CN114854629A - 一株植物乳杆菌c-37及其在发酵玉米胚芽粕中的应用 - Google Patents

一株植物乳杆菌c-37及其在发酵玉米胚芽粕中的应用 Download PDF

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Abstract

一株植物乳杆菌C‑37及其在发酵玉米胚芽粕中的应用，涉及乳酸菌制剂领域，该菌株已于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211494。该植物乳杆菌C‑37在抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌，发酵玉米胚芽粕，协同纤维素酶发酵玉米胚芽粕，提高纤维素降解率和半纤维素降解率，延长发酵玉米胚芽粕储藏期中的应用。该植物乳杆菌C‑37具有抑菌作用，对动物安全，无毒副作用，能显著降低pH和提高植物乳杆菌活菌数，能在纤维素酶的协同作用下改善玉米胚芽粕的营养品质，能延长发酵玉米胚芽粕储藏期。

Description

一株植物乳杆菌C-37及其在发酵玉米胚芽粕中的应用
技术领域
本发明涉及乳酸菌制剂技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌C-37及其在发酵玉米胚芽粕中的应用。
背景技术
随着养殖业的快速发展，我国蛋白饲料资源存在严重匮乏的现状，而大豆等蛋白饲料进口供应链存在断裂风险。据统计，随着肉蛋奶需求不断增加，我国饲料产量从1980年到2019年，由110万吨增加到2.29亿吨，39年增长超200 倍。在农产品进口屡创新高的背景下，饲料粮的进口替代备受关注。玉米胚芽粕在吉林省地区具有产量高、来源广泛且价格低廉的原料特点，是一种极具开发潜力的非常规蛋白饲料资源。目前，玉米胚芽粕存在粗蛋白含量低、纤维素含量高、适口性差、氨基酸不平衡等营养缺陷。其中，纤维组分含量高是制约其在单胃动物上应用的主要因素。
乳酸菌是指能利用乳糖或者葡萄糖发酵产生乳酸的一类微生物，其在饲料中应用很广泛。乳酸菌发酵饲料时可产生有机酸、降低饲料的pH，同时产生具有抑菌或杀菌效果的抗菌肽，从而有效地抑制病原微生物的滋生，减少有害微生物的数量，进而利于饲料的贮存。乳酸菌发酵后的饲料，具有良好的适口性，同时饲料中的乳酸菌活菌进入动物肠道后，使动物肠道中有益菌数量增加，促进肠道内形成有益优势菌群，从而竞争性抑制病原微生物增殖，保持肠道内微生态平衡，同时对机体的调节免疫产生积极地影响，提高动物的免疫力。因此，乳酸菌发酵饲料具有较大潜力和广阔的发展前景。
近两年来，有研究报道植物乳杆菌在发酵饲料中的作用，比如公开号为CN103205376A的中国专利《一株适用于发酵饲料的植物乳杆菌及其应用》和公开号为CN107446852A的《一株植物乳杆菌及其在发酵饲料方面的应用》。这两个专利表明植物乳杆菌可提高发酵饲料的营养价值和饲用品质。但是在畜牧领域中，发酵饲料产品大多数为多种饲料原料进行混合发酵，加之饲料原料均有其各自的营养缺陷。因此，将多种饲料原料进行混合发酵在一定程度上并不能充分提高其营养价值。
目前，植物乳杆菌在发酵玉米胚芽粕方面的应用还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株植物乳杆菌C-37及其在发酵玉米胚芽粕中的应用，以填补植物乳杆菌在发酵玉米胚芽粕方面的空白。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37，该菌株已于2021 年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211494。
本发明的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37在制备具有抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌作用的制剂中的应用。
本发明的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37在发酵玉米胚芽粕中的应用。
作为优选的实施方式，将玉米胚芽粕原料于121℃高压灭菌20min；置于 1000mL三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，调节玉米胚芽粕pH为7.0，装量100g/瓶，搅拌均匀后含水量为50％；按1×106cfu/g接菌量接入植物乳杆菌C-37，于37℃培养箱中厌氧发酵。
本发明的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37在协同纤维素酶发酵玉米胚芽粕中的应用。
作为优选的实施方式，将玉米胚芽粕原料于121℃高压灭菌20min；置于1000mL三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，调节玉米胚芽粕pH为7.0，装量100g/瓶，纤维素酶添加量为50U/g(0.5％)，搅拌均匀后含水量为50％；按1×106cfu/g接菌量接入植物乳杆菌C-37，于37℃培养箱中厌氧发酵。
