CN114272357B - 一种防治腹泻与降低料肉比的水禽用生物复方制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种防治腹泻与降低料肉比的水禽用生物复方制剂，按重量份数计包括：粪肠球菌1‑4份、枯草芽孢杆菌0.5‑2份、凝结芽孢杆菌0.5‑2份、丁酸梭菌3‑10份、抗菌肽0.01‑0.05份，保护剂2‑5份，辅料10‑15份。其中，保护剂为质量比为5‑10:1‑2的羧甲基纤维素钠与新琼寡糖；抗菌肽的序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了相应的制备方法，将该生物复方制剂用于水禽饲料时，可有效减少腹泻致死率、降低料肉比，具有明显的增重效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种防治腹泻与降低料肉比的水禽用生物复方制剂。
背景技术
水禽(鸭子、鹅等)在养殖过程中，常因致病菌、病毒、饲料发生霉变、饲料中过量钙质、代谢障碍、药物中毒、种蛋与孵化条件等诸多因素引起腹泻。腹泻可导致机体严重缺水，营养物质流失，具体表现出食欲下降、生产性能降低、精神不振等不良状况，一旦全群水禽被感染，则导致死淘率增加，饲料转化率降低。目前对于水禽腹泻的治疗大多直接采用抗生素、激素等治疗，不仅引起水禽菌群失调、耐药株增多、免疫功能下降，而且造成水禽产品中药物等有害物质残留，导致动物源性食品安全问题。
微生态类产品具有天然、低毒、残留少、不产生抗药性等特点，利用独特的靶位定植原理，对致病菌、病毒等病原物有一定的抑制和防御功能，已替代部分抗生素，可保障动物源性食品的安全。但是，现有的生物制剂对防治水禽腹泻效果并不十分理想，难以满足防治腹泻、降低料肉比的实际需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治腹泻与降低料肉比的水禽用生物复方制剂，本发明提供的生物复方制剂可有效减少腹泻致死率、降低料肉比，具有明显的增重效果。
为此，第一方面，本发明提供一种生物复方制剂，按重量份数计包括：粪肠球菌1-4份、枯草芽孢杆菌0.5-2份、凝结芽孢杆菌0.5-2份、丁酸梭菌3-10份、抗菌肽0.01-0.05份，保护剂2-5份，辅料10-15份。
进一步，所述生物复方制剂中，所述粪肠球菌的有效活菌数为3×109-15×109CFU/g，所述枯草芽孢杆菌的有效活菌数为4×108-12×108CFU/g，所述凝结芽孢杆菌的有效活菌数为0.3×108-1.2×108CFU/g，所述丁酸梭菌的有效活菌数为6×108-15×108CFU/g。
进一步，所述保护剂包括羧甲基纤维素钠和新琼寡糖；所述羧甲基纤维素钠与所述新琼寡糖的质量比为5-10:1-2，例如5:2、3:1、4:1、5:1、9:1、10:1等。
进一步，所述抗菌肽的氨基酸序列为GLLRKGGEKIGRKLKKIGQKIKKFFQKLVGGGGSGLWSKIKEVGK(SEQ ID NO：1)。
进一步，所述辅料为多孔淀粉。
本发明的第二方面，提供所述生物复方制剂的制备方法，包括：
S1、分别发酵粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌，将制备得到的发酵液分别经洗涤、离心后得到粪肠球菌菌泥、枯草芽孢杆菌菌泥、凝结芽孢杆菌菌泥和丁酸梭菌菌泥；
S2、将粪肠球菌菌泥、枯草芽孢杆菌菌泥、凝结芽孢杆菌菌泥、丁酸梭菌菌泥与所述抗菌肽、保护剂、辅料混合均匀，得到第一混合物；
S3、将步骤S2得到的第一混合物依次经过低温制粒、滚圆、低温真空干燥，即得到所述生物复方制剂。
进一步，所述粪肠球菌的发酵方法包括以下步骤：
(1)将粪肠球菌菌种接种于MRS固体斜面培养基，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24h；
(2)将斜面培养的粪肠球菌接种于种子培养基中，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24h；
(3)将步骤(2)所获得的种子液接种于发酵罐，在30-40℃有氧或兼性条件培养12-24h。
进一步，所述粪肠球菌的发酵方法中，步骤(1)中MRS斜面培养基组成：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，Tween-80 1g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙6g，琼脂16g，蒸馏水配至1000mL，调节pH值6.5-7.5。
