CN111388450A - Co气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体、制备方法及抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
Co气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体、制备方法及抗肿瘤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体、制备方法及抗肿瘤药物中的应用,包括以白蛋白为载体并负载葡萄糖氧化酶和羰基锰化合物形成的纳米粒、在纳米粒包载的二氧化锰壳层;在二氧化锰保护壳层上包覆的透明质酸层,形成具有双层保护结构的靶向性酶催化产气纳米粒HGMM@HA。本发明将CO气体疗法与化学动力疗法协同应用,将透明质酸作为衣壳包覆于纳米粒表面,构建CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米载药系统;利用透明质酸的靶向性靶向到肿瘤细胞区域,利用二氧化锰壳层降解提供氧气支持葡萄糖氧化酶的催化反应,伴随产生的过氧化氢有效地诱导羰基锰释放CO,导致癌细胞发生凋亡,进一步增强靶向纳米载药系统的抗肿瘤效果和安全性。
Description
技术领域
本发明涉及药物递送载体技术领域,尤其是CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体、制备方法及抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症,又称恶性肿瘤,是由正常细胞在一些非正常条件下发生突变引起的,正常细胞受到刺激形成具有非正常生物学特性的细胞,进而发展成肿瘤组织。癌症是严重威胁人类健康的致死性疾病。近年来,癌症的发病率逐年上升,己经发展成为人类的头号杀手,如何有效地治愈癌症是现阶段医学领域的一大难题。
传统的手术、化疗、放疗等临床肿瘤治疗方法能够使肿瘤细胞的生长得到抑制,但杀伤性能有限。纳米医学的快速发展为新型的抗癌方式提供了新的策略和方法。纳米粒子具有在肿瘤细胞靶向定位和促进细胞吸收的功能,其可以增强疗效同时减少副作用。在纳米疗法中气体治疗是最近新兴的一种具有广阔应用前景的治疗策略。气体治疗包括一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)和硫化氢(H2S)等,对癌症、炎症和心血管疾病都具有独特的治疗作用。一氧化碳(CO)疗法已经在治疗各种疾病显示出突出的治疗效果,已成为气体疗法领域的一个热门研究课题。由于CO气体对人血红蛋白的高亲和力,使用CO气体治疗肿瘤的主要挑战是缺乏目标靶向性以及在较高浓度下的毒性。
尽管已经研发出了具有在生物系统中传递CO的能力的CO释放分子(CORM),但随即而来的与CORM相关的一些缺点包括随机扩散,溶解性差,潜在的毒性以及在深部组织中CO释放不足等限制了其实际应用。因此,CO不适合外源性给药,在靶向组织中内源性原位控制CO生成是CO气体治疗的最佳选择。在达到肿瘤部位后需要肿瘤部位高水平的过氧化氢促发原位控制释放CO。虽然肿瘤部位高表达过氧化氢((10~50μM)),但仍不足以促发释放CO。因此,亟待开发一种新的策略以增加肿瘤中过氧化氢的浓度,有效地控制CO的生成量,从而提高气体治疗的功效。
有研究表明,葡萄糖氧化酶(GOx)是一种天然的有氧脱氢酶,GOx可以在肿瘤部位能够催化分解葡萄糖氧化酶产生过氧化氢和葡萄糖酸,是一种高效的过氧化氢生产催化剂,一直以来受到相当的重视。过量的过氧化氢产生可以促发羰基锰化合物释放CO,提高气体治疗的功效。然而,由于肿瘤部位的缺氧环境,即使肿瘤部位葡萄糖含量异常丰富,但酶催化反应得率仍不高。此外,这些纳米系统缺乏肿瘤靶向性和组织特异性容易对正常组织造成不可避免的损害。