作为优选的实施方式，将玉米胚芽粕原料于121℃高压灭菌20min；置于 1000mL三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，调节玉米胚芽粕pH为7.0，装量100g/瓶，纤维素酶添加量为50U/g(0.5％)，搅拌均匀后含水量为50％；按1×106cfu/g接菌量接入植物乳杆菌C-37，于37℃培养箱中厌氧发酵。
本发明的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37在提高玉米胚芽粕发酵过程中纤维素降解率和半纤维素降解率方面的应用。
本发明的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37在延长发酵玉米胚芽粕储藏期中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37，该菌株已于2021 年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211494。
通过抑菌试验证实，该植物乳杆菌C-37对大肠杆菌CVCC196、鼠伤寒沙门氏菌ATCC25241、金黄色葡萄球菌CVCC519及肠炎沙门氏菌CVCC3378均有抑制作用；且植物乳杆菌C-37上清液对病原菌的抑制效果最优。通过安全性试验证实，该植物乳杆菌C-37对动物安全，无毒副作用。该植物乳杆菌C-37 能成功发酵玉米胚芽粕，显著降低pH和提高了植物乳杆菌活菌数。该植物乳杆菌C-37能在纤维素酶的协同作用下进一步改善玉米胚芽粕的营养品质。该植物乳杆菌C-37能延长发酵玉米胚芽粕的储藏期。因此，本发明的一株植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)C-37应用价值和前景广阔。
附图说明
图1为实施例1中菌株C-37菌落的形态学特征。
图2为实施例1中菌株C-37菌落的革兰氏染色结果。
图3为实施例1中菌株C-37的16S rDNA PCR产物电泳结果。
图4为实施例1中菌株C-37基于16S rRNA基因序列的系统发育树。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37的分离筛选、鉴定与保藏
1、材料
MRS液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸取物10.0g，酵母提取液5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，吐温-801.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，碳酸钙20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1.0L， pH 6.8，115℃高压灭菌15-20min即得。
MRS固体培养基：MRS液体培养基中加15-20g琼脂粉，115℃高压灭菌 15-20min记得。
MRS筛选培养基：MRS液体培养基中加15-20g琼脂粉，添加2％碳酸钙， 115℃高压灭菌15-20min即得。
2、分离与筛选
2018年12月，从吉林省白山市收集长白山原始森林土壤样本运送至实验室进行菌株分离。收集土壤样本时采用四分法，首先将土壤表层0～3mm的表土刮去，然后采集距离地面0～20cm的土壤样本。采用倍比稀释涂布法分离菌株，首先将土壤样本进行梯度稀释至10-4、10-6，分别涂布于MRS筛选培养基上，再覆盖一层MRS固体培养基，30℃夹层厌氧培养48h，挑选溶钙圈最大的单菌落，在MRS固体培养基上多次划线分离纯化得到纯培养物，将其中1株菌株命名为C-37。
3、菌株的鉴定
(1)形态学特征和革兰氏染色
将从长白山原始森林土壤样本中分离得到的在MRS筛选培养基上溶钙圈最大的菌株C-37菌落进行形态学观察，结果如图1所示，菌株C-37菌落呈圆形，表面光滑、细密、色白。用灭菌后的接种环蘸取纯培养后的菌液在载玻片上涂抹均匀，固定后，先后使用结晶紫1min，碘液1min，95％的酒精20s，蕃红1 min，进行染色，干燥后，镜检，观察菌体形态，结果如图2所示，光学显微镜下观察，革兰氏阳性，杆状。
(2)生理、生化特征鉴定
通过葡萄糖产气试验、过氧化氢酶活性测定、硝酸盐还原试验、硫化氢产生试验、明胶液化试验、吲哚试验及乳酸菌生化鉴定条(HBIG11)对菌株C-37 进行生理、生化特征测定。
鉴定结果显示：菌株C-37发酵葡萄糖产酸不产气，且过氧化氢酶阴性属于同型发酵，硝酸盐、硫化氢、明胶和吲哚均为阴性，七叶苷、纤维二塘、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖和乳糖均为阳性，初步判定菌株C-37为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
(3)分子生物学鉴定
将菌株C-37接种于新鲜的MRS液体培养基中培养20h，采用天根生化科技有限公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用扩增引物为通用引物，其序列信息如下：
上游引物1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’；
