CN103540550B - 乳酸粪链球菌的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种乳酸粪链球菌的发酵方法，解决了现有乳酸粪链球菌在发酵过程中存在菌数偏低的问题。本发明方法由一、二、三级培养基的配制，一、二、三级种子培养，发酵罐培养液的配制和发酵罐内培养液的发酵四个步骤完成。本发明方法中的培养基成分易得且价格便宜，工艺参数简单、发酵周期短，所得的乳酸粪链球菌活菌数高且质量稳定，乳酸粪链球菌活菌数可以达到不少于50亿个/ml，显著提高了产品质量，值得推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵工程技术领域，具体是一种乳酸粪链球菌的发酵方法。
背景技术
乳酸粪链球菌属于肠球菌中的一种，是兼性厌氧的乳酸菌，它不仅是人和动物肠道中常见的正常菌种，还用于改善食品、饲料的质量。乳酸粪链球菌相对于严格厌氧、培养保存条件苛刻的双歧杆菌、乳杆菌来说，它是便于生产和使用的首选菌种。1989年美国FDA就公布它为可直接用于动物的菌种之一。大量实验证明，由乳酸粪链球菌组成的益生素可提高幼年畜禽的体增重，改善饲料报酬，减少腹泻率，降低死亡率。另外，乳酸粪链球菌代谢产生有机酸、双乙酰、过氧化氢、细菌素等物质，这些物质具有抑制病原菌和腐败菌、提高免疫力、改善畜产品品质等生理功效。因此，乳酸粪链球菌在畜牧生产中有着广泛的应用发展前景。
目前国内众多乳酸粪链球菌生产企业在乳酸粪链球菌发酵过程中，由于发酵技术的限制，造成了乳酸粪链球菌菌数偏低的问题，一般含量在37亿/ml以下，大大影响了产品的成本以及质量，为此，采取措施提高乳酸粪链球菌的活菌率是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有乳酸粪链球菌在发酵过程中存在菌数偏低的问题，而提供一种乳酸粪链球菌的发酵方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种乳酸粪链球菌的发酵方法，包括如下步骤：
1）一、二、三级培养基的配制：按质量比为100:6:12:20:20:20分别称取牛心浸液、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液、羊肝浸液和葡萄糖，将牛心浸液、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液和羊肝浸液混合得到混合液A，向混合液A中添加碳酸钠调节混合液A的pH至7.2-7.4，然后将混合液A煮沸过滤后得到滤液A，将葡萄糖添加到滤液A中搅拌均匀得到混合液B，分别取15ml混合液B作为一级培养基、取150ml混合液B作为二级培养基、取800ml混合液B作为三级培养基，其中，一级培养基中添加有质量为15ml混合液B质量1.5-2%的琼脂，一、二、三级培养基经115℃蒸汽灭菌25min后，再空白培养24h（空白培养是指里面不加任何菌种培养，这是本领域技术人员所熟知的），最后置于冰箱保存备用，冰箱温度控制在4-8℃；
2）一、二、三级种子培养：取乳酸粪链球菌作为菌种接入空白斜面试管内并在37-39℃下培养18-20h得到斜面菌种，其中，所取的乳酸粪链球菌的质量与步骤1）中牛心浸液的质量比为0.5:100；将得到的斜面菌种接入一级培养基中并在37-39℃下培养18-20h得到一级种子，将一级种子接入二级培养基中并在37-39℃下培养18-20h得到二级种子，将二级种子接入三级培养基中并在37-39℃下培养18-20h得到三级种子；
3）发酵罐培养液的配制：按质量比为9:9:72:20:20:18:72：400:1400分别称取牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液、羊肝浸液、碳酸钙、葡萄糖、纯化水A和纯化水B；将称量好的纯化水A、牛肉膏、氯化钠和蛋白胨加入夹层锅内，打开夹层锅的蒸汽阀，加热搅拌使其充分溶解，加热温度为80-85℃，再将称量好的猪肝浸液和羊肝浸液加入到夹层锅内，搅拌均匀得到混合液C，通过向混合液C中添加碳酸钠调节混合液C的pH至7.2-7.4，最后过滤混合液C得到滤液B；将滤液B以及称量好的纯化水B、碳酸钙、葡萄糖加入发酵罐中搅拌均匀得到培养液A，对培养液A进行121℃蒸汽灭菌25min后，放冷至37-40℃；