进一步，所述粪肠球菌的发酵方法中，步骤(2)中种子培养基为MRS斜面培养基中去除琼脂。
进一步，所述粪肠球菌的发酵方法中，步骤(3)中发酵所用培养基的组成：蛋白胨5-30g，葡萄糖1-10g，酵母粉1-10g，乙酸钠1-10g，柠檬酸二铵0.1-8g，Tween80 0.1-5g，磷酸氢二钾0.1-5g，硫酸镁0.05-lg，硫酸锰0.001-0.2g，碳酸钙1-30g，蒸馏水配至1000mL，调节pH值6.5-7.5。
进一步，所述枯草芽孢杆菌的发酵方法包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，在30-40℃有氧条件下培养12-24h；
(2)将斜面培养的枯草芽孢杆菌菌落接种于种子培养基中，在30-40℃有氧条件下培养12-24h；
(3)将枯草芽孢杆菌种子液接种于发酵罐中，在30-40℃有氧条件下发酵12-24h。
进一步，所述枯草芽孢杆菌的发酵方法中，步骤(1)中斜面培养基的组成为：牛肉膏1-5g，蛋白胨5-15g，酵母粉1-5g，氯化钠1-5g，葡萄糖1-10g，琼脂15-20g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0-7.5。
进一步，所述枯草芽孢杆菌的发酵方法中，步骤(2)中种子培养基组成：蛋白胨5-15g，牛肉膏0.1-2g，氯化钠0.1-3g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0-7.5。
进一步，所述枯草芽孢杆菌的发酵方法中，步骤(3)中发酵培养基的组成为：玉米粉1-5g，葡萄糖1-10g，豆饼粉1-30g，鱼粉0.1-1g，碳酸钙1-20g，硫酸铵0.1-0.5g，磷酸氢二钾0.01-0.1g，硫酸镁0.01-0.1g，硫酸锰0.01-0.1g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0-7.5。
进一步，所述凝结芽孢杆菌的发酵方法包括以下步骤：
(1)将凝结芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，在30-40℃有氧条件下培养12-24h；
(2)将斜面培养的凝结芽孢杆菌菌落接种于种子培养基中，在30-40℃有氧条件下培养12-24h；
(3)将凝结芽孢杆菌种子液接种于发酵罐中，在30-40℃有氧条件下发酵12-24h。
进一步，所述凝结芽孢杆菌的发酵方法中，步骤(1)中斜面培养基的组成为：牛肉膏1.0-5.0g，蛋白胨5.0-15.0g，酵母粉1.0-5.0g，氯化钠1.0-5.0g，葡萄糖1.0-10.0g，琼脂15-20g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0-7.5。
进一步，所述凝结芽孢杆菌的发酵方法中，步骤(2)中种子培养基组成：蛋白胨5-15g，牛肉膏0.1-2g，氯化钠0.1-3g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0-7.5。
进一步，所述凝结芽孢杆菌的发酵方法中，步骤(3)中发酵培养基的组成为：玉米粉1-5g，葡萄糖1-10g，豆饼粉1-30g，鱼粉0.1-1g，碳酸钙1-20g，硫酸铵0.1-0.5g，磷酸氢二钾0.01-0.1g，硫酸镁0.01-0.1g，硫酸锰0.01-0.1％，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0-7.5。
进一步，所述丁酸梭菌的发酵方法包括以下步骤：
(1)将丁酸梭菌菌种接种于种子培养基中，在34-38℃厌氧条件下培养12-24h，得到丁酸梭菌一级种子液；
(2)将丁酸梭菌一级种子液接种于种子培养基中，在34-38℃厌氧条件下培养12-24h，得到丁酸梭菌二级种子液；
(3)将丁酸梭菌二级种子液接种于发酵罐中，在34-38℃厌氧条件下发酵12-24h。
进一步，所述丁酸梭菌的发酵方法中，步骤(1)、步骤(2)中所述种子培养基的组成为：酵母粉2-4g，牛肉膏5-15g，胰蛋白胨5-15g，葡萄糖3-8g，可溶性淀粉0.2-2g，氯化钠3-8g，三水合乙酸钠1-5g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5-1g，蒸馏水配至1000mL，pH值为6.0-7.0。