下游引物27f：5’-agagttgatcctggctcag-3’。
PCR反应体系(50μL)为：Mixture 25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司)，上下游引物各1μL，模板DNA2μL，超纯水21μL。 PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，25个循环，72℃延伸10min。PCR产物送吉林省库美生物科技有限公司进行序列测定。
如图3所示，菌株C-37的16S rDNA PCR产物电泳结果显示，在分子量大小为1500bp左右得到一条特异性好的条带，与预期结果一致，并进行测序，序列如SEQ ID NO.1所示。将测序序列与http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上已登录的部分菌株的16S rDNA基因序列进行比对，结果表明，菌株C-37与植物乳杆菌NRRL B-14768(登录号：NR_042394.1)相似度可达100％，并用Mega5 建立系统发育树，如图4所示，菌株C-37与NR_042394.1Lactobacillus plantarum 聚为同一支，结合形态学、生理生化特征、分子生物学鉴定结果，将菌株C-37 鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
4、菌株的保藏
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37，已于2021年11月 29日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：CCTCC NO： M 20211494。
实施例2植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37的抑菌试验
1、材料
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0，121℃高压灭菌20min即得。
LB固体培养基：LB液体培养基中加15-20g琼脂粉，121℃高压灭菌20min 即得。
LB斜面固体培养基：LB液体培养基中加15-20g琼脂粉，121℃高压灭菌 20min即得。
MRS液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸取物10.0g，酵母提取液5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，吐温-801.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，碳酸钙20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1.0L， pH 6.8，115℃高压灭菌15-20min即得。
2、试验方法
(1)病原菌菌悬液的制备：将大肠杆菌CVCC196、鼠伤寒沙门氏菌 ATCC25241、金黄色葡萄球菌CVCC519、肠炎沙门氏菌CVCC3378这4株病原菌作为测试菌株，其中，病原菌用LB培养基37℃培养。
(2)植物乳杆菌C-37菌悬液的制备：在无菌条件将纯种的植物乳杆菌C-37 接种于100mL MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，菌液浓度达到108 cfu/mL。
(3)植物乳杆菌C-37抑菌性能测定：采用打孔法，取培养好的病原菌，调整菌液浓度约为106cfu/mL，涂布于固体LB培养基并打孔；将活化好的植物乳杆菌C-37于4℃、10000g离心10min，培养上清用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，取上清液100μL加入孔中，4℃静置3-5h，37℃培养48h，测量抑菌圈直径，每组3个重复，试验重复3次，对照组加入100μL LB液体培养基，结果如表1所示。
3、试验结果
由表1可知，植物乳杆菌C-37对大肠杆菌CVCC196、鼠伤寒沙门氏菌 ATCC25241、金黄色葡萄球菌CVCC519及肠炎沙门氏菌CVCC3378均有抑制作用；其中，植物乳杆菌C-37对大肠杆菌CVCC196的抑菌圈直径可达22.44mm，对鼠伤寒沙门氏菌ATCC25241的抑菌圈直径可达25.62mm，对金黄色葡萄球菌 CVCC519的抑菌圈直径达18.83mm；在抑制肠炎沙门氏菌CVCC3378方面，植物乳杆菌C-37抑菌圈直径可达24.52mm；植物乳杆菌C-37上清液对病原菌的抑制效果最优。
表1植物乳杆菌C-37对4株病原菌的抑菌性能
Figure BDA0003603752160000071
注：抑菌性：抑菌圈<10mm为抑菌效果微弱，10mm<抑菌圈<15mm的为中度抑菌，抑菌圈>15mm的为高度抑菌。抑菌圈越大说明抑菌效果越好，抑菌圈是指圆形透明圈的整个直径。
实施例3植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37的安全性试验
1、材料
(1)试验菌株：实施例1获得的植物乳杆菌C-37。
