CZ308399B6 - Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby - Google Patents
Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308399B6 CZ308399B6 CZ2017-661A CZ2017661A CZ308399B6 CZ 308399 B6 CZ308399 B6 CZ 308399B6 CZ 2017661 A CZ2017661 A CZ 2017661A CZ 308399 B6 CZ308399 B6 CZ 308399B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pythium oligandrum
- suspension
- weight
- oospores
- liquid composition
- Prior art date
Links
- 241000131360 Pythium oligandrum Species 0.000 title claims abstract description 99
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 title claims abstract description 74
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 title claims abstract description 71
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 title 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 108
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 83
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 83
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 82
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 68
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 57
- 230000000065 osmolyte Effects 0.000 claims abstract description 44
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 44
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 31
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 31
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 31
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 23
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 18
- 241000233639 Pythium Species 0.000 claims description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 14
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 14
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 11
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 9
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 9
- 239000004546 suspension concentrate Substances 0.000 claims description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 claims description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 7
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 6
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 claims description 5
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 claims description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 5
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims description 5
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 claims description 5
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 claims description 5
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 claims description 5
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 claims description 5
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 claims description 3
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims description 3
- 239000004464 cereal grain Substances 0.000 claims description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 claims description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 claims 1
- 239000005830 Pythium oligandrum M1 Substances 0.000 description 53
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 40
- 239000000047 product Substances 0.000 description 32
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 23
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 21
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 19
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 18
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 17
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 14
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 13
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 13
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 12
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 12
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 11
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 10
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 8
- 239000012871 anti-fungal composition Substances 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 6
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 5
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 5
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 5
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 5
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 5
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 5
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 5
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 5
- 241000264877 Hippospongia communis Species 0.000 description 4
- 238000004378 air conditioning Methods 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 4
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 4
- 229940034610 toothpaste Drugs 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 3
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 3
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 3
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 3
- ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N d-alpha-Tocopheryl acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 239000004476 plant protection product Substances 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 3
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 3
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 2
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 2
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 2
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 2
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 2
- 241000233614 Phytophthora Species 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N alpha-maltohexaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N 0.000 description 2
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 description 2
- DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N malto-hexaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005554 pickling Methods 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KNBVLVBOKWRYEP-XYLDXDTCSA-N (2r,3s,4r,5r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-(hydroxymethyl)-3,4,5-tris[[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy]oxan-2-yl]oxy-3,4,5,6-tetrakis[[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy]hexanal Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@H]([C@@H](O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@H](O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H](O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=O)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 KNBVLVBOKWRYEP-XYLDXDTCSA-N 0.000 description 1
- PZBPKYOVPCNPJY-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(allyloxy)-2-(2,4-dichlorophenyl)ethyl]imidazole Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1C(OCC=C)CN1C=NC=C1 PZBPKYOVPCNPJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001519451 Abramis brama Species 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 101150071146 COX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150086475 COXII gene Proteins 0.000 description 1
- 101100232709 Caenorhabditis elegans iff-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 1
- 102100027456 Cytochrome c oxidase subunit 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010012504 Dermatophytosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006424 Flood reaction Methods 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 239000005795 Imazalil Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 101150021539 MT-CO2 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 241001460074 Microsporum distortum Species 0.000 description 1
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001646398 Pseudomonas chlororaphis Species 0.000 description 1
- 241000596168 Robbauera albescens Species 0.000 description 1
- 241000231739 Rutilus rutilus Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N Stachyose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]2[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O2)O1 UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000002474 Tinea Diseases 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N UNPD130147 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(OC4C(OC(O)C(O)C4O)CO)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000003 effect on germination Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001523 electrospinning Methods 0.000 description 1
- 239000005712 elicitor Substances 0.000 description 1
- 229960002125 enilconazole Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000011554 guinea pig model Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003501 hydroponics Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- FJCUPROCOFFUSR-UHFFFAOYSA-N malto-pentaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 FJCUPROCOFFUSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RJQKKZNUWRIHCS-VBNQBVOGSA-N maltodecaose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@@H](O[C@@H](O[C@H]4[C@@H](O[C@@H](O[C@H]5[C@@H](O[C@@H](O[C@@H]6[C@H](O[C@H](O[C@@H]7[C@H](O[C@H](O[C@@H]8[C@H](O[C@H](O[C@@H]9[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]9O)CO)[C@H](O)[C@H]8O)CO)[C@H](O)[C@H]7O)CO)[C@H](O)[C@H]6O)CO)[C@@H](O)[C@@H]5O)CO)[C@@H](O)[C@@H]4O)CO)[C@@H](O)[C@@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@@H]2O)CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RJQKKZNUWRIHCS-VBNQBVOGSA-N 0.000 description 1
- RUJILUJOOCOSRO-WJMYNTJYSA-N maltooctaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O[C@@H]6[C@H](O[C@H](O[C@@H]7[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]7O)CO)[C@H](O)[C@H]6O)CO)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O RUJILUJOOCOSRO-WJMYNTJYSA-N 0.000 description 1
- FJCUPROCOFFUSR-GMMZZHHDSA-N maltopentaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 FJCUPROCOFFUSR-GMMZZHHDSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000008368 mint flavor Substances 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N stachyose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)O2)O)O1 UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 1
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000010463 virgin olive oil Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
- A01N25/22—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing ingredients stabilising the active ingredients
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Botany (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem, zahrnující stabilizovanou suspenzi mikroorganismu, který obsahuje 0,05 až 10,0 % hmotn. kultivační biomasy mikroorganismus obsahem kultivačního média, buněčných forem tohoto mikroorganismu a látek produkovaných tímto mikroorganismem; a 90,0 až 99,95 % hmotn. stabilizátoru, kterým je alespoň jedna komponenta ze skupiny, zahrnující vodu, solný roztok, olej, roztoky osmolytů a glycerol, přičemž v 1 ml tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředku je, po běžné standardizaci, předem požadovaný počet dormantních oospor v rozsahu 1 x 10až 2 x 10. Je nárokován způsob výroby tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředku.
Description
Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby
Oblast techniky
Vynález se týká biologického protiplísňového kapalného prostředku s mikroorganismem Pythium oligandrum s dlouhodobou stabilitou v řádu měsíců. Vynález se též týká způsobu výroby tohoto přípravku.
Dosavadní stav techniky
Chemické protiplísňové prostředky vzbuzují v posledních desetiletích vzrůstající obavy z hlediska negativního vlivu na životní prostředí i na samotného spotřebitele. Nicméně je možné konstatovat, že jejich nahrazení účinnými biologickými prostředky založenými na mikrobech schopných likvidovat plísně cíleným a šetrným způsobem zatím neproběhlo v žádoucím rozsahu. V zemích EU je pro tento účel nyní registrováno pouze 14 mikrobiálních druhů i přes velmi intenzivně probíhající výzkum, jak zdůrazňuje nedávný přehledný článek Gerbore a spol. z roku 2014 [1],
Praktická aplikace biologického prostředku využívajícího protiplísňové účinky mikroorganismu Pythium oligandrum je známá již od 70. let minulého století s odkazem na klasické práce Dreschslera [2] z r. 1943 a Deacona [3] z r. 1976 věnované biologii tohoto mikroorganismu a popisující jeho mykoparazitické vlastnosti. Z tohoto období pochází mj. patent US 4259317 [4] dvojice autorů Veselý a Hejdánek s prioritním datem 5. 7. 1978, věnovaný suchým práškovým přípravkům s obsahem oospor Pythium oligandrum Drechsler pro ochranu před plísňovými chorobami vzcházejících výhonků řepy cukrové s obsahem oospor nejméně 1 milion oospor na g přípravku, přičemž jako optimální rozsah je uváděno množství mezi 50 až 500 miliony oospor na g přípravku. Autoři tohoto vynálezu připouštějí jako použitelnou alternativu k suchým práškovým přípravkům i kapalné suspenze oospor, pro jimi připravenou aplikační formu však uvádějí řadu nevýhod, zejména nestabilitu takových přípravků limitující jejich praktickou použitelnost na cca 2 týdny. Po delší době dochází k nepřijatelnému snížení vzcházivosti oospor, která je nezbytná pro uplatnění mykoparazitického mechanismu ochrany, v důsledku autolýzy nebo kontaminace hyperparazity. Pokud jde o zdroje jednotlivých kmenů Pythium oligandrum, upozornili autoři Baker a Eifshitz ve svém patentu US 4574083 [5] na možnost získám regionálně vhodných kmenů izolací z půdy podle standardní publikované metodiky. Tento postup se mezitím osvědčil a ve veřejných sbírkách tak jsou k dispozici kmeny z různých geografických lokalit. Pro identifikaci izolátů byla v té době aplikována převážně biologická kritéria: rychlost růstu, optimální teplota růstu - bývá kolem 30 °C, a morfologie jednotlivých reprodukčních forem sexuálního i asexuálního cyklu. Z tohoto pohledu je jako průlomový možno označit následný patent, v němž vynálezce Martin US 5961971 [6] zavádí molekulární charakterizaci jednotlivých izolátů na základě přesného sekvenčního protokolu kritických genů. V témže patentovém dokumentu jsou detailně uváděny též jednotlivé formulace a způsoby aplikace mikroorganismu Pythium oligandrum v polních podmínkách, přičemž jako preferované formulace jsou zmiňovány jednak kapalná formulace po nárůstu na levných médiích založených na průmyslových odpadních surovinách a jednak prášková formulace připravená enkapsulací biomasy vysušené po fermentaci do alginátů nebo ve formě vysušeného a rozemletého produktu. Mezi dalšími možnými formulacemi je ještě uváděna formulace ve formě smáčitelných prášků, běžných prášků, emulgovaných olejů a granulí. Patent CZ 303908 a korespondující EP 2503892 [7] společnosti BIOPREPARATY, spol. s.r.o. z roku 2009 je zaměřený na posklizňovou ochranu plodin s použitím mikroorganismu Pythium oligandrum. Nq své technologické části se zaměřuje na kultivaci tohoto mikroorganismu v běžných fermentorech na kapalných médiích s obsahem obilovin bez přídavku dalších výživných látek. Akcentována je možnost získání čistého koncentrátu oospor bez přítomnosti vyčerpaného média nebo zbytků mycelia, které jsou odstraněny během sušení ve sprejové sušárně v pozdních fázích výrobního procesu. V omezené
- 1 CZ 308399 B6 míře byly publikovány poznatky s přípravou oospor jiných organismů než Pythium oligandrum. V patentové přihlášce CN 102807957 A [8] Liu X. a spol. z roku 2012 je popsána příprava vzcházejících oospor mikroorganismu Phytophthora capsid pro sledování rezistence vůči různým léčivům a pro genetický výzkum. Kapalné přípravky pro biologickou ochranu rostlin jsou uváděny v patentové přihlášce US 2014/0212387 [9] Uůth z roku 2014, přičemž se však jedná výlučně o kapalné prostředky s využitím poly ethoxy modifikovaných trisiloxanů jako solventů.
Příprava a stabilizace oospor a jiných reprodukčních forem mikroskopické řasovky Pythium oligandrum je dále diskutována do určité míry v nepatentové literatuře. McQuilken a spol. [10] publikoval v roce 1990 jednoduchou a reprodukovatelnou metodu přípravy oospor v kapalné kultuře s použitím melasy jako ekonomicky nenáročného substrátu. Otázka ideálního způsobu uchování připravených oospor není však v patentové ani nepatentové literatuře uspokojivě vyřešena. McQuilken a spol. [11] z roku 1992 sledovali vliv různých osmotik jako je glycerol, NaCl a KC1 na rychlost radiální extenze hyf a vzcházivost oospor řasovky Pythium oligandrum srovnáním s osmotickým tlakem představovaným extraktem půdy ve výši -0,5 MPa. Přídavek osmolytů snižoval rychlost radiální extenze, ale neměl vliv na vzcházivost až do hodnoty cca 2,0 MPa. Autoři uzavírají, že lze předpokládat dobrou účinnost aplikovaných oospor za běžně se vyskytujících osmotických podmínek v místech aplikace za předpokladu, že jsou též splněny podmínky z hlediska optimální teploty, zpravidla 30 °C, a kyselosti pH 6,0 až 7,5. Z hlediska skladovatelnosti získaných oospor je zmiňována autory Takenaka a Ishikawa [12] z roku 2013 jejich vysoká účinnost po dobu až 379 dní při uchování běžně připravené suspenze v destilované vodě v lednici při 4 °C.
