CN102286417B - 高密度粪肠球菌及其发酵培养工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高密度粪肠球菌及其发酵培养工艺，用高密度固体发酵培养工艺，1）以米糠、麸皮、玉米粉、豆粕中任意一种或几种原料，和活性炭作固态培养基料；2）于固态培养基料中加入营养液培养基作为固态发酵培养基；3）将固态发酵培养基灭菌后，接种粪肠球菌种液，经培养，干燥，粉碎制得高密度粪肠球菌产品；所述的营养液培养基各质量组分组成为：葡萄糖：5～20.0，蛋白胨：1～10.0，牛肉膏：1～5.0，酵母膏：1～5.0，硫酸镁0～0.5，硫酸锰0～0.2，磷酸氢二钾：0.5～3.0，去离子水1000，pH6.0～7.5；具有投资少、节能减排、清洁环保、产品保存性好，活性高，产品含活菌量高等特点。
Description
技术领域：本发明涉及饲料级微生物及其发酵培养工艺，特别是高密度粪肠球菌及其发酵培养工艺。
背景技术：粪肠球菌（Enterococcus faeccalis)，也叫粪链球菌，是我国农业部允许使用的16种饲料用微生物品种之一，美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)则公布了44种“可直接饲喂且通常认为是安全的微生物(Generally Recognized as Safe，GRAS)”作为微生态制剂的出发菌株，其中均有粪肠球菌。
粪肠球菌作为农业部批准使用的有益微生物菌种之一，已被广泛应用于养殖业中，为减少和避免使用抗生素发挥了很大作用。但现有工艺生产的粪肠球菌其质量要求中的一项为有效活菌数不足，直接影响其使用效果和推广应用。
经过广泛不完全收集统计国内厂商样品，发现国内固态发酵工艺生产厂家所生产产品含活菌量仅为20～30亿/克的水平，且在保存期衰减损失率大，特别是经85℃高温处理的损失率更大；未见粪肠球菌采用高密度固态发酵培养工艺生产的报道。
粪肠球菌的研究在国外起步较早，在国内则尚处于研究初级阶段，国外最为先进和著名的产品有瑞士百福门生物公司(Cerbios-Pharma S.A.Swizerland）于2001年进入中国市场的产品：“LBC ME10”，农业部批准文号为：(2001)外饲准285号。赐美健LBC ME10的特点是菌数含量高，活力强，并采用菌种多层包埋技术对细胞进行保护，其含活菌量可达到100亿/克。
目前现有的粪肠球菌生产普遍采用液体深层发酵培养工艺，其存在发酵工艺生产设备投资大，原料及能源消耗量大，且生产出的产品保存性差，球菌活性不高，其含活菌量少，最高为100亿/克。
发明内容：本发明内容是提供一种高密度粪肠球菌及其发酵培养工艺，用高密度固体发酵培养工艺，具有投资少、节能减排、清洁环保、产品保存性好，活性高,产品含活菌量高等特点。
本发明一种粪肠球菌发酵培养工艺是采用固体发酵培养工艺，包括：
1）以米糠、麸皮、玉米粉、豆粕中任意一种或几种原料，和活性炭作固态培养基料；
2）于固态培养基料中加入营养液培养基作为固态发酵培养基；
3）将固态发酵培养基灭菌后,接种粪肠球菌种液,经培养,干燥，粉碎制得高密度粪肠球菌产品；
所述的营养液培养基各质量组分组成为：葡萄糖：5～20.0，蛋白胨：1～10.0，牛肉膏：1～5.0，酵母膏：1～5.0，硫酸镁0～0.5，硫酸锰0～0.2，磷酸氢二钾：0.5～3.0，去离子水1000，pH6.0～7.5；
所述的粪肠球菌种液为用MRS液体培养基培养再接种粪肠球菌制得。
本发明高密度粪肠球菌发酵培养工艺，优选所述固体发酵培养工艺，包括：
1）固态培养基料各组分组成按质量比为 米糠:麸皮:玉米粉:豆粕:活性炭 = 1：1.5～2.5: 1.5～2.5:2.5～3.5:1.5～2.5的比例混合；
2）于上步固态培养基料中按质量比固态培养基料：营养液培养基为1：1～1.5的比例加入营养液培养基，并加入饲料用稀土添加剂，制成固态发酵培养基；
3）将2）步制得的固态发酵培养基，湿热灭菌，冷却后接种粪肠球菌种液，培养，干燥，粉碎制得粪肠球菌产品；