在各纳米疗法中,对肿瘤细胞的杀伤作用在很大程度上依赖于EPR效应驱动的肿瘤区域的纳米粒子积累,然而在静脉注射治疗过程中,纳米颗粒的积累效率是很低的,EPR的低效率使得治疗结果不令人满意。因此发展主动靶向的策略来延长纳米颗粒在肿瘤部位的富集是纳米疗法的一个新的方向。透明质酸(HA)是一个生物相容性很好的生物大分子,能避免体内酶的清除与吸附。因此HA作为抗癌药物递送系统的载体被广泛应用于肿瘤治疗中,已经成为肿瘤靶向给药系统研究的热点。HA作为肿瘤靶向药物的载体,主要通过受体介导作用,增加病灶区的药物浓度,达到靶向治疗的目的。
发明内容
本发明的第一方面的目的在于提供一种CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体,包括以白蛋白为载体并负载葡萄糖氧化酶和羰基锰化合物所形成的作为内核的纳米粒、在纳米粒外部包载的二氧化锰保护壳层;以及在二氧化锰保护壳层上包覆的透明质酸层,由此形成具有透明质酸和二氧化锰双层保护结构的靶向性酶催化产气纳米粒HGMM@HA。
如此,在靶向组织内源性释放CO的同时Mn离子产生的类芬顿反应两者两协同,增强肿瘤治疗;同时透明质酸和二氧化锰壳层双重保护作用防止化疗药物外泄,极大增加正常组织安全性。
尤其是,将CO气体疗法与化学动力疗法协同应用,并将透明质酸作为衣壳包覆于纳米粒表面,构建了CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米载药系统;该纳米粒先利用了透明质酸的靶向性靶向到肿瘤细胞区域,利用二氧化锰壳层降解提供氧气支持葡萄糖氧化酶的催化反应,伴随产生的过氧化氢有效地诱导羰基锰释放CO,从而导致癌细胞发生凋亡,进一步增强靶向纳米载药系统的抗肿瘤效果和安全性。
在优选的实施例中,所述纳米粒的粒径在170-180nm,电位为-22至-23mV。
在优选的实施例中,包载二氧化锰后的纳米粒的粒径为190-210nm,平均Zeta电位为19至21mV。
在优选的实施例中,靶向性酶催化产气纳米粒HGMM@HA的粒径为250-260nm,平均Zeta电位为-17至-19mV。
在优选的实施例中,所述作为内核的纳米粒中,负载的葡萄糖氧化酶的含量在5-7mg,锰羰基化合物含量在3-4mg。
在优选的实施例中,所述透明质酸层采用分子量10KD的透明质酸制备而成。
在优选的实施例中,所述羰基锰化合物为Mn2(CO)10,其中的锰为零价,两个锥体Mn(CO)5通过Mn-Mn键连接且相互错开,以便减少分子内的静电排斥作用,属于D 4d点群。Mn-Mn键的键长为239pm。红外振动光谱中有3个峰,分别是2044cm-1(中强)、2013cm-1(强)、1983cm-1(中强)。
根据本发明的第二方面的目的,还提出一种前述CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体在抗肿瘤药物中的应用。
根据本发明的第二方面的目的,还提出一种CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体的制备方法,包括:
(1)将白蛋白溶液稀释置于热水中,葡萄糖氧化酶溶于水配制成葡萄糖氧化酶溶液;将羰基锰化合物溶于乙醇配成羰基锰乙醇溶液;然后,将葡萄糖氧化酶溶液加入到白蛋白溶液中,低速搅拌5min,获得白蛋白-葡萄糖氧化酶溶液;
(2)将2ml羰基锰乙醇溶液在高速搅拌状态下,匀速滴加到白蛋白-葡萄糖氧化酶溶液中,待羰基锰乙醇溶液全部注入后,快速将溶液转移至冰水浴中继续强力搅拌10min,直至溶液冷却;再使用超滤杯超滤制备好的纳米粒内核,超滤掉残余小分子后收集于试管中,放置于冰箱保存;
(3)将高锰酸钾和聚烯丙胺盐酸分别溶于水配成溶液,取步骤(2)中制备好的纳米粒内核置于反应瓶中,在强力搅拌状态下先滴加高锰酸钾溶液,1min后滴加聚烯丙胺盐酸溶液,常温搅拌2h,离心一次,去掉上清,加水使底部沉淀悬浮,用大分子透析袋透析12h,12h后获得加载有二氧化锰壳层的纳米粒;
(4)将透明质酸加水溶解制成透明质酸溶液,置于反应瓶中,在强力搅拌状态下滴加步骤(3)中制备的包载有二氧化锰壳层的纳米粒,继续常温搅拌反应5-6h,反应结束后离心一次,去掉上清,加水使底部沉淀混悬,用大分子透析袋透析12h,12h后即获得靶向性酶催化产气纳米粒HGMM@HA。