进一步，所述丁酸梭菌的发酵方法中，步骤(3)中发酵培养基的组成为：可溶性淀粉10-40g，酵母粉5-15g，硫酸铵20-40g，氯化钠10-30g，磷酸二氢钾10-20g，硫酸镁0.1-0.4g，硫酸锰0.1-0.4g，碳酸钙2-4g，蒸馏水配至1000mL，pH值为6.0-7.0。
进一步，所述离心的转速为5000-8000rpm，离心时间为5-10min。
进一步，所述低温制粒的温度为：25℃ 42℃。
进一步，所述低温真空干燥的条件为：干燥温度为25℃ 42℃，工作压力≤300mm水柱，干燥时间为20min 50min。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
(1)本发明提供了一种水禽用生物复方制剂，通过各菌剂的合理配比，加入抗菌肽，同时采用羧甲基纤维素钠和新琼寡糖作为保护剂，将其用于水禽饲料时，可有效减少腹泻致死率、降低料肉比，具有明显的增重效果。
(2)本发明提供的抗菌肽、生物复方制剂对于革兰氏阳性菌、革兰氏阳性菌和真菌都具有较强的抗生素活性，有潜力完全或部分取代饲料中的抗生素。
(3)本发明提供的生物复方制剂所采用的菌种均已验证可用于动物饲料，且没有添加任何激素或者抗生素，安全性高，符合现代养殖业发展的需求，具有广阔的市场应用前景。
具体实施方式
下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
本实施例分别提供了粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌的发酵方法，制备得到了各菌种的发酵液，将其用于以下实施例和对比例生物复方制剂的制备。
一、粪肠球菌发酵液的制备方法包括：
(1)将粪肠球菌菌种(CGMCC 2196)接种于MRS固体斜面培养基(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，Tween-80 1g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙6g，琼脂16g，蒸馏水配至1000mL，调节pH值7.0)，在38℃有氧条件下培养12h；
(2)将斜面培养的粪肠球菌接种于种子培养基(MRS液体培养基)，在37℃有氧条件下培养12h，制备得到粪肠球菌种子液；
(3)将步骤(2)所获得的粪肠球菌种子液接种于发酵罐，发酵培养基：蛋白胨15g，葡萄糖10g，酵母粉5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵4g，Tween80 1g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙6g，蒸馏水配至1000mL，调节pH值7.0；在37℃有氧条件培养18h，制备得到粪肠球菌发酵液。
二、枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法包括：
(1)将枯草芽孢杆菌菌种(CICC No.6060)接种于斜面培养基(牛肉膏5g，蛋白胨15g，酵母粉5g，氯化钠1g，葡萄糖5g，琼脂15g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0)，在37℃有氧条件下培养12h；
(2)将斜面培养的枯草芽孢杆菌菌落接种于种子培养基(蛋白胨15g，牛肉膏2g，氯化钠1g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0)，在37℃有氧条件下培养12h，制备得到枯草芽孢杆菌种子液；
(3)将枯草芽孢杆菌种子液接种于发酵罐中，发酵培养基：玉米粉5g，葡萄糖5g，豆饼粉30g，鱼粉0.5g，碳酸钙10g，硫酸铵0.1g，磷酸氢二钾0.02g，硫酸镁0.02g，硫酸锰0.02g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0；在37℃有氧条件下发酵18h，制备得到枯草芽孢杆菌发酵液。
三、凝结芽孢杆菌发酵液的制备方法包括：
(1)将凝结芽孢杆菌菌种(CICC No.21736)接种于斜面培养基(牛肉膏5g，蛋白胨15g，酵母粉5g，氯化钠1g，葡萄糖5g，琼脂15g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0)，在37℃有氧条件下培养12h；
