aplikací výhodná, protože mohou být k tomuto účelu použity směsi vhodných přírodních stejně jako syntetických látek požadovaných vlastností. S výhodou mohou přitom být použity i běžně dostupné látka jako je sacharóza, ale pokud je to vyžadováno, mohou být použity i běžně dostupná nemetabolizovatelná analoga. Kompozice kapalných suspenzí je kompatibilní s širokou škálou dalších látek modifikujících jejich užitné vlastnosti nebo jejich aplikaci ve formě protioxidačních látek, přirozených aktivátorů a vitamínů, jako je například oxid křemičitý jakožto plnidlo, vitamin E acetát a jiné látky.
Překvapivě bylo zjištěno, že pokud je buněčný podíl vzniklý pevnou nebo kapalnou kultivací po skončení přípravy přímo upraven do formy suspenze, případně koncentrované suspenze, reprodukční formy mikroorganismu Pythium oligandrum si uchovají v takové suspenzi původní vzcházivost po dobu nejméně 6 měsíců při běžném skladování při laboratorní teplotě. Tento výsledek přitom vystupuje do popředí o to více, pokud zvážíme nereprodukovatelné a variabilní výsledky uváděné v publikované literatuře. V literatuře se například uvádí, že suspenze oospor připravená v destilované vodě a skladovaná po dobu 188 nebo 384 dní si uchovávala původní vzcházivost při skladování v lednici při 4°C. Nicméně zcela chybějící popis způsobu přípravy takto popisovaných preparátů činí téměř nemožné vyhodnotit jejich vědeckou platnost, nemluvě již o praktické použitelnosti, kdy za provozních podmínek na farmách nemusí být skladovací teplota 4°C dokonce ani k dispozici.
Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum se získá způsobem výroby podle tohoto vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že aerobní kultivaci oomycety Pythium oligandrum v kapalné táži se kapalné médium obsahující extrakt z obilovin, třtinovou melasu a další nezbytné živiny se sterilizuje v parním sterilizátoru. Po vychladnutí se zaočkuje jedním z vybraných kmenů Pythium oligandrum. Po skončení kultivace, v řádu několika dní s výhodou 13 dní, se biomasa sklidí a zpracuje. Po ukončení kultivační fáze Pythium oligandrum v kapalné fázi se biomasa s kapalným médiem homogenizuje, aby minimálně 95% částic v suspenzi bylo v rozmezí 0.050 až 0.300 mm, s výhodou 0,125 mm. Homogenní suspenze charakterizovaná počtem oospor se podle počtu oospor suspenze koncentruje nebo zředí na předem požadovanou koncentraci oospor v biologickém protiplísňovém prostředku. S výhodou se po fázi homogenizace a koncentrování nebo ředění se suspenze filtruje.
Vodná suspenze se při homogenizaci stabilizuje přídavkem osniolytu a v kombinaci s uchováváním při teplotách nižších než 8° C se skladuje ve sterilních velkoobjemových nádobách.
V případě bezvodé suspenze mikroorganismu Pythium oligandrum .ve po ukončení kultivační fáze na pevném substrátu nebo v kapalné fázi získaný materiál homogenizuje až do dosažení velikosti minimálně 95 % částic v suspenzi v rozmezí 0,050 až 0,300mm, s výhodou 0,125 mm. Získaná homogenní suspenze charakterizovaná počtem oospor se odstředí. Odstředěný materiál se po odstranění supematantu doplní olejem na předem požadovanou koncentraci oospor pro výrobu biologického protiplísňového prostředku v takovém množství, aby výsledná koncentrace oospor v biologickém protiplísňovém prostředku a takto získaný materiál se následně resuspenduje homogenizací.
-4CZ 2017 - 661 A3
Předkládané řešení se jeví být výhodné i z pohledu významného zjednodušení biotechnologického procesu přípravy mikroorganismu Pythium oligandrum a tím též významného snížení provozních nákladů výrobců takových přípravků. Filtrace nebo separace kultivované biomasy od produkčního média, její sušení a následné mletí na požadovanou velikost částic představuje několik procesů zpracování, které jsou energeticky a technologicky poměrně náročné, obtížně kontrolovatelné, náchylné k možnosti vzniku kontaminací a mohou konečně významně poškodit výsledný produkt, pokud nejsou prováděny za přesně definovaných a průmyslově vysoce náročných podmínek. Naopak technologicky velmi jednoduchým suspendováním získané biomasy v hustých a viskosních roztocích osmolytů se získá velmi stabilní výsledný produkt okamžitě vhodný pro řadu praktických aplikací. Z praktického hlediska představuje nezanedbatelnou výhodu, že připravené suspenze mikroorganismu Pythium oligandrum je možné téměř kvantitativně přenést z kultivačních nádob nebo lermentorů, což minimalizuje náklady na jejich čištění a údržbu a zároveň minimalizuje i množnost úniku produktu do pracovního prostředí výrobního provozu. Také samotný fakt, že takto získaný produkt je dlouhodobě stabilní i při skladování v běžných teplotách též významně snižuje provozní náklady a usnadňuje manipulaci s produktem.
Překvapivě bylo navíc zjištěno, že kromě stabilizačních efektů koncentrovaných roztoků osmolytů se v konkrétním případě námi zkoumaných suspenzí oospor mikroskopické řasovky Pythium oligandrum významně uplatňuje i konzervační účinek takových roztoků, který je z výrobní i běžné praxe dobře známý. Takto skladovaný produkt je proto chráněný před kontaminací nežádoucími mikroorganismy, které dokonce i v případě velmi nepravděpodobného vniknutí do takto stabilizovaných suspenzí se nemohou v navrhovaném chemickém prostředí rozmnožovat a nemohou proto kontaminovat výsledný produkt. Tato výhoda je v současné výrobní praxi zásadní povahy zejména ve světle stále se zpřísňujících požadavků na úroveň náhodné kontaminace u pesticidních, biocidních a kosmetických produktů.
Kromě úlohy stabilizátoru a úlohy konzervační látky mohou roztoky osmolytů též plnit úlohu adheziva, která se může prakticky uplatnit při mnoha aplikacích, ať již ve formě vodných roztoků po naředění stabilizovaných suspenzí oospor na optimální koncentraci s aplikací namáčením, nebo pro aplikaci jemným rozptýlením mikroskopických částic (tzv. mlžení). Ve všech shora uvedených příkladech aplikací tedy napomáhají roztoky polyolů k účinné adhezi a následné rovnoměrné aplikaci na ošetřených místech, rostlinách nebo plodinách.
V neposlední řadě je potom třeba zmínit, že v případě použití metabolizovatelných osmolytů mohou přímo na místech aplikace sloužit tyto látky jako živina důležitá při kolonizaci a osídlení cílových míst, přičemž jde o významnou živinu zejména v prvé fázi spojené s přechodem oospory do mycelámí formy. Následně mohou převzít úlohu živin důležitých pro dlouhodobý růst a udržení mikroskopické řasovky Pythium oligandrum na místě aplikace živiny více komplexní povahy představované nedokonale fermentovaným substrátem použitým při biotechnologickém růstu a namnožení oospor během biotechnologické kultivace.
Měrný obsah oospor a dalších reprodukčních forem mikroskopické řasovky v suspenzích podle předkládaného řešení je srovnatelný nebo vyšší s dříve zkoušenými a prodávanými sypkými přípravky, což je důležité z pohledu logistiky a ekonomiky distribuce takto vyráběného produktu. Nové formulace však umožňují i použití nižších koncentrací oproti předcházejícím řešením.
V návaznosti na použitý technologický postup došlo u nového kapalného protiplísňového prostředku podle tohoto vynálezu k faktické významné redukci kompoziční komplexity, aniž by toto bylo spojeno s jakýmkoliv omezením funkce, resp účinnosti takto formulovaného kapalného přípravku. Pokud jde o buněčnou a partikulární složku nově navrhovaného přípravku, je tato téměř výlučně představována stabilizovaným oosporami s velmi malým podílem myceliálních fragmentů, rozemletého prosa a jiných komponent. Tyto komponenty ovšem v hustém prostředí tvořeném koncentrovaným osmolyty vůbec nesedimentují, což překvapivě zaručuje dobrou homogenitu přípravku, nesrovnatelně lepší, než je tomu u smáčitelných prášků aplikovaných ve
-5 CZ 2017 - 661 A3 formě vodných suspenzí, kdy se jednalo o preparát velmi heterogenní z hlediska velikosti obsažených částic. Zejména se toto týká částic oxidu křemičitého obsaženého v doposud vyráběných přípravcích, v řešení podle předkládaného vynálezu naopak oxid křemičitý u většiny příkladů chybí (s výjimkou zubní pasty, kde je použit jako abrasivum). Z hlediska potřeb praktických aplikací tudíž nyní nedochází k ucpávání filtrů a jiných technologických zařízení během aplikace přípravku.
Pokud by pro určité aplikace byla na závadu přítomnost menších množství metabolizovatelných osmolytů, je tyto možné snadno nahradit bez jakéhokoliv ovlivněn nej důležitějších vlastností přípravku chemicky blízkými nemetabolizovatelnými osmolyty.
V případě, že by bylo technologicky vhodnější získaný produkt vysušit, nabízela by se jako vhodná technologie mrazové sublimace (lyofilizace) v přístrojích s vysokou hodnotou vakua, neboť použití koncentrovaných roztoků osmolytů jako kryopreservantů ochranných látek při lyofilizaci je dobře známé a široce využívané. Jako příklad je možné uvést osmolyty široce využívány jako ochranné kryopreservanty v řade citlivých aplikací včetně kryopreservace lidských oocytů popsané například v přehledném článku Wright [15] z roku 2004.