4）发酵罐内培养液的发酵：将步骤2）中得到的三级种子加入到发酵罐内的培养液A中，三级种子与培养液A的质量比为1:580，然后在39-41℃培养16-18h，培养过程中每隔1h开动发酵罐搅拌一次，每次搅拌10min，等发酵罐内的碳酸钙完全消失时，发酵完成即可放罐。
进一步地，所述的牛心浸液制备方法如下：取新鲜的牛心，除去脂肪、筋膜及血管，切细绞碎得到牛心肉末，取牛心肉末并加纯化水，纯化水的添加量为每3g牛心肉末添加10ml纯化水，将添加纯化水的牛心肉末置于冰箱中浸渍18h以上，冰箱温度控制在4-8℃，然后取出水浴加热至肌肉凝结成饼状并浮于液面，水浴加热温度控制在98-100℃，浸液呈澄明淡黄色，放冷至室温，过滤得到的滤液即为所述的牛心浸液；猪肝浸液、羊肝浸液的制备方法与牛心浸液的制备方法相同。
在步骤2）中，作为菌种的乳酸粪链球菌是从直接购买或实验室保存的乳酸粪链球菌斜面挑去少许菌落划线于培养基平皿上培养，反复多次，最后选取平皿上的大菌落，转接到试管斜面内并在37-39℃下培养18-20h得到斜面菌种。
本发明方法的有益效果在于：培养基成分易得且价格便宜，工艺参数简单、发酵周期短，所得的乳酸粪链球菌活菌数高且质量稳定，乳酸粪链球菌活菌数可以达到不少于50亿个/ml，显著提高了产品质量，值得推广使用。
具体实施方式
实施例1
一种乳酸粪链球菌的发酵方法，包括如下步骤：
1）一、二、三级培养基的配制：按质量比为100:6:12:20:20:20分别称取牛心浸液、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液、羊肝浸液和葡萄糖，将牛心浸液、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液和羊肝浸液混合得到混合液A，向混合液A中添加碳酸钠调节混合液A的pH至7.4，然后将混合液A煮沸过滤后得到滤液A，将葡萄糖添加到滤液A中搅拌均匀得到混合液B，分别取15ml混合液B作为一级培养基、取150ml混合液B作为二级培养基、取800ml混合液B作为三级培养基，其中，一级培养基中添加有质量为15ml混合液B质量1.5%的琼脂，一、二、三级培养基经115℃蒸汽灭菌25min后，再空白培养24h，最后置于冰箱保存备用，冰箱温度控制在8℃；
2）一、二、三级种子培养：取乳酸粪链球菌作为菌种接入空白斜面试管内并在38℃下培养20h得到斜面菌种，其中，所取的乳酸粪链球菌的质量与步骤1）中牛心浸液的质量比为0.5:100；将得到的斜面菌种接入一级培养基中并在37℃下培养19h得到一级种子，将一级种子接入二级培养基中并在38℃下培养18h得到二级种子，将二级种子接入三级培养基中并在39℃下培养20h得到三级种子；
3）发酵罐培养液的配制：按质量比为9:9:72:20:20:18:72：400:1400分别称取牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液、羊肝浸液、碳酸钙、葡萄糖、纯化水A和纯化水B；将称量好的纯化水A、牛肉膏、氯化钠和蛋白胨加入夹层锅内，打开夹层锅的蒸汽阀，加热搅拌使其充分溶解，加热温度为83℃，再将称量好的猪肝浸液和羊肝浸液加入到夹层锅内，搅拌均匀得到混合液C，通过向混合液C中添加碳酸钠调节混合液C的pH至7.3，最后过滤混合液C得到滤液B；将滤液B以及称量好的纯化水B、碳酸钙、葡萄糖加入发酵罐中搅拌均匀得到培养液A，对培养液A进行121℃蒸汽灭菌25min后，放冷至38℃；
4）发酵罐内培养液的发酵：将步骤2）中得到的三级种子加入到发酵罐内的培养液A中，三级种子与培养液A的质量比为1:580，然后在39℃培养16h，培养过程中每隔1h开动发酵罐搅拌一次，每次搅拌10min，等发酵罐内的碳酸钙完全消失时，发酵完成即可放罐。
实施例2
一种乳酸粪链球菌的发酵方法，包括如下步骤：