所述的粪肠球菌种液是用MRS液体培养基，经灭菌冷却后，接种粪肠球菌斜面种子，在30℃～40℃温度，180rpm转速下,于摇床上培养18～20小时制得。
本发明所述3）步固态发酵培养基经灭菌冷却后，接种粪肠球菌种液，粪肠球菌种液接入量为固态发酵培养基质量的5～20%，培养过程中控制培养温度30～40℃，时间20～72小时。
本发明所述3）步的培养过程中至少进行一次以上营养液培养基的流加操作。
本发明所述的活性炭为颗粒状活性炭,其颗粒直径控制在3～8mm。
本发明3）步所述的干燥粉碎是发酵培养后，物料于35～50℃下通风干燥至含水量10%以下，再粉碎至60～80目即为粪肠球菌成品。
本发明所述2）步饲料用稀土添加剂为含有镧、铈有效元素的饲料用稀土添加剂；添加剂加入量按质量比是固态培养基料：营养液培养基：饲料用稀土添加剂为1：1.0～1.3：0.00008～0.00015。
本发明所述的粪肠球菌种液的制备是:MRS液体培养基各质量组分组成为：蛋白胨8～12，牛肉膏8～12，酵母膏3～6，柠檬酸氢二铵1～3.0，葡萄糖15～25，吐温801，乙酸钠3～6，磷酸氢二钾1～3，硫酸镁0.4～0. 8，硫酸锰0.1～0.3，蒸馏水800～1200 ，pH = 6.2～6.6；灭菌条件为温度110～121℃，时间20～30分钟,接种粪肠球菌斜面种子，放置于摇床上培养18～24小时，即得到粪肠球菌种液。
本发明所述流加操作分二次进行，是两次将灭菌后的营养液培养基用碳酸钠调节PH值到8～8.5，制成为碱性营养液；再按碱性营养液：固态发酵培养基 = 0.3：1的质量比例加入碱性营养液于固态发酵培养基培养料中，于无菌环境条件下翻料搅拌数分钟，继续培养到结束。
一种高密度粪肠球菌依上面所述的发酵培养工艺制备获得。
下面是本发明产品和国内外样品的对比 表1；
表1：本发明高密度粪肠球菌与国内外样品的储存期损失率对照表
说明:储存过程为常规室温保存，置于阴凉干燥处保存处理；保存一年后，本发明的高密度粪肠球菌仍然在300亿/克以上，进口粪肠球菌却下降到75亿/克，国内样品下降到15亿/克左右。
本发明一种高密度粪肠球菌依据上面所述的粪肠球菌发酵培养工艺方法制备获得，具有如下特点：
具有投资少、节能减排、清洁环保、产品保存性好，活性高等，其成品中有效活菌数可以达到350～500亿/g。
采用清洁、节能的固态发酵培养技术，可获得最多的生物活性代谢物质；用多孔性矿物载体为基质的营养物流加培养技术，最终连同载体一起粉碎处理并作为产品，载体同时起到吸附包埋作用；运用 碱性溶液流加中和培养技术；还 添加特殊稀土促培养技术；气流烘干技术，以保证最大的活菌数量。
附图说明： 图1本发明高密度粪肠球菌的检测平板图；
图中：为本发明产品稀释2亿倍后检测的平板图，有透明圈背景下的一个白点即是粪肠球菌菌落，代表有2亿/克的含量，若是200个菌落代表样品含粪肠球菌量为400亿/克。
具体实施方式：下面结合具体实例对本发明作进一步说明。
本发明具体实施内容各原料制备如下：
（1）制备粪肠球菌种子液：用MRS液体培养基培养获得,MRS液体培养基配方：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温801.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，远离子水用蒸馏水1 000 mL ，pH 6.2～6.6，灭菌条件为121℃，20～30min；每50毫升灭菌后的液体培养基装于250毫升三角瓶中，接种斜面粪肠球菌种子一接种环，放置于摇床上培养18～24小时，即得到粪肠球菌种子液。
（2）营养液培养基制备：制备固态发酵过程中需要流加的营养液培养基， 配方为：葡萄糖：5～20.0g，蛋白胨：1～10.0g，牛肉膏：1～5.0g，酵母膏：1～5.0g，硫酸镁0～0.5g，硫酸锰0～0.2g，磷酸氢二钾：0.5～3.0g，去离子水1000ml，pH6.5～7.2；
