CN104450540B - 高密度嗜热侧孢霉及其发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高密度嗜热侧孢霉及其发酵培养方法，其采用固体发酵培养工艺，包括：1）以米糠、麸皮、玉米粉、豆粕中任意一种或几种原料，和保水性树胶作为固态培养基料；2）于固态培养基料中加入营养液培养基作为固态发酵培养基；3）将固态发酵培养基灭菌后,接种嗜热侧孢霉种子液,经培养,干燥，粉碎制得高密度嗜热侧孢霉产品；所述的营养液培养基为PDA培养基；所述的嗜热侧孢霉种子液为用PDA液体培养基接种嗜热侧孢霉培养制得。用高密度固体发酵培养工艺，具有投资少、节能减排、清洁环保、产品保存性强，活性好,产品含活菌量高等特点。
Description
技术领域：
本发明涉及农用微生物固态培养领域，一种嗜热侧孢霉菌的固态发酵培养工艺，特别是一种高密度嗜热侧孢霉及其发酵培养方法。
背景技术：
嗜热侧孢霉菌主要用于农业种植业，用于堆肥的快速发酵腐熟；嗜热侧孢霉属于真菌，能在恶劣环境中生长繁殖；生存酸度、温度范围宽广，pH5～pH10、5℃～70℃都可生存。
嗜热侧孢霉菌在种植业土壤改良方面的作用：能分泌大量的胞外纤维素酶，木聚糖酶，所以，具有极强的分解能力，并能协同自然界其他土壤微生物，将土壤中的有机质快速和彻底分解为植物易于吸收的小分子养分供植物生长；嗜热侧孢霉菌由于繁殖优势明显，可以显著抑制多种植物病源微生物的生长活性，从而预防多种土传病害。
嗜热侧孢霉菌可改良土壤物理结构和性状，它能通过繁殖产生大量的白色菌丝体，在土壤中形成良好的团粒结构，从而有效改良土壤保水保肥性能。
嗜热侧孢霉菌在发酵秸秆或在有机物料腐熟方面的巨大作用：嗜热侧孢霉菌可以作为发酵堆肥，畜禽粪便快速发酵腐熟，秸秆循环腐熟利用方面起到巨大的作用；
在发酵秸秆方面：嗜热侧孢霉是典型的嗜热纤维素分解真菌，可在较高的温度如40～50℃下能大量分泌纤维素酶、木聚糖酶，从而可将秸秆、腐草、草炭等田间有机物快速分解和腐熟成为植物可以利用的有机质，降解秸秆可在20天内完成；从而在农业领域有巨大的应用空间。
在发酵腐熟畜禽粪便方面：结合秸秆作为发酵腐熟畜禽粪便的填料，秸秆起到疏松的作用，有利于空气供给，有利于好氧发酵，则分解腐熟畜禽粪便只需20天以内，在堆肥（加秸秆辅助）发酵中，堆温可达50～70℃，并可维持高温期在10天以上，不仅可能粪便秸秆充分起到腐熟作用，还可以彻底消除粪便臭味，更重要的是高温能杀死堆肥中的病菌、虫卵、草籽，还可以降解秸秆中的农药残留，络合重金属，从而达到优质堆肥的生产目的，并对环境起到净化作用，消解养殖场非常头痛的粪便污染问题。
嗜热侧孢霉菌在改善植物根系方面的作用：嗜热侧孢霉在土壤中能快速繁殖，既能附生在根表，又能在根系周围形成良好的微生态环境，收集施用嗜热侧孢霉菌腐熟的堆肥植物根系土壤，肉眼能看到灰白色的菌丝，显微镜检查为典型嗜热侧孢霉菌菌丝团，可与植物根系周围土壤形成良性土壤微生态环境，防止植物微生物病害，增加土壤有益微生物的种群和数量，降低作物根部病害的发生频率，起到以菌治菌的效果。
由嗜热侧孢霉菌形成的植物根系微生态系统，能将根系不能到达位置的养分送到根部，又将根系不能直接吸收的养分转化后供给作物利用；同时微生物在生命活动中或死亡后所排出的东西，不仅含有有机养分和N、P、K等无机肥分，还包括多种氨基酸、维生素、细胞分裂素和植物生长素，使作物获得高额产量。
嗜热侧孢霉（Thermophilic sporotrichum)，也是我国农业部允许使用的农用微生物品种之一，在种植业土壤改良方面、发酵秸秆或在有机物料腐熟方面和改善植物根系方面都有重要的作用。该嗜热侧孢霉菌在国内则尚处于研究初级阶段，市售产品含菌量低，市售产品中，其含活菌量少，活菌量仅为5亿/克。目前现有的嗜热侧孢霉生产普遍采用初级的固态发酵培养工艺，其存在发酵工艺生产设备简陋，其发酵工艺生产设备投资大，原料及能源消耗量大，且生产出的嗜热侧孢霉产品质量参差不齐，保存性差，杂菌众多，菌活性不高。
