CN101220342B - Fq15粪肠球菌以及采用该菌种生产促生长饲料添加剂的方法 - Google Patents

Fq15粪肠球菌以及采用该菌种生产促生长饲料添加剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种FQ15粪肠球菌及以此菌种生产促生长饲料添加剂的方法：用MRS培养基为种子培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下培养FQ15粪肠球菌4～24小时，成为一级种子；将一级种子液接种在种子罐中进行扩大培养，采用MRS培养基为种子培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下培养4～24小时，成为二级种子；将二级种子液接种在发酵罐中进行发酵培养，采用改良的MRS培养基为发酵培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下，采用定时或连续补料分批发酵方式培养8～36小时；将所获得的发酵液分装或将c步骤所获得的发酵液分离，在菌泥中加入1～25％的干燥保护剂，采用20～80℃制粒、冻干或喷雾干燥。可替代饲用抗生素、促进畜禽高效增重、生产工艺简单、成本低等优点。

Description

FQ15粪肠球菌以及采用该菌种生产促生长饲料添加剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种饲料(饲料、饮水)添加剂，尤其是一种可替代饲用抗生素、促进畜禽高效增重、生产工艺简单、成本低的促生长饲料添加剂的生产方法。
背景技术：
随着我国农业养殖结构调整，规模化、集团化养殖已成为发展趋势，养殖户为了追求经济效益最大化，在饲料中添加饲用抗生素、激素及益生菌制剂等，以达到促进动物增重和快速生长的目的。
在整个养殖期添加促生长饲用抗生素等药物，可抑制和杀灭畜禽肠道微生物的生长、繁殖。一方面，减弱了肠道微生物对肠壁上皮细胞的有效刺激，抑制了肠绒毛的发育，使肠绒毛出现退化，肠壁变薄，提高了肠道内养分的透过率，从而提高动物的增长速度；同时也增加了肠道病原微生物的通过性，增加了疾病感染机会。另一方面，减少了对肠壁免疫细胞的刺激，使M细胞对抗原的摄取能力下降，巨噬细胞酶分泌能力及抗原信息传递能力减弱，抑制了机体的体液免疫和细胞免疫。因此，在饲料中添加抗生素促进动物生长与动物机体的防病及免疫功能形成了矛盾。添加促生长饲用抗生素等药物还可使致病菌的耐药性越来越普遍、耐药谱越来越广，由此引起动物疫病越来越难以控制，形成恶性循环，不但影响畜牧养殖业的可持续发展，还会造成畜禽类产品中残留抗生素和激素的严重超标，直接影响到人类的身体健康。
在饲料中添加益生菌等微生态饲料添加剂，一方面，能分泌和产生营养物质(如B族维生素1、2、6、12，叶酸、泛酸、VH和多种氨基酸及菌体蛋白等)，平衡饲料营养结构，有利于提高饲料利用率。另一方面，能分泌和产生脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶，补充肠道消化酶的不足，同时，还能产生果胶酶、纤维素酶及葡聚糖酶等消化道没有的酶类，促进肠道中营养物质的消化吸收。更重要的是微生态饲料添加剂能增加和促进肠道有益微生物的生长、繁殖，对肠壁上皮细胞形成有效刺激，促进肠绒毛的发育，使肠壁皱褶增多、陷窝加深，从而增加了动物肠道对营养物质有效吸收面积，提高了机体对营养物质的吸收能力；益生菌还能产生促生长因子，提高了细胞碱性磷酸酶(AKP)等活性水平，促进细胞RNA、DNA及蛋白质合成水平，促进了动物生长和增重。由于肠壁结构和益生菌群完善，减少了病原微生物的通透性，降低了疾病感染机会。专利号为200410068185.6的发明专利申请公开了“一种饲料级微生物添加剂及其制备与应用”，是由噬酸乳杆菌、粪肠球菌、丁酸梭菌构成的益生菌部分与由丁酸、乙酸、丙酸构成的营养液部分混合而成。其原料组分种类较多，生产过程中需要对各种组分严格配比，存在着生产工艺复杂、成本高的问题；实验结果也表明增重效果并不理想：小规模试验30天平均增重18.5克，42天平均增重42.5克；大规模试验42天平均增重10克。
因此，尽管微生态饲料添加剂也具有一定的增重效果，但远不如抗生素增重效果显著，为此，目前养殖户大多还是以对人体有害的抗生素作为动物增重的首选。
发明内容：
本发明是为了解决现有技术所存在的微生态饲料添加剂增重效果差的技术问题，提供一种可替代饲用抗生素、促进畜禽高效增重、生产工艺简单、成本低的促生长饲料添加剂的生产方法。
