CN101229389A

CN101229389A - 纳米固定化酶止血材料制备方法

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Publication number: CN101229389A
Application number: CNA2008100826656A
Authority: CN
Inventors: 陈长昊
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-12-29
Filing date: 2008-02-25
Publication date: 2008-07-30

Abstract

本发明公开一种纳米固定化酶止血材料制备方法，其在严格控制温度低于10℃、pH值在4－7.3之间的环境条件下，以纳米级配制凝血酶溶液和具有止血效果的由生物相容性材料组成的固体联结物溶液，并将两种溶液共混后干燥，或将两种溶液干燥后共混，制备成纳米固定化酶止血材料。本发明运用了纳米技术及分子筛原理，结合酶固定化技术，有机整合了壳聚糖和凝血酶，实现优势互补，该方法操作方便、无需繁琐的准备工作、所制得止血材料使用时安全可靠、能起到快速止血、加速创面愈合、并且可作为药物载体。

Description

纳米固定化酶止血材料制备方法

【技术领域】

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种新型纳米微粒止血材料的制备方法。

【技术背景】

应用局部止血剂妥善止血是降低创伤或战伤死亡率、缩短手术时间、提高手术成功率的有效手段。当前，局部止血剂涉及医学、材料学、高分子化学等多个学科，诸如：1)经典止血剂凝血酶、纤维蛋白原等；2)微球类止血材料，如沸石、微孔多聚糖止血粉等；3)壳聚糖类止血剂如HemCon绷带、聚乙酰氨基葡萄糖止血绷带。但各种新型止血敷料的止血机理主要有以下三个：1)直接提供高浓度凝血因子，在局部快速形成血凝块；2)浓缩局部凝血因子，提供凝血表面，激活血小板、吸附红细胞，激发凝血级联反应；3)刺激血管收缩或局部压迫使血管闭锁。

作为生物蛋白酶的经典止血剂——凝血酶可有效缩短止血时间，其环境稳定性却限制着它的使用范围。新型止血材料壳聚糖可通过改性制备成各种制剂，但其止血效果多不及生物酶类止血剂。微球类止血材料是一类利用分子筛、提供凝血表面等物理、化学作用缩短止血时间的制剂，在临床应用中，止血效果不甚稳定。纳米材料有着独特的性质，如表面效应、尺寸效应、隧道效应等，可以为外科止血提供独立于缝扎、电凝、填塞、促进凝血栓形成等方法之外的新途径，但是纳米止血技术尚处试验阶段，极不成熟。

如何将经典的生物酶类止血材料与最新止血技术相结合，制备适合多种环境(诸如野战急救、术中止血等)的新型止血材料成为止血领域的研究热点。

【发明内容】

本发明旨在运用纳米技术及分子筛原理，结合酶固定化技术，提供一种纳米固定化酶止血材料制备方法，有机整合壳聚糖和凝血酶，实现优势互补。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明纳米固定化酶止血材料制备方法，其在严格控制温度低于10℃、pH值在4-7.3之间的环境条件下，以纳米级配制凝血酶溶液和具有止血效果的由生物相容性材料组成的固体联结物溶液，并将两种溶液共混后干燥，或将两种溶液干燥后共混，制备成纳米固定化酶止血材料。