目前还没有采用固态发酵培养工艺生产高密度嗜热侧孢霉及其发酵培养方法的报道。
发明内容：
本发明提供一种高密度嗜热侧孢霉及其发酵培养方法，用高密度固体发酵培养工艺，具有投资少、节能减排、清洁环保、产品保存性强，活性好,产品含活菌量高等特点。
本发明一种高密度嗜热侧孢霉发酵培养方法，其采用固体发酵培养工艺，包括：1）以米糠、麸皮、玉米粉、豆粕中任意一种或几种原料，和保水性树胶作为固态培养基料；2）于固态培养基料中加入营养液培养基作为固态发酵培养基； 3）将固态发酵培养基灭菌后,接种嗜热侧孢霉种子液,经培养,干燥，粉碎制得高密度嗜热侧孢霉产品；所述的营养液培养基为PDA培养基；
所述的嗜热侧孢霉种子液为用PDA液体培养基接种嗜热侧孢霉培养制得。
本发明所述的高密度嗜热侧孢霉发酵培养方法，其所述固体发酵培养工艺，优选为包括：
1）固态培养基料各组分组成按质量比为 米糠:麸皮:玉米粉:豆粕：保水性树胶= 1:（1.5-3.5）:（ 1.0-1.5）:（1.5-2.5）:（0.05-0.1）的比例混合；
2）于上步固态培养基料中按质量比固态培养基料：营养液培养基为1：（1-1.5）的比例加入营养液培养基，并加入饲料用稀土添加剂，制成固态发酵培养基；
3）将2）步制得的固态发酵培养基，湿热灭菌，冷却后接种嗜热侧孢霉种子液，经培养，干燥，粉碎制得高密度嗜热侧孢霉产品；所述的嗜热侧孢霉种子液是用PDA液体培养基，经灭菌冷却后，接种嗜热侧孢霉斜面种子，在30℃-40℃温度，180rpm转速下,于摇床上培养18-20小时制得。
本发明所述的高密度嗜热侧孢霉发酵培养方法，所述3）步接种嗜热侧孢霉种子液，嗜热侧孢霉种子液接入量为固态发酵培养基质量的1-20%，培养过程中控制培养温度30-40℃，时间20-72小时。
所述的高密度嗜热侧孢霉发酵培养方法，其所述3）步的培养过程中至少进行一次以上营养液培养基的流加操作。
本发明所述的高密度嗜热侧孢霉发酵培养方法，其3）步所述的干燥粉碎是发酵培养后，物料于35-50℃下通风干燥至含水量10Wt%以下，再粉碎至60-80目即为高密度嗜热侧孢霉成品。
本发明所述的高密度嗜热侧孢霉发酵培养方法，其所述2）步饲料用稀土添加剂为含有镧、铈有效元素的饲料用稀土添加剂；添加剂加入量按质量比是固态培养基料：营养液培养基：饲料用稀土添加剂为1：（1.0-1.3）：（0.00005-0.00015）。
本发明所述的高密度嗜热侧孢霉发酵培养方法，其所述的嗜热侧孢霉种子液的制备是:称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml高压蒸煮20分钟，过滤，再加10-20g葡萄糖，充分溶解后趁热过滤。灭菌条件为温度110-121℃，时间20-30分钟,冷却后接种嗜热侧孢霉斜面种子，放置于摇床上培养18-48小时，即得到嗜热侧孢霉种子液。
本发明所述的高密度嗜热侧孢霉发酵培养方法，优选是分二次进行流加操作，是两次将灭菌后的营养液培养基按营养液：固态发酵培养基 =（ 0.1-0.3）：1的质量比例加入营养液于固态发酵培养基培养料中，于无菌环境条件下翻料搅拌数分钟，继续培养到结束。
本发明一种高密度嗜热侧孢霉依据上面所述的嗜热侧孢霉发酵培养方法制备获得。 本发明所述制备高密度嗜热侧孢霉即是指高密度嗜热侧孢霉培养物。
本发明高密度嗜热侧孢霉依据上面所述的嗜热侧孢霉发酵培养工艺方法制备获得，具有如下特点：具有投资少、节能减排、清洁环保、产品保存性好，活性高等，其成品中有效活菌数可以达到100-200亿/g。