本发明的技术解决方案是：一种FQ15粪肠球菌CGMCC 2196，属于肠球菌属、粪肠球菌种，菌株代码FQ15，拉丁文学名Enterococcus faecalis，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，菌种保藏代号：CGMCC 2196，菌种保藏日期：2007-10-16。
FQ15粪肠球菌株的分离培养方法：
将健康鸡致死、解剖后，分别用无菌方法取小肠黏膜和肠内容物或新鲜粪便各1g，加入装有9mL灭菌生理盐水的小瓶中，混匀后进行倍比稀释，取10-4、10-5、10-6稀释度的混悬液100μL，分别滴加到3个MRS固体培养基上，用玻璃棒涂抹均匀，然后于37℃厌氧和需氧培养48h，观察菌落形态及是否有溶钙环。挑选有溶钙环的乳酸菌菌落接种到MRS琼脂斜面上进行纯培养。
FQ15粪肠球菌株的具体特性：
3.1菌落形态与菌体形态
利用MRS培养基，从11份健康鸡肠道和粪便样本中共分离、纯化得到16株能产生乳酸的分离物。FQ15粪肠球菌分离菌株在MRS培养基上37℃生长良好，菌落成圆形，直径大小0.8～2.0mm，较光滑，乳白色或灰白色，菌落周围有轻微的溶钙环。革兰氏染色镜鉴，菌体呈球形，直径为0.5～0.8mm，成单或双存在、无芽孢、革兰氏染色呈阳性。
3.2生理生化鉴定
经过常规生化和系统生化鉴定，鉴定结果见表所示。
表-1FQ15菌株生理生化试验结果
生化项目     试验结果 生化项目     试验结果
    FQ15     FQ15
过氧化氢氧化酶6.5％NaC1硫化氢试pH 9.640％胆盐45℃葡糖糖乳糖棉籽糖     ------+++- 鼠李糖木糖甘露醇蔗糖山梨醇密二糖松三糖Arg双水解精氨酸     --++-+-++
根据表中结果，结合形态学特征并与标准菌株对照，参考《常见细菌系统鉴定手册》以及《伯杰氏细菌鉴定手册》，初步判定为肠球菌，粪肠球菌种，菌株命名为FQ15。
一种以FQ15粪肠球菌为菌种生产促生长饲料添加剂的方法，按如下步骤进行：
a.用MRS培养基为种子培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下培养FQ15粪肠球菌4～24小时，成为一级种子；
b.将步骤a所获得的一级种子液接种在种子罐中进行扩大培养，采用MRS培养基为种子培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下培养4～24小时，成为二级种子；
c.将步骤b所获得的二级种子液接种在发酵罐中进行发酵培养，采用改良的MRS培养基为发酵培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下，采用定时或连续补料分批发酵方式培养8～36小时；
c.将c步骤所获得的发酵液分装或将c步骤所获得的发酵液分离，在菌泥中加入1～25％的干燥保护剂，采用20～80℃制粒、冻干或喷雾干燥。
所述c步骤中的改良MRS培养基是在每升MRS培养基中加有大豆蛋白胨5～30g，葡萄糖1～10g，酵母粉1～10g，乙酸钠1～10g，柠檬酸二胺0.1～8g，Tween800.1～5g，磷酸氢二钾0.1～5g，硫酸镁0.05～1g，硫酸锰0.001～0.2g，碳酸钙1～30g，纯净水1升，调节pH值5.5～8.0。
本发明采用一株功能性益生菌-FQ15粪肠球菌(CGMCC 2196)，该菌株能够很好的在家禽肠道内定植，以该菌种生产的饲料添加剂在动物体内繁殖过程中能产生多种氨基酸、维生素、蛋白酶以及淀粉酶(此类物质均为家禽体内必需物质)等，对饲料营养结构起到平衡作用，促进了动物机体对饲料的消化，提高了饲料的利用率，从而使动物发挥最佳的生长潜能，达到促进动物生长的目的，其增重效果甚至超过了饲用抗生素增重的效果。不仅如此，通过使用本发明的功能性益生菌产品后，能使家禽机体肠道菌群恢复平衡，减少了因肠道菌群紊乱而导致的细菌疾病，可减少或取代抗生素的使用，避免抗生素对动物及人体所带来的副作用。据有可替代饲用抗生素、促进畜禽高效增重、生产工艺简单、成本低等优点。
附图说明：
图1是本发明的FQ15粪肠球菌株在MRS琼脂培养基上形成的菌落。
图2是本发明的FQ15粪肠球菌株经革兰氏染色后镜检细菌形态。
图3是本发明试验组十二指肠发育状况示意图。
图4是对照组十二指肠发育状况示意图。
图5是本发明试验组粪便形成情况示意图。
图6是对照组粪便形成情况示意图。
菌种保藏日期：2007-10-16。
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
菌种保藏代号：CGMCC 2196。
具体实施方式：
实施例1：
一种FQ15粪肠球菌CGMCC 2196，属于肠球菌属、粪肠球菌种，菌株代码FQ15，拉丁文学名Enterococcus faecalis，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。