Velkou předností přípravků získaných podle předkládaného vynálezu je, že tyto přípravky jsou vhodné pro všechny aplikace, v nichž se jeví výhodné využít protiplísňových mykoparasitických, elicitorových a růstových vlastností mikroorganismu Pythium oligandrum. Zejména se tedy jedná o použití tohoto přípravku jako rostlinného biofůngicidu, pro humánní a veterinární použití mikroorganismu Pythium oligandrum, pro rozrušení biofilmů a odstranění dysbios vyskytujících se při různých lékařských diagnosách a též pro komunální ochranu před plísněmi vyskytujícími se v životním a/nebo pracovním prostředí. V závislosti na použitých matricích v kapalném suspenzním koncentrátu lze tento použít jako ochranný postřik rostlin v přítomnosti degradovatelného biopolymeru, který slouží nejen jako ochranný faktor, ale také jako postupně se uvolňující degradovatelná matrice a tedy vlastně jako „nosič“ materiálu Polyversum s oosporami aktivního mikroorganismu Pythium oligandrum.
Ochrana proti plísním, houbám, patogenním bakteriím a kvasinkám s použitím stabilizované koncentrované suspenze oospor mikroorganismu Pythium oligandrum, spočívající v aplikaci této stabilizované koncentrované suspenze, v neředěné nebo ředěné podobě, na místa postižená výskytem plísní nebo hub nebo patogenních bakterií nebo patogenních kvasinek nebo mikrobiální dysbiosou. umožňuje definovat široký okruh aplikací pro stabilizovaný kapalný koncentrát.
V oblasti rostlinné ochrany je možné kompozice využít k ochraně proti plísním, houbám, nebo patogenním bakteriím a kvasinkám tak. že se stabilizovaná koncentrovaná suspenze v ředěné nebo neředěné formě aplikuje na rostliny nebo jejich prostředí nebo semena nebo plodiny nebo plody a to jak před sklizní, tak po sklizni jako například i ve skladech, včetně aplikace ve formě aerosolů, samorozpustných kapslí obsahujících koncentrovanou suspenzi, přihnojování k patě rostlin, máčení plodin, postřik plodin, moření plodin, mlžení plodin, hnojení a přihnojování jako součást komplexních hnojiv, a aplikaci ve formě hydroponií.
Při ochraně dutiny ústní se může stabilizovaná koncentrovaná suspenze v ředěné nebo neředěné formě aplikovat na místa postižená orálním plakem nebo paradentózou, výskytem infikovaných nehojících se ran zejména u diabetiků, výskytem dermatofýtálních nebo kvasinkových infekčních onemocnění a výskytem jiných symptomů spojených s mikrobiální dysbiosou kůže a povrchových sliznic člověka.
Pro použití v komunální ochraně se stabilizovaná koncentrovaná suspenze v ředěné nebo neředěné formě aplikuje na místa na zdech a zdivu postižená výskytem plísní. Další inovativní oblasti použití zahrnují protiplísňovou ochranu chladicích zařízení, klimatizací, oblastí postižených záplavami a povodněmi a jiná místa s častým výskytem cílových plísní pro
-6CZ 2017 - 661 A3 mikroorganismus Pythium oligandrum.
Objasnění výkresů
Vynález je dále podrobně popsán na příkladných provedeních a blíže osvětlen na připojených schématických výkresech.
Obr. ΙΑ, 1B, 1C blíže osvětlují srovnání rychlosti růstu fytopatogenní plísně Fusarium graminearum bez přítomnosti mikroorganismu Pythium oligandrum a v přítomnosti tohoto mikroorganismu.
Podrobněji ukazuje:
obr. 1A růst kolonií fytopatogenní plísně Fusarium graminearum samostatně (čtverce) a při současné inokulaci Pythium oligandrum z dormantních oospor a z kapalné a pevné kultivace ( hvězdičky a trojúhelníky);
obr. 1B fotografie 4 příkladů Petriho misek na něž byl v levé části inokulován mikroorganismus Pythium oligandrum z dormantních oospor a v pravé části lytopatogenní plíseň Fusarium graminearum (horní řada) a na kontrolních miskách byla inokulována pouze plíseň Fusarium graminearum, přitom nárůst byl zaznamenán po 4 dnech;
obr. 1C Fotografie Petriho misek se současnou inokulaci mikroorganismus Pythium oligandrum z dormantních oospor lytopatogenní plísně Fusarium graminearum. kde nárůst byl zaznamenán po 11 dnech.
Obr. 2A, 2B, 2C znázorňují výsledky laboratorních pokusů s nárůstem pšenice v přítomnosti fytopatogenní plísně Fusarium graminearum, mikroorganismu Pythium oligandrum, a kombinace obou těchto mikroorganismů.
Podrobněji se ukazují na:
obr. 2A Erlenmayerovy baňky, v nichž rostla na agarové půdě pšenice v přítomnosti pouze fytopatogenní plísně Fusarium graminearum, tvořící bílé ostrůvky, zaznamenány po 20 dnech od inokulace ke klíčku pšenice;
obr. 2B Erlenmayerova baňky, v nichž rostla na agarové půdě pšenice v přítomnosti jak fytopatogenní plísně Fusarium graminearum tak také mikroorganismu Pythium oligandrum, baňky byly zaznamenány po 20 dnech od současné inokulace ke klíčku pšenice; a obr. 2C Erlenmayerovy baňky, v nichž rostla na agarovc pudě pšenice v přítomnosti pouze mikroorganismu Pythium oligandrum, baňky byly foceny po 20 dnech od inokulace této plísně ke klíčku pšenice.
Obr. 3A, 3B, 3C, 3D, 3E je vyobrazena aplikace protiplísňového přípravku na ochranu rostlin podle příkladu provedení 1 a následná analýza populační dynamiky mikroorganismu Pythium oligandrum pozorovaná v polním pokuse na pšenici a přilehlé půdě včetně reakce na přítomnost plísní sledovaná genovou expresí a genetické sledování úrovně plísňové kontaminace.
Podrobněji znázorňují na:
obr. 3A obsah mikroorganismu Pyíhium oligandrum stanovený genetickým testem na rostlinách (světle šedé sloupce) a v okolní přilehlé půdě (tmavě šedé sloupce) v různých časech po aplikaci;
-7 CZ 2017 - 661 A3 obr. 3B vývoj teplot měřených infračerveným teploměrem přímo na poli v době odběrů (světle šedé sloupce) a teplotní záznam získaný z místní meteorologické stanice (tmavě šedé sloupce);
obr. 3C průběh genových expresí genu pro celulasu (POCELL), endo-3-glukanasu (POENDO) a strukturní protein bohatý na serin a threonin (POSTRU) v jednotlivých částech rostliny a v okolní půdě (So, půda, R, kořen, St, stonek. L, list) sledovaný v čase 6 až 120 h, přičemž úroveň exprese genů byla normalizována na expresi konstitutivního genu β-tubulinu (POTUBU) a je vyjadřována oproti kontrole bez aplikace přípravku dle citované metodiky [12];
obr. 3D úroveň plísňové kontaminace v identických vzorcích jako v panelu C měřená pomocí kvantitativní PCR s obecnými amplifikacními primery pro amplifikaci plísní, obr. 3E korelační graf sledující korelaci mezi úrovní exprese genu pro celulasu (POCELL) a úrovní plísňové kontaminace.
Obr. 4A, 4B, 4C, 4D znázorňují test účinnosti zubních past dle příkladu provedení číslo 4 z hlediska jejich schopnosti eliminovat biofilmy uměle vytvořené na keramických hydroxylapatitových destičkách, a to v horní části obrázku s použitím slin zdravého jedince a ve spodní části obrázku s použitím slin jedince postiženého paradentózou.
Podrobněji se ukazuje na:
obr. 4A fotografie šestijamkové destičky s použitím slin zdravého jedince po uvolnění promytých biofilmů do roztoku a vyjmutí keramických hydroxylapatitových destiček, které byly předtím čištěny kartáčkem bez pasty, pastou Odol, pastou Enzycal, pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4 bez přídavku mikroorganismu Pythium oligandrum, pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4 bez přídavku oxidu křemičitého a úplnou pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4;
obr. 4B kvantitativní vyhodnocení obsahu biofilmů měřením intenzity zabarvení v jednotlivých jamkách obr. 1A na destičkovém spektrofotometru při vlnové délce 562 nm;
obr. 4C fotografie šestijamkové destičky s použitím slin jedince s paradentózou po uvolnění promytých biofilmů do roztoku a vyjmutí keramických hydroxylapatitových destiček, které byly předtím čištěny kartáčkem bez pasty, pastou Odol, pastou Enzycal, pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4 bez přídavku mikroorganismu Pythium oligandrum, pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4 bez přídavku oxidu křemičitého a úplnou pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4; a obr. 4D kvantitativní vyhodnocení obsahu biofilmů měřením intenzity zabarvení v jednotlivých jamkách obr. IC na destičkovém spektrofotometru při vlnové délce 562 nm,
Příklady uskutečnění vynálezu
Biologický protiplísňový kapalný prostředek obsahuje mikroorganisms Pythium oligandrum a ve všech příkladných provedeních, mikroorganismem Pythium oligandrum je je kmen Pythium oligandrum Drechsler ATTC 38472, který byl deponován v České sbírce mikroorganizmů CCM, Masarykova Univerzita v Brně, pod označením Pythium oligandrum ML a pod tímto označením je dále uváděn v příkladných provedeních.