所述固体联结物溶液所采用的生物相容性材料采用壳聚糖、甲亢素、聚乙酰氨基葡萄糖、胶原蛋白、淀粉中任意一种。

所述凝血酶溶液的溶剂为凝血酶原、纤维蛋白或纤维蛋白原。

在制备凝血酶溶液时可加入包被药物，用于参与治疗。所述包被药物为生长因子、化疗药物、止痛药物或抗菌药物。

本方法在制备止血材料的过程中，控制所述固体联结物与凝血本酶共混后质量比为1∶1～100∶1之间。

所述固体联结物的浓度被控制为0.5mg/L～20mg/L之间。

本方法的止血材料粒径控制在30～2000nm之间。

更进一步，制备成所称的止血材料后，本方法还具有对其进行消毒的步骤。

本方法所制得的止血材料中，被控制至少存在1～500mg的凝血酶。

与现有技术相比，本发明具备如下优点：

1.按本发明的方法可避免使用有毒材料，诸如传统的交联剂戊二醛、甲醛等，所生产的产品与机体生物相容性好、无毒副作用，在体内可彻底降解；

2.凝血酶已经为纳米级固体联结物尤其是壳聚糖所固定化，物理及化学稳定性大为提高，可于常温下储存运输，价格低廉；可直接喷洒于出血创面，使用方便、快捷；

3.纳米级壳聚糖固定化凝血酶，不但使壳聚糖、凝血酶的常规止血作用优势互补，还具有纳米微球类的分子筛作用，发挥其独特的止血作用；

4.运用纳米药物缓释技术，可携带多种药物，制备适合不同环境、各种出血创面的止血制剂，扩大本止血材料的使用范围，在机体中可缓慢释放药物，达到局部用药、减少药物毒副作用或促进创面愈合的功能。

【附图说明】

图1为本发明止血材料的示意图，图中T代表凝血酶，C代表固体联结物；

图2为应用本发明的方法所生产的产品的TEM(透射电子显微镜)照片；

图3为应用本发明的方法所生产的产品的SEM(扫描电子显微镜)照片。

【具体实施方式】

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明：

如下列举本发明纳米固定化酶止血材料制备方法的四种实施例，各实施例均需先完成一个步骤，即：配制固体联结物溶液和凝血酶溶液，环境应严格控制温度于10℃以下，pH值在4-7.3之间，或者更精确地控制在4.2-4.8之间。

需要指出的是，所述固体联结物溶液所采用的生物相容性材料可采用壳聚糖、甲亢素、聚乙酰氨基葡萄糖、胶原蛋白、淀粉中任意一种。以下各实施例中则以壳聚糖例进行说明。而所述凝血酶溶液的溶剂则可为凝血酶原、纤维蛋白或纤维蛋白原。在制备凝血酶溶液时可加入包被药物，用于参与治疗。所述包被药物为生长因子、化疗药物、止痛药物或抗菌药物。

实施例一主要包括如下几个步骤：

步骤一、分别真空冷冻干燥所述两种溶液，得固体联结物和凝血酶干粉制剂；

步骤二、按比例将所述两种干粉制剂共混，固体联结物与凝血酶的质量比控制在(1～20)∶1之间；

步骤三、将共混后的干粉制剂进行物理研磨至呈500～2000nm微粒。

实施例二主要包括如下几个步骤：

步骤一、按比例混合所述两种溶液，如所采用的壳聚糖和凝血酶的质量比控制在(2～100)∶1之间，壳聚糖浓度在(0.5～20)mg/L；

步骤二、将共混后的溶液置入密闭容器，加盖筛孔直径为20～1000nm的滤器，接真空冷冻干燥器，利用喷雾干燥法得粒径在30～1000nm的纳米微粒。

实施例三主要包括如下几个步骤：

步骤一、按比例混合上述两种溶液，如壳聚糖和凝血酶的质量比控制在(2～100)∶1之间，壳聚糖浓度在(0.5～5)mg/L；

步骤二、在磁力搅拌、超声等方式下，加入三聚磷酸钠等无毒离子交联剂，制备壳聚糖固定化凝血酶纳米微粒溶液；

步骤三、真空冷冻干燥步本实施例步骤二所得纳米微粒溶液，得粒径在30～500nm的纳米微粒。

实施例四主要包括如下几个步骤：

步骤一、对固体联结物如壳聚糖进行化学修饰，制备具有亲水和疏水的两性分子；

步骤二、在磁力搅拌、超声等方式下，将上述修饰过的两性分子加入凝血酶溶液，分子自组装成纳米微粒，使壳聚糖和凝血酶的最终质量比在(2～100)∶1之间，壳聚糖的最终浓度在(0.5～5)mg/L之间；

