CN109046360A - 一种催化活性提高的Fe3O4纳米酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶及其制备方法和应用，在四氧化三铁纳米酶(Fe₃O₄nanozyme)中掺杂金属元素后可提高其过氧化物酶、过氧化氢酶和/或超氧化物歧化酶活性；本发明的金属元素掺杂的四氧化三铁纳米酶可以大批量制备，成本低廉、室温保存的稳定性较好、安全性好，具有较好的经济价值和应用前景。

Description

一种催化活性提高的Fe3O4纳米酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米材料及生物医学纳米技术领域，具体涉及一种催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶及其制备方法和应用。

背景技术

酶是活细胞产生的一类具有催化作用的有机分子，具有催化效率高、底物专一、反应条件温和等特点。然而，由于酶的化学本质是蛋白质，在酸、碱、热等非生理环境中容易发生结构变化而失活。为此，科学家一直在寻求用化学合成法制备人工模拟酶，以便在非生理环境中应用。如何提高模拟酶的催化效率，一直是该领域的核心问题之一。

自1993年以来，纳米材料类酶催化现象偶有报道，但是由于缺乏深入研究而没有引起广泛关注。直到2007年，中国科学家打破传统学科界限，通过生物、化学、材料、物理、医学等领域研究人员的多年精诚合作，首次从酶学角度系统地研究了无机纳米材料的酶学特性(包括催化的分子机制和效率，以及酶促反应动力学)，建立了一套测量纳米酶催化活性的标准方法，并将其作为酶的替代品应用于疾病的诊断。随后，国内外许多实验室也陆续报道了其他纳米材料的酶学特性。2013年，汪尔康院士和魏辉教授以纳米酶(nanozyme)为题发表长篇综述文章。从此，纳米酶(nanozyme)这一新概念引起了学术界广泛关注。目前，全球至少已有22个国家130个实验室从事纳米酶研究，50多种不同材料和结构的纳米酶被陆续报道，纳米酶的应用研究也已经拓展到了生物、农业、医学、环境治理和国防安全等多个领域，逐渐形成了纳米酶研究新领域。

纳米酶是新一代人工模拟酶，它如同天然酶一样，能够在温和条件下高效催化酶的底物，呈现出类似天然酶的催化效率和酶促反应动力学；但是它比天然酶稳定，即使在强酸/强碱(pH 2～10)或较大温度范围(4℃～90℃)内，仍能保持85％催化活性。动物实验表明，纳米酶有保护心肌、改善阿尔茨海默病和缺血性脑卒中等功能，预示纳米酶的应用研究已经从体外扩展到了体内，有望为疾病的治疗提供新思路和新方法。纳米酶的出现改变了人们的传统观念，无机纳米材料不再被认为是惰性物质。纳米酶揭示了纳米材料自身蕴含的生物效应，这不仅拓展了纳米材料在生物医学中的应用，还为人工模拟酶研究提供了新思想和新材料，更是为纳米生物学开启了新的研究方向。

本申请的发明人在早期工作发现了Fe₃O₄纳米酶(iron oxide nanozyme，IONzyme)具有过氧化物模拟酶活性。Fe₃O₄纳米酶在生物医学和催化剂等方面有着广泛的用途，主要是由于Fe₃O₄纳米酶磁性强、比表面积大、粒径分布小、生物相容性高等特点，利用这些可以进行筛选与分离细胞组织，靶向递送药物，还可以用于肿瘤诊断和治疗。Fe₃O₄纳米酶可以作为催化剂的载体，把催化剂包覆在表面。Fe₃O₄纳米酶的应用范围越来越广，但是其类酶催化活性与天然酶相比较低，限制了其实际应用价值，需要开发新的方法进一步优化提高其催化活性。

发明内容

一方面，本发明提供了一种催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶，其为掺杂铬、钙、镁、铜、锌、锰、镍、钴、锡、铅中的一种或多种金属元素的Fe₃O₄纳米酶。

所述催化活性包括过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性中的一种或多种。具体的，掺杂铬、镍、锡、铜、锰、钴和铅中的一种或多种，可以提高Fe₃O₄纳米酶的过氧化物酶活性；掺杂钴、锰、铅、钙、铬、镍和铜中的一种或多种，可以提高Fe₃O₄纳米酶的过氧化氢酶活性；掺杂铬可以提高Fe₃O₄纳米酶的超氧化物歧化酶活性。

另一方面，本发明提供了一种制备催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶的方法，所述方法包括在制备Fe₃O₄纳米颗粒的过程中掺杂入金属元素的步骤。

所述Fe₃O₄纳米颗粒的制备可以通过水热法、非水溶剂热法、共沉淀法、微乳液法、微波等离子法等本领域常规的方法即可实现，优选水热法和/或溶剂热法。

进一步的，所述方法包括如下步骤：(1)将铁源与溶剂按比例溶解，得反应液A；(2)向反应液A中加入碱性溶液，得反应液B；(3)向反应液B中加入金属元素，得反应液C；(4)将反应液C置于反应釜中，加热得到催化活性提高的Fe3O4纳米酶。