在优选的实施例中,所述步骤(1)中,将白蛋白溶液和葡萄糖氧化酶溶液通过热水水浴,加热到63.7±1℃,舒展两种蛋白的肽链结构,利于药物包载。
在优选的实施例中,在前述步骤中,加入羰基锰溶液时保持在高速搅拌状态下,并且在1min内缓慢匀速注入,其目的旨在保证纳米粒子粒径均一性及药物含量均一性。
在优选的实施例中,加入高锰酸钾后的时间间隔不宜太长,优选地在1-2min内继续滴加聚烯丙胺盐酸溶液,其目的旨在减少高锰酸钾对纳米粒内核的氧化作用,减少羰基锰药物在制备过程中的损耗。
在优选的实施例中,所述步骤(1)中葡萄糖氧化酶溶液浓度为7-9mg/mL。
在步骤(1)中,白蛋白-葡萄糖氧化酶溶液的溶液体系为20ml,浓度为2mg/ml(包含葡萄糖氧化酶)。
作为优选,前述羰基锰乙醇溶液浓度为2-3mg/ml。
作为优选,所述步骤(2)中,高速搅拌速度为1100-1200r/min,超滤最终体积为8ml。
作为优选,所述步骤(3)中,高锰酸钾溶度为0.4mg/ml,聚烯丙胺盐酸浓度为50mg/ml,加入体积为50ul,搅拌速度为800~900r/min。
作为优选,所述步骤(4)中,因为蛋白的缘故,离心仅可一次,离心时间为8~10min,温度为4℃,转速为10000rpm。
由此,本发明的抗肿瘤纳米递送载体中,即HSA纳米载体,以白蛋白(HSA)为材料,同时包载羰基锰化合物(Mn2(CO)10)和葡萄糖氧化酶(GOx),并将二氧化锰壳层通过氧化还原方法加载在纳米粒表面,在外层再包覆生物相容新大分子透明质酸,制成靶向纳米产气杀伤肿瘤细胞的纳米递送系统。
与现有技术相比,本发明的显著的有益效果在于:
(1)基于葡萄糖氧化酶(GOx)介导释放CO气体,协同锰离子类芬顿反应杀伤肿瘤原理,将CO气体疗法和化学动力疗法协同应用,并将生物相容性大分子透明质酸作为外壳覆于纳米粒表面,成功构建一种基于酶催化产气协同抗肿瘤靶向纳米载药系统。与单独的化学动力疗法组及气体疗法组比较,本纳米粒可以显著提高抗肿瘤效果,从试验结果来看,其显著提高了乳腺癌荷瘤小鼠体内的抑瘤率;
(2)本发明的递送系统(纳米粒)采用双层保护结构,具有较高的安全性与生物兼容性。以生物相容性大分子透明质酸作为外壳包载纳米粒,因其广泛存在于结缔组织、上皮组织和神经组织中,是生物体内含有的大分子,因此其免疫原性极低,生物兼容性好;纳米粒的内核保护壳层二氧化锰是一种重要的无机催化材料,在中性、碱性环境中不降解,在酸性环境下降解,提供氧气。因此整个靶向纳米药物递送系统在靶向肿瘤,有效提高疗效的同时,还可以减少化学药物和酶的外泄,减小对正常组织的毒副作用;
本发明递送系统使用的二氧化锰壳层的纳米粒,不仅能够依靠肿瘤部位酸性环境以及过氧化氢条件等优势产生氧气,提供给葡萄糖氧化酶作为催化条件;还能消耗肿瘤细胞内高表达的谷胱甘肽,使得类芬顿反应增强。同时,在正常血液中二氧化锰壳层不降解,避免了化疗药物对正常组织的伤害,起到保护性的作用。
(3)本发明解决纳米递送系统的稳定性问题,所制得的纳米粒在PBS溶液中,在常温条件下的放置稳定性超过72h,具有长时的稳定性;
(4)本发明方法操作简单,反应步骤少,制备的纳米药物颗粒靶向能力强,保护作用显著且药物包载率高,葡萄糖氧化酶的载药量可以达到20%-25%,羰基锰化合物的载药量可以达到10%-15%。
应当理解,前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。另外,所要求保护的主题的所有组合都被视为本公开的发明主题的一部分。
结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见,或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。
附图说明
附图不意在按比例绘制。在附图中,在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见,在每个图中,并非每个组成部分均被标记。现在,将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例,其中:
图1是本发明示例性实施例的靶向纳米递药系统的粒径表征图。
图2是靶向纳递药系统的电位表征图。
图3是靶向纳米递药系统的透射电镜图,分别显示了HGM、HGMM的扫描电镜图。
图4是靶向纳米递药系统在不同组别、不同浓度下对4T1细胞毒性比较图。
图5是靶向纳米递药系统实验组、对照组和生理盐水对照组经尾静脉注射入乳腺癌荷瘤鼠后的治疗情况。
具体实施方式
为了更了解本发明的技术内容,特举具体实施例并配合所附图式说明如下。
在本公开中参照附图来描述本发明的各方面,附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解,上面介绍的多种构思和实施例,以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施,这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外,本发明公开的一些方面可以单独使用,或者与本发明公开的其他方面的任何适当组合来使用。
根据本发明示例性实施例的CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体,在制备过程中,首先将羰基锰化合物和葡萄糖氧化酶负载于白蛋白上,再加入高锰酸钾和聚烯丙胺盐酸通过氧化还原反应制得具有二氧化锰壳层保护的纳米粒,最后将生物相容性大分子透明质酸包覆纳米粒,即可得到靶向递送气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米粒。
如此,所制得的纳米粒提供了一种新的肿瘤治疗策略,CO气体协同化学动力疗法,并以透明质酸作为纳米粒衣壳,使得其在靶向肿瘤组织后能够内源性原位控制一氧化碳气体生成,起到了较好的抗肿瘤效果和长时递送稳定性。同时,有效提高疗效的同时,还可以避免了化疗药物对正常组织的伤害,减少化学药物和酶的外泄,减小对正常组织的毒副作用,起到保护性的作用。
作为示例制备得到的CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤药物递送系统,包括以白蛋白为载体并负载葡萄糖氧化酶和羰基锰化合物所形成的作为内核的纳米粒、在纳米粒外部包载的二氧化锰保护壳层;以及在二氧化锰保护壳层上包覆的透明质酸层,由此形成具有透明质酸和二氧化锰双层保护结构的靶向性酶催化产气纳米粒HGMM@HA。本发明的示例的纳米粒的粒径在170-180nm,电位为-22至-23mV。
在优选的实施例中,包载二氧化锰后的纳米粒的粒径为190-210nm,平均Zeta电位为19至21mV。
在优选的实施例中,靶向性酶催化产气纳米粒HGMM@HA的粒径为250-260nm,平均Zeta电位为-17至-19mV。
在优选的实施例中,所述作为内核的纳米粒中,负载的葡萄糖氧化酶的含量在5-7mg,锰羰基化合物含量在3-4mg。
在优选的实施例中,所述透明质酸层采用分子量10KD的透明质酸制备而成。
在优选的实施例中,所述羰基锰化合物为Mn2(CO)10,其中的锰为零价,两个锥体Mn(CO)5通过Mn-Mn键连接且相互错开,以便减少分子内的静电排斥作用,属于D 4d点群。Mn-Mn键的键长为239pm。红外振动光谱中有3个峰,分别是2044cm-1(中强)、2013cm-1(强)、1983cm-1(中强)。
在制备过程中,总体上包括以下过程:
(1)将白蛋白溶液稀释置于热水中,葡萄糖氧化酶溶于水配制成葡萄糖氧化酶溶液;将羰基锰化合物溶于乙醇配成羰基锰乙醇溶液;然后,将葡萄糖氧化酶溶液加入到白蛋白溶液中,低速搅拌5min,获得白蛋白-葡萄糖氧化酶溶液;其中,前述热水的温度在63.7±1℃;
(2)将2ml羰基锰乙醇溶液在高速搅拌状态下,匀速滴加到白蛋白-葡萄糖氧化酶溶液中,待羰基锰乙醇溶液全部注入后,快速将溶液转移至冰水浴中继续强力搅拌10min,直至溶液冷却;再使用超滤杯超滤制备好的纳米粒内核,超滤掉残余小分子后收集于试管中,放置于冰箱保存;