（3）固态发酵培养基配制和灭菌：固态发酵培养基包括麸皮、玉米粉、豆粕、米糠、颗粒活性炭等，在固态培养基料中再加入上述营养液培养基作为固态发酵培养基营养液，再加入采自宜春四一四矿的含有镧、铈有效元素用于饲料稀土添加剂的稀土（市售获得）作为促培养剂，固态培养基：液体培养基：稀土比例为1：1.0～1.3：0.0001 ，拌匀后灭菌，灭菌条件为121℃，20～30min。
（4）固态发酵培养：对灭菌冷却后的固态发酵培养基接种培养：按接种量5～20%，在灭好菌的固态发酵培养基中接入粪肠球菌种子液，在30～37℃无菌环境下培养24～72h。
（5）培养过程中营养液培养基和固态发酵培养基的流加操作：培养20小时后，将上述灭菌冷却后的营养液培养基用碳酸钠调节PH值到8.5，即成为碱性营养液，按碱性营养液：固态发酵培养基为0.3：1的比例加入碱性营养液，于无菌环境中简单翻料搅拌几分钟，继续培养，培养到40小时时，重复上述的补充流加碱性营养液的操作，再继续培养到72小时时即培养完毕。
（6）干燥粉碎：出料后，于35～50℃下通风干燥至含水量10%以下时结束。粉碎至60目即为粪肠球菌高密度固态发酵成品，用平板培养检测法检测粪肠球菌其含活菌量达到350～500亿/g。
固态培养基料的各组分的加入量，粪肠球菌种液接入固态发酵培养基的量均可按现有技术的配比或接入量计加入，而饲料用稀土添加剂可由市售获得，并按说明添加。
实施例1：除下述说明外其余和上述高密度粪肠球菌固态发酵工艺相同，步骤及操作如下：
1、用灭菌MRS液体培养基作为种子培养基，在250毫升三角瓶中装入灭菌冷却后的MRS液体培养基50毫升，接种粪肠球菌斜面种子一环，在35℃摇床上培养18～24h，成为接种用粪肠球菌种子液。
2、营养液培养基制备：制备固态发酵过程中需要流加的营养液培养基， 配方为：葡萄糖：5～20.0g，蛋白胨：1～10.0g，牛肉膏：1～5.0g，酵母膏：1～5.0g，硫酸镁0～0.5g，硫酸锰0～0.2g，磷酸氢二钾：0.5～3.0g，去离子水或蒸馏水1000ml，pH6.5～7.2；
3、配制固态发酵物料：将米糠、麸皮、玉米粉、豆粕、5mm直径的颗粒活性炭按质量比1：2： 3：2的比例混合均匀，即成为固态培养基料，在固态培养基料中再加入上述营养液培养基作为固态发酵培养基营养液，再加入宜春四一四矿的含有镧、铈有效元素用于饲料稀土添加剂的稀土（市售获得）作为促培养剂，固态培养基：液体培养基：饲料稀土添加剂比例为1：1.0～1.3：0.0001 ，拌匀后灭菌，灭菌条件为121℃，20～30min。
4、接种：待灭菌物料冷却至室温后，接入粪肠球菌种子液，接种量按固态基料质量的10%计算。
5、将接好种的物料放置培养室35℃无菌环境中进行培养，培养20小时后，将前述灭菌后的营养液培养基用碳酸钠调节PH值到8.5，即成为碱性营养液，按碱性营养液：固态发酵培养基为0.3：1的比例加入碱性营养液，于无菌环境中简单翻料搅拌几分钟，继续培养，培养到40小时时，重复上述的补充流加碱性营养液的操作，再继续培养到72小时时即培养完毕。
6、出料后的物料于35～50℃通风干燥，干燥至含水量10%以下时结束。
7、粉碎干燥好的物料，即为本发明产品350～500亿/g的粪肠球菌高密度固态发酵成品。
8、检测培养基为：蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g，葡萄糖20.0g，氯化钠5.0g琼脂粉10.0g碳酸钙10.0g，蒸馏水1000ml，pH自然，33℃培养48h。
检测操作方法简述：将样品采用逐级稀释方法，用无菌生理盐水稀释2亿倍，制成负2亿倍的菌悬液，将事先灭好菌的90mm平板培养皿放于无菌操作室内，将上述检测培养基用三角瓶装好灭菌并冷却到45℃左右，置于45℃恒温水浴锅内保温备用；
在平板培养皿中注入1毫升稀释后的菌悬液，然后注入上述45℃的溶解状态的琼脂培养基，在接种台上转动平板培养皿几圈，使培养基与菌悬液混合均匀，待凝固后，置于33℃恒温培养箱中培养48小时；