Dále je uvedena Sekvenční Listina tohoto mikroorganismu dle ST25 PCT:
CZ 2017 - 661 A3 \· ;X;
,χ
Příklad 1
-9CZ 2017 - 661 A3
Biologický protiplísňový kapalný prostředek určený k postřikům kulturních plodin s vysokým hmotnostním procentem biomasy
Příprava:
Biomasa získaná kultivací mikroorganismu Pythiuin oligandrwn Ml na pevném substrátu byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána s demineralizovanou vodou a homogenizována. Homogenizace proběhla za otáček 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Následně byl do výchozí neředěné suspenze přidán osmolyt (sacharóza) v množství, které odpovídá výsledné hmotnostní koncentraci 60 % hmotn. A požadovanému počtu oospor. Suspenze s osmolytem (sacharózou) byla poté homogenizována v mixéru 1 minutu při 2000 ot/min. Poté byla suspenze uložena do sterilních nerezových tanků při teplotě pod 8°C.
Výhodněji byl biologický protiplísňový kapalný prostředek připraven sloučením kroků homogenizace v demineralizované vodě a následného přidání osmolytu (sacharózy) v jeden, a to tím způsobem, že biomasa získaná pevnou kultivací byla homogenizována v nádobě průmyslového homogenizátoru v roztoku osmolytu (65% roztoku sacharózy). Homogenizace proběhla za otáček 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Po stanovení počtu oospor ve výchozí suspenzi, byla tato suspenze zředěna osmolytem (65% roztokem sacharózy) běžným způsobem tak, aby bylo dosaženo požadované koncentrace oospor v přípravku. Následně byla suspenze uložena do sterilních nerezových tanků při teplotě pod 8°C.
Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick - Rafteovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací s Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení přípravku:
Sacharóza jako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium olizandrum % hmotn.
% hmotn.
% hmotn.
x 105 /1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
Příklad 2
Biologický protiplísňový kapalný prostředek určený k postřikům kulturních plodin s nízkým hmotnostním procentem biomasy
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum získaná kapalnou kultivací byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána s osmolytem (sacharózou) a homogenizována tak, aby bylo dosaženo požadovaného počtu oospor a koncentrace osmoiytu (sacharózy). Homogenizace proběhla při rychlosti 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Poté byla suspenze uložena ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8 °C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v
- 10CZ 2017 - 661 A3 souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilnich oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Sacharóza jako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pvthium olivandrům Ml % hmotn.
35,9 % hmotn.
0.1% hmotn.
x 105 /1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25° C.
Příklad 3
Biologický protiplísňový kapalný prostředek určený k moření zrna
Příprava:
Biomasa získaná kultivací mikroorganismu Pythium oligandrum Ml na pevném substrátu byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána s demineralizovanou vodou a homogenizována. Homogenizace proběhla při 3000 až 5000 ot/min po dobu minut. Následně byl do výchozí neředěné suspenze přidán osmolyt (sacharóza) v množství, které odpovídá výsledné hmotnostní koncentraci 60 % hmotn. A požadovanému počtu oospor. Suspenze s osmolytem (sacharózou) byla poté homogenizována v mixéru 1 minutu.
Výhodněji byl prostředek připraven sloučením kroků homogenizace demineralizované vodě a následného přidání osmolytu (sacharózy) v jeden, a to tím způsobem, že biomasa získaná pevnou kultivací byla homogenizována v nádobě průmyslové hohomogenizátoru v roztoku osmolytu (65% roztoku sacharózy). Homogenizace proběhla za otáček 3000 - 5000 ot/min po dobu 3 minut. Po stanovení počtu oospor ve výchozí suspenzi, byla tato suspenze zředěna osmolytem (65% roztokem sacharózy) běžným způsobem tak, aby bylo dosaženo požadované koncentrace oospor v přípravku. Následně byla suspenze uložena do sterilních nerezových tanků při teplotě pod 8 °C.
Poté byla získaná suspenze uložena ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8 C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilnich oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilnich oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25°C.
Složení:
Sacharóza jako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml % hmotn.
% hmotn.
% hmotn.
2,5 x 106 /1 ml.
Příklad 4
Biologický protiplísňový kapalný prostředek jakožto suspenzní koncentrát s nízkým
- 11 CZ 2017 - 661 A3 obsahem vody
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml z kapalné kultivace byla po sklizení odstředěna. Supernantant byl po odstředění odstraněn a odstředěný materiál byl doplněn parafinovým olejem tak, aby výsledný počet oospor byl 500 000 oospor na 1 ml přípravku. Poté byla směs homogenizována v průmyslovém mixéru po dobu 3 minut. Suspenze byla uložena ve sterilních nádobách při teplotě pod 8° C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím SedgewickRafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Kultivační biomasa
Parafínový olej jako stabilizátor
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium olisandrum Ml
0,1 % hmotn.
99,9 % hmotn.
x 105 /1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C
Příklad 5
Biologický protiplísňový kapalný prostředek aplikovaný formou nanovláken tvořících postupně se uvolňující degradovatelnou matrix pro mikroorganismus Pythium oligandrum Ml
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum z kapalné kultivace byla po sklizení odstředěna. Supernantant byl odstraněn a odstředěný materiál byl doplněn o osmolyt (65% sacharózu) a biopolymer, který pak byl dále zpracováván technologií elektrostatického zvlákňování s použitím netoxického, biodegradibilního polymeru polyvinylalkoholu (PVA). Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní
Složení:
1. Hlavní složka (kapalná suspenze mikroorganizmu Pythium oligandrum.) 84 % hmotn. z toho
Sacharóza jako stabilizátor Voda jako stabilizátor Kultivační biomasa
2. PVA nosič
PVA jako degradovatelný nosič
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml % hmotn.
% hmotn.
% hmotn.
% hmotn.
x 106 /1 ml.
- 12CZ 2017 - 661 A3
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25°C
Příklad 6
Biologický protiplísňový kapalný prostředek aplikovaný ve formě impregnačního nátěru nebo nástřiku
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml z kapalné kultivace byla po sklizení homogenizována a filtrována filtrační technologií separující částice s velikostí do 300 pm. Po odstředění byla takto připravená biomasa smíchána s minerálním olejem o nízké viskozitě, tak aby bylo dosaženo požadovaného počtu oospor v 1 ml přípravku.. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Kultivační biomasa
Minerální olej jako stabilizátor
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium olisandrum Ml
0,1 % hmotn.
99.9 % hmotn. 2 x 105 / 1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě 10 až 45 °C (v závislosti na typu sekundární látky).
Příklad 7
Biologický protiplísňový kapalný prostředek aplikovaný jako sanitační prostředek pro klimatizace
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml z kapalné kultivace byla po sklizení homogenizována a filtrována filtrační technologií separující částice s velikostí do 100 pm. Po odstředění byla biomasa zředěna roztokem soli na požadovaný počet oospor v 1 ml přípravku. Princip působení je oplach či nástřik filtrů či potrubí klimatizačních nebo chladících jednotek. Přítomnost mikroorganismu Pythium oligandrum Ml zaručuje odolnost vůči plísním a houbových chorobám.
Čištění pylových filtrů:
Filtr byl ponořen do sanitačního roztoku a byl v něm ponechán působit po dobu 10-30 minut; poté opláchnut. Alternativou je, že tentýž roztok může být nastříkán na filtr v jeho pracovní pozici. Znečištění a zbytky činidla budou vyfoukány ven stlačeným vzduchem.
Sanitace odpařovače a filtrů:
Po vyčištění odpařovačů a/nebo filtrů se aplikuje roztok produktu bez oplachování. Výborného sanitačního účinkuje dosaženo i tehdy, jestliže se produkt použije výhradně jenom jako detergent k omytí. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních
- 13 CZ 2017 - 661 A3 oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní
Složení:
Kultivační biomasa 0,1 % hmotn.
Solný roztok jako stabilizátor 99.9 % hmotn.
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium olimndrum Ml 5 x 105 /1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě 10-45 °C (v závislosti na typu sekundární látky).
Příklad 8
Biologický protiplísňový kapalný prostředek aplikovaný jako sanitační prostředek pro ošetření sedimentu - pro bahenní nánosy, vyplavené územní celky
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Mil z kapalné kultivace byla po sklizení homogenizována a filtrována filtrační technologií separující částice s velikosti do 400 pni. Po odstředění byla biomasa zředěna destilovanou nebo demineralizovanou vodou na požadavaný počet oospor v 1 ml přípravku. Principem působení je vytvoření vodné suspenze dle ředění uvedeného níže a aplikování v oblastech postižených kontaminovanými nánosy bahna a sedimentů, jako meliorační postup ke zlepšení vlastností půd a zemin. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Kultivační biomasa
Destilovaná voda jako stabilizátor
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml
Aplikační využitelnost je od 250 g/ha při koncentraci 500 000 oospor na ml.
0,1% hmotn.