(2)将斜面培养的凝结芽孢杆菌菌落接种于种子培养基(蛋白胨15g，牛肉膏2g，氯化钠1g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0)，在37℃有氧条件下培养12h，制备得到凝结芽孢杆菌种子液；
(3)将凝结芽孢杆菌种子液接种于发酵罐中，发酵培养基：玉米粉5g，葡萄糖5g，豆饼粉30g，鱼粉0.5g，碳酸钙10g，硫酸铵0.1g，磷酸氢二钾0.02g，硫酸镁0.02g，硫酸锰0.02g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0；在37℃有氧条件下发酵18h，制备得到凝结芽孢杆菌发酵液。
四、丁酸梭菌发酵液的制备方法包括：
(1)将丁酸梭菌菌种(CICC No.23847)接种于种子培养基(酵母粉2g，牛肉膏15g，胰蛋白胨10g，葡萄糖5g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，三水合乙酸钠2g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0)，在37℃厌氧条件下培养12h，得到丁酸梭菌一级种子液；
(2)将丁酸梭菌一级种子液接种于种子培养基(同步骤(1)的种子培养基)，在37℃厌氧条件下培养12h，得到丁酸梭菌二级种子液；
(3)将丁酸梭菌二级种子液接种于发酵罐中，发酵培养基：可溶性淀粉30g，酵母粉15g，硫酸铵20g，氯化钠10g，磷酸二氢钾10g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.2g，碳酸钙2g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0；在37℃厌氧条件下发酵18h，制备得到丁酸梭菌发酵液。
实施例2
本实施例提供一种抗菌肽，其序列如SEQ ID NO：1所示。该抗菌肽通过将CRMAP(Cathelin-related antimicrobial peptide)抗菌肽(SEQ ID NO：2，GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQ)与DRS-B2抗菌肽(SEQ ID NO：3，GLWSKIKEVGKEAAKAAAKAAGKAALGAVSEAV)融合重组得到。在设计融合抗菌肽的过程中，通过在CRMAP抗菌肽的亲水螺旋面上通过氨基酸取代(E12R，N23K)增加了正电荷；对CRMAP抗菌肽C末端氨基酸进行了截短以使融合后的抗菌肽的空间结构合理，消除了空间位阻，能够发挥融合前抗菌肽的作用；选取DRS-B2抗菌肽的N端1-11位氨基酸，在不显著增加肽链长度的情况下增强了融合抗菌肽的抗菌活性。改造得到的抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌具有较强的抗生素活性，而且没有溶血等副作用。通过现有的固相化学合成的方法制备得到纯度达95％以上的抗菌肽(SEQ ID NO：1)，将其用于后续实施例3-5、对比例2-4中生物复方制剂的制备。
表1抗菌肽最小抑菌浓度
实施例3
本实施例提供一种生物复方制剂，按重量份数计其组成成分为：粪肠球菌4份、枯草芽孢杆菌1份、凝结芽孢杆菌2份、丁酸梭菌4份、序列为SEQ ID NO：1的抗菌肽0.02份、羧甲基纤维素钠3.6份、新琼寡糖0.4份，多孔淀粉10份；在制得的生物复方制剂中，各菌的有效活菌数约为：粪肠球菌15×109CFU/g，枯草芽孢杆菌8×108CFU/g，凝结芽孢杆菌1.2×108CFU/g，丁酸梭菌8×108CFU/g。
S1、将实施例1制备得到的各发酵液分别经蒸馏水洗涤、5000rpm离心10min后得到粪肠球菌菌泥、枯草芽孢杆菌菌泥、凝结芽孢杆菌菌泥和丁酸梭菌菌泥；
S2、收集步骤S1所得的各菌泥，将所述菌泥与所述抗菌肽、羧甲基纤维素钠、新琼寡糖、多孔淀粉混合均匀，得到第一混合物；
S3、将步骤S2得到的第一混合物依次经过低温制粒、滚圆、低温真空干燥，即得到所述生物复方制剂；其中，所述低温制粒的温度为30℃，低温真空干燥的温度为30℃，工作压力≤300mm水柱，干燥时间为20min。
实施例4