Jako hlavní překážka pro větší rozšíření biologických ochranných prostředků je odborníky jasně uváděna zejména závislost účinnosti na konkrétních podmínkách aplikace a praktické problémy s udržováním a přípravou biologických přípravků na ochranu rostlin v každodenní zemědělské praxi. Proto je vyřešení praktických problémů spojených s jednoduchým a účinným skladováním a aplikaci oospor Pythium oligandrum pro obchodní úspěch biologických přípravků kritické. Pro vyřešení tohoto problému by bylo žádoucí vyvinout prostředky biologické ochrany v kapalném stavu s vysokou dlouhodobou stabilitou i za podmínek běžného skladování. Dosud publikovaná řešení však trpí řadou nevýhod, které se nepodařilo ani po letech intenzivního úsilí odstranit. Většina postupů laboratorní přípravy biologických přípravků na ochranu rostlin je složitá a zvládnutelná jen v laboratorním měřítku, což silně omezuje použití těchto postupů pro průmyslovou výrobu. Dosud preferovaný způsob aplikace ve formě smáčitelných prášků, který byl uplatněn u celosvětově prodávaných přípravků produkovaných českou biotechnologickou firmou Biopreparáty, spol s.r.o. (Polyversum®, Polygandron, BIOREPEU®), není bez komplikací z pohledu cílení ochranného zásahu i ochrany uživatelů. Doposud nebyl publikován jednoduchý, dobře vyzkoušený a konzistentně definovaný postup vhodný pro formulaci s dostatečnou skladovatelnosti připravených reprodukčních forem mikroorganismu Pythium oligandrum, zejména oospor, v jednoduché a průmyslově snadno využitelné podobě.
Podstata vynálezu
Uvedené nevýhody dosud uplatňovaných řešení protiplísňových biologických přípravků se odstraní nebo omezí podle tohoto vynálezu, jehož podstatou je biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum podle nezávislého nároku 1, zahrnující stabilizovanou suspenzi Pythium oligandrum, který obsahuje: 0,05 až 10,0 % hmoto, kultivační biomasy mikroorganismu Pythium oligandrum s obsahem kultivačního média, buněčných forem tohoto mikroorganismu a látek produkovaných tímto mikroorganismem; a 90,0 až 99,95 % hmota, stabilizátoru, kterým je alespoň jedna komponenta ze skupiny, zahrnující vodu, solný roztok, olej, roztoky osmolytů a glycerol; přičemž v 1 ml tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředkuje, po běžné standardizaci, předem požadovaný počet dormantních oospor v rozsahu 1 x 103 až 2 x 107.
-2CZ 308399 B6
Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythíum olígandrum, podle tohoto vynálezu také zahrnuje stabilizovanou suspenzi mikroorganismu Pythium olígandrum, která obsahuje: 0,05 až 10,0 % hmota, kultivační biomasy mikroorganismu Pythium olígandrum s obsahem kultivačního média, buněčných forem tohoto mikroorganismu a látek produkovaných tímto mikroorganismem, 79,77 až 99,95 % hmota, stabilizátoru, kterým je alespoň jedna komponenta ze skupiny, zahrnující vodu, solný roztok, olej, roztoky osmolytů a glycerol; a případně zbytek do 100 % hmota, nejméně jedné běžné modifikující/aplikační látky ze skupiny, zahrnující plnidlo, aroma, vitamin E; přičemž v 1 ml tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředkuje, po běžné standardizaci, předem požadovaný počet dormantních oospor v rozsahu 2,5 x 104 až 1,0 x 106.
S výhodou je mikroorganismem Pythium olígandrum kmen Pythium olígandrum Drechsler ATTC 38472, který byl deponován v České sbírce mikroorganizmů (CCM) Masarykova Univerzita v Brně pod označením Pythium olígandrum Ml.
Hlavní výhodou tohoto vynálezu je získání nového biologického protiplísňového kapalného prostředku, vhodného pro dlouhodobé použití, a dosažení jeho dlouhodobého a významného stabilizačního účinku, přičemž použité stabilizátory jsou cenově dostupné a poskytují další výhodu při ochraně obsažené biomasy mikroorganismu Pythium olígandrum před mikrobiální kontaminací. Nárokovaný obsah dormantních buněk výše uvedeného mikroorganismu ve formě oospor poskytuje prakticky vyzkoušený a ekonomicky výhodný rozsah, umožňující snadné dávkování pro široký rozsah potřebných aplikací. Mohou se použít různé druhy biomasy, které se zpracují vhodnou přípravou. Nižší koncentrace dormantních oospor, např. v počtu desítek nebo stovek dormantních oospor přináší též výsledky, ale účinnost tohoto prostředkuje nižší. Předem stanovený počet dormantních oospor se může upravovat v případě potřeby běžnou standardizací, tj. zředěním, nebo koncentrováním na požadovanou hodnotu.
Je výhodné, když stabilizátor obsahuje alespoň jednu komponentu ze skupiny, zahrnující vodu, solný roztok, oleje nebo roztoky osmolytů, což mohou být roztoky polyolů, typu sacharidů nebo sacharidových alkoholů nebo roztoky solí. Roztoky polyolů mohou být vybrány ze skupiny, zahrnující metabolizovatelné nebo nemetabolizovatelné roztoky různých oligosacharidů, obsahujících maximálně 10 sacharidových jednotek a minimálně 2 sacharidové jednotky, jako je maltodekaosa nebo maltononaosa nebo maltooktaosa nebo maltoheptaosa nebo maltohexaosa nebo maltopentaosa nebo stachyosa nebo rafmosa nebo sacharóza nebo sukralosa, popřípadě mohou být použité sacharidy větvené.
Ve výhodném provedení je stabilizátorem voda v množství např. 30,0, až 99,9 % hmota., nebo solný roztok v množství např. 99,9 % hmota., nebo osmolyt ve formě sacharózy v množství např. 60,0 až 64,95 % hmota., nebo alespoň jeden olej vybraný ze skupiny zahrnující parafínový olej, minerální olej, slunečnicový olej v množství např. 79,77 až 99,9 % hmota.
Biologický protiplísňový kapalný prostředek může obsahovat další modifikující nebo aplikační látky pro dané specifické použití jako např. postupně se uvolňující biodegradovatelnou matrici jakožto nosič oospor mikroorganismu Pythium olígandrum, jako je polyvinylalkohol, v množství např. 16,0 % hmota.; nebo plnidlo na bázi oxidu křemičitého, v množství např. 16,0 % hmota.; případně další aplikační/modifíkující látky, jako je šalvějové nebo mátové aroma, v množství např. 0,96 % hmota., nebo vitamin E v množství např. 0,4 % hmota.
Použití těchto aplikačních/modifíkujících látek se odvíjí podle aplikací biologického protiplísňového prostředku.
Tudíž, stabilizovaná suspenze oospor mikroorganismu Pythium olígandrum může využít široký rozsah stabilizujících činidel hydrofílní i hydrofobní povahy jako je obyčejná voda nebo olej nebo roztoky různých cenově nenáročných osmolytů.
-3 CZ 308399 B6
Osmolyty je možné jejich chemickou povahou ideálně přizpůsobit na míru potřebným aplikacím, neboť se ukázalo, že osmolyty mohou být jak iontové povahy, jako jsou roztoky různých solí, tak i neiontové povahy, jako jsou roztoky polyolů. Skutečnost, že polyoly mohou být představovány například metabolizovatelnými nebo nemetabolizovatelnými roztoky různých definovaných oligosacharidů, je pro řadu aplikací výhodná, protože mohou být k tomuto účelu použity směsi vhodných přírodních stejně jako syntetických látek požadovaných vlastností. S výhodou mohou přitom být použity i běžně dostupné látka jako je sacharóza, ale pokud je to vyžadováno, mohou být použity i běžně dostupná nemetabolizovatelná analoga. Kompozice kapalných suspenzí je kompatibilní s širokou škálou dalších látek modifikujících jejich užitné vlastnosti nebo jejich aplikaci ve formě protioxidačních látek, přirozených aktivátorů a vitamínů, jako je například oxid křemičitý jakožto plnidlo, vitamin E acetát a jiné látky.
Překvapivě bylo zjištěno, že pokud je buněčný podíl vzniklý pevnou nebo kapalnou kultivací po skončení přípravy přímo upraven do formy suspenze, suspenze reprodukční formy mikroorganismu Pythium oligandrum si uchovají v takové teplotě. Tento výsledek přitom vystupuje do popředí o to více, pokud zvážíme nereprodukovatené a variabilní výsledky uváděné v publikované literatuře. V literatuře se například uvádí, že suspenze oospor připravená v destilované vodě a skladovaná po dobu 188 nebo 384 dní si uchovávala původní vzcházivost při skladování v lednici při 4 °C. Nicméně zcela chybějící popis způsobu přípravy takto popisovaných preparátů činí téměř nemožné vyhodnotit jejich vědeckou platnost, nemluvě již o praktické použitelnosti, kdy za provozních podmínek na farmách nemusí být skladovací teplota 4 °C dokonce ani k dispozici.
Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum se získá způsobem výroby podle tohoto vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že při aerobní kultivaci oomycety Pythium oligandrum v kapalné fázi se kapalné médium obsahující extrakt z obilovin, třtinovou melasu a další nezbytné živiny sterilizuje v parním sterilizátoru. Po vychladnutí se zaočkuje jedním z vybraných kmenů Pythium oligandrum. Po skončení kultivace, v řádu několika dní s výhodou 13 dní, se biomasa sklidí a zpracuje. Po ukončení kultivační fáze Pythium oligandrum v kapalné fázi se biomasa s kapalným médiem homogenizuje, aby minimálně 95 % částic v suspenzi bylo v rozmezí 0,050 až 0,300 mm, s výhodou 0,125 mm. Homogenní suspenze charakterizovaná počtem oospor se podle počtu oospor suspenze koncentruje nebo zředí na předem požadovanou koncentraci oospor v biologickém protiplísňovém prostředku. S výhodou se po fázi homogenizace a koncentrování nebo ředění suspenze filtruje.
Vodná suspenze se při homogenizaci stabilizuje přídavkem osmolytů a v kombinaci s uchováváním při teplotách nižších než 8 °C se skladuje ve sterilních velkoobjemových nádobách.
V případě bezvodé suspenze mikroorganismu Pythium oligandrum se po ukončení kultivační fáze na pevném substrátu nebo v kapalné fázi získaný materiál homogenizuje až do dosažení velikosti minimálně 95 % částic v suspenzi v rozmezí 0,050 až 0,300 mm, s výhodou 0,125 mm. Získaná homogenní suspenze charakterizovaná počtem oospor se odstředí. Odstředěný materiál se po odstranění supematantu doplní olejem na předem požadovanou koncentraci oospor pro výrobu biologického protiplísňového prostředku v takovém množství, aby výsledná koncentrace oospor v biologickém protiplísňovém prostředku a takto získaný materiál se následně resuspenduje homogenizací.
Předkládané řešení se jeví být výhodné i z pohledu významného zjednodušení biotechnologického procesu přípravy mikroorganismu Pythium oligandrum a tím též významného snížení provozních nákladů výrobců takových přípravků. Filtrace nebo separace kultivované biomasy od produkčního média, její sušení a následné mletí na požadovanou velikost částic představuje několik procesů zpracování, které jsou energeticky a technologicky poměrně náročné, obtížně kontrolovatelné, náchylné k možnosti vzniku kontaminací a mohou konečně významně poškodit výsledný produkt, pokud nejsou prováděny za přesně definovaných a průmyslově vysoce náročných podmínek. Naopak technologicky velmi jednoduchým suspendováním získané biomasy v hustých a viskosních roztocích osmolytů se získá velmi
-4CZ 308399 B6 stabilní výsledný produkt okamžitě vhodný pro řadu praktických aplikací. Z praktického hlediska představuje nezanedbatelnou výhodu, že připravené suspenze mikroorganismu Pythium oligandrum je možné téměř kvantitativně přenést z kultivačních nádob nebo fermentorů, což minimalizuje náklady na jejich čištění a údržbu a zároveň minimalizuje i množnost úniku produktu do pracovního prostředí výrobního provozu. Také samotný fakt, že takto získaný produkt je dlouhodobě stabilní i při skladování v běžných teplotách též významně snižuje provozní náklady a usnadňuje manipulaci s produktem.