99.9 % hmotn. 5 x 105 / 1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C
Příklad 9
Biologický protiplísňový kapalný prostředek jakožto stabilizovaná vodná suspenze oospor Pythium oligandrum Ml
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml získaná kapalnou kultivací je po odstředění (4000 ot/rnin, 5 min) a odstranění supernatantu smíchána se sterilní destilovanou vodou a homogenizována. Homogenizace probíhá za vysokých otáček (20 000 ot/min) po dobu 1 minuty. Poté může být suspenze podle potřeby filtrována a koncentrována za účelem získání suspenzního koncentrátu obsahujícího v 1 ml požadovaný počet oospor Pythium oligandrum Ml a neobsahujícího zbytky
- 14CZ 2017 - 661 A3 původního média ani zbytky mycelia. Získaný suspenzní materiál může být uložen ve sterilních tancích při teplotě 1-8°C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Sterilní destilovaná voda jako stabilizátor Kultivační biomasa Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml 99,9 % hmotn. 0.1% hmotn. 5 x 105 /1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: minimálně 6 měsíců při teplotě do 25°C
Příklad 10
Biologický protiplísňový kapalný prostředek jakožto stabilizovaná suspenze s vysokou koncentrací oospor Pythium oligandrum Ml
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml získaná kapalnou kultivací byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) homogenizována. Homogenizace proběhla při 20000 ot/min po dobu 3 minut. Poté byla suspenze odstředěna a biomasa po odstranění supematantu koncentrována na požadovaný počet oospor v 1 ml přípravku smícháním s osmolytem (65% sacharózou). Suspenzní koncentrát byl uložen ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8°C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množštví viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Sacharóza jako stabilizátor Voda jako stabilizátor Kultivační biomasa Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oliuandrum Ml 60 % hmotn. 35 % hmotn. 5 % hmotn. 2 x 107 / 1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25°C.
Příklad 11
Biologický protiplísňový prostředek ve formě pasty na bázi glycerolu
Příprava:
Do laboratorního homogenizátoru bylo nalito 1197,1 g glycerolu farmaceutické kvality (Glycerol 99 % PharmEur) a poté bylo opatrně přisypáno 239,4 g oxidu křemičitého Sident® 22 S, 43,1 g kultivační biomasy, 14,4 g vitaminu E a 6 g šalvějového aromatu. Směs byla míchána při 60
CZ 2017 - 661 A3 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při laboratorní teplotě. Poté byla směs plněna po 75 g do plastových tub s uzávěrem, celkově bylo vyrobeno 20 ks takových tub. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Glycerol 99% Pharm Eur jako stabilizátor SIO2 Sident® 22 S jako plnidlo na bázi oxidu křemičitého Kultivační biomasa Pythium oligandrum Ml Vitamin E acetát jako aplikační látka Šalvějové aroma FC02 Bio 35 % jako aroma Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml 79,77 % hmotn. 16,00 % hmotn. 2,87 % hmotn. 0,96 % hmotn. 0,40 % hmotn. 2,5 x 104 / 1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: nejméně 6 měsíců při teplotě 25 °C.
Příklad 12
Biologický protiplísňový prostředek ve formě pasty na bázi olivového oleje
Příprava:
Do laboratorního homogenizátoru bylo nalito 600 g panenského olivového oleje a poté bylo opatrně přisypáno 120 g oxidu křemičitého Sident® 22 S, 21,6 g kultivační biomasy, 7,2 g vitaminu E a 3 g mátového aromatu. Směs byla míchána při 20 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při laboratorní teplotě. Poté byla směs plněna po 75 g do plastových tub s uzávěrem, celkem bylo vyrobeno 10 takových tub. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikaci Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Olivový olej rafinovaný jako stabilizátor S1O2 Sident® 22 S jako plnidlo na bázi oxidu křemičitého Kultivační biomasa Pythium oligandrum Ml Vitamin E acetát jako aplikační látka Esenciální oleje máta pepmá HNA jako aroma Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml 79,77 /0 hmotn. 16,00 % hmotn. 2,87 % hmotn. 0,96 % hmotn. 0,40 % hmotn. 2,5 x 104 / 1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě 25 °C
Příklad 13
Biologický protiplísňový kapalný prostředek na ochranu akvatických organismů
Přípravek je určen k preventivní ochraně ryb a rybí násady (kapr, plotice, cejn) před spektrem plísňových onemocnění (zejména Aspergillus spp.). Přípravek je aplikován preventivně do
- 16CZ 2017 - 661 A3 chovných nádrží. Přípravek je dále určen k preventivní ochraně rybích jiker před napadením spektrem plísňových onemocnění (zejména rody Fusarium spp., Aspergillus spp.).
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml získaná kapalnou kultivací byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) homogenizována. Homogenizace proběhla při 20 000 ot/min po dobu 3 minut. Poté byla suspenze odstředěna a biomasa po odstranění supernatantu koncentrována na požadovaný počet oospor v 1 ml přípravku smícháním s osmolytem (65% sacharózou). Suspenze byla uložena ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8 °C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody \ souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Sacharóza jako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml % hmotn.
% hmotn. 1 % hmotn.
5.106/ 1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25°C.
Příklad 14
Biologický protiplísňový tekutý přípravek k ošetření včelích plastů
Přípravek je určen k preventivnímu ošetření včelích plástů před napadením širším spektrem plísní především rodu Aspergillus a Fusarium. Přípravkem lze ošetřit plásty určené k uskladnění mimo včelí úl i plásty uvnitř včelího úlu neobsazeného včelami.
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml získaná kapalnou kultivací byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána s osmolytem (sacharózou) a homogenizována tak, aby bylo dosaženo požadovaného počtu oospor a koncentrace osmolytu (sacharózy). Homogenizace proběhla při 20 000 ot/min po dobu 3 minut. Poté byla suspenze uložena ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8°C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Sacharóza jako stabilizátor Voda jako stabilizátor Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium olizandrum Ml
64% hmotn.
35,9 % hmotn.
0,1 % hmotn.
x 106 / 1 ml
Vlastnosti:
- 17 CZ 2017 - 661 A3
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C
Příklad 15
Biologický protiplísňový kapalný prostředek jakožto bezvodý suspenzní koncentrát určený k postřikům kulturních plodin
Biomasa získaná kultivací mikroorganismu Pythium oligandrum Ml na pevném substrátu byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána demineralizovanou vodou a homogenizována. Homogenizace proběhla za otáček 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Po homogenizaci byla získaná suspenze smíchána s anorganickým nosičem (Sipemat), usušena a semleta odstředivým mlýnem na výslednou velikost částic do 350 pm. Suchá, kultivační biomasa s nosičem pak byla smíchána s parafínovým olejem, tak aby bylo dosaženo požadované koncentrace oospor v přípravku. Suspenze byla uložena ve sterilních nádobách při teplotě do 25°C.
Výhodou přípravku oproti příkladu jedna je delší stabilita přípravku, která je zajištěna přítomností vody. Anorganický nosič na bázi oxidu křemičitého zajišťuje dobrou suspendovatelnost pevných částic (biomasy) v přípravku.
Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky, stabilita byla stanovena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací s Etxeberria a kol. [13] z roku 2011.
Složení:
Kultivační biomasa
Sipernat 22 jako anorganický nosič
Parafínový olej jako stabilizátor
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml
1,5% hmotn.
6,5 % hmotn. 92 % hmotn.
x 106 / 1 ml
Vlastnosti:
Stabilita: 24 měsíců při teplotě do 25 °C
Příklad 16
Biologický protiplísňový kapalný prostředek jakožto bezvodý suspenzní koncentrát určený k postřikům kulturních plodin v ekologickém zemědělství
Biomasa získaná kultivací mikroorganismu Pythium oligandrum Ml na pevném substrátu byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána s demineralizovanou vodou a homogenizována. Homogenizace proběhla za otáček 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Po homogenizaci byla získaná suspenze smíchána s anorganickým nosičem (Sipemat), usušena a semleta odstředivým mlýnem na výslednou velikost částic do 350 pm. Suchá, kultivační biomasa s nosičem pak byla smíchána se slunečnicovým olejem, tak aby bylo dosaženo požadované koncentrace oospor v přípravku. Suspenze byla uložena ve sterilních nádobách při teplotě do 25
Výhodou přípravku oproti příkladu jedna je delší stabilita přípravku, která je zajištěna přítomností vody. Anorganický nosič na bázi oxidu křemičitého zajišťuje dobrou suspendovatelnost pevných částic (biomasy) v přípravku.
Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Ralterovy počítací komůrky, stabilita byla stanovena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor
- 18 CZ 2017 - 661 A3 s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací s Etxeberria a kol. [13] z roku 2011.
Složení:
Kultivační biomasa
Sipemat 22 jako anorganický nosič?
Slunečnicový olej jako stabilizátor
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium olimndrum Ml % hmotn.
6.5 % hmotn.
% hmotn.
1.106/ 1 ml
Vlastnosti:
Stabilita: 24 měsíců při teplotě do 25°C
Příklad 17
Biologický protiplísňový tekutý přípravek se sníženou koncentrací oospor
Biomasa Pythium oligandrum Ml získaná kapalnou kultivací byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána s osmolytem (sacharózou) a homogenizována tak, aby bylo dosaženo požadovaného počtu oospor a koncentrace osmolytu (sacharózy). Homogenizace proběhla při 20 000 ot/min po dobu 3 minut. Následně byla suspenze smíchána s osmolytem (65% sacharózou) tak, aby koncentrace oospor v přípravku odpovídala požadavkům na přípravek. Poté byla suspenze uložena ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8 °C.
Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Počet dormantních oospor se v případě potřeby stabilizuje běžným způsobem.
Složení:
Sacharóza jako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml
Vlastnosti:
64,95 % hmotn.
% hmotn.
0,05 % hmotn.
x 103 / 1 ml
Stabilita: 12 měsíců při teplotách od 2 do 8 °C; 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
Příklad 18
Test laboratorní účinnosti biologických protiplísňových kapalných prostředků na mykoparasitických experimentech
Laboratorní test proliferace Pylhium oligandrum Ml z dormantních oospor suspenzního koncentrátu podle příkladu provedení 1 a následného mykoparasitismu na lytopatogenní plísni Fusarium graminearum byl proveden na sterilních agarových plotnách s živným médiem na bázi sladového extraktu. Zředěný koncentrát na aplikační úroveň, tj. 0,2 ml koncentrátu na 1 1 vody, byl nanesen na agarovou plotnu, část této plotny byla po vyklíčení oospor vyjmuta a přenesena na jiný agar, který byl současně inokulován plísní Fusaňum graminearum.
Výsledek tohoto testu je představen na Obr. 1 ukazujícím významné zastavení růstu fytopatogenní plísně Fusarium graminearum po přidání mikroorganismu Pythium oligandrum Ml ve srovnání se standardním růstem (obr. 1A). Tato situace je dále ilustrována pomocí série
- 19CZ 2017 - 661 A3
Petriho misek vyfotografovaných po 4 dnech jednak společného růstu obou mikroorganimů a jednak růstu samotné fýtopatogenní plísně (obr. 1B). Po 11 dnech kultivace je patrné výrazné potlačení fýtopatogenní plísně nárůstem mikroorganismu Pythium oligandrum Ml (obr. 1C). Pokud množství viabilnich oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Příklad 19
Protiplísňová účinnost vůči fytopatogenním plísním demonstrovaná v laboratorním experimentu s pšenicí
Semena kulturních plodin (pšenice) byla ošetřena roztokem Sava (1 až 5%roztok) a naklíčena na soil extract agaru. Po naklíčení byly klíčky znova ošetřeny 1 % roztokem Sava a umístěny na vrstvu fýtoagaru v 250 ml Erlenmayerově baňce. Baňky byly inokulovány kouskem agaru (5 mm) s fytopatogenem Fusarium graminearum nebo mikroorganismem Pythium oligandrum Ml (dormantní oospory v suspenzním koncentrátu) o aplikační koncentraci 0,2 ml/L a objemu 0,2 ml ve variantách: 1) fytopatogen; 2) fytopatogen + Pythium oligandrum Ml; 3) pouze Pythium oligandrum Ml; 4) kontrolní vzorek, který nebyl inokulován. Baňky byly uzavřeny tenkou vrstvou buničiny a gázy. Kultivace probíhala v místnosti při teplotě 24°C. Byl sledován nárůst kolonie fytopatogenů a mikroorganismu Pythium oligandrum Ml a stav rostliny.
Výsledek tohoto laboratorního experimentuje představen na obr. 2. V případě přidání samotného fytopatogena je dobře patrný nejen jeho významný nárůst v okolí rostoucí pšenice, ale též poškození rostliny tímto patogenem (obr. 2A). Pokud byl kromě fýtopatogenní plísně přidán i mikroorganismus Pythium oligandrum Ml, nebyla přítomnost fytopatogena viditelná a docházelo k dobrému nárůstu pěstované rostliny (obr. 2B). Kontrolní experiment provedený pouze v přítomnosti mikroorganismu Pythium oligandrum Ml ukázal normální nárůst rostlinek pšenice, který byl srovnatelný s experimenty bez přidání jakéhokoliv mikroorganismu (obr. 2C).
Příklad 20
Test účinnosti biologického protiplísňového kapalného prostředku určeného k postřikům kulturních plodin podle příkladu provedení č. 2 ve skleníkovém pokuse na řepce Brassicanapus
Byly použity 4 sektory ve firemním skleníku v Úhercích s rostoucí řepkou Brassica napus var. Lohana Cl, přičemž aplikace byla zahájena ve stádiu BBCh 15-21. V prvém sektoru byl aplikován sypký biofůngicid s mykoparazitickým mikroorganismem Pythium oligandrum Ml (Pólyveršům®), ve druhém sektoru byl aplikován nový kapalný fungicid podle příkladu provedení 1 tohoto vynálezu, ve třetím sektoru nový kapalný protiplísňový přípravek podle příkladu provedení 2 tohoto vynálezu a v posledním čtvrtém sektoru byl aplikován nový kapalný protiplísňový prostředek podle příkladu provedení 4 tohoto vynálezu. Ve všech případech byla aplikační koncentrace 0,5 g/L popřípadě 0,5 ml/L s rozprášením 100 ml takto koncentrovaného přípravku na 1 m2 ošetřené plochy. V každém sektoru bylo označeno odběrové místo pro odběr vzorků zahrnujících rostlinu a půdu mezi řádky. Během každého odběru byly též prováděny fotodokumentace a odečet teploty ve skleníku v okamžiku odběru. Odebrané vzorky byly během hodiny přeneseny do laboratoře a uloženy v mrazničce při -20 °C až do okamžiku analýzy. Odběry byly provedeny před aplikací protiplísňových přípravků a poté 1 hodinu, 2 hodiny, 7 hodin, 20 hodin, 2 dny, 3 dny, 4 dny, 5 dnů, 6 dnů, 7 dnů, 8 dnů, 11 dnů, 14 dnů, 17 dnů a 20 dnů po aplikaci.
Laboratorní zpracování vzorků zahrnovalo fotodokumentaci jednotlivých rostlin, separaci listu a kořene, stanovení vlhké hmotnosti vzorku, homogenizaci vzorku v DNA extrakčním putru, centrifůgaci a provedení molekulárních analýz. Kvantitativní stanovení přítomnosti mikroorganismu Pythium oligandrum Ml bylo provedeno metodou qPCR se sondou cílenou na
-20CZ 2017 - 661 A3
ITS sekvence, kvantitativní stanovení DNA řepky bylo provedeno identickou metodou se sondou cílenou na Fal(A)A sekvenci. Kvantitativní stanovení zahrnovalo provedení 50 cyklů DNA amplifikace za standardních podmínek a výpočet koncentrace cílových sekvencí pomocí kalibrační křivky. Podobně byla též detekována úroveň plísňového zamoření na základě standardního protokolu.
Výsledky testu účinnosti jsou uvedeny v následující Tabulce 1. Účinnost dosahovaná pro nové kapalné protiplísňový přípravky podle tohoto vynálezu je ve všech případech srovnatelná nebo lepší než účinnost pevného sypkého přípravku. K potlačení cizorodých plísní vždy docházelo v závislosti na kolonizaci a amplifikaci mikroorganismu Pythium oligandrum Ml na místě aplikace. Nízká úroveň kontaminace plísněmi se poté udržela i po snížení koncentrace mikoorganismu Pythium oligandrum Ml na konci experimentu. Dynamika populace mikroorganismu Pythium oligandrum Ml byla sledována v tomto experimentu pouze po dobu 15 dní, a proto není možné komentovat dlouhodobé efekty. Nicméně z hlediska protiplísňové účinnosti přípravku je nepochybné, ze schopnost potlačit plísně je významná a dlouhodobá: došlo ke snížení výskytu těchto plísní zhruba o jeden řád za 24 hodin po aplikaci, a za dalších 24 hodin se jednalo také o snížení téměř o řád.
Tabulka 1 '«kkniiimě»* pvkuM;. Výšivky ges&má η» 5 hsMhdské D^.A Bpky : Scktař i
W |
ZTBUí??.;
if“........................:
............................ 1Í0B1 8.x
li— lIsysíB““...... ffUs
v.v.-.·.·. .......... . . . . . “fis“ 6 x
ii“....................f sfi“
klii ;·Β ur
U:
uf
U.f li™
f.x Uf
.............. r
4S* ,sS.SS:XX<:
1A·
6xuf ·· ··.;·· lili
Uf 'Ϊ v Uf
IB“.....t uf úl “3 t
.....í lif
356
A ifs......
ssf“...:::ÍÍl
Ur l!l!!
BA
Příklad 21
Test účinnosti biologického protiplísňového kapalného prostředku určeného k postřikům kulturních plodin podle příkladu provedení 1 v polním pokuse na pšenici Triticum aestivum
Ozimá pšenice Triticum aestivum byla vyseta v říjnu 2015 na firemním poli v blízkosti osady Úherce u Loun. V souladu s agrotechnickými normami a schválenou registrací pro protiplísňový přípravek pro rostlinnou ochranu Polyversum® byla v listopadu 2015 provedena na vyznačených drahách aplikace protiplísňovýho přípravku podle příkladu provedení 1 tohoto vynálezu standardní postřikovou metodou v množství 100 ml na 1 ha. Na 4 vyznačených odběrových
-21 CZ 2017 - 661 A3 místech byly prováděny odběry před aplikací a dále různý počet dní po aplikaci, odebírány byly rostoucí rostliny pšenice a dále půda v blízkosti odběru. Ihned po odběru byly vzorky zmraženy a uchovávány v uzavřených sáčcích nebo zkumavkách při -20 °C až do okamžiku analýzy. Nukleové kyseliny byly z odebraných vzorků extrahovány s využitím publikované metodiky (Klimeš R, Suchánek M, Mastalkova L a spol. /2016/ Comparison of the efficacy of treatment of dermatophytosis by Chemical and biological antifungals: soil peronosporomycete Pythium oligandrumis as efficient as the antifungal enilconazole in the guinea pig model. Vet Dermatol, v tisku) a použity pro molekulární analýzy).