FQ15粪肠球菌株的分离培养方法：
将健康鸡致死、解剖后，分别用无菌方法取小肠黏膜和肠内容物或新鲜粪便各1g，加入装有9mL灭菌生理盐水的小瓶中，混匀后进行倍比稀释，取10-4、10-5、10-6稀释度的混悬液100μL，分别滴加到3个MRS固体培养基上，用玻璃棒涂抹均匀，然后于37℃厌氧和需氧培养48 h，观察菌落形态及是否有溶钙环。挑选有溶钙环的乳酸菌菌落接种到MRS琼脂斜面上进行纯培养，4℃冰箱保存。
所述的FQ15粪肠球菌菌株是从动物肠道中分离的兼性菌，无鞭毛、不运动，无芽孢的革兰氏染色为阳性球菌；在MRS琼脂培养基上能形成圆形、隆起、不透明乳白色的中小菌落；能分解葡萄糖和乳糖产生乳酸、乙酸和细菌素，分泌淀粉酶和蛋白酶等。能在含有0.1-1.4％的胆盐和0.1-1.0％的苯酚条件的培养基中生长；能在pH1.5和pH3.5的环境中生长；同时，具有良好的肠道吸附、定值特性，该菌株对机体不产生免疫刺激或产生抗体能力低；在干燥后，细菌存活率在25～89％。
FQ15粪肠球菌株在MRS琼脂培养基上形成的菌落、FQ15粪肠球菌株经革兰氏染色后镜检细菌形态见图1、图2。
以FQ15粪肠球菌为菌种生产促生长饲料添加剂的方法，按如下步骤进行：
a.用MRS培养基为种子培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下培养FQ15粪肠球菌4～24小时，成为一级种子；
b.将步骤a所获得的一级种子液接种在种子罐中进行扩大培养，采用MRS培养基为种子培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下培养4～24小时，成为二级种子；
c.将步骤b所获得的二级种子液接种在发酵罐中进行发酵培养，采用改良的MRS培养基为发酵培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下，采用定时或连续补料分批发酵方式培养8～36小时；
c.将c步骤所获得的发酵液分装或将c步骤所获得的发酵液分离，在所获得的菌泥中加入1～25％的干燥保护剂，采用20～80℃制粒、冻干或喷雾干燥。干燥保护剂可用现有技术中的任何一种，如中国专利申请号为200510047203.7的发明专利申请“药用水溶性微胶囊及生产方法”中所公开的活性保护剂，即取海澡糖的浓度为1～3％，PH值为6.8～7.2，离子浓度为0.2mol/L的PBS溶液作为为活性药剂保护液。
实施例2：
所用菌种同实施例1。
与实施例1所不同的是其中c步骤中的改良MRS培养基是在每升MRS培养基中加有大豆蛋白胨5～30g，葡萄糖1～10g，酵母粉1～10g，乙酸钠1～10g，柠檬酸二胺0.1～8g，Tween80 0.1～5g，磷酸氢二钾0.1～5g，硫酸镁0.05～1g，硫酸锰0.001～0.2g，碳酸钙1～30g，纯净水1升，调节pH值5.5～8.0。
本发明实施例试验结果如下：
1.FQ15粪肠球菌菌株对小白鼠增重试验
试验动物：采用1月龄的KM鼠，60只，体重20-23g；
试验菌株：FQ15粪肠球菌菌株；
试验分组：按照1∶1的公母比例随机分成3组，
试验目的：按照不同的添加量来研究FQ15粪肠球菌菌株对小白鼠的增重影响。
    试验组     对照组     FQ15粪肠球菌组
    饲喂量     0     1亿     1000万
    试验数     20只     20只     20只
组别   试验前初重   试验后末重   平均日增重     增重提高率
对照   22.23g   28.86g   0.44g     -
粪肠球菌 1亿   21.00g   30.61g   0.64g     45.45％
0.1亿   22.34   30.39   0.54g     22.73％
结论：通过上述试验，试验组(1亿)增重率比对照组提高了45.45％，且比0.1亿组提高了1倍，因此，本发明对KM小白鼠具有明显的增重效果。
2.本发明实施例肉鸡小规模试验
试验动物：肉鸡(AA鸡)1070羽；
试验期限：试验从1日龄开始，试验期为30天；
饲喂剂量：每天饲喂1亿/羽活菌数，通过饲料或饮水添加。
结果如下：
    项    目     本发明试验组     对照组
    试验数     5035只     5035只
    进雏时平均重     46g     46.7g
    9日龄平均重     251.67g     215.55g
    18日龄平均重     681.25g     450.85g
    30日龄平均重     1660g     1375g