Překvapivě bylo navíc zjištěno, že kromě stabilizačních efektů koncentrovaných roztoků osmolytů se v konkrétním případě námi zkoumaných suspenzí oospor mikroskopické řasovky Pythium oligandrum významně uplatňuje i konzervační účinek takových roztoků, který je z výrobní i běžné praxe dobře známý. Takto skladovaný produkt je proto chráněný před kontaminací nežádoucími mikroorganismy, které dokonce i v případě velmi nepravděpodobného vniknutí do takto stabilizovaných suspenzí se nemohou v navrhovaném chemickém prostředí rozmnožovat a nemohou proto kontaminovat výsledný produkt. Tato výhoda je v současné výrobní praxi zásadní povahy zejména ve světle stále se zpřísňujících požadavků na úroveň náhodné kontaminace u pesticidních, biocidních a kosmetických produktů.
Kromě úlohy stabilizátoru a úlohy konzervační látky mohou roztoky osmolytů též plnit úlohu adheziva, která se může prakticky uplatnit při mnoha aplikacích, ať již ve formě vodných roztoků po naředění stabilizovaných suspenzí oospor na optimální koncentraci s aplikací namáčením, nebo pro aplikaci jemným rozptýlením mikroskopických částic (tzv. mlžení). Ve všech shora uvedených příkladech aplikací tedy napomáhají roztoky polyolů k účinné adhezi a následné rovnoměrné aplikaci na ošetřených místech, rostlinách nebo plodinách.
V neposlední řadě je potom třeba zmínit, že v případě použití metabolizovatelných osmolytů mohou přímo na místech aplikace sloužit tyto látky jako živina důležitá při kolonizaci a osídlení cílových míst, přičemž jde o významnou živinu zejména v prvé fázi spojené s přechodem oospory do mycelámí formy. Následně mohou převzít úlohu živin důležitých pro dlouhodobý růst a udržení mikroskopické řasovky Pythium oligandrum na místě aplikace živiny více komplexní povahy představované nedokonale fermentovaným substrátem použitým při biotechnologickém růstu a namnožení oospor během biotechnologické kultivace.
Měrný obsah oospor a dalších reprodukčních forem mikroskopické řasovky v suspenzích podle předkládaného řešení je srovnatelný nebo vyšší s dříve zkoušenými a prodávanými sypkými přípravky, což je důležité z pohledu logistiky a ekonomiky distribuce takto vyráběného produktu. Nové formulace však umožňují i použití nižších koncentrací oproti předcházejícím řešením.
V návaznosti na použitý technologický postup došlo u nového kapalného protiplísňového prostředku podle tohoto vynálezu k faktické významné redukci kompoziční komplexity, aniž by toto bylo spojeno s jakýmkoliv omezením fůnkce, resp. účinnosti takto formulovaného kapalného přípravku. Pokud jde o buněčnou a partikulární složku nově navrhovaného přípravku, je tato téměř výlučně představována stabilizovanými oosporami s velmi malým podílem myceliálních fragmentů, rozemletého prosa a jiných komponent. Tyto komponenty ovšem v hustém prostředí tvořeném koncentrovanými osmoly vůbec nesedimentují, což překvapivě zaručuje dobrou homogenitu přípravku, nesrovnatelně lepší, než je tomu u smáčitelných prášků aplikovaných ve formě vodných suspenzí, kdy se jednalo o preparát velmi heterogenní z hlediska velikosti obsažených částic. Zejména se toto týká částic oxidu křemičitého obsaženého v doposud vyráběných přípravcích, v řešení podle předkládaného vynálezu naopak oxid křemičitý u většiny příkladů chybí (s výjimkou zubní pasty, kde je použit jako abrasivum). Z hlediska potřeb praktických aplikací tudíž nyní nedochází k ucpávání filtrů a jiných technologických zařízení během aplikace přípravku.
Pokud by pro určité aplikace byla na závadu přítomnost menších množství metabolizovatelných osmolytů, je tyto možné snadno nahradit bez jakéhokoliv ovlivnění nej důležitějších vlastností přípravku chemicky blízkými nemetabolizovatelnými osmolyty.
-5 CZ 308399 B6
V případě, že by bylo technologicky vhodnější získaný produkt vysušit, nabízela by se jako vhodná technologie mrazové sublimace (lyofilizace) v přístrojích s vysokou hodnotou vakua, neboť použití koncentrovaných roztoků osmolytů jako kryopreservantů a ochranných látek při lyofilizaci je dobře známé a široce využívané. Jako příklad je možné uvést osmolyty široce využívány jako ochranné kryopreservanty v řade citlivých aplikací včetně kryopreservace lidských oocytů popsané například v přehledném článku Wright [15] z roku 2004.
Velkou předností přípravků získaných podle předkládaného vynálezu je, že tyto přípravky jsou vhodné pro všechny aplikace, v nichž se jeví výhodné využít protiplísňových mykoparasitických, elicitorových a růstových vlastností mikroorganismu Pythium oligandrum. Zejména se tedy jedná o použití tohoto přípravku jako rostlinného biofungicidu, pro humánní a veterinární použití mikroorganismu Pythium oligandrum, pro rozrušení biofilmů a odstranění dysbios vyskytujících se při různých lékařských diagnosách a též pro komunální ochranu před plísněmi vyskytujícími se v životním a/nebo pracovním prostředí. V závislosti na použitých matricích v kapalném suspenzním koncentrátu lze tento použít jako ochranný postřik rostlin v přítomnosti degradovatelného biopolymeru, který slouží nejen jako ochranný faktor, ale také jako postupně se uvolňující degradovatelná matrice, a tedy vlastně jako „nosič materiálu Polyversum s oosporami aktivního mikroorganismu Pythium oligandrum.
Ochrana proti plísním, houbám, patogenním bakteriím a kvasinkám s použitím stabilizované koncentrované suspenze oospor mikroorganismu Pythium oligandrum, spočívající v aplikaci této stabilizované koncentrované suspenze, v neředěné nebo ředěné podobě, na místa postižená výskytem plísní nebo hub nebo patogenních bakterií nebo patogenních kvasinek nebo mikrobiální dysbiosou, umožňuje definovat široký okruh aplikací pro stabilizovaný kapalný koncentrát.
V oblasti rostlinné ochrany je možné kompozice využít k ochraně proti plísním, houbám, nebo patogenním bakteriím a kvasinkám tak, že se stabilizovaná koncentrovaná suspenze v ředěné nebo neředěné formě aplikuje na rostliny nebo jejich prostředí nebo semena nebo plodiny nebo plody a to jak před sklizní, tak po sklizni jako například i ve skladech, včetně aplikace ve formě aerosolů, samorozpustných kapslí obsahujících koncentrovanou suspenzi, přihnojování k patě rostlin, máčení plodin, postřik plodin, moření plodin, mlžení plodin, hnojení a přihnojování jako součást komplexních hnojiv, a aplikaci ve formě hydroponií.
Při ochraně dutiny ústní se může stabilizovaná koncentrovaná suspenze v ředěné nebo neředěné formě aplikovat na místa postižená orálním plakem nebo paradentózou, výskytem infikovaných nebojících se ran zejména u diabetiků, výskytem dermatofytálních nebo kvasinkových infekčních onemocnění a výskytem jiných symptomů spojených s mikrobiální dysbiosou kůže a povrchových sliznic člověka.
Pro použití v komunální ochraně se stabilizovaná koncentrovaná suspenze v ředěné nebo neředěné formě aplikuje na místa na zdech a zdivu postižená výskytem plísní. Další inovativní oblasti použití zahrnují protiplísňovou ochranu chladicích zařízení, klimatizací, oblastí postižených záplavami a povodněmi a jiná místa s častým výskytem cílových plísní pro mikroorganismus Pythium oligandrum.
Objasnění výkresů
Vynález je dále podrobně popsán na příkladných provedeních a blíže osvětlen na připojených schématických výkresech.
Obr. 1A, IB, 1C blíže osvětlují srovnání rychlosti růstu fytopatogenní plísně Fusarium graminearum bez přítomnosti mikroorganismu Pythium oligandrum a v přítomnosti tohoto mikroorganismu.
-6CZ 308399 B6
Podrobněji ukazuje:
obr. 1A růst kolonií fytopatogenní plísně Fusarium graminearum samostatně (čtverec) a při současné inokulaci Pythium oligandrum z dormantních oospor a z kapalné a pevné kultivace (hvězdičky a troj úhelníky);
obr. 1B fotografie 4 příkladů Petriho misek na něž byl v levé části inokulován mikroorganismus Pythium oligandrum z dormantních oospor a v pravé části fytopatogenní plíseň Fusarium graminearum (horní řada) a na kontrolních miskách byla inokulována pouze plíseň Fusarium graminearum, přitom nárůst byl zaznamenán po 4 dnech;
obr. 1C Fotografie Petriho misek se současnou inokulaci mikroorganismus Pythium oligandrum z dormantních oospor fytopatogenní plísně Fusarium graminearum. kde nárůst byl zaznamenán po 11 dnech.
Obr. 2A, 2B, 2C znázorňují výsledky laboratorních pokusů s nárůstem pšenice v přítomnosti fýtopatogenní plísně Fusarium graminearum, mikroorganismu Pythium oligandrum, a kombinace obou těchto mikroorganismů.
Podrobněji se ukazují na:
obr. 2A Erlenmayerovy baňky, v nichž rostla na agarové půdě pšenice v přítomnosti pouze fýtopatogenní plísně Fusarium graminearum, tvořící bílé ostrůvky, zaznamenány po 20 dnech od inokulace ke klíčku pšenice;
obr. 2B Erlenmayerova baňky, v nichž rostla na agarové půdě pšenice v přítomnosti jak fýtopatogenní plísně Fusarium graminearum, tak také mikroorganismu Pythium oligandrum, baňky byly zaznamenány po 20 dnech od současné inokulace ke klíčku pšenice; a obr. 2C Erlenmayerovy baňky, v nichž rostla na agarové půdě pšenice v přítomnosti pouze mikroorganismu Pythium oligandrum, baňky byly foceny po 20 dnech od inokulace této plísně ke klíčku pšenice.
Na obr. 3A, 3B, 3C, 3D, 3E je vyobrazena aplikace protiplísňového přípravku na ochranu rostlin podle příkladu provedení 1 a následná analýza populační dynamiky mikroorganismu Pythium oligandrum pozorovaná v polním pokuse na pšenici a přilehlé půdě včetně reakce na přítomnost plísní sledovaná genovou expresí a genetické sledování úrovně plísňové kontaminace.
Podrobněji znázorňují na:
obr. 3A obsah mikroorganismu Pythium oligandrum stanovený genetickým testem na rostlinách (světle šedé sloupce) a v okolní přilehlé půdě (tmavě šedé sloupce) v různých časech po aplikaci;
obr. 3B vývoj teplot měřených infračerveným teploměrem přímo na poli v době odběrů (světle šedé sloupce) a teplotní záznam získaný z místní meteorologické stanice (tmavě šedé sloupce);
obr. 3C průběh genových expresí genu pro celulasu (POCELL), endo-p-glukanasu (POENDO) a strukturní protein bohatý na serin a threonin (POSTRU) v jednotlivých částech rostliny a v okolní půdě (So, půda, R, kořen. St, stonek, L, list) sledovaný v čase 6 až 120 h, přičemž úroveň exprese genů byla normalizována na expresi konstitutivního genu β-tubulinu (POTUBU) a je vyjadřována oproti kontrole bez aplikace přípravku dle citované metodiky [12];
obr. 3D úroveň plísňové kontaminace v identických vzorcích jako v panelu C měřenou pomocí kvantitativní PCR s obecnými amplifikačními primery pro amplifikaci plísní.
-7CZ 308399 B6 obr. 3E korelační graf sledující korelaci mezi úrovní exprese genu pro celulasu (POCELL) a úrovní plísňové kontaminace.
Obr. 4A, 4B, 4C, 4D znázorňují test účinnosti zubních past dle příkladu provedení číslo 4 z hlediska jejich schopnosti eliminovat biofilmy uměle vytvořené na keramických hydroxylapatitových destičkách, a to v horní části obrázku s použitím slin zdravého jedinec a ve spodní části obrázku s použitím slin jedince postiženého paradentózou.