(2)试验动物：昆明系小白鼠，体重20±2g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。
(3)培养基
MRS液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸取物10.0g，酵母提取液5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，吐温-80 1.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，碳酸钙20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1.0L， pH 6.8，115℃高压灭菌15-20min即得。
2、试验方法
(1)植物乳杆菌C-37菌液的制备
在无菌条件将纯种的植物乳杆菌C-37接种于100mL MRS液体培养基中， 37℃静置培养24h，菌浓度达108cfu/mL。
(2)试验设计：选择体重20±2g健康昆明系小白鼠100只，雌雄各半；基础日粮预饲一周后随机分为5组，每组20只，雌雄各10只，分笼喂养，其中一组为对照组，其余四组均为试验组。
(3)给药
将制备好的植物乳杆菌C-37采用生理盐水分别稀释至1×106cfu/mL、1×108 cfu/mL、1×1010cfu/mL和1×1012cfu/mL；给药方式为灌胃，各组小鼠禁食16h 后，对照组灌胃生理盐水，其余四个试验组分别灌胃用生理盐水稀释好的菌液 (1×106cfu/mL、1×108cfu/mL、1×1010cfu/mL和1×1012cfu/mL)，按照0.2mL/20 g体重的受试样品量进行灌胃给样，连续灌胃两天，每次灌胃后密切观察2h，2 h后常规饮食，连续观察14天，每天定时观察记录。
(4)观察指标
①肉眼观察：详细记录被毛和皮肤、眼睛和粘膜，呼吸、循环、自主神经和中枢神经系统，肢体活动和行为等改变；特别注意是否出现震颤、抽搐、流涎、腹泻、嗜睡和昏迷等症状；应记录毒作用体征出现和消失的时间以及死亡时间。
②小鼠体重：于试验开始时、7d和14d分别对每组雌雄小鼠进行称重，比较其体重情况。
③病理学检查：14d时对各组小鼠取5只进行尸检，观察脏器器官病变，对观察有变化的脏器需进行组织病理学检查。
3、试验结果
(1)各组小鼠的生长和死亡情况如表2所示。
表2植物乳杆菌C-37对各组雌-雄性小鼠生长和死亡情况的影响
Figure BDA0003603752160000091
由表2可知，在14d观察期内，各组小鼠体态观察正常，四肢活动正常，对体重无显著性影响，各组均没有出现死亡情况；解剖后仔细观察小鼠肝脏、肾脏和脾脏，均无肉眼可见病变。
(2)各组小鼠的器官指数如表3所示。
表3植物乳杆菌C-37对各组小鼠器官指数的影响
Figure BDA0003603752160000092
由表3可知，植物乳杆菌C-37对各组小鼠的脾脏指数和肝体比没有显著性影响。综上，本发明的植物乳杆菌C-37对动物安全，无毒副作用。
实施例4植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37发酵玉米胚芽粕
1、材料
(1)发酵基料：玉米胚芽粕，由公主岭黄龙食品工业有限公司提供。
(2)菌种：实施例1获得的植物乳杆菌C-37；植物乳杆菌BLCC1-0015购自山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院菌种保藏中心。
(3)试剂：碳酸氢钠。
2、试验方法
首先将原始玉米胚芽粕原料于121℃高压灭菌20min；称取一定量高压灭菌后的玉米胚芽粕于1000mL三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，调节玉米胚芽粕pH为7.0，装量100g/瓶，搅拌均匀后含水量为50％，每个样品设3 个平行；按1×106cfu/g接菌量分别接入植物乳杆菌C-37和市售植物乳杆菌 BLCC1-0015，以不接种任何菌株作为对照组，封好瓶口于37℃培养箱中厌氧发酵，分别于发酵0、24h、48h取样，测定发酵样植物乳杆菌活菌数和pH。
上述指标的测定方法如下：
(1)pH的测定
准确称取2.00g样品溶于20.00mL蒸馏水中，室温150r/min震荡10min，静止1min后，测定上清液pH值。
(2)植物乳杆菌活菌数的测定
准确称取发酵玉米胚芽粕10.0g，用生理盐水10倍递增稀释，取适当稀释度的样品分别至MRS固体培养基中，37℃培养24h，根据菌落数计算样品中植物乳杆菌活菌数，结果用cfu/g发酵料表示。
3、试验结果
发酵玉米胚芽粕中植物乳杆菌活菌数和pH如表4所示。
表4发酵玉米胚芽粕中植物乳杆菌活菌数和pH
Figure BDA0003603752160000101
Figure BDA0003603752160000111