(3)将高锰酸钾和聚烯丙胺盐酸分别溶于水配成溶液,取步骤(2)中制备好的纳米粒内核置于反应瓶中,在强力搅拌状态下先滴加高锰酸钾溶液,1min后滴加聚烯丙胺盐酸溶液,常温搅拌2h,离心一次,去掉上清,加水使底部沉淀悬浮,用大分子透析袋透析12h,12h后获得加载有二氧化锰壳层的纳米粒;
(4)将透明质酸加水溶解制成透明质酸溶液,置于反应瓶中,在强力搅拌状态下滴加步骤(3)中制备的包载有二氧化锰壳层的纳米粒,继续常温搅拌反应5-6h,反应结束后离心一次,去掉上清,加水使底部沉淀混悬,用大分子透析袋透析12h,12h后即获得靶向性酶催化产气纳米粒HGMM@HA。
下面将结合具体的示例和试验,对前述递送系统的制备及其递送效果进行示例性试验和对比。
可选地,本发明下述实施例所使用的白蛋白溶液购自Octapharma。葡萄糖氧化酶购自中国上海源叶公司。羰基锰化合物(Mn 2(CO)10)购自于中国上海麦克林生化科技有限公司。当然本发明的实施例并不以此为限。
【实施例1】
(1)先将水浴锅磁力搅拌器温度设定为63.7℃,用100ml烧杯量取18ml水(水的总体系为20ml,溶解葡萄糖氧化酶需2ml),加热备用;称取5mg羰基锰溶于2ml无水乙醇中,配制得到浓度为2.5mg/mL的羰基锰乙醇溶液;称取8mg葡萄糖氧化酶溶于2ml去离子水中;在温度达到设定温度时,加入白蛋白溶液32mg,同时加入葡萄糖氧化酶水溶液,低速搅拌5min;随后转速调节到高速剧烈搅拌,用2ml注射器在1min内缓慢匀速将羰基锰乙醇溶液注入;注入完毕后迅速转移至预先备好的冰水浴中继续搅拌10min;用超滤杯过滤制备的纳米内核,每次加水20ml,超滤3次,最后超滤至体积为8ml,用试管收集纳米内核,置于4℃的环境中保存,备用。
(2)称取一定质量高锰酸钾,加水溶解使高锰酸钾浓度为0.8mg/ml;称取50mg聚烯丙胺盐酸,加入1ml去离子水,溶解备用;吸取步骤(1)中的纳米内核1ml于西林瓶中,搅拌状态下加入1ml高锰酸钾溶液,在1-2min内滴加入50ul聚烯丙胺盐酸溶液,常温搅拌反应2h;2h后离心一次,弃上清,加水混悬纳米沉淀;用1000kd分子量透析袋透析12h,收集包载有二氧化锰壳层的纳米粒,置于4℃的环境中保存,备用。
(3)称取12mg透明质酸,加1ml水溶解;先将透明质酸溶液置于西林瓶中,将步骤(2)中得到的包载有二氧化锰壳层的纳米粒滴加到透明质酸溶液中,室温搅拌反应6h,反应结束后离心一次,弃上清,加水混悬纳米沉淀;用1000kd分子量透析袋透析12h,即可得到靶向递送纳米粒HGMM@HA。
【实施例2】
按照实施例1中的方法制备以白蛋白为载体的纳米内核HGM和包载有二氧化锰壳层的纳米粒HGMM,将白蛋白为载体的纳米内核HGM,载有二氧化锰壳层的纳米粒HGMM以及靶向纳米粒HGMM@HA分别用去离子水配成羰基锰浓度为100μg/mL的溶液,然后在37℃下测其粒径大小。
三种纳米粒的粒径结果如图1所示,白蛋白为载体的纳米内核HGM的粒径为175±5nm;包载有二氧化锰壳层的纳米粒HGMM的粒径为200±10nm;靶向纳米粒HGMM@HA的粒径为255±5nm。结果表明粒径随着外层的包载越来越大,二氧化锰壳层以及透明质酸的成功包裹。
【实施例3】
按照实施例1中的方法制备以白蛋白为载体的纳米内核HGM和包载有二氧化锰壳层的纳米粒HGMM,将白蛋白为载体的纳米内核HGM,载有二氧化锰壳层的纳米粒HGMM以及靶向纳米粒HGMM@HA分别用去离子水配成羰基锰浓度为100μg/mL的溶液,然后在37℃下测其电位。
三种纳米粒的电位结果如图2所示,白蛋白为载体的纳米内核HGM的电位为-22±1mV;包载有二氧化锰壳层的纳米粒HGMM的电位为20±1mV;靶向纳米粒HGMM@HA的电位为-18±1mV。HGMM和HGM电位结果表明二氧化锰壳层成功加载,HGMM@HA和HGMM电位结果表明透明质酸成功包裹。
【实施例4】
按照实施例1中的方法制备以白蛋白为载体的纳米内核HGM和包载有二氧化锰壳层的纳米粒HGMM,将白蛋白为载体的纳米内核HGM和载有二氧化锰壳层的纳米粒HGMM分别用去离子水配成羰基锰浓度为100μg/mL的溶液,然后在透射电镜下测其形貌。