1）一、二、三级培养基的配制：按质量比为100:6:12:20:20:20分别称取牛心浸液、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液、羊肝浸液和葡萄糖，将牛心浸液、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液和羊肝浸液混合得到混合液A，向混合液A中添加碳酸钠调节混合液A的pH至7.3，然后将混合液A煮沸过滤后得到滤液A，将葡萄糖添加到滤液A中搅拌均匀得到混合液B，分别取15ml混合液B作为一级培养基、取150ml混合液B作为二级培养基、取800ml混合液B作为三级培养基，其中，一级培养基中添加有质量为15ml混合液B质量2%的琼脂，一、二、三级培养基经115℃蒸汽灭菌25min后，再空白培养24h，最后置于冰箱保存备用，冰箱温度控制在6℃；
2）一、二、三级种子培养：取乳酸粪链球菌作为菌种接入空白斜面试管内并在37℃下培养19h得到斜面菌种，其中，所取的乳酸粪链球菌的质量与步骤1）中牛心浸液的质量比为0.5:100；将得到的斜面菌种接入一级培养基中并在38℃下培养18h得到一级种子，将一级种子接入二级培养基中并在39℃下培养19h得到二级种子，将二级种子接入三级培养基中并在37℃下培养19h得到三级种子；
3）发酵罐培养液的配制：按质量比为9:9:72:20:20:18:72：400:1400分别称取牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液、羊肝浸液、碳酸钙、葡萄糖、纯化水A和纯化水B；将称量好的纯化水A、牛肉膏、氯化钠和蛋白胨加入夹层锅内，打开夹层锅的蒸汽阀，加热搅拌使其充分溶解，加热温度为80℃，再将称量好的猪肝浸液和羊肝浸液加入到夹层锅内，搅拌均匀得到混合液C，通过向混合液C中添加碳酸钠调节混合液C的pH至7.2，最后过滤混合液C得到滤液B；将滤液B以及称量好的纯化水B、碳酸钙、葡萄糖加入发酵罐中搅拌均匀得到培养液A，对培养液A进行121℃蒸汽灭菌25min后，放冷至40℃；
4）发酵罐内培养液的发酵：将步骤2）中得到的三级种子加入到发酵罐内的培养液A中，三级种子与培养液A的质量比为1:580，然后在41℃培养17h，培养过程中每隔1h开动发酵罐搅拌一次，每次搅拌10min，等发酵罐内的碳酸钙完全消失时，发酵完成即可放罐。
实施例3
一种乳酸粪链球菌的发酵方法，包括如下步骤：
1）一、二、三级培养基的配制：按质量比为100:6:12:20:20:20分别称取牛心浸液、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液、羊肝浸液和葡萄糖，将牛心浸液、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液和羊肝浸液混合得到混合液A，向混合液A中添加碳酸钠调节混合液A的pH至7.2，然后将混合液A煮沸过滤后得到滤液A，将葡萄糖添加到滤液A中搅拌均匀得到混合液B，分别取15ml混合液B作为一级培养基、取150ml混合液B作为二级培养基、取800ml混合液B作为三级培养基，其中，一级培养基中添加有质量为15ml混合液B质量1.8%的琼脂，一、二、三级培养基经115℃蒸汽灭菌25min后，再空白培养24h，最后置于冰箱保存备用，冰箱温度控制在4℃；
2）一、二、三级种子培养：取乳酸粪链球菌作为菌种接入空白斜面试管内并在39℃下培养18h得到斜面菌种，其中，所取的乳酸粪链球菌的质量与步骤1）中牛心浸液的质量比为0.5:100；将得到的斜面菌种接入一级培养基中并在39℃下培养20h得到一级种子，将一级种子接入二级培养基中并在37℃下培养20h得到二级种子，将二级种子接入三级培养基中并在38℃下培养18h得到三级种子；
3）发酵罐培养液的配制：按质量比为9:9:72:20:20:18:72：400:1400分别称取牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液、羊肝浸液、碳酸钙、葡萄糖、纯化水A和纯化水B；将称量好的纯化水A、牛肉膏、氯化钠和蛋白胨加入夹层锅内，打开夹层锅的蒸汽阀，加热搅拌使其充分溶解，加热温度为85℃，再将称量好的猪肝浸液和羊肝浸液加入到夹层锅内，搅拌均匀得到混合液C，通过向混合液C中添加碳酸钠调节混合液C的pH至7.4，最后过滤混合液C得到滤液B；将滤液B以及称量好的纯化水B、碳酸钙、葡萄糖加入发酵罐中搅拌均匀得到培养液A，对培养液A进行121℃蒸汽灭菌25min后，放冷至37℃；