采用清洁、节能的固态发酵培养技术，可获得最多的生物活性代谢物质；用保水性树胶载体为基质的营养物流加培养技术，最终连同载体一起粉碎处理并作为产品，载体同时起到吸附包埋作用；运用培养液流加培养技术；还添加特殊稀土促培养技术；气流烘干技术，以保证最大的活菌数量。
附图说明：
图1为本发明高密度嗜热侧孢霉产品稀释2亿倍后检测的平板图；
图中：图中小点均是嗜热侧孢霉菌落，菌落开始白色，后变成灶土色，最后变成咖啡色；每一个小点菌落代表有2亿/克的含量，若是20个菌落代表样品含嗜热侧孢霉量为40亿/克。
具体实施方式：下面结合具体实例对本发明作进一步说明；质量或质量比。
本发明具体实施内容各原料制备如下： （1）制备嗜热侧孢霉种子液PDA培养基：其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml高压蒸煮20分钟，过滤，再加10-20g葡萄糖，充分溶解后热过滤，冷却后贮存备用。灭菌条件为：控制灭菌温度为121℃，时间20-30min；每50毫升灭菌后的液体培养基装于250毫升三角瓶中，接种斜面嗜热侧孢霉种子一接种环，放置于摇床上培养18～24小时，即得到嗜热侧孢霉种子液。
（2）营养液培养基制备：制备固态发酵过程中需要流加的营养液培养基，制备方法同（1)所述PDA培养液，灭菌冷却后贮存备用。
（3）固态发酵培养基配制和灭菌：固态发酵培养基包括麸皮、玉米粉、豆粕、米糠、保水性树胶等，在固态培养基料中再加入上述营养液培养基作为固态发酵培养基营养液，再加入采自江西市场某地的含有镧、铈有效元素用于饲料稀土添加剂的稀土（市售获得）作为促培养剂，固态培养基：液体培养基：稀土比例为1：（1.0-1.3）：0.0001 ，拌匀后灭菌，灭菌条件为121℃，20-30min。
（4）固态发酵培养：对灭菌冷却后的固态发酵培养基接种培养：按接种量5-20%，在灭好菌的固态发酵培养基中接入嗜热侧孢霉种子液，在30～37℃无菌环境下培养24～72h；培养过程中营养液培养基和固态发酵培养基的流加操作：培养20小时后，将上述灭菌冷却后的营养液培养基pH值为6.5，即成为流加营养液，按流加营养液：固态发酵培养基为0.2：1的比例加入流加营养液，于无菌环境中简单翻料搅拌几分钟，继续培养，培养到40小时时，重复上述的补充流加营养液的操作，再继续培养到72小时时即培养完毕。
（5）干燥粉碎：出料后，于35～50℃下通风干燥至含水量10%以下时结束。粉碎至60目即为嗜热侧孢霉高密度固态发酵成品，也即是高密度嗜热孢霉培养物产品，用平板培养检测法检测嗜热侧孢霉其含活菌量达到100～200亿/g。
固态培养基料的各组分的加入量，嗜热侧孢霉种子液接入固态发酵培养基的量均可按现有技术的配比或接入量计加入，而饲料用稀土添加剂可由市售获得，并按说明添加。
实施例1：除下述说明外其余和上述高密度嗜热侧孢霉固态发酵工艺相同，步骤及操作如下：
1、用灭菌PDA液体培养基作为种子培养基，在250毫升三角瓶中装入灭菌冷却后的PDA液体培养基50毫升，接种嗜热侧孢霉斜面种子一环，在35℃摇床上培养18～24h，成为接种用嗜热侧孢霉种子液。2、营养液培养基制备：制备固态发酵过程中需要流加的PDA营养液培养基，灭菌冷却后贮存备用。
3、配制固态发酵基料：将米糠、麸皮、玉米粉、豆粕、保水性树胶按质量比1：2： 1：2：0.1的比例混合均匀，即成为固态培养基料，在固态培养基料中再加入上述营养液培养基作为固态发酵培养基营养液，再加入市售的含有镧、铈有效元素用于饲料稀土添加剂的稀土（市售获得）作为促培养剂，固态培养基：营养液培养基：饲料用稀土添加剂比例为1：1.0～1.3：0.0001 ，拌匀后灭菌，灭菌条件为121℃，20～30min。