两种纳米粒的透射电镜结果如图3所示,二氧化锰壳层包载的HGMM纳米粒比相同比例尺下的白蛋白为载体的纳米内核HGM要大,表面也更完整,进一步证明二氧化锰壳层的加载。
【实施例5】
(1)将-80℃取出的4T1细胞复苏接种到25mm3的培养瓶中,加入5ml配好的1640完全培养基(含90%1640RPMI培养基,10%胎牛血清,1%青霉素-链霉素双抗),在37℃,5%CO2的条件下于培养箱中培养24h使细胞贴壁繁殖。
(2)在二次传代后,将一瓶4T1细胞消化后计数,以10000每孔的密度接种到96孔板中,在37℃,5%CO 2的条件下于培养箱中培养24h使细胞贴壁。
(3)弃去培养液,设置组别:空白组(无细胞,培养基,不加药);对照组(有细胞,培养基,不加药);白蛋白-葡萄糖氧化酶-羰基锰化合物-二氧化锰纳米粒组(HGMM)(有细胞,培养基,加药);白蛋白-葡萄糖氧化酶-二氧化锰纳米粒组(HGM)(有细胞,培养基,加药);白蛋白-葡萄糖氧化酶-二氧化锰纳米粒组(HMM)(有细胞,培养基,加药);每组设置3个复孔。用加入盐酸调节pH至6.0的1640培养基(不含血清)稀释药物,药物浓度如图4所示。加药后将4T1细胞放置在37℃、5%CO 2的培养箱中温育3小时。
(4)孵育3h弃去上清,加入灭菌PBS清洗三次,再次加入完全培养基继续培养4T1细胞2小时。最后,每孔加入10μL CCK-8试剂溶液和100μL的1640培养基,在37℃、5%CO 2的培养箱中温育2小时,最后用酶标仪测定450nm处的吸光度。
(5)数据处理。细胞存活率=(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)*100%。
(6)结果如图4所示,在同一酸性环境,统一操作处理后,HGMM组别的4T1细胞增殖被显著抑制,毒性最大;HGM组别的4T1细胞也被抑制,毒性中等;HMM组别的4T1细胞存活率最高,杀伤性最低。从结果来分析,HMM组由于没有葡萄糖氧化酶催化肿瘤细胞内葡萄糖,因而细胞内过氧化氢含量没有增加,CO得不到释放;HGM组由于葡萄糖氧化酶本身的所产生的化学动力疗法,对肿瘤细胞有一定的杀伤作用。
HGMM组在葡萄糖氧化酶以及羰基锰化合物双重影响下,两者相协同共同杀死肿瘤细胞,杀伤效果显著。所有这些结果表明,载有二氧化锰壳层的纳米粒HGMM对癌细胞有较强的抑制作用,说明基于酶催化产气抗肿瘤纳米粒具有很好的抗癌效果。
【实施例6】
(1)选取荷瘤体积(30-40mm 3)大致相等的4T1小鼠,随机分为5组(n=6):生理盐水组;白蛋白-二氧化锰载体组(HM);白蛋白-葡萄糖氧化酶-二氧化锰组(HGM);白蛋白-羰基锰-二氧化锰组(HMM);白蛋白-葡萄糖氧化酶-羰基锰-二氧化锰纳米粒组(HGMM)。分别静脉注射上述五组(GOx 240μg/mL,Mn2(CO)10 120μg/mL,200μl)。自第一次注射起,隔一天注射一次,共重复注射4次(除生理盐水组外其余各组都包载有透明质酸,增加药物蓄积)
(2)在给药第一天起连续记录肿瘤大小和体重,并根据下式计算肿瘤体积:宽度2×长度/2,2周后处死小鼠。
(3)结果如图5所示,通过不同的处理,在乳腺癌荷瘤小鼠中评估抗肿瘤治疗的功效。与对照组相比,载体组HM几乎无治疗效果,其他几组样品组HGM,HMM等治疗效果并不十分理想,而HGMM组则显示出非常好的抗肿瘤效果。该结果证明,CO气体治疗和化学动力疗法两者相协同有更佳的抗肿瘤效果。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者,在不脱离本发明的精神和范围内,当可作各种的更动与润饰。因此,本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。
Claims (11)
1.一种CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体,其特征在于,包括:以白蛋白为载体并负载葡萄糖氧化酶和羰基锰化合物所形成的作为内核的纳米粒、在纳米粒外部包载的二氧化锰保护壳层;以及在二氧化锰保护壳层上包覆的透明质酸层,由此形成具有透明质酸和二氧化锰双层保护结构的靶向性酶催化产气纳米粒HGMM@HA。