Podrobněji se ukazuje na:
obr. 4A fotografie šestijamkové destičky s použitím slin zdravého jedince po uvolnění promytých biofilmů do roztoku a vyjmutí keramických hydroxylapatitových destiček, které byly předtím čištěny kartáčkem bez pasty, pastou Odol, pastou Enzycal, pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4 bez přídavku mikroorganismu Pythium oligandrum, pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4 bez přídavku oxidu křemičitého a úplnou pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4;
obr. 4B kvantitativní vyhodnocení obsahu biofilmů měřením intenzity zabarvení v jednotlivých jamkách obr. 1A na destičkovém spektrofotometru při vlnové délce 562 nm;
obr. 4C fotografie šestijamkové destičky s použitím slin jedince s paradentózou po uvolnění promytých biofilmů do roztoku a vyjmutí keramických hydroxylapatitových destiček, které byly předtím čištěny kartáčkem bez pasty, pastou Odol, pastou Enzycal, pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4 bez přídavku mikroorganismu Pythium oligandrum, pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4 bez přídavku oxidu křemičitého a úplnou pastou s glycerolem dle příkladu provedení číslo 4; a obr. 4D kvantitativní vyhodnocení obsahu biofilmů měřením intenzity zabarvení v jednotlivých jamkách obr. 1C na destičkovém spektrofotometru při vlnové délce 562 nm.
Příklady uskutečnění vynálezu
Biologický protiplísňový kapalný prostředek obsahuje mikroorganisme Pythium oligandrum a ve všech příkladných provedeních, mikroorganismem Pythium oligandrum je kmen Pythium oligandrum Drechsler ATTC 38472, který byl deponován v České sbírce mikroorganizmů CCM, Masarykova Univerzita v Brně, pod označením Pythium oligandrum Ml, a pod tímto označením je dále uváděn v příkladných provedeních.
Dále je uvedena Sekvenční Listina tohoto mikroorganismu dle ST25 PCT:
<160>
<210>
<211>
<212>
<213>
<221>
<400>
759
DNA
Pythium oligandrum strain Μ1
ITS rRNA gene
- 8 CZ 308399 B6
<210>2 <211>683 <212>DNA < 213> Pythium oligandrum strain Ml < 221> Mitochondrial COXII cytochrome oxidase < 400>2 o
;L:.ggaaggta tt.;;;;ttatcatgat ttag':,;»;:trtt.aattfjt. tttqaotqtt g
-9CZ 308399 B6
Příklad 1
Biologický protiplísňový kapalný prostředek určený k postřikům kulturních plodin s vysokým hmotnostním procentem biomasy
Příprava:
Biomasa získaná kultivací mikroorganismu Pythium oligandrum Ml na pevném substrátu byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána s demineralizovanou vodou a homogenizována. Homogenizace proběhla za otáček 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Následně byl do výchozí neředěné suspenze přidán osmolyt (sacharóza) v množství, které odpovídá výsledné hmotnostní koncentraci 60 % hmota, a požadovanému počtu oospor. Suspenze s osmolytem (sacharózou) byla poté homogenizována v mixéru 1 minulu při 2000 ot/min. Poté byla suspenze uložena do sterilních nerezových tanků při teplotě pod 8 °C.
Výhodněji byl biologický protiplísňový kapalný prostředek připraven sloučením kroků homogenizace v demineralizované vodě a následného přidání osmolytů (sacharózy) v jeden, a to tím způsobem, že biomasa získaná pevnou kultivací byla homogenizována v nádobě průmyslového homogenizátoru v roztoku osmolytů (65% roztoku sacharózy). Homogenizace proběhla za otáček 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Po stanovení počtu oospor ve výchozí suspenzi, byla tato suspenze zředěna osmolytem (65% roztokem sacharózy) běžným způsobem tak, aby bylo dosaženo požadované koncentrace oospor v přípravku. Následně byla suspenze uložena do sterilních nerezových tanků při teplotě pod 8 °C.
Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgcwick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací s Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení přípravku:
Sacharóza jako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum % hmota.
% hmota. 10% hmota.
x 105 /1 ml
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
Příklad 2
Biologický protiplísňový kapalný prostředek určený k postřikům kulturních plodin s nízkým hmotnostním procentem biomasy
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum získaná kapalnou kultivací byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána s osmolytem (sacharózou) a homogenizována tak, aby bylo dosaženo požadovaného počtu oospor a koncentrace osmolytů (sacharózy). Homogenizace proběhla při rychlosti 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Poté byla suspenze uložena ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8 °C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v
- 10 CZ 308399 B6 souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
Sacharózajako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml % hmota.
35,9 % hmota.
0,1% hmota.
x 105 /1 ml.
Vlastnosti:
Příklad 3
Biologický protiplísňový kapalný prostředek určený k moření zma
Příprava:
Biomasa získaná kultivací mikroorganismu Pythium oligandrum Ml na pevném substrátu byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána s demineralizovanou vodou a homogenizována. Homogenizace proběhla při 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Následně byl do výchozí neředěné suspenze přidán osmolyt (sacharóza) v množství, které odpovídá výsledné hmotnostní koncentraci 60 % hmota, a požadovanému počta oospor. Suspenze s osmolytem (sacharózou) byla poté homogenizována v mixéru 1 minutu.
Výhodněji byl prostředek připraven sloučením kroků homogenizace v demineralizované vodě a následného přidání osmolytů (sacharózy) v jeden, a to tím způsobem, že biomasa získaná pevnou kultivací byla homogenizována v nádobě průmyslového homogenizátoru v roztoku osmolytů (65% roztoku sacharózy). Homogenizace proběhla za otáček 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Po stanovení počta oospor ve výchozí suspenzi, byla lato suspenze zředěna osmolytem (65% roztokem sacharózy) běžným způsobem tak, aby bylo dosaženo požadované koncentrace oospor v přípravku. Následně byla suspenze uložena do sterilních nerezových tanků při teplotě pod 8 °C.
Poté byla získaná suspenze uložena ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8 °C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
Složení:
Sacharózajako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml % hmota.
% hmota.
% hmota.
2,5 x 106/l ml.
Příklad 4
Biologický protiplísňový kapalný prostředek jakožto suspenzní koncentrát s nízkým obsahem vody
- 11 CZ 308399 B6
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml z kapalné kultivace byla po sklizení odstředěna. Supemantant byl po odstředění odstraněn a odstředěný materiál byl doplněn parafinovým olejem tak, aby výsledný počet oospor byl 500 000 oospor na 1 ml přípravku. Poté byla směs homogenizována v průmyslovém mixéru po dobu 3 minut. Suspenze byla uložena ve sterilních nádobách při teplotě pod 8 °C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím SedgewickRafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Kultivační biomasa
Parafinový olej jako stabilizátor
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml
0,1 % hmota.
99,9 % hmota.
5x 105/l ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
Příklad 5
Biologický protiplísňový kapalný prostředek aplikovaný formou nanovláken tvořících postupně se uvolňující degradovatelnou matrix pro mikroorganismus Pythium oligandrum Ml
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum z kapalné kultivace byla po sklizení odstředěna. Supemantant byl odstraněn a odstředěný materiál byl doplněn o osmolyt (65% sacharózu) a biopolymer, který pak byl dále zpracováván technologií elektrostatického zvlákňování s použitím netoxického, biodegradibilního polymeru polyvinylalkoholu (PVA). Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní
Složení:
1. Hlavní složka (kapalná suspenze mikroorganizmu Pythium oligandrum. z toho
Sacharózajako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
2. PVA nosič
PVA jako degradovatelný nosič
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml % hmota.
% hmota.
% hmota.
% hmota.
% hmota.
x 106 /1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
- 12 CZ 308399 B6
Příklad 6
Biologický protiplísňový kapalný prostředek aplikovaný ve formě impregnačního nátěru nebo nástřiku
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml z kapalné kultivace byla po sklizení homogenizována a filtrována filtrační technologií separuj ící částice s velikostí do 300 pm. Po odstředění byla takto připravená biomasa smíchána s minerálním olejem o nízké viskozitě, tak aby bylo dosaženo požadovaného počtu oospor v 1 ml přípravku. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Kultivační biomasa
Minerální olej jako stabilizátor
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml
0,1 % hmota.
99.9 % hmota. 2x 105 /1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě 10 až 45 °C (v závislosti na typu sekundární látky).
Příklad 7
Biologický protiplísňový kapalný prostředek aplikovaný jako sanitační prostředek pro klimatizace
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml z kapalné kultivace byla po sklizení homogenizována a filtrována filtrační technologií separující částice s velikostí do 100 pm. Po odstředění byla biomasa zředěna roztokem soli na požadovaný počet oospor v 1 ml přípravku. Princip působení je oplach či nástřik filtrů či potrubí klimatizačních nebo chladicích jednotek. Přítomnost mikroorganismu Pythium oligandrum Ml zaručuje odolnost vůči plísním a houbovým chorobám.
Čištění pylových filtrů:
Filtr byl ponořen do sanitačního roztoku a byl v něm ponechán působit po dobu 10 až 30 minut; poté opláchnut. Alternativou je, že tentýž roztok může být nastříkán na filtr v jeho pracovní pozici. Znečištění a zbytky činidla budou vyfoukány ven stlačeným vzduchem.
Sanitace odpařovače a filtrů:
Po vyčištění odpařovačů a/nebo filtrů se aplikuje roztok produktu bez oplachování. Výborného sanitačního účinkuje dosaženo i tehdy, jestliže se produkt použije výhradně jenom jako detergent k omytí. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím SedgewickRafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
- 13 CZ 308399 B6
Složení:
Kultivační biomasa 0,1 % hmota.
Solný roztok jako stabilizátor 99,9 % hmota.
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium 5 x 105 /1 ml.
oligandrum Ml
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě 10 až 45 °C (v závislosti na typu sekundární látky).
Příklad 8
Biologický protiplísňový kapalný prostředek aplikovaný jako sanitační prostředek pro ošetření sedimentů - pro bahenní nánosy, vyplavené územní celky
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml z kapalné kultivace byla po sklizení homogenizována a filtrována filtrační technologií separuj ící částice s velikostí do 400 pm. Po odstředění byla biomasa zředěna destilovanou nebo demineralizovanou vodou na požadovaný počet oospor v 1 ml přípravku. Principem působení je vytvoření vodné suspenze dle ředění uvedeného níže a aplikování v oblastech postižených kontaminovanými nánosy bahna a sedimentů, jako meliorační postup ke zlepšení vlastností půd a zemin. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafierovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Kultivační biomasa 0,1 % hmota.
Destilovaná voda jako stabilizátor 99,9 % hmota.
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml 5 x 105 /1 ml.
Aplikační využitelnost je od 250 g/ha při koncentraci 500 000 oospor na ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
Příklad 9
Biologický protiplísňový kapalný prostředek jakožto stabilizovaná vodná suspenze oospor Pythium oligandrum Ml
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml získaná kapalnou kultivací je po odstředění (4000 ot/min, 5 min) a odstranění supematantu smíchána se sterilní destilovanou vodou a homogenizována. Homogenizace probíhá za vysokých otáček (20 000 ot/min) po dobu 1 minuty. Poté může být suspenze podle potřeby filtrována a koncentrována za účelem získání suspenzního koncentrátu obsahujícího v 1 ml požadovaný počet oospor Pythium oligandrum Ml a neobsahujícího zbytky původního média ani zbytky mycelia. Získaný suspenzní materiál může být uložen ve sterilních tancích při teplotě 1 až 8 °C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací
- 14 CZ 308399 B6
Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Sterilní destilovaná voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium olígandrum Ml
99,9 % hmota.
0,1 % hmota.
x 105/l ml.
Vlastnosti:
Stabilita: minimálně 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
Příklad 10
Biologický protiplísňový kapalný prostředek jakožto stabilizovaná suspenze s vysokou koncentrací oospor Pythium olígandrum Ml
Příprava:
Biomasa Pythium olígandrum Ml získaná kapalnou kultivací byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) homogenizována. Homogenizace proběhla při 20 000 ot/min po dobu 3 minut. Pote byla suspenze odstředěna a biomasa po odstranění supematantu koncentrována na požadovaný počet oospor v 1 ml přípravku smícháním s osmolytem (65% sacharózou). Suspenzní koncentrát byl uložen ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8 °C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Sacharózajako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium olígandrum Ml % hmota.
% hmota.
% hmota.