本实施例提供一种生物复方制剂，按重量份数计其组成成分为：粪肠球菌1份、枯草芽孢杆菌2份、凝结芽孢杆菌0.5份、丁酸梭菌10份、序列为SEQ ID NO：1的抗菌肽0.03份、羧甲基纤维素钠4份、新琼寡糖1份，多孔淀粉15份；在制得的生物复方制剂中，各菌的有效活菌数约为：粪肠球菌3×109CFU/g，枯草芽孢杆菌12×108CFU/g，凝结芽孢杆菌0.3×108CFU/g，丁酸梭菌15×108CFU/g。
S1、将实施例1制备得到的各发酵液分别经蒸馏水洗涤、5000rpm离心10min后得到粪肠球菌菌泥、枯草芽孢杆菌菌泥、凝结芽孢杆菌菌泥和丁酸梭菌菌泥；
S2、收集步骤S1所得的各菌泥，将所述菌泥与所述抗菌肽、羧甲基纤维素钠、新琼寡糖、多孔淀粉混合均匀，得到第一混合物；
S3、将步骤S2得到的第一混合物依次经过低温制粒、滚圆、低温真空干燥，即得到所述生物复方制剂；其中，所述低温制粒的温度为30℃，低温真空干燥的温度为30℃，工作压力≤300mm水柱，干燥时间为20min。
实施例5
本实施例提供一种生物复方制剂，按重量份数计其组成成分为：粪肠球菌2份、枯草芽孢杆菌0.5份、凝结芽孢杆菌1份、丁酸梭菌3份、序列为SEQ ID NO：1的抗菌肽0.05份、羧甲基纤维素钠2.5份、新琼寡糖0.5份，多孔淀粉15份；在制得的生物复方制剂中，各菌的有效活菌数约为：粪肠球菌8×109CFU/g，枯草芽孢杆菌4×108CFU/g，凝结芽孢杆菌0.6×108CFU/g，丁酸梭菌6×108CFU/g。
S1、将实施例1制备得到的各发酵液分别经蒸馏水洗涤、5000rpm离心10min后得到粪肠球菌菌泥、枯草芽孢杆菌菌泥、凝结芽孢杆菌菌泥和丁酸梭菌菌泥；
S2、收集步骤S1所得的各菌泥，将所述菌泥与所述抗菌肽、羧甲基纤维素钠、新琼寡糖、多孔淀粉混合均匀，得到第一混合物；
S3、将步骤S2得到的第一混合物依次经过低温制粒、滚圆、低温真空干燥，即得到所述生物复方制剂；其中，所述低温制粒的温度为30℃，低温真空干燥的温度为30℃，工作压力≤300mm水柱，干燥时间为20min。
实施例6
本实施例提供一种生物复方制剂，按质量百分比包括以下成分：可溶性葡萄糖50-55％、粪肠球菌1-4％、枯草芽孢杆菌0.5-2％、凝结芽孢杆菌10-20％、丁酸梭菌3-10％、粘附因子1-5％。所述生物复方制剂含有活菌数分别为：粪肠球菌10×108-45×108CFU/g、枯草芽孢杆菌1×108-5×108CFU/g、凝结芽孢杆菌0.5×108-5×108CFU/g、丁酸梭菌1.5×108-10×108CFU/g、粘附因子1×108-10×108CFU/g。
具体地，按照以下步骤制备得到生物复方制剂：
S1、将所述粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌、粘附因子(ATCC53103)的菌种发酵液通过包被形成菌粉；
S2、按照以下重量份数称取各菌粉及其他组分：可溶性葡萄糖51.5份、粪肠球菌4份、枯草芽孢杆菌2份、凝结芽孢杆菌13.2份、丁酸梭菌5份、粘附因子3份；
S3、将步骤S2称取的各组分混合均匀，即制备得到生物复方制剂，将该生物复方制剂用于后续实验例。
在制备得到的该生物复方制剂中，每200g制剂含有活菌数含量为：粪肠球菌8000-9000×108CFU、枯草芽孢杆菌800-1000×108CFU、凝结芽孢杆菌200-400×108CFU、丁酸梭菌500-800×108CFU、粘附因子500-1000×108CFU。
对比例1
本对比例提供一种生物复方制剂，按重量份数计其组成成分为：粪肠球菌1份、枯草芽孢杆菌2份、凝结芽孢杆菌0.5份、丁酸梭菌10份、羧甲基纤维素钠4份、新琼寡糖1份，多孔淀粉15份；在制得的生物复方制剂中，各菌的有效活菌数约为：粪肠球菌3×109CFU/g，枯草芽孢杆菌12×108CFU/g，凝结芽孢杆菌0.3×108CFU/g，丁酸梭菌15×108CFU/g。
S1、将实施例1制备得到的各发酵液分别经蒸馏水洗涤、5000rpm离心10min后得到粪肠球菌菌泥、枯草芽孢杆菌菌泥、凝结芽孢杆菌菌泥和丁酸梭菌菌泥；
S2、收集步骤S1所得的各菌泥，将所述菌泥与羧甲基纤维素钠、新琼寡糖、多孔淀粉混合均匀，得到第一混合物；
S3、将步骤S2得到的第一混合物依次经过低温制粒、滚圆、低温真空干燥，即得到所述生物复方制剂；其中，所述低温制粒的温度为30℃，低温真空干燥的温度为30℃，工作压力≤300mm水柱，干燥时间为20min。
对比例2