由表4可知，在0h时，经预处理后玉米胚芽粕pH在7.0左右，接菌量约为3×106cfu/g；与对照组相比，各菌株在发酵24h和48h，pH进一步下降，其中植物乳杆菌C-37在发酵48h时pH最低可达4.51；植物乳杆菌活菌数方面，在24h时，植物乳杆菌C-37活菌数可达109cfu/g，以植物乳杆菌C-37最高，活菌数达到7.2×109cfu/g；在48h时，植物乳杆菌C-37活菌数可达1011cfu/g，以植物乳杆菌C-37最高，活菌数达到4.2×1011cfu/g，显著高于市售植物乳杆菌 BLCC1-0015。综上，本发明的植物乳杆菌C-37成功发酵玉米胚芽粕，显著降低pH和提高了植物乳杆菌活菌数。
实施例5利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37添加纤维素酶发酵玉米胚芽粕
1、材料
(1)发酵基料：玉米胚芽粕，由公主岭黄龙食品工业有限公司提供。
(2)菌种和酶制剂：实施例1获得的植物乳杆菌C-37；纤维素酶(5万 U/g)购自北京索莱宝科技有限公司。
(3)试剂：碳酸氢钠。
2、试验方法
首先将原始玉米胚芽粕原料于121℃高压灭菌20min；称取一定量高压灭菌后的玉米胚芽粕于1000mL三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，调节玉米胚芽粕pH为7.0，装量100g/瓶，纤维素酶添加量为50U/g(0.5％)，搅拌均匀后含水量为50％，每个样品设3个平行；按1×106cfu/g接菌量接入植物乳杆菌C-37，以未添加酶制剂作为对照组，封好瓶口于37℃培养箱中厌氧发酵，于发酵48h取样，测定发酵玉米胚芽粕中植物乳杆菌活菌数、pH、中性洗涤纤维 (NDF)含量、酸性洗涤纤维(ADF)含量、酸性洗涤木质素(ADL)含量、纤维素降解率及半纤维素降解率。
上述指标的测定方法如下：
(1)pH的测定
准确称取2.00g样品溶于20.00mL蒸馏水中，室温150r/min震荡10min，静止1min后，测定上清液pH值。
(2)植物乳杆菌活菌数的测定
准确称取发酵玉米胚芽粕10.0g，用生理盐水10倍递增稀释，取适当稀释度的样品分别至MRS固体培养基中，37℃培养24h，根据菌落数计算样品中植物乳杆菌活菌数，结果用cfu/g发酵料表示。
(3)中性洗涤纤维素(NDF)含量的测定
中性洗涤剂溶液(3％十二烷基硫酸钠溶液)的配制：称取18.6g乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2·2H2O)和6.8g四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)，放人1000ml 烧杯中，加适量蒸馏水加热溶解后，再加入30g十二烷基硫酸钠(C12H25NaSO4) 和10ml乙二醇乙醚；称取4.56g无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)置于另一烧杯中，加蒸馏水加热溶解冷却后倒入第一个烧杯中，稀释至1000ml。
聚酯纤维滤网袋的处理：用高质量的聚酯细丝(聚对苯二甲酸乙二醇酯，细丝的直径为34μm)织成孔径为20μm的均匀一致的聚酯超细网后，制成为5cm ×6cm长方形的聚酯网袋，三面塑封口，一面开口，用特殊记号笔编号、称重。
样品称量：在已知质量(m1)的5cm×6cm聚酯纤维滤网袋(用特殊记号笔编号)中，装入样品，准确称取样品0.5-1.0g左右(m)，准确至0.0001g，用塑封机封口。每个样品做3个平行样测定。当样品脂肪含量大于10％，须预先脱脂：将装有样品的滤网袋用丙酮浸泡10-20min。
中性洗涤剂处理：将20个样品滤网袋放入3L大烧杯中，加入2000ml配好的中性洗涤剂溶液2000ml，煮沸60±1min。在煮沸期间要保持溶液浓度不变。煮沸完毕取出滤网袋，用水冲洗干净后把水挤压干。
丙酮处理：将滤网袋放烧杯中用丙酮浸泡10min去除剩余脂肪，取出纤维滤网袋并在通风橱凉干。
烘干：将滤网袋放在烘箱内105℃烘干1h，取出立即称重m2。如果NDF包含灰分，则此步骤不做；若NDF去除灰分，可按以下步骤测定残渣中的灰分含量)。将纤维滤网袋放入已知质量的坩埚中，把坩埚放在电炉上炭化至无烟，然后转移到马福炉中500℃灰化30min，取出在干燥器内冷却至室温，称重，测定灰分重(m3)。
中性洗涤纤维(NDF)(含灰分)的含量％＝(m2-m1)/m×100％或者中性洗涤纤维(NDF)(不含灰分)的含量％＝(m2-m1-m3)/m×100％。式中：m为试样质量， m2为中性洗涤纤维残渣和滤网袋的质量，m1为滤网袋的质量，m3为灰分质量。
(4)酸性洗涤纤维素(ADF)含量的测定
0.5mol/L硫酸(H2SO4)溶液的配制：取27.9ml(约49g)浓硫酸，慢慢加入已装有500ml水的1000ml容量瓶中，冷却后定容。
酸性洗涤剂溶液(2％十六烷基三甲基溴化铵溶液)：称取20g十六烷基三甲基溴化铵，溶于1000ml 0.5mol/L硫酸溶液。
聚酯纤维滤网袋：同中性洗涤纤维素(NDF)含量的测定。
样品称量：在已知质量(m1)的5cm×6cm聚酯纤维滤网袋(用特殊记号笔编号)中，装入样品，准确称取样品1.000g左右(m)，用塑封机封口。每个样品做3个平行样测定。当样品脂肪含量大于10％，须预先脱脂：将装有样品的滤网袋用丙酮浸泡10-20min。
酸性洗涤剂处理：将20个样品滤网袋放入3L大烧杯中，加入2000ml配好的酸性洗涤剂2000ml，煮沸60±1min。在煮沸期间要保持溶液浓度不变。煮沸完毕取出滤网袋，用水冲洗干净后把水挤压干。