2xl07 1/ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
Příklad 11
Biologický protiplísňový prostředek ve formě pasty na bázi glycerolu
Příprava:
Do laboratorního homogenizátoru bylo nalito 1197,1 g glycerolu farmaceutické kvality (Glycerol 99 % PharmEur) a poté bylo opatrně přisypáno 239,4 g oxidu křemičitého Sident® 22 S, 43,1 g kultivační biomasy, 14,4 g vitaminu E a 6 g šalvějového aromátu. Směs byla míchána při 60 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při laboratorní teplotě. Poté byla směs plněna po 75 g do plastových tub s uzávěrem, celkově bylo vyrobeno 20 ks takových tub. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické
- 15 CZ 308399 B6 metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Glycerol 99% Pharm Eur jako stabilizátor
S1O2 Sident® 22 S jako plnidlo na bázi oxidu křemičitého
Kultivační biomasa Pythium oligandrum Ml
Vitamin E acetát jako aplikační látka
Šalvějové aroma FC02 Bio 35 % jako aroma
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml
79,77 % hmota.
16,00 % hmota.
2,87 % hmota.
0,96 % hmota.
0,40 % hmota.
2,5 x 104/1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: nejméně 6 měsíců při teplotě 25 °C.
Příklad 12
Biologický protiplísňový prostředek ve formě pasty na bázi olivového oleje
Příprava:
Do laboratorního homogenizátoru bylo nalito 600 g panenského olivového oleje a poté bylo opatrně přisypáno 120 g oxidu křemičitého Sident® 22 S, 21,6 g kultivační biomasy, 7,2 g vitaminu E a 3 g mátového aromátu. Směs byla míchána při 20 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při laboratorní teplotě. Poté byla směs plněna po 75 g do plastových tub s uzávěrem, celkem bylo vyrobeno 10 takových tub. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počta viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Olivový olej rafinovaný jako stabilizátor
S1O2 Sident® 22 S jako plnidlo na bázi oxidu křemičitého
Kultivační biomasa Pythium oligandrum Ml
Vitamin E acetát jako aplikační látka
Esenciální oleje máta pepmá HNA jako aroma
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml
79,77 % hmota.
16,00 % hmota.
2,87 % hmota.
0,96 % hmota.
0,40 % hmota.
2,5 x 104/1 ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě 25 °C.
Příklad 13
Biologický protiplísňový kapalný prostředek na ochranu akvatických organismů
Přípravek je určen k preventivní ochraně ryb a rybí násady (kapr, plotice, cejn) před spektrem plísňových onemocnění (zejména Aspergillus spp.). Přípravek je aplikován preventivně do chovných nádrží. Přípravek je dále určen k preventivní ochraně rybích jiker před napadením spektrem plísňových onemocnění (zejména rody Fusarium spp., Aspergillus spp.).
- 16 CZ 308399 B6
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml získaná kapalnou kultivací byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) homogenizována. Homogenizace proběhla při 20 000 ot/min po dobu 3 minul. Poté byla suspenze odstředěna a biomasa po odstranění supematantu koncentrována na požadovaný počet oospor v 1 ml přípravku smícháním s osmolytem (65% sacharózou). Suspenze byla uložena ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8 °C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Sacharózajako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml % hmota.
% hmota.
% hmota.
x 106/l ml.
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
Příklad 14
Biologický protiplísňový tekutý přípravek k ošetření včelích plástů
Přípravek je určen k preventivnímu ošetření včelích plástů před napadením širším spektrem plísní především rodu Aspergillus a Fusarium. Přípravkem lze ošetřit plásty určené k uskladnění mimo včelí úl i plásty uvnitř včelího úlu neobsazeného včelami.
Příprava:
Biomasa Pythium oligandrum Ml získaná kapalnou kultivací byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána s osmolytem (sacharózou) a homogenizována tak, aby bylo dosaženo požadovaného počtu oospor a koncentrace osmolytů (sacharózy). Homogenizace proběhla při 20 000 ot/min po dobu 3 minut. Poté byla suspenze uložena ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8 °C. Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Pokud množství viabilních oospor nepokleslo pod 90% výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Složení:
Sacharózajako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml % hmota.
35,9 % hmota.
0,1 % hmota.
x 106 /1 ml
Vlastnosti:
Stabilita: 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
- 17 CZ 308399 B6
Příklad 15
Biologický protiplísňový kapalný prostředek jakožto bezvodý suspenzní koncentrát určený k postřikům kulturních plodin
Biomasa získaná kultivací mikroorganismu Pythium oligandrum Ml na pevném substrátu byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána demineralizovanou vodou a homogenizována. Homogenizace proběhla za otáček 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Po homogenizaci byla získaná suspenze smíchána s anorganickým nosičem (Sipemat), usušena a semleta odstředivým mlýnem na výslednou velikost částic do 350 pm. Suchá, kultivační biomasa s nosičem pak byla smíchána s parafinovým olejem tak, aby bylo dosaženo požadované koncentrace oospor v přípravku. Suspenze byla uložena ve sterilních nádobách při teplotě do 25 °C.
Výhodou přípravku oproti příkladu jedna je delší stabilita přípravku, která je zajištěna přítomností vody. Anorganický nosič na bázi oxidu křemičitého zajišťuje dobrou suspendovatelnost pevných částic (biomasy) v přípravku.
Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky, stabilita byla stanovena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací s Etxeberria a kol. [ 13] z roku 2011.
Složení:
Kultivační biomasa
Sipemat 22 jako anorganický nosič
Parafinový olej jako stabilizátor
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml
1,5 % hmota.
6,5 % hmota.
% hmota.
x 106 /1 ml
Vlastnosti:
Stabilita: 24 měsíců při teplotě do 25 °C.
Příklad 16
Biologický protiplísňový kapalný prostředek jakožto bezvodý suspenzní koncentrát určený k postřikům kulturních plodin v ekologickém zemědělství
Biomasa získaná kultivací mikroorganismu Pythium oligandrum Ml na pevném substrátu byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána demineralizovanou vodou a homogenizována. Homogenizace proběhla za otáček 3000 až 5000 ot/min po dobu 3 minut. Po homogenizaci byla získaná suspenze smíchána s anorganickým nosičem (Sipemat), usušena a semleta odstředivým mlýnem na výslednou velikost částic do 350 pm. Suchá, kultivační biomasa s nosičem pak byla smíchána se slunečnicovým olejem tak, aby bylo dosaženo požadované koncentrace oospor v přípravku. Suspenze byla uložena ve sterilních nádobách při teplotě do 25 °C.
Výhodou přípravku oproti příkladu jedna je delší stabilita přípravku, která je zajištěna přítomností vody. Anorganický nosič na bázi oxidu křemičitého zajišťuje dobrou suspendovatelnost pevných částic (biomasy) v přípravku.
Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky, stabilita byla stanovena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací s Etxeberria a kol. [13] z roku 2011.
- 18 CZ 308399 B6
Složení:
Kultivační biomasa
Sipemat 22 jako anorganický nosič?
Slunečnicový olej jako stabilizátor
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml
1,5 % hmota.
6,5 % hmota.
% hmota.
x 106/l ml
Vlastnosti:
Stabilita: 24 měsíců při teplotě do 25 °C.
Příklad 17
Biologický protiplísňový tekutý přípravek se sníženou koncentrací oospor
Biomasa Pythium oligandrum Ml získaná kapalnou kultivací byla v nádobě homogenizátoru (průmyslového mixéru) smíchána s osmolytem (sacharózou) a homogenizována tak, aby bylo dosaženo požadovaného počtu oospor a koncentrace osmolytů (sacharózy). Homogenizace proběhla při 20 000 ot/min po dobu 3 minut. Následně byla suspenze smíchána s osmolytem (65% sacharózou) tak, aby koncentrace oospor v přípravku odpovídala požadavkům na přípravek. Poté byla suspenze uložena ve sterilních nerezových tancích při teplotě pod 8 °C.
Počet dormantních oospor byl stanoven mikroskopicky s použitím Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a stabilita byla měřena na základě mikroskopického sledování počtu viabilních oospor s použitím plazmolytické metody v souladu s publikací Etxeberria a kol. [13] z roku 2011. Počet dormantních oospor se v případě potřeby stabilizuje běžným způsobem.
Složení:
Sacharóza jako stabilizátor
Voda jako stabilizátor
Kultivační biomasa
Počet dormantních oospor mikroorganismu Pythium oligandrum Ml
64,95 % hmota.
% hmota.
0,05 % hmota.
x 103 /1 ml
Vlastnosti:
Stabilita: 12 měsíců při teplotách od 2 do 8 °C; 6 měsíců při teplotě do 25 °C.
Příklad 18
Test laboratorní účinnosti biologických protiplísňových kapalných prostředků na mykoparasitických experimentech
Laboratorní test proliferace Pythium oligandrum Ml z dormantních oospor suspenzního koncentrátu podle příkladu provedení 1 a následného mykoparasitismu na fýtopatogenní plísni Fusarium graminearum byl proveden na sterilních agarových plotnách s živným médiem na bázi sladového extraktu. Zředěný koncentrát na aplikační úroveň, tj. 0,2 ml koncentrátu na 1 1 vody, byl nanesen na agarovou plotnu, část této plotny byla po vyklíčení oospor vyjmuta a přenesena na jiný agar, který byl současně inokulován plísní Fusarium graminearum.
Výsledek tohoto testuje představen na Obr. 1 ukazujícím významné zastavení růstu fýtopatogenní plísně Fusarium graminearum po přidání mikroorganismu Pythium oligandrum Ml ve srovnání se standardním růstem (obr. 1A). Tato situace je dále ilustrována pomocí série Petriho misek vyfotografovaných po 4 dnech jednak společného růstu obou mikroorganimů a jednak růstu samotné fýtopatogenní plísně (obr. 1B). Po 11 dnech kultivace je patrné výrazné potlačení fýtopatogenní plísně nárůstem mikroorganismu Pythium oligandrum Ml (obr. 1C). Pokud
- 19 CZ 308399 B6 množství viabilních oospor nepokleslo pod 90 % výchozí hodnoty, byl přípravek označen jako stabilní.
Příklad 19
Protiplísňová účinnost vůči fytopatogenním plísním demonstrovaná v laboratorním experimentu s pšenicí
Semena kulturních plodin (pšenice) byla ošetřena roztokem Sava (1 až 5%roztok) a naklíčeny na soil extract agaru. Po naklíčení byly klíčky znova ošetřeny 1% roztokem Sava a umístěny na vrstvu fytoagaru v 250 ml Erlenmayerově baňce. Baňky byly inokulovány kouskem agaru (5 mm) s fytopatogenem Fusarium graminearum nebo mikroorganismem Pythium oligandrum Ml (dormantní oospory v suspenzním koncentrátu) o aplikační koncentraci 0,2 ml/L a objemu 0,2 ml ve variantách: 1) fytopatogen: 2) fytopatogen + Pythium oligandrum Ml: 3) pouze Pythium oligandrum Ml; 4) kontrolní vzorek, který nebyl inokulován. Baňky byly uzavřeny tenkou vrstvou buničiny a gázy. Kultivace probíhala v místnosti při teplotě 24 °C. Byl sledován nárůst kolonie fytopatogenů a mikroorganismu Pythium oligandrum Ml a stav rostliny.
Výsledek tohoto laboratorního experimentuje představen na obr. 2. V případě přidání samotného fytopatogena je dobře patrný nejen jeho významný nárůst v okolí rostoucí pšenice, ale též poškození rostliny tímto patogenem (obr. 2A). Pokud byl kromě fytopatogenní plísně přidán i mikroorganismus Pythium oligandrum Ml, nebyla přítomnost fytopatogena viditelná a docházelo k dobrému nárůstu pěstované rostliny (obr. 2B). Kontrolní experiment provedený pouze v přítomnosti mikroorganismu Pythium oligandrum Ml ukázal normální nárůst rostlinek pšenice, který byl srovnatelný s experimenty bez přidání jakéhokoliv mikroorganismu (obr. 2C).
Příklad 20
Test účinnosti biologického protiplísňového kapalného prostředku určeného k postřikům kulturních plodin podle příkladu provedení č. 2 ve skleníkovém pokuse na řepce Brassicanapus
Byly použity 4 sektory ve firemním skleníku v Uhercích s rostoucí řepkou Brassica napus var. Lohana Cl, přičemž aplikace byla zahájena ve stádiu BBCh 15 - 21. V prvém sektoru byl aplikován sypký biofúngicid s mykoparazitickým mikroorganismem Pythium oligandrum Ml (Polyversum®), ve druhém sektoru byl aplikován nový kapalný fungicid podle příkladu provedení 1 tohoto vynálezu, ve třetím sektoru nový kapalný protiplísňový přípravek podle příkladu provedení 2 tohoto vynálezu a v posledním čtvrtém sektoru byl aplikován nový kapalný protiplísňový prostředek podle příkladu provedení 4 tohoto vynálezu. Ve všech případech byla aplikační koncentrace 0,5 g/L popřípadě 0,5 ml/L s rozprášením 100 ml takto koncentrovaného přípravku na 1 m2 ošetřené plochy. V každém sektoru bylo označeno odběrové místo pro odběr vzorků zahrnujících rostlinu a půdu mezi řádky. Během každého odběru byly též prováděny fotodokumentace a odečet teploty ve skleníku v okamžiku odběru. Odebrané vzorky byly během hodiny přeneseny do laboratoře a uloženy v mrazničce při -20 °C až do okamžiku analýzy. Odběry byly provedeny před aplikací protiplísňových přípravků a poté 1 hodinu, 2 hodiny, 7 hodin, 20 hodin, 2 dny, 3 dny, 4 dny, 5 dnů, 6 dnů, 7 dnů, 8 dnů, 11 dnů, 14 dnů, 17 dnů a 20 dnů po aplikaci.