本对比例提供一种生物复方制剂，按重量份数计其组成成分为：粪肠球菌1份、枯草芽孢杆菌2份、凝结芽孢杆菌0.5份、丁酸梭菌10份、序列为SEQ ID NO：1的抗菌肽0.03份、新琼寡糖1份，多孔淀粉15份；在制得的生物复方制剂中，各菌的有效活菌数约为：粪肠球菌3×109CFU/g，枯草芽孢杆菌14×108CFU/g，凝结芽孢杆菌0.3×108CFU/g，丁酸梭菌16×108CFU/g。
S1、将实施例1制备得到的各发酵液分别经蒸馏水洗涤、5000rpm离心10min后得到粪肠球菌菌泥、枯草芽孢杆菌菌泥、凝结芽孢杆菌菌泥和丁酸梭菌菌泥；
S2、收集步骤S1所得的各菌泥，将所述菌泥与所述抗菌肽、新琼寡糖、多孔淀粉混合均匀，得到第一混合物；
S3、将步骤S2得到的第一混合物依次经过低温制粒、滚圆、低温真空干燥，即得到所述生物复方制剂；其中，所述低温制粒的温度为30℃，低温真空干燥的温度为30℃，工作压力≤300mm水柱，干燥时间为20min。
对比例3
本对比例提供一种生物复方制剂，按重量份数计其组成成分为：粪肠球菌1份、枯草芽孢杆菌2份、凝结芽孢杆菌0.5份、丁酸梭菌10份、序列为SEQ ID NO：1的抗菌肽0.03份、羧甲基纤维素钠4份，多孔淀粉15份；在制得的生物复方制剂中，各菌的有效活菌数约为：粪肠球菌3×109CFU/g，枯草芽孢杆菌12×108CFU/g，凝结芽孢杆菌0.3×108CFU/g，丁酸梭菌15×108CFU/g。
S1、将实施例1制备得到的各发酵液分别经蒸馏水洗涤、5000rpm离心10min后得到粪肠球菌菌泥、枯草芽孢杆菌菌泥、凝结芽孢杆菌菌泥和丁酸梭菌菌泥；
S2、收集步骤S1所得的各菌泥，将所述菌泥与所述抗菌肽、羧甲基纤维素钠、多孔淀粉混合均匀，得到第一混合物；
S3、将步骤S2得到的第一混合物依次经过低温制粒、滚圆、低温真空干燥，即得到所述生物复方制剂；其中，所述低温制粒的温度为30℃，低温真空干燥的温度为30℃，工作压力≤300mm水柱，干燥时间为20min。
对比例4
本对比例提供一种生物复方制剂，按重量份数计其组成成分为：粪肠球菌10份、枯草芽孢杆菌2份、凝结芽孢杆菌0.5份、丁酸梭菌1份、序列为SEQ ID NO：1的抗菌肽0.03份、羧甲基纤维素钠1份、新琼寡糖10份，多孔淀粉15份；在制得的生物复方制剂中，各菌的有效活菌数约为：粪肠球菌2.5×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌109CFU/g，凝结芽孢杆菌0.2×108CFU/g，丁酸梭菌1.5×108CFU/g。
S1、将实施例1制备得到的各发酵液分别经蒸馏水洗涤、5000rpm离心10min后得到粪肠球菌菌泥、枯草芽孢杆菌菌泥、凝结芽孢杆菌菌泥和丁酸梭菌菌泥；
S2、收集步骤S1所得的各菌泥，将所述菌泥与所述抗菌肽、羧甲基纤维素钠、新琼寡糖、多孔淀粉混合均匀，得到第一混合物；
S3、将步骤S2得到的第一混合物依次经过低温制粒、滚圆、低温真空干燥，即得到所述生物复方制剂；其中，所述低温制粒的温度为30℃，低温真空干燥的温度为30℃，工作压力≤300mm水柱，干燥时间为20min。
实验例
试验选择70000羽0日龄樱桃谷肉鸭，采用单因子试验设计，随机分为7个处理组，每组10000羽，采用中慧肉鸭料为基础日粮。对照组不额外添加生物复方制剂，其余5组分别添加实施例4、实施例6、对比例1-4制备得到的生物复方制剂，添加量为1kg/吨基础日粮。
试验鸭采用地面厚垫料饲养，按常规方式进行管理，自由采食、饮水，并观察鸭群的生长状况。养殖实验为期42天。
生长性能指标的测定：记录每天耗料量，每日观察鸭群的生长、发病及死亡情况，记录死淘情况。定期称重、计算肉鸭的平均日增重、平均日采食量和平均料重比。养殖期满42天时，各组的生产性能指标见表2所示。
表2各组生产性能指标
| 组别 | 总重(kg) | 只数 | 均重(kg) | 料肉比 | 成活率 |
| 对照 | 29081.9 | 9598 | 3.03 | 2.03 | 96.0％ |
| 实施例4 | 31765.3 | 9865 | 3.22 | 1.86 | 98.7％ |
| 实施例6 | 31446.4 | 9827 | 3.20 | 1.88 | 98.3％ |
| 对比例1 | 30232.3 | 9721 | 3.11 | 1.96 | 97.2％ |
| 对比例2 | 30373.5 | 9704 | 3.13 | 1.95 | 97.0％ |
| 对比例3 | 30145.2 | 9693 | 3.11 | 1.95 | 96.9％ |