4）发酵罐内培养液的发酵：将步骤2）中得到的三级种子加入到发酵罐内的培养液A中，三级种子与培养液A的质量比为1:580，然后在40℃培养18h，培养过程中每隔1h开动发酵罐搅拌一次，每次搅拌10min，等发酵罐内的碳酸钙完全消失时，发酵完成即可放罐。
按照乳酸菌制剂检验法项下的活乳酸菌数测定法对实施例1、2、3有效活菌数进行测定，得到结果为：实施例1中有效活菌数为52亿/ml，实施例2中有效活菌数为55亿/ml，实施例1中有效活菌数为54亿/ml。
Claims (2)
1.一种乳酸粪链球菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）一、二、三级培养基的配制：按质量比为100:6:12:20:20:20分别称取牛心浸液、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液、羊肝浸液和葡萄糖，将牛心浸液、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液和羊肝浸液混合得到混合液A，向混合液A中添加碳酸钠调节混合液A的pH至7.2-7.4，然后将混合液A煮沸过滤后得到滤液A，将葡萄糖添加到滤液A中搅拌均匀得到混合液B，分别取15ml混合液B作为一级培养基、取150ml混合液B作为二级培养基、取800ml混合液B作为三级培养基，其中，一级培养基中添加有质量为15ml混合液B质量1.5-2%的琼脂，一、二、三级培养基经115℃蒸汽灭菌25min后，再空白培养24h，最后置于冰箱保存备用，冰箱温度控制在4-8℃；
2）一、二、三级种子培养：取乳酸粪链球菌作为菌种接入空白斜面试管内并在37-39℃下培养18-20h得到斜面菌种，其中，所取的乳酸粪链球菌的质量与步骤1）中牛心浸液的质量比为0.5:100；将得到的斜面菌种接入一级培养基中并在37-39℃下培养18-20h得到一级种子，将一级种子接入二级培养基中并在37-39℃下培养18-20h得到二级种子，将二级种子接入三级培养基中并在37-39℃下培养18-20h得到三级种子；
3）发酵罐培养液的配制：按质量比为9:9:72:20:20:18:72：400:1400分别称取牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、猪肝浸液、羊肝浸液、碳酸钙、葡萄糖、纯化水A和纯化水B；将称量好的纯化水A、牛肉膏、氯化钠和蛋白胨加入夹层锅内，打开夹层锅的蒸汽阀，加热搅拌使其充分溶解，加热温度为80-85℃，再将称量好的猪肝浸液和羊肝浸液加入到夹层锅内，搅拌均匀得到混合液C，通过向混合液C中添加碳酸钠调节混合液C的pH至7.2-7.4，最后过滤混合液C得到滤液B；将滤液B以及称量好的纯化水B、碳酸钙、葡萄糖加入发酵罐中搅拌均匀得到培养液A，对培养液A进行121℃蒸汽灭菌25min后，放冷至37-40℃；
4）发酵罐内培养液的发酵：将步骤2）中得到的三级种子加入到发酵罐内的培养液A中，三级种子与培养液A的质量比为1:580，然后在39-41℃培养16-18h，培养过程中每隔1h开动发酵罐搅拌一次，每次搅拌10min，等发酵罐内的碳酸钙完全消失时，发酵完成即可放罐；
其中，所述的牛心浸液制备方法如下：取新鲜的牛心，除去脂肪、筋膜及血管，切细绞碎得到牛心肉末，取牛心肉末并加纯化水，纯化水的添加量为每3g牛心肉末添加10ml纯化水，将添加纯化水的牛心肉末置于冰箱中浸渍18h以上，冰箱温度控制在4-8℃，然后取出水浴加热至肌肉凝结成饼状并浮于液面，水浴加热温度控制在98-100℃，浸液呈澄明淡黄色，放冷至室温，过滤得到的滤液即为所述的牛心浸液；猪肝浸液、羊肝浸液的制备方法与牛心浸液的制备方法相同。
2.根据权利要求1所述的一种乳酸粪链球菌的发酵方法，其特征在于：在步骤2）中，作为菌种的乳酸粪链球菌是从直接购买或实验室保存的乳酸粪链球菌斜面挑取少许菌落划线于培养基平皿上培养，反复多次，最后选取平皿上的大菌落，转接到试管斜面内并在37-39℃下培养18-20h得到斜面菌种。
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