丙酮处理：将滤网袋放烧杯中用丙酮浸泡10min去除剩余脂肪，取出滤网袋并在通风橱凉干。
烘干：将滤网袋放在烘箱内105℃烘干1h，取出室内冷却1min，立即称重m2。 (如果ADF包括灰分，则此步骤不需要做；如果ADF去除灰分，则按下列步骤残渣中的灰分含量)将纤维滤网袋放入已知质量的坩埚中，把坩埚放在电炉上炭化至无烟，然后转移到马福炉中500℃灰化30min，取出在干燥器内冷却至室温，称重，测定灰分重(m3)。
酸性洗涤纤维(ADF)(含灰分)的含量％＝(m2-m1)/m×100％或者酸性洗涤纤维(ADF)(不含灰分)的含量％＝(m2-m1-m3)/m×100％。式中：m为试样质量， m2为酸性洗涤纤维残渣和滤网袋的质量，m1为滤网袋的质量，m3为灰分质量。
(5)酸性洗涤木质素(ADL)含量的方法
将样品称量在已知质量(m1)的聚酯纤维滤网袋(5cm×6cm)上，用特殊记号笔编号，装入样品，准确称量样品质量(m)1.000g左右于滤网袋中，封好口；酸性洗涤溶液处理：将滤网袋放入3L大烧杯中，加入2000ml配好的酸性洗涤溶液(2％十六烷基三甲基溴化铵溶液)2000ml，煮沸60±1min，在煮沸期间要保持溶液浓度不变；煮沸完毕取出滤网袋，用水冲洗干净后把水挤压干；浓硫酸处理：将滤网袋放在烘箱内105℃烘干30min，取出，将以上的滤网袋中的残渣揉碎后，放入烧杯中，加12.0mol/L的硫酸(72％)在20-25℃下浸泡3h，取出用水洗净至中性，挤干水分；将滤网袋放入105℃烘箱中烘1h，取出立即称重(m2)。
酸性洗涤木质素(ADL)含量(％)＝(m2-m1)/m×100％。式中：m为样品质量，m2为浓硫酸处理后滤网袋及残渣的烘干质量，m1为聚酯纤维滤网袋的质量。
(6)其他指标计算公式如下：
半纤维素含量(％)＝中性洗涤纤维素(NDF)含量-酸性洗涤纤维素(ADF) 含量；
纤维素含量(％)＝酸性洗涤纤维素(ADF)含量-经硫酸(72％)处理后的残渣含量；
纤维素降解率(％)＝(发酵前纤维素含量-发酵后纤维素含量)/发酵前纤维素含量；
半纤维素降解率(％)＝(发酵前半纤维素含量-发酵后半纤维素含量)/发酵前半纤维素含量。
3、试验结果
发酵玉米胚芽粕中植物乳杆菌活菌数和pH如表5所示。
表5发酵玉米胚芽粕中植物乳杆菌活菌数和pH
Figure BDA0003603752160000151
利用本发明的植物乳杆菌C-37添加纤维素酶发酵玉米胚芽粕对其纤维组分的影响如表6所示。
表6
未添加酶制剂组发酵48h 添加酶制剂组发酵48h
纤维素降解率(％) 5.05 20.93
半纤维素降解率(％) 10.67 18.78
由表5和表6可知，本发明的植物乳杆菌C-37添加纤维素酶后发酵玉米胚芽粕，纤维素和半纤维素降解率显著提高，植物乳杆菌活菌数进一步提高，可达4.3×1012cfu/g，pH可降低至4.25以下。这说明本发明的植物乳杆菌C-37能在纤维素酶的协同作用下进一步改善玉米胚芽粕的营养品质。
实施例6利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37添加纤维素酶发酵玉米胚芽粕的贮藏性试验
1、材料
(1)发酵基料：玉米胚芽粕，由公主岭黄龙食品工业有限公司提供。
(2)菌种和酶制剂：实施例1获得的植物乳杆菌C-37；纤维素酶(5万 U/g)购自北京索莱宝科技有限公司。
(3)试剂：碳酸氢钠。
2、试验方法
首先将原始玉米胚芽粕原料于121℃高压灭菌20min；称取一定量高压灭菌后的玉米胚芽粕于呼吸膜发酵袋中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，调节玉米胚芽粕pH为7.0，装量100g/袋，纤维素酶添加量为0.5％，搅拌均匀后含水量为50％，每个样品设3个平行；按1×106cfu/g接菌量接入植物乳杆菌C-37，密封后于37℃培养箱中厌氧发酵48h，以未加入植物乳杆菌的发酵玉米胚芽粕作为对照组；发酵完成后将发酵玉米胚芽粕置于室温中储藏，定期观察其是否发生霉变，即是否出现霉点。
3、试验结果
结果显示，采用本发明的植物乳杆菌C-37并添加纤维素酶生产的发酵玉米胚芽粕可在室温下保存60-90天不发生霉变；而对照组(不添加植物乳杆菌，其他配料均相同)常温下只能保存约20天。这说明本发明的植物乳杆菌C-37能延长发酵玉米胚芽粕的储藏期。
本发明公开了一株植物乳杆菌C-37及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一株植物乳杆菌C-37及其在发酵玉米胚芽粕中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1418
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtattgatt ggtgcttgca tcatgattta catttgagtg agtggcgaac tggtgagtaa 60
cacgtgggaa acctgcccag aagcggggga taacacctgg aaacagatgc taataccgca 120
taacaacttg gaccgcatgg tccgagtttg aaagatggct tcggctatca cttttggatg 180