| 对比例4 | 30715.5 | 9782 | 3.18 | 1.93 | 97.8％ |
其中，应用本发明提供的生物复方制剂的组别中，肉鸭的腹泻死亡率显著低于其他组别，从而显著提高了总成活率；并且与其他组别相比，具有增重效果好、料肉比低的优点。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 江苏三仪生物工程有限公司，大连三仪动物药品有限公司
<120> 一种防治腹泻与降低料肉比的水禽用生物复方制剂
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Arg Lys Leu Lys Lys
1 5 10 15
Ile Gly Gln Lys Ile Lys Lys Phe Phe Gln Lys Leu Val Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Leu Trp Ser Lys Ile Lys Glu Val Gly Lys
35 40 45
<210> 2
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu Lys Leu Lys Lys
1 5 10 15
Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asn Phe Phe Gln Lys Leu Val Pro Gln Pro
20 25 30
Glu Gln
<210> 3
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Leu Trp Ser Lys Ile Lys Glu Val Gly Lys Glu Ala Ala Lys Ala
1 5 10 15
Ala Ala Lys Ala Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Val Ser Glu Ala
20 25 30
Val
Claims (14)
1.一种生物复方制剂，其特征在于，按重量份数计包括：粪肠球菌1份、枯草芽孢杆菌2份、凝结芽孢杆菌0.5份、丁酸梭菌10份、抗菌肽0.03份，保护剂5份，辅料15份；其中，所述粪肠球菌的菌种为CGMCC 2196，所述枯草芽孢杆菌的菌种为CICC No.6060，所述凝结芽孢杆菌的菌种为CICC No.21736，所述丁酸梭菌的菌种为CICC No.23847；所述抗菌肽的序列为SEQ ID NO：1；所述保护剂由质量比为4:1的羧甲基纤维素钠和新琼寡糖组成；所述辅料为多孔淀粉。
2.如权利要求1所述的生物复方制剂，其特征在于，所述生物复方制剂中，所述粪肠球菌的有效活菌数为3×109-15×109CFU/g，所述枯草芽孢杆菌的有效活菌数为4×108-12×108CFU/g，所述凝结芽孢杆菌的有效活菌数为0.3×108-1.2×108CFU/g，所述丁酸梭菌的有效活菌数为6×108-15×108CFU/g。
3.权利要求1-2任一项所述生物复方制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分别发酵所述粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌，将制备得到的发酵液分别经洗涤、离心后得到粪肠球菌菌泥、枯草芽孢杆菌菌泥、凝结芽孢杆菌菌泥和丁酸梭菌菌泥；
S2、将所述粪肠球菌菌泥、枯草芽孢杆菌菌泥、凝结芽孢杆菌菌泥、丁酸梭菌菌泥与所述抗菌肽、保护剂、辅料混合均匀，得到第一混合物；
S3、将步骤S2得到的第一混合物依次经过低温制粒、滚圆、低温真空干燥，即得到所述生物复方制剂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述粪肠球菌的发酵方法包括以下步骤：
(1)将粪肠球菌菌种接种于MRS固体斜面培养基，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24h；
(2)将斜面培养得到的粪肠球菌菌落接种于种子培养基中，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24h，得到粪肠球菌种子液；