Laboratorní zpracování vzorků zahrnovalo fotodokumentaci jednotlivých rostlin, separaci listu a kořene, stanovení vlhké hmotnosti vzorku, homogenizaci vzorku v DNA extrakčním pufiru, centrifůgaci a provedení molekulárních analýz. Kvantitativní stanovení přítomnosti mikroorganismu Pythium oligandrum Ml bylo provedeno metodou qPCR se sondou cílenou na ITS sekvence, kvantitativní stanovení DNA řepky bylo provedeno identickou metodou se sondou cílenou na Fat(A)A sekvenci. Kvantitativní stanovení zahrnovalo provedení 50 cyklů DNA amplifikace za standardních podmínek a výpočet koncentrace cílových sekvencí pomocí kalibrační křivky. Podobně byla též detekována úroveň plísňového zamoření na základě standardního protokolu.
-20 CZ 308399 B6
Výsledky testu účinnosti jsou uvedeny v následující Tabulce 1. Účinnost dosahovaná pro nové kapalné protiplísňový přípravky podle tohoto vynálezu je ve všech případech srovnatelná nebo lepší než účinnost pevného sypkého přípravku. K potlačení cizorodých plísní vždy docházelo v závislosti na kolonizaci a amplifikaci mikroorganismu Pythium oligandrum Ml na místě aplikace. Nízká úroveň kontaminace plísněmi se poté udržela i po snížení koncentrace mikoorganismu Pythium oligandrum Ml na konci experimentu. Dynamika populace mikroorganismu Pythium oligandrum Ml byla sledována v tomto experimentu pouze po dobu 15 dní, a proto není možné komentovat dlouhodobé efekty. Nicméně z hlediska protiplísňové účinnosti přípravku je nepochybné, že schopnost potlačit plísně je významná a dlouhodobá: došlo ke snížení výskytu těchto plísní zhruba o jeden řád za 24 hodin po aplikaci, a za dalších 24 hodin se jednalo také o snížení téměř o řád.
Tabulka 1
Měření obsahu mikroorganismu Pyíiiium oligandrum M!& a měřeni obsahu plísní na listech řepky ve skleníkovém pokusu. Výsledky jsou uvedeny jako počty detekovaných diploid nich
| genomů | na ϊ pg hostitelské DNA řepky. | |||||||
| Cas | Sektor 1 | .............. ···.· · | Sekto r 2 | Sektor 3 | Sektor 4 | |||
| odběru | Pythium | 11 f ísné | Pythiuiii | PÍisně...... | Pythium | Plísně | Pythium | Plísně |
| (h) | ||||||||
| 0 | 8x !(T | •a 2; | Ύχϊο-...... | í x í(? | 8 x iú | 2x ίό* | 6 x 1 0 | Iff |
| Ί A- | r2x !04 | 8 X : í .·' | Ϊ x ΚΓ | 1 x 10° | 1 x I01....... | i X iff | 2 x íffr | i x UŤ |
| >0.............. | 2 x 1 o | 1 x 10' | 2 x 105 | 2 x 10’ | 2 x IT | 3 x í05 | 2 x 10’ | 2 x i(P |
| 26 | Ú5 x U ) ; | 4x ur..... | ft ý uf | (Ί \ U..... | 7x ΙΟ'4 | 8 x i 04 | 6x Í(P | 5 λ 1(P |
| 44 | T xíT | 2 x W' | 2 x ! 0' | 2 x 1 (? | i x iff’ | 2 x 1 (T | 2x10''’ | i x iff |
| ~92............... | ÍHHr | i X ;(i | K.x 10' | 2x10’ | / x :0 ..... | 1 x 10 s | ; x iff | Txltp...... |
| '110.......... | ΤχΊ(ύ | 5 x í (f..... | Ι'χ'ϊύ...... | 6 x :o; | Túítf...... | óxTo7..... | i x ;o: | S x kF |
| 212 | 1 x Iff1 | 5 x Ϊ 02 | 2.x IÓJ | 5 xío3””' | 2 x l (?...... | X 10'...... | 2 x 1Τ | Λ x IP |
| ........ | 8 x Toy | ' 6x Ííf | ; \ 10' | '4ϊ'Ϊ0- ”” | 1 x Iff1 | > x ; b7 ' | i x | 4 χ ϊϋ' |
| ____________________ | _______________________ | __________________________ | ... _______............. | ..................... | --------—........·>·.····· | ...................... | --------------........ | i-..................... |
Příklad 21
Test účinnosti biologického protiplísňového kapalného prostředku určeného k postřikům kulturních plodin podle příkladu provedení 1 v polním pokuse na pšenici Triticum aestivum
Ozimá pšenice Triticum aestivum byla vyseta v říjnu 2015 na firemním poli v blízkosti osady Úherce u Loun. V souladu s agrotechnickými normami a schválenou registrací pro protiplísňový přípravek pro rostlinnou ochranu Polyversum® byla v listopadu 2015 provedena na vyznačených drahách aplikace protiplísňového přípravku podle příkladu provedení 1 tohoto vynálezu standardní postřikovou metodou v množství 100 ml na 1 ha. Na 4 vyznačených odběrových místech byly prováděny odběry před aplikací a dále různý počet dní po aplikaci, odebírány byly rostoucí rostliny pšenice a dále půda v blízkosti odběru. Ihned po odběru byly vzorky zmraženy a uchovávány v uzavřených sáčcích nebo zkumavkách při -20 °C až do okamžiku analýzy. Nukleové kyseliny byly z odebraných vzorků extrahovány s využitím publikované metodiky (Klimeš R, Suchánek M, Maštalková L a spol. /2016/ Comparison of the efficacy of treatment of dermatophytosis by chemical and biological antifúngals: soil peronosporomycete Pythium oligandrumis as efficient as the antifungal enilconazole in the guinea pig model. Vet Dermatol, v tisku) a použity pro molekulární analýzy).
-21 CZ 308399 B6
Pokud jde o dynamiku výskytu mikroorganismu Pythium oligandrum Ml po postřiku kapalným přípravkem podle příkladu provedení 1, normalizované koncentrace na rostlinách a v okolní půdě sledovaly podobnou závislost. Zatímco před aplikací mohly být genetickým testem qPCR identifikovány jen jednotlivé buňky na g vzorku, po aplikaci kapalného preparátu odpovídajícího standardnímu normalizovanému množství se tento počet zvýšil na stovky buněk na g vzorku. Po 48 hodinách po aplikaci došlo k viditelnému namnožení mikroorganismu Pythium oligandrum Ml za daných experimentálních podmínek, přičemž tento pozitivní trend byl přerušen za podmínek konkrétního experimentu mrazovou episodou počátkem prosince 2015, po níž se již dynamický populační růst neobnovil (srovnej obr. 3A a obr. 3B).
Množství hodnotných informací bylo získáno analýzou genových expresních profilů metodou RT-qPCR prováděných ve „vrcholové fázi experimentu s největším nárůstem mikroorganismu Pythium oligandrum Ml. Hodnoty koncentrací transkriptů ukazovaly rychlou reakci na vyskytující se fimgální patogeny v prvé fázi (výrazná exprese genu pro celulasu) následované zvýšeným výskytem zoospor (exprese endoglukanasy). Teprve po 48 ha 120 h je zvýšený charakteristický genový marker sporulace, a to zejména v okolní půdě a kořeni (obr. 3C). Zároveň bylo možné pozorovat významné snížení relativního obsahu plísní již 48 hodin po aplikaci (obr. 3D) a toto snížení recipročně korelovalo s expresí genu pro celulasu odpovědnou za degradaci povrchových sacharidů v plísních během mykoparasitického působení mikroorganismu Pythium oligandrum Ml (obr. 3E).
Příklad 22
Test účinnosti zubních past v modelu orálního biofilmu s mechanickým odstraňováním plaku.
Pro sledování účinnosti připravených zubních past byl proveden laboratorní test s použitím modelu orálního biofilmu s mechanickým odstraňováním plaku dle publikace Verkaik MJ a spol. [14] z roku 2010. Byla použita verze (B) výše publikovaného protokolu spočívající ve dvouhodinové adhezi s následným růstem přes noc (16-hodinový biofilm) a mechanickým čištěním. Účinnost glycerolové zubní pasty s mikroorganismem Pythium oligandrum Ml a zubní pasty s olivovým olejem a mikroorganismem Pythium oligandrum Ml při odstranění mikroorganismů zubního plaku byla srovnána se dvěma druhy běžně dostupných zubních past (Odol a Enzycal) a jako kontrola bylo použito pouze mechanické čištění zubním kartáčkem bez pasty (označeno Kontrola). V kontrolním experimentu byla použita identická pasta jednak bez obsahu Pythium oligandrum a jednak bez použitého abraziva oxidu křemičitého.
Výsledek tohoto testuje popsán na výsledkové tabuli v obrázku 4. Ten prokázal, že pasta podle příkladu provedení číslo 4 vykazovala významně vyšší účinnost při odstranění zubního biofilmu a plaku než alternativní používané přípravky, dokonce i u jedinců postižených paradentózou (obr. 4A až obr. 4D). Zatímco dosud běžně používané pasty snížily intenzitu tvorby biofilmu zhruba na polovinu, nové pasty podle tohoto vynálezu až na desetinu. U kontrolní pasty bez obsahu mikroorganismu Pythium oligandrum Ml byl její účinek srovnatelný s běžnými pastami, u kontrolní pasty bez oxidu křemičitého již byl účinek významně vyšší. U pacienta s periodontálním onemocněním byla celková úroveň tvorby biofilmu významně vyšší a bylo možno i lépe pozorovat rozdíly v účinnosti jednotlivých past.
Příklad 23
Test účinnosti biologického protiplísňového kapalného prostředku podle příkladu provedení 1 na ochranu obytných prostor před sporami plísní
Protiplísňový přípravek podle příkladu provedení číslo 1 byl naředěn vodou na koncentraci 330 000 oospor na litr aplikačního roztoku, tj. bylo přidáno 0,66 ml kapalného koncentrátu na 1 litr roztoku. Dále byl připraven kontrolní roztok za identických podmínek, avšak bez obsahu biomasy Pythium oligandrum Ml, biomasa byla nahrazena vodou. Takto připravené roztoky byly
-22 CZ 308399 B6 aplikovány ve dvou malých uzavřených místnostech v zemědělské usedlosti v Uhercích u Loun čp. 2 ve formě rozstřiku jemné mlhy rozprašovačem. Po aplikaci byly obě místnosti neprodyšně uzavřeny a byly prováděny spadové zkoušky na obsah spor metodou podle Omeljanského. Výsledky byly vyhodnoceny v laboratoři Dr. Miroslava Kolaříka v Mikrobiologickém ústavu A V ČR v Praze.
Výsledky experimentu jsou znázorněny v níže uvedené Tabulce 2. Experiment probíhal v uzavřených místnostech bez proudění vzduchu, proto jsou pozorované změny pomalejší a byly pozorovatelné až po několika měsících. Z výsledků je nicméně patrné, že v kontrolní místnosti 1 s aplikací pomocných látek zjištěné počty spor kolísaly, po celou dobu pozorování však nepoklesly pod limit WHO (Světové zdravotnické organizace) ve výši 500 spor na 1 m3 vzduchu. Naopak v místnosti 2 došlo po 3 měsících od aplikace ke statisticky významnému poklesu spor, který posléze poklesl pod limit WHO 6 měsíců od data provedení aplikace.
Tabulka 2 | Měření počtu plísňovýeh spór na 1 n? v místnosti 1 s aplikaci kontrolního přípravku a v místnosti 2 s aplikací přípravku s aktivní látkou Pythium ufigandrum Ml
Měsíce po aplikaci (0 před aplikací) Místnost I kontr.