gtcccgcggc gtattagcta gatggtgggg taacggctca ccatggcaat gatacgtagc 240
cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt gttaaagaag aacatatctg agagtaactg 420
ttcaggtatt gacggtattt aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480
taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt 540
ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctc aaccgaagaa gtgcatcgga aactgggaaa 600
cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg 660
gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagt 720
atgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccatac cgtaaacgat gaatgctaag 780
tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga 840
gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900
tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatac tatgcaaatc 960
taagagatta gacgttccct tcggggacat ggatacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt atcagttgcc 1080
agcattaagt tgggcactct ggtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca 1200
acgagttgcg aactcgcgag agtaagctaa tctcttaaag ccattctcag ttcggattgt 1260
aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc 1380
caaagtcggt ggggtaacct tttaggaacc agccgcct 1418

Claims (8)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37，其特征在于，该菌株已于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211494。
2.如权利要求1所述的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37在制备具有抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌作用的制剂中的应用。
3.如权利要求1所述的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37在发酵玉米胚芽粕中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将玉米胚芽粕原料于121℃高压灭菌20min；置于1000mL三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，调节玉米胚芽粕pH为7.0，装量100g/瓶，搅拌均匀后含水量为50％；按1×106cfu/g接菌量接入植物乳杆菌C-37，于37℃培养箱中厌氧发酵。
5.如权利要求1所述的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37在协同纤维素酶发酵玉米胚芽粕中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将玉米胚芽粕原料于121℃高压灭菌20min；置于1000mL三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，调节玉米胚芽粕pH为7.0，装量100g/瓶，纤维素酶添加量为50U/g(0.5％)，搅拌均匀后含水量为50％；按1×106cfu/g接菌量接入植物乳杆菌C-37，于37℃培养箱中厌氧发酵。
7.如权利要求1所述的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37在提高玉米胚芽粕发酵过程中纤维素降解率和半纤维素降解率方面的应用。
8.如权利要求1所述的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C-37在延长发酵玉米胚芽粕储藏期中的应用。
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