(3)将步骤(2)所获得的粪肠球菌种子液接种于发酵罐，在30-40℃有氧或兼性条件培养12-24h，得到粪肠球菌发酵液。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述粪肠球菌的发酵方法中，步骤(3)中发酵所用培养基的组成：蛋白胨5-30g，葡萄糖1-10g，酵母粉1-10g，乙酸钠1-10g，柠檬酸二铵0.1-8g，Tween80 0.1-5g，磷酸氢二钾0.1-5g，硫酸镁0.05-lg，硫酸锰0.001-0.2g，碳酸钙1-30g，蒸馏水配至1000mL，调节pH值6.5-7.5。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的发酵方法包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，在30-40℃有氧条件下培养12-24h；
(2)将斜面培养得到的枯草芽孢杆菌菌落接种于种子培养基中，在30-40℃有氧条件下培养12-24h，得到枯草芽孢杆菌种子液；
(3)将步骤(2)所获得的枯草芽孢杆菌种子液接种于发酵罐中，在30-40℃有氧条件下发酵12-24h，得到枯草芽孢杆菌发酵液。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的发酵方法中，步骤(3)中发酵培养基的组成为：玉米粉1-5g，葡萄糖1-10g，豆饼粉1-30g，鱼粉0.1-1g，碳酸钙1-20g，硫酸铵0.1-0.5g，磷酸氢二钾0.01-0.1g，硫酸镁0.01-0.1g，硫酸锰0.01-0.1g，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0-7.5。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌的发酵方法包括以下步骤：
(1)将凝结芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，在30-40℃有氧条件下培养12-24h；
(2)将斜面培养得到的凝结芽孢杆菌菌落接种于种子培养基中，在30-40℃有氧条件下培养12-24h，得到凝结芽孢杆菌种子液；
(3)将步骤(2)所获得的凝结芽孢杆菌种子液接种于发酵罐中，在30-40℃有氧条件下发酵12-24h，得到凝结芽孢杆菌发酵液。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌的发酵方法中，步骤(3)中发酵培养基的组成为：玉米粉1-5g，葡萄糖1-10g，豆饼粉1-30g，鱼粉0.1-1g，碳酸钙1-20g，硫酸铵0.1-0.5g，磷酸氢二钾0.01-0.1g，硫酸镁0.01-0.1g，硫酸锰0.01-0.1％，蒸馏水配至1000mL，pH值为7.0-7.5。
10.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述丁酸梭菌的发酵方法包括以下步骤：
(1)将丁酸梭菌菌种接种于种子培养基中，在34-38℃厌氧条件下培养12-24h，得到丁酸梭菌一级种子液；
(2)将丁酸梭菌一级种子液接种于种子培养基中，在34-38℃厌氧条件下培养12-24h，得到丁酸梭菌二级种子液；
(3)将所述丁酸梭菌二级种子液接种于发酵罐中，在34-38℃厌氧条件下发酵12-24h，得到丁酸梭菌发酵液。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述丁酸梭菌的发酵方法中，步骤(3)中发酵培养基的组成为：可溶性淀粉10-40g，酵母粉5-15g，硫酸铵20-40g，氯化钠10-30g，磷酸二氢钾10-20g，硫酸镁0.1-0.4g，硫酸锰0.1-0.4g，碳酸钙2-4g，蒸馏水配至1000mL，pH值为6.0-7.0。
12.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述离心的转速为5000-8000rpm，离心时间为5-10min。
13.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述低温制粒的温度为25℃-42℃。
14.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述低温真空干燥的条件为：干燥温度为25℃-42℃，工作压力≤300mm水柱，干燥时间为20min-50min。
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