步骤三、真空冷冻干燥本实施例步骤二所得溶液，得粒径在20～300nm的纳米微粒。

上述各实施例在完成其各自的几个主要步骤后，所得的纳米微粒还需要进行消毒的步骤，具体可采用Co60进行消毒，消毒后即可用直接用于出血部位，亦可作为原材料，进行深加工，从而制备适用于不同条件的止血剂。

上述各实施例制备的包含凝血酶的纳米微粒具有止血效果，如再加入其他治疗目的的药物后，可通过上述工艺制备具有不同治疗作用的材料，深加工后可制备止血贴剂、止血胶的不同止血制剂。

上述制作固体联结物是壳聚糖纳米微粒体系，该体系制作工艺成熟，产物生物相容性好，有一定的黏附性，且可作为多种药物的载体。同时，随着旧材料的改型及新材料的研发，壳聚糖纳米粒亦可为甲壳素、聚乙酰氨基葡萄糖、胶原蛋白、淀粉等材料所替代。

上述凝血酶来自猪或其他动物，亦可来自血站，制备方法如下：

以新鲜血液为原料，经过高速离心，硫酸钡沉淀、盐溶液洗脱、脱盐、氯化钙激活浓缩，加保护剂，去病毒、无菌过滤、得到凝血酶溶液。

本发明所制得的止血材料可通过参考图1和图3获得进一步提高认识。

综上所述，本发明相对现有技术具有较大的改进，用该本发明的方法所生产的产品可广泛应用于普通外科、神经外科、心胸外科、泌尿外科、妇产科、口腔科、微创外科(如腹腔镜、胸腔镜、盆腔镜)等需要止血、堵漏(瘘)的手术中，缩短手术时间，降低手术风险，加速创伤愈合，缩短住院时间。亦可用于战伤、事故中的急救止血。

Claims

1.一种纳米固定化酶止血材料制备方法，其特征在于：在严格控制温度低于10℃、pH值在4-7.3之间的环境条件下，以纳米级配制凝血酶溶液和具有止血效果的由生物相容性材料组成的固体联结物溶液，并将两种溶液共混后干燥，或将两种溶液干燥后共混，制备成纳米固定化酶止血材料。

2.根据权利要求1所述的纳米固定化酶止血材料制备方法，其特征在于：所述固体联结物溶液所采用的生物相容性材料采用壳聚糖、甲亢素、聚乙酰氨基葡萄糖、胶原蛋白、淀粉中任意一种。

3.根据权利要求2所述的纳米固定化酶止血材料制备方法，其特征在于：所述凝血酶溶液的溶剂为凝血酶原、纤维蛋白或纤维蛋白原。

4.根据权利要求3所述的纳米固定化酶止血材料制备方法，其特征在于：在制备凝血酶溶液时加入包被药物，用于参与治疗。

5.根据权利要求4所述的纳米固定化酶止血材料制备方法，其特征在于：所述包被药物为生长因子、化疗药物、止痛药物或抗菌药物。

6.根据权利要求1至5中任意一项所述的纳米固定化酶止血材料制备方法，其特征在于：本方法在制备止血材料的过程中，控制所述固体联结物与凝血本酶共混后质量比为1∶1～100∶1之间。

7.根据权利要求1至5中任意一项所述的纳米固定化酶止血材料制备方法，其特征在于：所述固体联结物的浓度被控制为0.5mg/L～20mg/L之间。

8.根据权利要求1至5中任意一项所述的纳米固定化酶止血材料制备方法，其特征在于：本方法的止血材料粒径控制在30～2000nm之间。

9.根据权利要求1至5中任意一项所述的纳米固定化酶止血材料制备方法，其特征在于：制备成所称的止血材料后，本方法还具有对其进行消毒的步骤。

10.根据权利要求1至5中任意一项所述的纳米固定化酶止血材料制备方法，其特征在于：本方法所制得的止血材料中，被控制至少存在1～500mg的凝血酶。