Pokud jde o dynamiku výskytu mikroorganismu Pythium oligandrum Ml po postřiku kapalným přípravkem podle příkladu provedení 1, normalizované koncentrace na rostlinách a v okolní půdě sledovaly podobnou závislost. Zatímco před aplikací mohly být genetickým testem qPCR identifikovány jen jednotlivé buňky na g vzorku, po aplikaci kapalného preparátu odpovídajícího standardnímu normalizovanému množství se tento počet zvýšil na stovky buněk na g vzorku. Po 48 hodinách po aplikaci došlo k viditelnému namnožení mikroorganismu Pythium oligandrum Ml za daných experimentálních podmínek, přičemž tento pozitivní trend byl přerušen za podmínek konkrétního experimentu mrazovou episodou počátkem prosince 2015, po níž se již dynamický populační růst neobnovil (srovnej obr. 3A a obr. 3B).
Množství hodnotných informací bylo získáno analýzou genových expresních profilů metodou RT-qPCR prováděných ve „vrcholové“ fázi experimentu s největším nárůstem mikroorganismu Pythium oligandrum Ml. Hodnoty koncentrací transkriptů ukazovaly rychlou reakci na vyskytující se fungální patogeny v prvé fázi (výrazná exprese genu pro celulasu) následované zvýšeným výskytem zoospor (exprese endoglukanasy). Teprve po 48 h a 120 h je zvýšený charakteristický genový markér sporulace. a to zejména v okolní půdě a koření (obr. 3C). Zároveň bylo možné pozorovat významné snížení relativního obsahu plísní již 48 hodin po aplikaci (obr. 3D) a toto snížení recipročně korelovalo s expresí genu pro celulasu odpovědnou za degradaci povrchových sacharidů v plísních během mykoparasitického působení mikroorganismu Pythium oligandrum Ml (obr. 3E).
Příklad 22
Test účinnosti zubních past v modelu orálního biofilmu s mechanickým odstraňováním plaku.
Pro sledování účinnosti připravených zubních past byl proveden laboratorní test s použitím modelu orálního biofilmu s mechanickým odstraňováním plaku dle publikace Verkaik MJ a spol. [14] z roku 2010. Byla použita verze (B) výše publikovaného protokolu spočívající ve dvouhodinové adhezi s následným růstem přes noc (16-hodinový biofilm) a mechanickým čištěním. Účinnost glycerolové zubní pasty s mikroorganismem Pythium oligandrum Ml a zubní pasty s olivovým olejem a mikroorganismem Pythium oligandrum Ml při odstranění mikroorganismů zubního plaku byla srovnána se dvěma druhy běžně dostupných zubních past (Odol a Enzycal) a jako kontrola bylo použito pouze mechanické čištění zubním kartáčkem bez pasty (označeno Kontrola). V kontrolním experimentu byla použita identická pasta jednak bez obsahu Pythium oligandrum a jednak bez použitého abraziva oxidu křemičitého.
Výsledek tohoto testuje popsán na výsledkové tabuli v obrázku 4. Ten prokázal, že pasta podle příkladu provedení číslo 4 vykazovala významně vyšší účinnost při odstranění zubního biofilmu a plaku než alternativní používané přípravky, dokonce i u jedinců postižených paradentózou (obr. 4A až obr. 4D). Zatímco dosud běžně používané pasty snížily intenzitu tvorby biofilmů zhruba na polovinu, nové pasty podle tohoto vynálezu až na desetinu. U kontrolní pasty bez obsahu mikroorganismu Pythium oligandrum Ml byl její účinek srovnatelný s běžnými pastami, u kontrolní pasty bez oxidu křemičitého již byl účinek významně vyšší. U pacienta s periodonlálním onemocněním byla celková úroveň tvorby biofilmu významně vyšší a bylo možno i lépe pozorovat rozdíly v účinnosti jednotlivých past.
-22CZ 2017 - 661 A3
Příklad 23
Test účinnosti biologického protiplísňového kapalného prostředku podle příkladu provedení 1 na ochranu obytných prostor před sporami plísní
Protiplísňový přípravek podle příkladu provedení číslo 1 byl naředěn vodou na koncentraci 330 000 oospor na litr aplikačního roztoku, tj. bylo přidáno 0,66 ml kapalného koncentrátu na 1 litr roztoku. Dále byl připraven kontrolní roztok za identických podmínek avšak bez obsahu biomasy Pythium oligandrum Ml, biomasa byla nahrazena vodou. Takto připravené roztoky byly aplikovány ve dvou malých uzavřených místnostech v zemědělské usedlosti v Uhercích u Loun čp. 2 ve formě rozstřiku jemné mlhy rozprašovačem. Po aplikaci byly obě místnosti neprodyšně uzavřeny a byly prováděny spadové zkoušky na obsah spor metodou podle Omeljanského. Výsledky byly vyhodnoceny v laboratoři Dr. Miroslava Kolaříka v Mikrobiologickém ústavu AV ČR v Praze.
Výsledky experimentu jsou znázorněny v níže uvedené Tabulce 2. Experiment probíhal v uzavřených místnostech bez proudění vzduchu, proto jsou pozorované změny pomalejší a byly pozorovatelné až po několika měsících. Z výsledků je nicméně patrné, že v kontrolní místnosti 1 s aplikací pomocných látek zjištěné počty spor kolísaly, po celou dobu pozorování však nepoklesly pod limit WHO (Světové zdravotnické organizace) ve výši 500 spor na 1 m3 vzduchu. Naopak v místnosti 2 došlo po 3 měsících od aplikace ke statisticky významnému poklesu spor, který posléze poklesl pod limit WHO 6 měsíců od data provedení aplikace.
Tabulka 2
a * mkůmti 2 x aptíkw pHpmku s htkua
M&St&P pO ; .............................. ................................ |i i/i 'i/^:|;|
···· j
............................|| ................
l|PŮ| II A
......... A § IJW .............pil
Příklad 24
Způsob výroby biologického protiplísňového kapalného prostředku s Pythium oligandrum Ml
Detailní povaha biologického protiplísňového kapalného prostředku s Pyíhium oligandrum Ml podle tohoto vynálezu byla podrobně demonstrována na předchozích příkladech provedení.
Dále jsou uvedeny příklady způsobu výroby tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředku s Pythium oligandrum Ml podle tohoto vynálezu.
-23 CZ 2017 - 661 A3
K aerobní kultivaci oomycety Pythium oligandrum Ml v kapalné fázi se použije médium obsahující extrakt z obilovin, třtinovou melasu a další nezbytné živiny. Kapalné medium se sterilizuje v parním sterilizátoru. Po vychladnutí se zaočkuje jedním z vybraných kmenů Pythium oligandrum Ml. Po skončení kultivace, která trvá přibližně 13 dní, se biomasa sklidí a zpracuje, jak je uvedeno ve shora uvedených příkladech provedení.
Pro kultivaci mikroorganismu Pythium oligandrum Ml na pevném substrátu se připraví médium obsahující zrna obilnin, výhodně loupané obilky prosa, např. Panicům miliaceum L., které se smíchají s podílem živného kapalného média. Médium se v kultivačních nádobách sterilizuje v parním sterilizátoru. Po vychladnutí se médium naočkuje jedním z vybraných kmenů Pythium oligandrum Ml. Po skončení procesu kultivace, který trvá přibližně 8 dní, se sklizená biomasa dále zpracuje do formy suspenzního koncentrátu, jak je popsáno ve shora uvedených příkladech provedení.
Po ukončení kultivační fáze Pythium oligandrum Ml. v kapalné i pevné fázi se biomasa s kapalným médiem homogenizuje, např. průmyslovým mixérem tak, aby minimálně 95% částic v suspenzi byla v rozmezí 0,05 až 0,30 mm, s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm. Homogenní suspenze je následně charakterizována počtem oospor. Podle počtu oospor se suspenze standardizuje - zkoncentruje nebo zředí - na předem požadovanou koncentraci oospor vhodnou k přípravě daného biologického protiplísňového kapalného prostředku.
Po ukončení kultivační fáze Pythium oligandrum Ml na pevném substrátu se biomasa homogenizuje, s výhodou průmyslovým mixerém, v odpovídajícím objemu demineralizované vody tak, aby výsledná velikost minimálně 95 % částic v suspenzi byla v rozmezí 0,050 až 0,300 mm, s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm. Homogenní suspenze je následně charakterizována počtem oospor. Podle počtu oospor se získaná suspenze zkoncentruje nebo zředí na předem požadovanou koncentraci oospor vhodnou k přípravě daného biologického protiplísňového kapalného prostředku.
K zajištění maximální přípustné velikosti částic v daném rozmezí se po fázi homogenizace a koncentrování, případně naředění, suspenze separuje, např. filtruje.
V případě získání částic kolem 0,05 mm až 0,125 mm je vysoká pravděpodobnost získání koncentrované suspenze, respektive téměř čisté koncentrované suspenze oospor Pythium oligandrum Ml. Většina příkladných provedení shora uvedených měla velikost částic převážně 0,050 až 0,125 mm.
Vodná suspenze se při homogenizaci může stabilizovat přídavkem osmolytu a v kombinaci s uchováváním při teplotách nižších než 8 °C ji lze skladovat ve sterilních velkoobjemových nádobách.