4、接种：待灭菌物料冷却至室温后，接入嗜热侧孢霉种子液，接种量按固态基料质量的10%计算。
5、将接好种的物料置于培养室35℃无菌环境中进行培养，培养20小时后，将前述灭菌后的营养液调节pH值到6.5，即成为流加营养液，按流加营养液：固态发酵培养基为0.2：1的比例加入营养液，于无菌环境中简单翻料搅拌几分钟，继续培养，培养到40小时时，重复上述的补充流加营养液的操作，再继续培养到72小时时即培养完毕。
6、出料后的物料于35～50℃通风干燥，干燥至含水量10%以下时结束。
7、 粉碎干燥好的物料，即为本发明产品100～200亿/g的嗜热侧孢霉高密度固态发酵成品高密度嗜热侧孢霉培养物。
8、检测培养基为：PDA琼脂培养基，于PDA液体培养基中加入琼脂1.5～2%，pH自然，37℃培养72h。 检测操作方法简述：将样品采用逐级稀释方法，用无菌生理盐水稀释1亿倍，制成10-8的菌悬液，将事先灭好菌的90mm平板培养皿放于无菌操作室内，将上述检测培养基用三角瓶装好灭菌并冷却到45℃左右，置于45℃恒温水浴锅内保温备用； 在平板培养皿中注入1毫升稀释后的菌悬液，然后注入上述45℃的溶解状态的琼脂培养基，在接种台上转动平板培养皿几圈，使培养基与菌悬液混合均匀，待凝固后，置于37℃恒温培养箱中培养72小时； 检测计数方法：培养结束后，菌落计数，即为嗜热侧孢霉的菌落，计数结果乘以1亿，即得到样品的嗜热侧孢霉菌数含量，依据上述检测方法本发明产品培养得到100～200亿cfu/g的嗜热侧孢霉菌含量。
说明：cfu/g单位是指：每克样品含有的有效菌落形成单位。
Claims (3)
1.一种高密度嗜热侧孢霉发酵培养方法，采用固体发酵培养工艺，其特征是所述固体发酵培养工艺，包括：
1）按质量比米糠：麸皮：玉米粉：豆粕：保水性树胶= 1:（1.5-3.5）: （1.0-1.5）:（1.5-2.5）:（0.05-0.1）的比例混合，制成固态培养基料；
2）于上步固态培养基料中加入营养液培养基、及饲料用稀土添加剂，制成固态发酵培养基；所述营养液培养基为PDA培养基，饲料用稀土添加剂为含有镧、铈有效元素的饲料用稀土添加剂；固态发酵培养基各组分组成按质量比为固态培养基料：营养液培养基：饲料用稀土添加剂=1：（1.0-1.3）：（0.00005-0.00015）；
3）将2）步制得的固态发酵培养基，湿热灭菌，冷却后接种嗜热侧孢霉种子液，嗜热侧孢霉种子液接入量为固态发酵培养基质量的1-20%，培养过程中控制培养温度30-40℃，时间20-72小时，经培养，物料于35～50℃下通风干燥至含水量10Wt%以下，再粉碎至60-80目即制得高密度嗜热侧孢霉产品；
所述的嗜热侧孢霉种子液的制备是:称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml高压蒸煮20分钟，过滤，再加10-20g葡萄糖，充分溶解后趁热过滤，灭菌条件为温度110-121℃，时间20-30分钟，冷却后接种嗜热侧孢霉斜面种子，在30℃-40℃温度，180rpm转速下，放置于摇床上培养18-20小时，即得到嗜热侧孢霉种子液。
2.依据权利要求1所述的高密度嗜热侧孢霉发酵培养方法，其特征是所述3）步的培养过程中至少进行一次以上营养液培养基的流加操作。
3.依据权利要求2所述的高密度嗜热侧孢霉发酵培养方法，其特征是分二次进行流加操作，是两次将灭菌后的营养液培养基按营养液：固态发酵培养基 = （0.1-0.3）：1的质量比例加入营养液于固态发酵培养基培养料中，于无菌环境条件下翻料搅拌数分钟，继续培养到结束。
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