2.根据权利要求1所述的CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体,其特征在于,所述纳米粒的粒径在170-180nm,电位为-22至-23mV。
3.根据权利要求1所述的CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体,其特征在于,包载二氧化锰后的纳米粒的粒径为190-210nm,平均Zeta电位为19至21mV。
4.根据权利要求1所述的CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体,其特征在于,靶向性酶催化产气纳米粒HGMM@HA的粒径为250-260nm,平均Zeta电位为-17至-19mV。
5.根据权利要求1所述的CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体,其特征在于,所述作为内核的纳米粒中,负载的葡萄糖氧化酶的含量在5-7mg,锰羰基化合物含量在3-4mg。
6.根据权利要求1所述的CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体,其特征在于,所述透明质酸层采用分子量10KD的透明质酸制备而成。
7.根据权利要求1所述的CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体,其特征在于,所述羰基锰化合物为Mn2(CO)10,其中的锰为零价,两个锥体Mn(CO)5通过Mn-Mn键连接且相互错开,Mn-Mn键的键长为239pm。
8.一种根据权利要求1所述的CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体在抗肿瘤药物中的应用。
9.一种CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体的制备方法,其特征在于,包括:
(1)将白蛋白溶液稀释置于热水中,葡萄糖氧化酶溶于水配制成葡萄糖氧化酶溶液;将羰基锰化合物溶于乙醇配成羰基锰乙醇溶液;然后,将葡萄糖氧化酶溶液加入到白蛋白溶液中,低速搅拌5min,获得白蛋白-葡萄糖氧化酶溶液;
(2)将2ml羰基锰乙醇溶液在高速搅拌状态下,匀速滴加到白蛋白-葡萄糖氧化酶溶液中,待羰基锰乙醇溶液全部注入后,快速将溶液转移至冰水浴中继续强力搅拌10min,直至溶液冷却;再使用超滤杯超滤制备好的纳米粒内核,超滤掉残余小分子后收集于试管中,放置于冰箱保存;
(3)将高锰酸钾和聚烯丙胺盐酸分别溶于水配成溶液,取步骤(2)中制备好的纳米粒内核置于反应瓶中,在强力搅拌状态下先滴加高锰酸钾溶液,1min后滴加聚烯丙胺盐酸溶液,常温搅拌2h,离心一次,去掉上清,加水使底部沉淀悬浮,用大分子透析袋透析12h,12h后获得加载有二氧化锰壳层的纳米粒;
(4)将透明质酸加水溶解制成透明质酸溶液,置于反应瓶中,在强力搅拌状态下滴加步骤(3)中制备的包载有二氧化锰壳层的纳米粒,继续常温搅拌反应5-6h,反应结束后离心一次,去掉上清,加水使底部沉淀混悬,用大分子透析袋透析12h,12h后即获得靶向性酶催化产气纳米粒HGMM@HA。
10.根据权利要求9所述的CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,将白蛋白溶液和葡萄糖氧化酶溶液通过热水水浴,加热到63.7±1℃,舒展两种蛋白的肽链结构。
11.根据权利要求9所述的CO气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中使用的羰基锰化合物为Mn2(CO)10,其中的锰为零价,两个锥体Mn(CO)5通过Mn-Mn键连接且相互错开,Mn-Mn键的键长为239pm。
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