Místnost 2 (přípravek pudle přikladu provedení číslo I)
Příklad 24
Způsob výroby biologického protiplísňového kapalného prostředku s Pythium oligandrum Ml
Detailní povaha biologického protiplísňového kapalného prostředku s Pythium oligandrum Ml podle tohoto vynálezu byla podrobně demonstrována na předchozích příkladech provedení.
Dále jsou uvedeny příklady způsobu výroby tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředku s Pythium oligandrum Ml podle tohoto vynálezu.
K aerobní kultivaci oomycety Pythium oligandrum Ml v kapalné fázi se použije médium obsahující extrakt z obilovin, třtinovou melasu a další nezbytné živiny. Kapalné médium se sterilizuje v parním sterilizátoru. Po vychladnutí se zaočkuje jedním z vybraných kmenů Pythium oligandrumMl. Po skončení kultivace, která trvá přibližně 13 dní, se biomasa sklidí a zpracuje, jak je uvedeno ve shora uvedených příkladech provedení.
Pro kultivaci mikroorganismu Pythium oligandrum Ml na pevném substrátu se připraví médium obsahující zrna obilnin, výhodně loupané obilky prosa, např. Panicům miliaceum L, které se smíchají s podílem živného kapalného média. Médium se v kultivačních nádobách sterilizuje v parním sterilizátoru. Po vychladnutí se médium naočkuje jedním z vybraných kmenů Pythium oligandrum Ml. Po skončení procesu kultivace, který trvá přibližně 8 dní. se sklizená biomasa dále zpracuje do formy suspenzního koncentrátu, jak je popsáno ve shora uvedených příkladech provedení.
-23 CZ 308399 B6
Po ukončení kultivační fáze Pythium oligandrum Ml v kapalné i pevné fázi se biomasa s kapalným médiem homogenizuje, např. průmyslovým mixérem tak, aby minimálně 95 % částic v suspenzi bylo v rozmezí 0,05 až 0,30 mm, s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm. Homogenní suspenze je následně charakterizována počtem oospor. Podle počtu oospor se suspenze standardizuje - zkoncentruje nebo zředí - na předem požadovanou koncentraci oospor vhodnou k přípravě daného biologického protiplísňového kapalného prostředku.
Po ukončení kultivační fáze Pythium oligandrum Ml na pevném substrátu se biomasa homogenizuje, s výhodou průmyslovým mixerem, v odpovídajícím objemu demineralizované vody tak, aby výsledná velikost minimálně 95 % částic v suspenzi byla v rozmezí 0,050 až 0,300 mm, s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm. Homogenní suspenze je následně charakterizována počtem oospor. Podle počtu oospor se získaná suspenze zkoncentruje nebo zředí na předem požadovanou koncentraci oospor vhodnou k přípravě daného biologického protiplísňového kapalného prostředku.
K zajištění maximální přípustné velikosti částic v daném rozmezí se po fázi homogenizace a koncentrování, případně naředění, suspenze separuje, např. filtruje. V případě získání částic kolem 0,05 mm až 0,125 mm je vysoká pravděpodobnost získání koncentrované suspenze, respektive téměř čisté koncentrované suspenze oospor Pythium oligandrum Ml. Většina příkladných provedení shora uvedených měla velikost částic převážně 0,050 až 0,125 mm.
Vodná suspenze se při homogenizaci může stabilizovat přídavkem osmolytů a v kombinaci s uchováváním při teplotách nižších než 8 °C ji lze skladovat ve sterilních velkoobjemových nádobách.
V případě bezvodé suspenze mikroorganismu Pythium oligandrum Ml se po ukončení kultivační fáze na pevném substrátu nebo v kapalné fázi získaný materiál se homogenizuje, s výhodou průmyslovým mixérem tak, aby výsledná velikost minimálně 95 % částic v suspenzi byla 0,050 až 0,300 mm, s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm. Získaná homogenní suspenze, charakterizována počtem oospor, se následně odstředí a odstředěný materiál se po odstranění supematantu doplní olejem, na předem požadovanou koncentraci oospor vhodnou k přípravě daného biologického protiplísňového kapalného prostředku. Následně se získaný materiál resuspenduje, např. průmyslovým mixérem.
Konkrétní neomezující možné způsoby výroby jsou uvedeny ve shora uvedených příkladech provedení.
Průmyslová využitelnost
Nový kapalný protiplísňový prostředek obsahující stabilizovanou suspenzi oospor je možno vyrábět ve značných objemech především proto, že u tohoto prostředku jsou jak fáze fermentační výroby, tak fáze formulační technicky dobře zvládnuté. Nový kapalný prostředek najde uplatnění ve všech oblastech, v nichž byly doposud aplikovány a používány jiné formy mikroskopické oomycety Pythium oligandrum, zejména tedy v biologické ochraně rostlin, pro ochranu budov a obydlí před plísněmi a popřípadě i pro potlačování plísní a kvasinek a při nastolení fyziologické rovnováhy mikroflóry při humánních a veterinárních aplikacích. Jako velmi inovativní je možno uvést použití jako ochranného postřiku rostlin s degradovatelným biopolymerem, který slouží nejen jako ochranný faktor, ale také jako postupně se uvolňující degradovatelná matrice „nosič oospor mikroorganismu Pythium oligandrum. Přípravek podle tohoto vynálezu je možno s výhodou použít k nátěru či nástřiku dřevěných konstrukcí, kdy dochází zároveň k účinné impregnaci dřeva olejovými komponentami přípravku. Přítomnost mikroorganismu zaručuje odolnost vůči plísním a houbovým chorobám a „defektům dřeva. Jako zcela nové použití je pak možno uvést použití pro účinnou konzervaci vzduchotechnických zařízení, klimatizační a chladicích jednotek. Pro snížení úrovně plísňové kontaminace v oblastech zasažených
-24 CZ 308399 B6 povodněmi, ve vysušovaných oblastech a v okolí rekultivovaných vodních ploch se jeví výhodné použití přípravku speciálně vyvinutého pro tyto účely.
Citovaná literatura
1. Gerbore J, Benhamou N, Vallance J, FeFloch G, Grizard D, Rcgnault-Roger C, Rcy P (2014) Biological control of plant pathogens: advantages and limitations seen through ihe case study of Pythium oligandrum, Environ Sci Pollut Res 21, 4847-4860.
2. Drechsler C (1943) Several species of Pythium peculiar in their sexual development, Phytopathology 33, 261-299.
3. Deacon JW (1976) Studies on Pythium oligandrum, an aggresive parasite of other fimgi, Trans BritMycolSoc 66,383-391.
4. US 4259317. Veselý D, Hejdánek S. Preparation for the protection of emerging sugar beets against dumping-off, and method ofits production.
5. US 4574083. Baker R, Lifshitz R, Isolates of Pythium species which are antagonistic to Pythium ultimum.
6. US 5961971, Martin FN, Biocontrol of fungal soilbome pathogens by Pythium oligandrum.
7. CZ 303908 B6, BIOPREPARÁTY. spol. s r.o. (Suchánek M.), Use of fungal organism Pythium oligandrum
8. CN 102807957 A, Liu X. a spol, Method for increasing Phytophthora capsid output and promoting oospore germination.
9. US 2014/0212387 Al, Luth P, Liquid preparation for biological plant protection, m
10. McQuilken MP, Whipps JM, Cooke RC (1990) Oospores of the biocontrol agent Pythium oligandrum bulk-produced in liquid culture. My col Res 94, 613-616
11. McQuilken MP, Whipps JM, Cooke RC (1992) Effect of osmotic and matrix potential on growth and oospore germination of the biocontrol agent Pythium oligandrum. Mycol Res 96,588-591.
12. Takenaka S, Ishikawa S (2013) Biocontrol of sugar beet seedlings and taproot diseases caused by Aphanomyces cochlioideshy - Pythium oligandrum treatments before transplanting. JapAgric Res Quart 47, 75-83.
13. Etxeberria A, Mendarte S, Larregla S. (2011) Determination of viability of Phytophthora capsici oospores with the tetrazolium bromide staining test versus a plasmolysis method. Rev Iberoam Micol. 28, 43-49.
14. Verkaik M.I a spol. (2010) Oral biofilm models for mechanical plaque removal. Clin Oral Invest 14:403-409.
15. Wright D (2004) Use of sugars in cryopreserving human oocytes. Reprod Bio Med Online 9, 179-186.
Claims (15)
- PATENTOVÉ NÁROKY-25 CZ 308399 B61. Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium olígandrum, s dlouhodobou stabilitou v řádu měsíců v podmínkách běžného skladování, vyznačující se tím, že zahrnuje stabilizovanou suspenzi mikroorganismu Pythium olígandrum, a obsahuje0,05 až 10,0 % hmota, kultivační biomasy mikroorganismu Pythium olígandrum s obsahem kultivačního média, buněčných forem tohoto mikroorganismu a látek produkovaných tímto mikroorganismem a90,0 až 99,95 % hmota, stabilizátoru, kterým je alespoň jedna komponenta ze skupiny, zahrnující vodu, solný roztok, olej, roztoky osmolytů a glycerol, přičemž v 1 ml tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředku je, po běžné standardizaci, předem požadovaný počet dormantních oospor v rozsahu 1 x 103 až 2 x 107;nebo zahrnuje stabilizovanou suspenzi mikroorganismu Pythium olígandrum, a obsahuje0,05 až 10,0 % hmota, kultivační biomasy mikroorganismu Pythium olígandrum s obsahem kultivačního média, buněčných forem tohoto mikroorganismu a látek produkovaných tímto mikroorganismem,79,77 až 99,95 % hmota, stabilizátoru, kterým je alespoň jedna komponenta ze skupiny, zahrnující vodu, solný roztok, olej, roztoky osmolytů a glycerol, a případně zbytek do 100 % hmota, nejméně jedné běžné modifikující/aplikační látky ze skupiny, zahrnující plnidlo, aroma, vitamin E, přičemž v 1 ml tohoto biologického protiplísňového kapalného prostředku je, po běžné standardizaci, předem požadovaný počet dormantních oospor v rozsahu 2,5 x 104 až 1,0 x 106.
- 2. Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium olígandrum podle nároku 1, vyznačující se tím, že mikroorganismem Pythium olígandrum je kmen Pythium olígandrum Drechsler ATTC 38472, který byl deponován v České sbírce mikroorganizmů (CCM) Masarykova Univerzita v Brně pod označením Pythium olígandrum Ml.
- 3. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle některého nároku 1 až 2, vyznačující se tím, že stabilizovaná suspenze mikroorganismu Pythium olígandrum obsahuje stabilizátor na bázi vody v rozmezí 30,0 až 99,9 % hmota.
- 4. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že stabilizátorem vodné suspenze je destilovaná voda nebo sterilizovaná destilovaná voda v množství 99,9 % hmota.
- 5. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že stabilizátorem vodné suspenze je solný roztok v množství 99,9 % hmota.
- 6. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že stabilizátor vodné suspenze obsahuje vodu a osmolyt, a to vodu v množství 30 až 36 % hmota, a osmolyt ve formě sacharózy v množství 60 až 95 % hmota.-26 CZ 308399 B6
- 7. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle některého nároku 1 až 2, vyznačující se tím, že stabilizovaná suspenze mikroorganismu Pythium oligandrum je bezvodá, stabilizátorem je alespoň jeden olej vybraný ze skupiny zahrnující parafínový olej, minerální olej, olivový olej a slunečnicový olej v množství 79,77 až 99,9 % hmota.
- 8. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že bezvodá suspenze obsahuje jeden olej vybraný ze skupiny, zahrnující parafinový olej v množství 92,0 až 99,9 % hmota.minerální olej v množství 99,9 % hmota.olivový olej v množství 79,77 % hmota, a slunečnicový olej v množství 92,0 % hmota.
- 9. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že stabilizovaná suspenze mikroorganismu Pythium oligandrum je bezvodá a stabilizátorem je glycerol v množství 79,77 % hmota.
- 10. Biologický protiplísňový kapalný prostředek podle některého z předcházejících nároků 1 až9, vyznačující se tím, že obsahuje, jakožto nosič oospor mikroorganismu Pythium oligandrum,6,5 % hmota, oxidu křemičitého nebo16,0 % hmota, postupně se uvolňující biodegradovatelnou matrici jako je póly viny lalkohol.