    与对照组均差     285g     -
    项    目     本发明试验组     对照组
    与对照比试验组增重提高百分比     20.73％     -
    料肉比     1.36∶1     1.83∶1
    与对照比试验组降低百分比     34.56％     -
    死亡数     2％     3.60％
结论：通过上述试验，试验组增重率比对照组提高了20.73％，料肉比降低了25.68％，死亡降低了44.4％。因此，本发明实施例对AA肉鸡具有明显的增重和降低死亡的功能。
3.本发明实施例大规模试验
肉鸡养殖中试
试验时间：试验期2006.4.26-2006.6.5
试验动物：3日龄肉用仔鸡(AA鸡)，14000羽
试验分组：随机分成2组，每组7000羽，自由采食和饮水
试验组：每日饲喂0.5-1亿/羽活菌，养殖期内添加在饲料、饮水中。
对照组：正常饮水，水、料中均不含任何微生态制剂。
观察项目：
体重测定：分别于进雏时和出栏时进行空腹称重，计算每羽净增体重。
耗料量：每天记录各组肉鸡耗料量，分别统计各组耗料总量。
料肉比：根据耗料量和净增重量，计算各组肉鸡的料肉比。
料肉比＝耗料总量(kg)/增重总量(kg)
消化道观察：在出栏前一天，剖检试验组和对照组的健康鸡，观察肠壁发育情况，其结果如图3、4所示，结果表明，试验组肠壁增厚，肠绒毛发育良好。
对饲养期的粪便形成进行观察：记录正常与不正常粪便的天数。结果如图5、6所示，从粪便形成情况来看，试验组粪便干燥、成型。
试验结果：
  组  别     试验组     对照组
  试  验  数(羽)     7000     7000
  始平均重(g/羽)     46.00     46.70
  末平均重(g/羽)     2520.00     2300.00
  组  别     试验组     对照组
  与对照组均差(g/羽)     220.00
  平均重比对照组提高的百分比     9.50％
结论：
a.通过试验组与对照组进行比较，增重效果差异极显著(P＜0.01)。
b.通过试验该菌株能促进肉鸡生长，使鸡群整齐度与均匀度有很大改善，出栏平均重量提高了9.0％以上，试验组鸡群可提前3-5天出栏。

Claims (3)

1.一种FQ15粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏代号为CGMCC 2196。
2.一种以保藏代号为CGMCC 2196的FQ15粪肠球菌为菌种生产促生长饲料添加剂的方法，按如下步骤进行：
a.用MRS培养基为种子培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下培养FQ15粪肠球菌4～24小时，成为一级种子；
b.将步骤a所获得的一级种子液接种在种子罐中进行扩大培养，采用MRS培养基为种子培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下培养4～24小时，成为二级种子；
c.将步骤b所获得的二级种子液接种在发酵罐中进行发酵培养，采用改良的MRS培养基为发酵培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下，采用定时或连续补料分批发酵方式培养8～36小时；
d.将c步骤所获得的发酵液分装或将c步骤所获得的发酵液分离，在菌泥中加入1～25％的干燥保护剂，采用20～80℃制粒、冻干或喷雾干燥。
3.根据权利要求2所述的生产促生长饲料添加剂的方法，其特征在于所述c步骤中的改良MRS培养基是在每升MRS培养基中加有大豆蛋白胨5～30g，葡萄糖1～10g，酵母粉1～10g，乙酸钠1～10g，柠檬酸二胺0.1～8g，Tween800.1～5g，磷酸氢二钾0.1～5g，硫酸镁0.05～1g，硫酸锰0.001～0.2g，碳酸钙1～30g，纯净水1升，调节pH值5.5～8.0。
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冷寒冰等.一株功能型益生菌对肉鸡生产性能的影响.中国微生态学杂志19 2.2007,19(2),139-141.
冷寒冰等.一株功能型益生菌对肉鸡生产性能的影响.中国微生态学杂志19 2.2007,19(2),139-141. *
张董燕等.鸡源益生菌菌种的分离及属种的鉴定.饲料研究 2.2007,(2),75-77.
张董燕等.鸡源益生菌菌种的分离及属种的鉴定.饲料研究 2.2007,(2),75-77. *

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