-24CZ 2017 - 661 A3
V případě bezvodé suspenze mikroorganismu Pythium oligandrum Ml se po ukončení kultivační fáze na pevném substrátu nebo v kapalné fázi získaný materiál se homogenizuje, s výhodou průmyslovým mixérem tak, aby výsledná velikost minimálně 95 % částic v suspenzi byla 0,050 až 0,300 mm, s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm. Získaná, homogenní suspenze, charakterizována počtem oospor, se následně odstředí a odstředěný materiál se po odstranění supematantu doplní olejem, na předem požadovanou koncentraci oospor vhodnou k přípravě daného biologického protiplísňového kapalného prostředku. Následně se získaný materiál resuspenduje, např. průmyslovým mixérem.
Konkrétní neomezující možné způsoby výroby jsou uvedeny ve shora uvedených příkladech provedení.
Průmyslová využitelnost
Nový kapalný protiplísňový prostředek obsahující stabilizovanou suspenzi oospor je možno vyrábět ve značných objemech především proto, že u tohoto prostředku jsou jak fáze fermentační výroby, tak fáze formulační technicky dobře zvládnuté. Nový kapalný prostředek najde uplatnění ve všech oblastech, v nichž byly doposud aplikovány a používány jiné formy mikroskopické oomycety Pythium oligandrum, zejména tedy v biologické ochraně rostlin, pro ochranu budov a obydlí před plísněmi a popřípadě i pro potlačování plísní a kvasinek a při nastolení fýziologické rovnováhy mikroflóry při humánních a veterinárních aplikacích. Jako velmi inovativní je možno uvést použití jako ochranného postřiku rostlin s degradovatelným biopolymerem, který slouží nejen jako ochranný faktor, ale také jako postupně se uvolňující degradovatelná matrice „nosič“ oospor mikroorganismu Pythium oligandrum. Přípravek podle tohoto vynálezu je možno s výhodou použít k nátěru či nástřiku dřevěných konstrukcí, kdy dochází zároveň k účinné impregnaci dřeva olejovými komponentami přípravku. Přítomnost mikroorganismu zaručuje odolnost vůči plísním a houbových chorobám a „defektům“ dřeva. Jako zcela nové použití je pak možno uvést použití pro účinnou konzervaci vzduchotechnických zařízení, klimatizační a chladících jednotek. Pro snížení úrovně plísňové kontaminace v oblastech zasažených povodněmi, ve vysušovaných oblastech a v okolí rekultivovaných vodních ploch se jeví výhodné použití přípravku speciálně vyvinutého pro tyto účely.
Citovaná literatura
1. Gerbore J, Benhamou N. Vallance J, LeFloch G. Grizard D, Regnault-Roger C, Rey P (2014) Biological control of plant pathogens: advantages and limitations seen through the čase study of Pythium oligandrum, Environ Sci Pollut Res 21, 4847-4860.
2. Drechsler C (1943) Several species of Pythium peculiar in their sexual development. Phytopathology 33, 261-299.
3. Deacon JW (1976) Studies on Pythium oligandrum, an aggresive parasite of other fungi, Trans Brit MycolSoc 66, 383-391.
4. US 4,259,317, Veselý D, Hejdánek S, Preparation for the protection of emerging sugar beets against dumping-off, and method of its production.
5. US 4,574,083, Baker R, Lifshitz R, Isolates of Pythium species which are antagonistic to Pythium ultimum.
6. US, 5,961,971, Martin FN, Biocontrol ot tungal soilbome pathogens by Pythium oligandrum.
7. CZ 303 908 B6, BIOPREPARÁTY, spol. s r.o. (Suchánek M.). Use of fungal organism Pythium oligandrum
8. CN 10 2807 957A. Liu X. a spol, Method for increasing capsica output and promoting oospore germination.
9. US 2014/0 212 387A1, Luth P, Liquid preparation for biological plant protection, m
-25 CZ 2017 - 661 A3
10. McQuilken MP, Whipps JM, Cooke RC (1990) Oospores of the biocontrol agent Pythium oligandrum bulk-produced in liquid culture. Mycol Res 94. 613-616
11. McQuilken MP, Whipps JM. Cooke RC (1992) Effect of osmotic and matrix potential on growth and oospore germination of the biocontrol agent Pythium oligandrum Mycol Res 96, 588591.
12. Takenaka S, Ishikawa S (2013) Biocontrol of sugar beet seedlings and taproot diseases caused by Aphanomyces cochlioidesby - Pythium oligandrum treatments before transplanting. JapAgric Res Quart 47, 75-83.
13. Etxeberria A, Mendarte S, Larregla S. (2011) Determination of viability of Phytophthora capsici oospores with the tetrazolium bromide staining test versus a plasmolysis method. Rev Iberoam Micol. 28, 43-49.
14. Verkaik MJ a spol. (2010) Oral biolilm models for mechanical plaque removal. Clin Oral Invest 14:403-409.
15. Wright D (2004) Use of sugars in cryopreserving human oocytes. Reprod Bio Med Online 9, 179-186.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (16)

1. Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum, vyznačující se tím, že zahrnuje stabilizovanou suspenzi mikroorganismu Pythium oligandrum, a obsahuje
0,05 až 10,0 % hmotn. kultivační biomasy mikroorganismu Pythium oligandrum s obsahem kultivačního média, buněčných forem tohoto mikroorganismu a látek produkovaných tímto mikroorganismem a
90,0 až 99,95 % hmotn. stabilizátoru, přičemž v 1 ml tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředku je, po běžné standardizaci, předem požadovaný počet dormantních oospor v rozsahu 1 x 103 až 2 x 107.
2. Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum, vyznačující se tím, že zahrnuje stabilizovanou suspenzi mikroorganismu Pythium oligandrum, a obsahuje 0,05 až 10,0 % hmotn. kultivační biomasy mikroorganismu Pythium oligandrum s obsahem kultivačního média, buněčných forem tohoto mikroorganismu a látek produkovaných tímto mikroorganismem, 79,77 až 99,95 % hmotn. stabilizátoru, a zbytek do 100 % hmotn. nejméně jedné modifikující/aplikační látky ze skupiny, zahrnující plnidlo, aroma, vitamin E. přičemž v 1 ml tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředku je. po běžné standardizaci, předem požadovaný počet dormantních oospor v rozsahu 2,5 x 104 až 1,0 x 106.
3. Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že mikroorganismem Pythium oligandrum je kmen Pythium oligandrum Drechsler ATTC 38472, který byl deponován v České sbírce mikroorganizmů (CCM) Masarykova Univerzita v Brně pod označením Pythium oligandrum Ml.
4. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že stabilizátor obsahuje alespoň jednu komponentu ze skupiny, zahrnující vodu, solný roztok, olej nebo roztoky osmolytů.
5. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že stabilizátorem je voda v rozmezí 30,0 až 99,9 % hmotn.
6. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že
-26CZ 2017 - 661 A3 stabilizátorem je solný roztok v množství 99,9 % hmotn.
7. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 4. vyznačující se tím, že stabilizátorem je osmolyt ve formě sacharózy v rozmezí 60,0 až 64,95 % hmotn.
8. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že stabilizátorem je alespoň jeden olej vybraný ze skupiny zahrnující parafinový olej, minerální olej, glycerol, slunečnicový olej v množství 79,77 až 99,9 % hmotn.
9. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že dále obsahuje 16,0 % hmotn. postupné se uvolňující biodegradovatelné matrice jakožto nosiče oospor mikroorganismu Pythium oligandrum. jako je polyvinylalkohol.
10. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 2 nebo 3 vyznačující se tím, že dále obsahuje v množství 16,0 % hmotn. plnidlo na bázi oxidu křemičitého.
11. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že dále obsahuje aplikační/modifikující látky, a to 0,96 % hmotn. šalvějového nebo mátového aroma a 0,4 % hmotn. vitaminu E.
12. Způsob výroby biologického protiplísňového kapalného prostředku s mikroorganismem Pythium oligandrum zahrnující stabilizovanou suspenzi mikroorganismu Pythium oligandrum podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že
a) k aerobní kultivaci oomycety Pythium oligandrum v kapalné fázi se použije kapalné médium obsahující extrakt z obilovin, třtinovou melasu a další nezbytné živiny.
b) kapalné medium se sterilizuje,
c) po vychladnutí se zaočkuje jedním z vybraných kmenů Pythium oligandrum
d) po skončení kultivace se biomasa sklidí a zpracuje,
e) následně po ukončení kultivační fáze Pythium oligandrum v kapalné fázi se biomasa s kapalným médiem homogenizuje, aby minimálně 95% částic v suspenzi byla v rozmezí 0,050 až 0,300 mm, s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm.
f) získaná homogenní suspenze charakterizovaná počtem oospor se podle počtu oospor následně standardizuje - zkoncentruje nebo zředí - na předem požadovanou koncentraci oospor daného biologického protiplísňového kapalného prostředku.