- 11. Způsob výroby biologického protiplísňového kapalného prostředku s mikroorganismem Pythium oligandrum, zahrnující stabilizovanou suspenzi mikroorganismu Pythium oligandrum podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, žea) k aerobní kultivaci oomycety Pythium oligandrum v kapalné fázi se použije kapalné médium obsahující extrakt z obilovin, třtinovou melasu a další nezbytné živiny, kapalné médium se sterilizuje,b) po vychladnutí se zaočkuje jedním z vybraných kmenů Pythium oligandrum,c) po skončení kultivace se biomasa sklidí a zpracuje,d) následně po ukončení kultivační fáze Pythium oligandrum v kapalné fázi se biomasa s kapalným médiem homogenizuje, aby velikost minimálně 95 % částic v suspenzi byla v rozmezí 0,050 až 0,300 mm, s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm af) získaná homogenní suspenze, charakterizovaná počtem oospor, se podle počta oospor následnou běžnou standardizací - zkoncentruje nebo zředí - na předem požadovanou koncentraci oospor daného biologického protiplísňového kapalného prostředku.
- 12. Způsob výroby biologického protiplísňového kapalného prostředku s mikroorganismem Pythium oligandrum, zahrnující stabilizovanou suspenzi mikroorganismu Pythium oligandrum podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, žeg) pro kultivaci mikroorganismu Pythium oligandrum na pevném substrátu se připraví médium obsahující zma obilnin, výhodně loupané obilky prosa, např. Panicům miliaceum L., které se smíchají s podílem živného kapalného média,h) médium se v kultivačních nádobách sterilizuje,i) po vychladnutí se médium naočkuje jedním z vybraných kmenů Pythium oligandrum, po skončení procesu kultivace se sklizená biomasa dále zpracuje do formy suspenzního koncentrátu,-27 CZ 308399 B6k) po ukončení kultivační fáze Pythium oligandrum na pevném substrátu se biomasa homogenizuje, v odpovídajícím objemu demineralizované vody tak, aby výsledná velikost minimálně 95 % částic v suspenzi byla v rozmezí 0,050 až 0,300 mm, s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm a1) získaná homogenní suspenze, charakterizovaná počtem oospor, se podle počtu oospor následnou běžnou standardizací - zkoncentruje nebo zředí - na předem požadovanou koncentraci oospor vhodnou k přípravě daného biologického protiplísňového kapalného prostředku.
- 13. Způsob výroby biologického protiplísňového kapalného prostředku s mikroorganismem Pythium oligandrum podle některého z nároků 11 nebo 12, vyznačující se tím, žem) pro bezvodou suspenzi mikroorganismu Pythium oligandrum se po ukončení kultivační fáze na pevném substrátu nebo v kapalné fázi získaný materiál homogenizuje, aby výsledná velikost minimálně 95 % částic v suspenzi byla 0,050 až 0,300 mm, s výhodou v rozmezí 0,050 až 0,125 mm,n) získaná homogenní suspenze, charakterizovaná počtem oospor, se následně odstředío) a odstředěný materiál se po odstranění supematantu následnou běžnou standardizací doplní olejem nebo glycerolem na předem požadovanou koncentraci oospor vhodnou k přípravě daného biologického protiplísňového kapalného prostředku,p) následně se získaný materiál resuspenduje.
- 14. Způsob výroby biologického protiplísňového kapalného prostředku s mikroorganismem Pythium oligandrum podle některého z nároků 11 až 13, vyznačující se tím, že k zajištění maximální přípustné velikosti částic mikroorganizmu Pythium oligandrum v daném rozmezí 0,050 až 0,300 mm, s výhodou 0,050 až 0,125 mm, se suspenze po homogenizaci separuje, např. filtruje na předem danou velikost částic a následnou běžnou standardizací se suspenze zkoncentruje nebo naředí.
- 15. Způsob výroby podle některého z nároků 11 až 14, vyznačující se tím, že vodná suspenze se při homogenizaci stabilizuje běžnou standardizací přídavkem osmolytů a v kombinaci s uchováváním při teplotách nižších než 8 °C se skladuje ve sterilních velkoobjemových nádobách.
Priority Applications (23)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TNP/2019/000120A TN2019000120A1 (en) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Biological antifugal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production |
| MX2019001363A MX2019001363A (es) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Producto biologico liquido antifungico que contiene el microorganismo pythium oligandrum y metodo de produccion. |
| PCT/CZ2017/000064 WO2018068774A2 (en) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Biological antifugal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production |
| EP17809170.8A EP3525592A2 (en) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Biological antifungal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production |
| BR112019007376A BR112019007376B1 (pt) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Produto antifúngico biológico líquido, e, método de produção do produto antifúngico biológico líquido. |
| JP2019517801A JP2019530455A (ja) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | 微生物ピシウム・オリガンドラムを含む生物学的抗真菌液体製品及び製造方法 |
| PE2019000819A PE20191317A1 (es) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Producto biologico liquido antifungico que contiene el microorganismo pythium oligandrum y metodo de produccion |
| CR20190231A CR20190231A (es) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Producto biologico liquido antungico que contiene el microorganismo pythium oligandrum y metodo de producción |
| UAA201905120A UA127216C2 (uk) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Рідкий біологічний протигрибковий препарат, що містить мікроорганізм pythium oligandrum, та спосіб його отримання |
| EA201990201A EA201990201A1 (ru) | 2017-10-16 | 2017-10-16 | Жидкий биологический противогрибковый препарат, содержащий микроорганизм pythium oligandrum, и способ его получения |
| KR1020247001302A KR20240017085A (ko) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | 피씨움 올리간드럼을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물 및 제조 방법 |
| AU2017344214A AU2017344214A1 (en) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Biological antifugal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production |
| CZ2017-661A CZ308399B6 (cs) | 2017-10-16 | 2017-10-16 | Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby |
| CN201780052778.9A CN110072392A (zh) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | 含有寡雄腐霉微生物的液体生物抗真菌制品和制备方法 |
| US16/326,032 US20210386073A1 (en) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Biological antifugal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production |
| CA3040613A CA3040613A1 (en) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Liquid biological antifungal product containing the pythium oligandrum microorganism and method of production |
| KR1020197013191A KR20190082780A (ko) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | 피씨움 올리간드럼을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물 및 제조 방법 |
| ZA2019/02252A ZA201902252B (en) | 2016-10-14 | 2019-04-10 | Biological antifungal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production |
| IL265999A IL265999B (en) | 2016-10-14 | 2019-04-12 | Liquid antifungal biological preparation including Pythium oligandrum microorganism and production method |
| CL2019001006A CL2019001006A1 (es) | 2016-10-14 | 2019-04-12 | Producto biológico líquido antifúngico que contiene el microorganismo pythium oligandrum y método de producción. |
| PH12019500797A PH12019500797A1 (en) | 2016-10-14 | 2019-04-12 | Biological antifugal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production |
| CONC2019/0004381A CO2019004381A2 (es) | 2016-10-14 | 2019-04-29 | Producto biológico líquido antifúngico que contiene el microorganismo pythium oligandrum y método de producción |
| AU2022204145A AU2022204145B2 (en) | 2016-10-14 | 2022-06-14 | Biological antifungal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-661A CZ308399B6 (cs) | 2017-10-16 | 2017-10-16 | Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2017661A3 CZ2017661A3 (cs) | 2019-05-09 |
| CZ308399B6 true CZ308399B6 (cs) | 2020-07-29 |
Family
ID=66344449
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2017-661A CZ308399B6 (cs) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ308399B6 (cs) |
| EA (1) | EA201990201A1 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118743398A (zh) * | 2024-06-17 | 2024-10-08 | 甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所 | 一种抗当归麻口病的复合微生物菌剂及其制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010143876A (ja) * | 2008-12-19 | 2010-07-01 | National Agriculture & Food Research Organization | 植物病害防除剤 |
| CZ302297B6 (cs) * | 2009-11-04 | 2011-02-09 | Bio Agens Research And Development - Bard, S.R.O. | Protiplísnová smes s houbovým organismem Pythium oligandrum |
| CZ303908B6 (cs) * | 2009-11-27 | 2013-06-19 | BIOPREPARÁTY, spol. s r.o. | Pouzití houbového organismu Pythium oligandrum |
-
2017
- 2017-10-16 EA EA201990201A patent/EA201990201A1/ru unknown
- 2017-10-16 CZ CZ2017-661A patent/CZ308399B6/cs unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010143876A (ja) * | 2008-12-19 | 2010-07-01 | National Agriculture & Food Research Organization | 植物病害防除剤 |
| CZ302297B6 (cs) * | 2009-11-04 | 2011-02-09 | Bio Agens Research And Development - Bard, S.R.O. | Protiplísnová smes s houbovým organismem Pythium oligandrum |
| CZ303908B6 (cs) * | 2009-11-27 | 2013-06-19 | BIOPREPARÁTY, spol. s r.o. | Pouzití houbového organismu Pythium oligandrum |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CLIQUET S. et al.: „Development of a defined medium for Pythium oligandrum oospore production", Biocontrol Science and Technology, vol. 12, no. 4, 2002, str. 455 - 467, ISSN 0968-3157 * |
| IKEDA S. et al.: „Biocontrol of black scurf on potato by seed tuber treatment with Pythium oligandrum", Biological Control, vol. 60, no. 3, 2012, str. 297 - 304, ISSN 1049-9644 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201990201A1 (ru) | 2019-08-30 |
| CZ2017661A3 (cs) | 2019-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2022204145B2 (en) | Biological antifungal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production | |
| CN111254086B (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在生防中的应用 | |
| JP3059245B2 (ja) | トリコデルマの新規な分離菌、この分離菌を含有する殺菌組成物、並びにｂ．シネレアおよびｓ．スクレロチオルムに対するその使用 | |
| CN109182137A (zh) | 一株防病促生的非洲哈茨木霉及其应用 | |
| CN1069391A (zh) | 控制既成的植物病害的脂肪酸组合物 | |
| CN111961598B (zh) | 一种爪哇棒束孢菌株及其在防治黄曲条跳甲方面的应用 | |
| Sanogo et al. | Production and germination of conidia of Trichoderma stromaticum, a mycoparasite of Crinipellis perniciosa on cacao | |
| Lahlali et al. | Control of citrus blue mold by the antagonist yeast Pichia guilliermondii Z1: Compatibility with commercial fruit waxes and putative mechanisms of action | |
| De Corato et al. | Use of alginate for extending shelf life in a lyophilized yeast-based formulate in controlling green mould disease on citrus fruit under postharvest condition | |
| FR3097557A1 (fr) | Nouvel agent de biocontrole et son utilisation pour la lutte contre des maladies fongiques de plantes | |
| CN103642704B (zh) | 棉花内生真菌cef-714及其在棉花黄萎病防治中的应用 | |
| EP1990404A1 (fr) | Souche de trichoderma atroviride, procédé d'isolement d'une telle souche, procédé d'obtention d'un produit à base d'une telle souche et utilisation d'une telle souche | |
| CZ308399B6 (cs) | Biologický protiplísňový kapalný prostředek s mikroorganismem Pythium oligandrum a způsob jeho výroby | |
| Sagar | Investigations on the etiology, epidemiology and integrated management of rhizome rot complex of ginger and turmeric | |
| WO2005121314A2 (en) | Pochonia chlamydosporia strain pcmr and method to use it in biological control of the root-knot-nematode (meloidogyne spp.) | |
| CN115806880B (zh) | 一种白僵菌及其分离和筛选方法和在防治枳壳虫害上的应用 | |
| CN1785989A (zh) | 吡喃酮抗生素及其制备方法与应用 | |
| EA042498B1 (ru) | Жидкий биологический противогрибковый препарат, содержащий микроорганизм pythium oligandrum, и способ его получения | |
| CN114214262A (zh) | 一种增强杀虫效力和抗非生物逆境能力的生防真菌孢子培养方法 | |
| Bailey et al. | Influence of adjuvants on disease development by Pleospora papaveracea on opium poppy (Papaver somniferum) | |
| CN114521485A (zh) | 一种防治梨火疫病菌引发病害的果树授粉方法 | |
| CN114554853A (zh) | 用于植物以预防或减少真菌病原体的微生物组合物 | |
| Tongsri et al. | Yeast metabolites inhibit banana anthracnose fungus Colletotrichum musae | |
| Swarnapriya et al. | Role of nanomaterials in vegetable crops | |
| KR102670639B1 (ko) | 뿌리응애 방제능을 가지는 메타리지움 아니소플리애 432 균주 및 이의 용도 |