检测计数方法：培养结束后，由于乳酸粪肠球菌在培养过程中分泌L-乳酸，将培养基中的碳酸钙溶解，使得菌落的周围形成一个透明圈，所以，计数有透明圈的菌落，即为乳酸粪肠球菌的菌落，计数结果乘以2亿，即得到样品的乳酸粪肠球菌菌数含量，本发明专利可以培养得到350～500亿cfu/g的乳酸粪肠球菌含量。
说明：cfu/g单位是指：每克样品含有的有效菌落形成单位。
Claims (9)
1.一种高密度粪肠球菌发酵培养方法，其特征是采用固体发酵培养工艺，包括：
1）以米糠、麸皮、玉米粉、豆粕中任意一种或几种原料，和活性炭作为固态培养基料；
2）于固态培养基料中加入营养液培养基作为固态发酵培养基；
3）将固态发酵培养基灭菌后,接种粪肠球菌种液,经培养,干燥，粉碎制得高密度粪肠球菌产品；
所述的营养液培养基各质量份组分组成为：葡萄糖：5～20.0，蛋白胨：1～10.0，牛肉膏：1～5.0，酵母膏：1～5.0，硫酸镁0～0.5，硫酸锰0～0.2，磷酸氢二钾：0.5～3.0，去离子水1000，pH6.0～7.5；
所述的粪肠球菌种液为用MRS液体培养基接种粪肠球菌培养制得。
2.依据权利要求1所述的高密度粪肠球菌发酵培养方法，其特征是所述固体发酵培养工艺，包括：
1）固态培养基料各组分组成按质量比为 米糠:麸皮:玉米粉:豆粕:活性炭 = 1：1.5～2.5: 1.5～2.5:2.5～3.5:1.5～2.5的比例混合；
2）于上步固态培养基料中按质量比固态培养基料：营养液培养基为1：1～1.5的比例加入营养液培养基，并加入饲料用稀土添加剂，制成固态发酵培养基；
3）将2）步制得的固态发酵培养基，湿热灭菌，冷却后接种粪肠球菌种液，培养，干燥，粉碎制粪肠球菌产品；
所述的粪肠球菌种液是用MRS液体培养基，经灭菌冷却后，接种粪肠球菌斜面种子，在30℃～40℃温度，180rpm转速下,于摇床上培养18～20小时制得。
3.依据权利要求1或2所述的高密度粪肠球菌发酵培养方法，其特征是所述3）步固态发酵培养基经灭菌冷却后，接种粪肠球菌种液，粪肠球菌种液接入量为固态发酵培养基质量的5～20%，培养过程中控制培养温度30～40℃，时间20～72小时。
4.依据权利要求1或2所述的高密度粪肠球菌发酵培养方法，其特征是所述3）步的培养过程中至少进行一次以上营养液培养基的流加操作。
5.依据权利要求1或2所述的高密度粪肠球菌发酵培养方法，其特征是所述活性炭为颗粒状活性炭,其颗粒直径控制在3～8mm。
6.依据权利要求1或2所述的高密度粪肠球菌发酵培养方法，其特征是3）步所述的干燥粉碎是发酵培养后，物料于35～50℃下通风干燥至含水量10%以下，再粉碎至60～80目即为粪肠球菌成品。
7.依据权利要求2所述的高密度粪肠球菌发酵培养方法，其特征是所述2）步饲料用稀土添加剂为含有镧、铈有效元素的饲料用稀土添加剂；添加剂加入量按质量比是固态培养基料：营养液培养基：饲料用稀土添加剂为1：1.0～1.3：0.00008～0.00015。
8.依据权利要求1或2所述的高密度粪肠球菌发酵培养方法，其特征是所述的粪肠球菌种液的制备是:MRS液体培养基各质量份组分组成为：蛋白胨8～12，牛肉膏8～12，酵母膏3～6，柠檬酸氢二铵1～3.0，葡萄糖15～25，吐温801，乙酸钠3～6，磷酸氢二钾1～3，硫酸镁0.4～0.8，硫酸锰0.1～0.3，蒸馏水800～1200 ，pH = 6.2～6.6；灭菌条件为温度110～121℃，时间20～30分钟,接种粪肠球菌斜面种子，放置于摇床上培养18～24小时，即得到粪肠球菌种液。
9.依据权利要求4所述的高密度粪肠球菌发酵培养方法，其特征是分二次进行流加操作，是两次将灭菌后的营养液培养基用碳酸钠调节PH值到8～8.5，制成为碱性营养液；再按碱性营养液：固态发酵培养基 =0.3：1的质量比例加入碱性营养液于固态发酵培养基培养料中，于无菌环境条件下翻料搅拌数分钟，继续培养到结束。
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| GR01 | Patent grant |