13. Způsob výroby biologického protiplísňového kapalného prostředku s mikroorganismem Pythium oligandrum, zahrnující stabilizovanou suspenzi mikroorganismu Pythium podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že
g) pro kultivaci mikroorganismu Pythium oligandrum na pevném substrátu se připraví médium obsahující zrna obilnin, výhodně loupané obilky prosa, např. Panicům miliaceum které se smíchají s podílem živného kapalného média,
h) médium se v kultivačních nádobách sterilizuje,
i) po vychladnutí se médium naočkuje jedním z vybraných kmenů Pythium oligandrum,
j) po skončení procesu kultivace se sklizená biomasa dále zpracuje do formy suspenzního koncentrátu,
k) po ukončení kultivační fáze Pythium oligandrum na pevném substrátu se biomasa homogenizuje, v odpovídajícím objemu demineralizované vody tak, aby výsledná velikost minimálně 95 % částic v suspenzi byla v rozmezí 0,050 až 0,300 mm, s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm,
l) získaná homogenní suspenze charakterizována počtem oospor se podle počtu oospor standardizuje - zkoncentruje nebo zředí - na předem požadovanou koncentraci oospor vhodnou k přípravě daného biologického protiplísňového kapalného prostředku.
-27 CZ 2017 - 661 A3
14. Způsob výroby biologického protiplísňového kapalného prostředku s mikroorganismem Pythium oligandrum podle některého z nároků 12 nebo 13, vyznačující se tím, že
m) pro bezvodou suspenzi mikroorganismu Pythium oligandrum se po ukončení kultivační fáze na pevném substrátu nebo v kapalné fázi získaný materiál se homogenizuje aby výsledná velikost minimálně 95 % částic v suspenzi byla 0,050 až 0,300 mm s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm,
n) získaná homogenní suspenze, charakterizovaná počtem oospor, se následně odstředí o a odstředěný materiál se po odstranění supematantu doplní olejem na předem požadovanou koncentraci oospor vhodnou k přípravě daného biologického protiplísňového kapalného prostředku,
p) následně se získaný materiál resuspenduje.
15. Způsob výroby biologického protiplísňového kapalného prostředku s mikroorganismem Pythium oligandrum podle některého z nároků 12 až 14, vyznačující se tím, že k zajištění maximální přípustné velikosti částic mikroorganizmu Pythium oligandrum v daném rozmezí 0,050 až 0,300 mm, s výhodou 0,050 až 0,125 mm, po homogenizaci a standardizaci zkoncentrování nebo naředění - se suspenze separuje např. filtruje na předem danou velikost částic.
16. Způsob výroby podle některého z nároků 12 až 15, vyznačující se tím, že vodná suspenze se při homogenizaci stabilizuje přídavkem osmolytu a v kombinaci s uchováváním při teplotách nižších než 8 °C se skladuje ve sterilních velkoobjemových nádobách.
CZ2017-661A 2016-10-14 2017-10-16 Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby CZ308399B6 (cs)

Priority Applications (23)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PE2019000819A PE20191317A1 (es) 2016-10-14 2017-10-16 Producto biologico liquido antifungico que contiene el microorganismo pythium oligandrum y metodo de produccion
PCT/CZ2017/000064 WO2018068774A2 (en) 2016-10-14 2017-10-16 Biological antifugal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production
US16/326,032 US20210386073A1 (en) 2016-10-14 2017-10-16 Biological antifugal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production
MX2019001363A MX2019001363A (es) 2016-10-14 2017-10-16 Producto biologico liquido antifungico que contiene el microorganismo pythium oligandrum y metodo de produccion.
JP2019517801A JP2019530455A (ja) 2016-10-14 2017-10-16 微生物ピシウム・オリガンドラムを含む生物学的抗真菌液体製品及び製造方法
UAA201905120A UA127216C2 (uk) 2016-10-14 2017-10-16 Рідкий біологічний протигрибковий препарат, що містить мікроорганізм pythium oligandrum, та спосіб його отримання
KR1020197013191A KR20190082780A (ko) 2016-10-14 2017-10-16 피씨움 올리간드럼을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물 및 제조 방법
CA3040613A CA3040613A1 (en) 2016-10-14 2017-10-16 Liquid biological antifungal product containing the pythium oligandrum microorganism and method of production
CR20190231A CR20190231A (es) 2016-10-14 2017-10-16 Producto biologico liquido antungico que contiene el microorganismo pythium oligandrum y metodo de producción
EA201990201A EA201990201A1 (ru) 2017-10-16 2017-10-16 Жидкий биологический противогрибковый препарат, содержащий микроорганизм pythium oligandrum, и способ его получения
CN201780052778.9A CN110072392A (zh) 2016-10-14 2017-10-16 含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品和制备方法
EP17809170.8A EP3525592A2 (en) 2016-10-14 2017-10-16 Biological antifungal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production
AU2017344214A AU2017344214A1 (en) 2016-10-14 2017-10-16 Biological antifugal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production
CZ2017-661A CZ308399B6 (cs) 2017-10-16 2017-10-16 Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby
TNP/2019/000120A TN2019000120A1 (en) 2016-10-14 2017-10-16 Biological antifugal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production
KR1020247001302A KR20240017085A (ko) 2016-10-14 2017-10-16 피씨움 올리간드럼을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물 및 제조 방법
BR112019007376A BR112019007376B1 (pt) 2016-10-14 2017-10-16 Produto antifúngico biológico líquido, e, método de produção do produto antifúngico biológico líquido.
ZA2019/02252A ZA201902252B (en) 2016-10-14 2019-04-10 Biological antifungal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production
PH12019500797A PH12019500797A1 (en) 2016-10-14 2019-04-12 Biological antifugal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production
CL2019001006A CL2019001006A1 (es) 2016-10-14 2019-04-12 Producto biológico líquido antifúngico que contiene el microorganismo pythium oligandrum y método de producción.
IL265999A IL265999B (en) 2016-10-14 2019-04-12 Liquid antifungal biological preparation including Pythium oligandrum microorganism and production method
CONC2019/0004381A CO2019004381A2 (es) 2016-10-14 2019-04-29 Producto biológico líquido antifúngico que contiene el microorganismo pythium oligandrum y método de producción
AU2022204145A AU2022204145A1 (en) 2016-10-14 2022-06-14 Biological antifungal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2017-661A CZ308399B6 (cs) 2017-10-16 2017-10-16 Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2017661A3 true CZ2017661A3 (cs) 2019-05-09
CZ308399B6 CZ308399B6 (cs) 2020-07-29

Family

ID=66344449

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2017-661A CZ308399B6 (cs) 2016-10-14 2017-10-16 Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ308399B6 (cs)
EA (1) EA201990201A1 (cs)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5469334B2 (ja) * 2008-12-19 2014-04-16 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 植物病害防除剤
CZ2009724A3 (cs) * 2009-11-04 2011-02-09 Bio Agens Research And Development - Bard, S.R.O. Protiplísnová smes s houbovým organismem Pythium oligandrum
CZ303908B6 (cs) * 2009-11-27 2013-06-19 BIOPREPARÁTY, spol. s r.o. Pouzití houbového organismu Pythium oligandrum

Also Published As

Publication number Publication date
CZ308399B6 (cs) 2020-07-29
EA201990201A1 (ru) 2019-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111254086B (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在生防中的应用
US7579183B1 (en) Saprophytic yeast, Pichia anomala
Anderson et al. Comparative growth kinetics and virulence of four different isolates of entomopathogenic fungi in the house fly (Musca domestica L.)
AU2022204145A1 (en) Biological antifungal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production
CN1069391A (zh) 控制既成的植物病害的脂肪酸组合物
Moore et al. Effects of rehydration on the conidial viability of Metarhizium flavoviride mycopesticide formulations
Lahlali et al. Control of citrus blue mold by the antagonist yeast Pichia guilliermondii Z1: Compatibility with commercial fruit waxes and putative mechanisms of action
CA2867076C (en) A formulation comprising a particulate calcium silicate and clonostachys rosea for treating plants
Guijarro et al. Effects of different biological formulations of Penicillium frequentans on brown rot of peaches
EP1990404A1 (fr) Souche de trichoderma atroviride, procédé d&#39;isolement d&#39;une telle souche, procédé d&#39;obtention d&#39;un produit à base d&#39;une telle souche et utilisation d&#39;une telle souche
FR3097557A1 (fr) Nouvel agent de biocontrole et son utilisation pour la lutte contre des maladies fongiques de plantes
CN109673672B (zh) 一种杂色曲霉hy12菌株的应用
CN107258823A (zh) 一种防治蛴螬的白僵菌颗粒剂制备方法及其应用
CZ2017661A3 (cs) Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby
Boff et al. Biocontrol of grey mould by Ulocladium atrum applied at different flower and fruit stages of strawberry
WO2021030195A2 (en) Microbial compositions for use with plants for the prevention or reduction of fungal pathogens
EA042498B1 (ru) Жидкий биологический противогрибковый препарат, содержащий микроорганизм pythium oligandrum, и способ его получения
Tongsri et al. Yeast metabolites inhibit banana anthracnose fungus Colletotrichum musae
KR102670639B1 (ko) 뿌리응애 방제능을 가지는 메타리지움 아니소플리애 432 균주 및 이의 용도
EP1884160A1 (en) Biopesticide compositions comprising fungal spores pathogenic for ticks, tween, and paraffin oil
JP2021108580A (ja) 卵菌類の卵胞子形成のためのアルカリ培養法
Shure et al. Inhibition of fungal infection using sulfite pads prior to initiation of callus from Vitis labruscana cv. Concord
CN115806880A (zh) 一种白僵菌及其分离和筛选方法和在防治枳壳虫害上的应用
CN111903684A (zh) 对氨基苯甲酸的应用
CN114214262A (zh) 一种增强杀虫效力和抗非生物逆境能力的生防真菌孢子培养方法