进一步的，所述步骤(1)中，铁源与溶剂搅拌完全溶解。

进一步的，所述步骤(2)中，加入碱性溶液，搅拌，形成均匀悬浊液。

进一步的，所述步骤(3)中，金属元素与反应液B充分混合均匀，任选的，加入金属元素后包括搅拌和/或超声的步骤。

进一步的，所述步骤(4)中，加热的温度为100-500℃，优选150-300℃加热的时间为1-72h，优选5-40h。

可选的，在步骤(4)之后还包括醇洗的步骤。

所述铁源选自二价铁和/或三价铁，优选氯化铁和/或硫酸亚铁。

所述溶剂为醇类溶剂、醚类溶剂、酮类溶剂、烃类溶剂、酯类溶剂中的一种或多种；优选，醇类溶剂；更优选，乙二醇、丙三醇、乙醇、聚乙二醇中的一种或多种。

所述铁源与溶剂的摩尔比为1:1-1000。

所述碱性溶液选自醋酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、NH₄ ⁺中的一种或多种，优选醋酸钠、柠檬酸钠和/或碳酸氢钠；所述碱性溶液的终浓度为0.01-1mol/L。

所述金属元素选自常见金属元素和过渡金属元素，优选，钙、镁、铜、锌、锰、铬、镍、钴、锡、铅中的一种或多种；所述金属元素加入的终浓度为10^-4-10mol/L。优选的，所述金属元素以金属盐的形式加入；优选的，所述金属盐为卤化盐、硫酸盐和/或磷酸盐。

所述催化活性包括过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性中的一种或多种。

进一步的，所述步骤(3)中，加入铬、镍、锡、铜、锰、钴和铅中的一种或多种，可以得到过氧化物酶活性提高的Fe₃O₄纳米酶；加入钴、锰、铅、钙、铬、镍和铜中的一种或多种，可以得到过氧化氢酶活性提高的Fe₃O₄纳米酶；加入铬可以得到超氧化物歧化酶活性提高的Fe₃O₄纳米酶。

另一方面，本发明还提供了一种提高Fe₃O₄纳米酶催化活性方法，所述方法包括在Fe₃O₄纳米酶中掺杂入金属元素的步骤；所述催化活性包括过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性中的一种或多种。所述金属元素选自常见金属元素和过渡金属元素，优选，钙、镁、铜、锌、锰、铬、镍、钴、锡、铅中的一种或多种；掺杂铬、镍、锡、铜、锰、钴和铅中的一种或多种，可以提高Fe₃O₄纳米酶的过氧化物酶活性；掺杂钴、锰、铅、钙、铬、镍和铜中的一种或多种，可以提高Fe₃O₄纳米酶的过氧化氢酶活性；掺杂铬可以提高Fe₃O₄纳米酶的超氧化物歧化酶活性。

另一方面，本发明还提供了催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶的应用，所述应用包括生物、农业、医学、环境治理和国防安全等领域的应用，例如，在生物医学、传感检测、化工制药、环境治理等方面的应用。

具体的，本发明的Fe₃O₄纳米酶的应用可包括在制备催化剂中的应用，在制备肿瘤诊断试剂和/或制备治疗肿瘤的药物中的应用，在检测血糖和/或尿酸中的应用，在制备药物载体和/或造影剂中的应用，在制备抗菌药物中的应用，在环境检测和/或污水治理中的应用，以及在农药和/或神经毒剂检测中的应用。

有益效果

本发明涉及的Fe₃O₄纳米酶易大批量制备、成本低、生物相容性高、室温保存更稳定、易于修饰和标记，而且安全无毒。根据不同酶活性的需求，可以添加相应的金属元素进行调节，从而得到催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶，可满足实际生产的需求。

附图说明

图1.金属元素掺杂的Fe₃O₄纳米酶的扫描电子显微镜图。

图2.金属元素掺杂的Fe₃O₄纳米酶透射电子显微镜图。

图3.金属元素掺杂Fe₃O₄纳米酶中金属元素的含量。

图4.金属元素掺杂Fe₃O₄纳米酶表面电荷表征。

图5.金属元素掺杂Fe₃O₄纳米酶过氧化物酶活性测定结果，其中，U/mg代表比活力。

图6.金属元素掺杂Fe₃O₄纳米酶过氧化氢酶活性测定结果，其中，Vmax/Km代表催化效率。

图7.金属元素掺杂Fe₃O₄纳米酶超氧化物歧化酶活性测定结果，其中，U/mg代表比活力。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1：金属元素掺杂提高Fe₃O₄纳米酶的制备

试验材料：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，TMB)、氯化铁、乙二醇均从Sigma公司订购，室温避光储存备用。30％H₂O₂、醋酸钠、氯化钙、氯化镁、氯化铜、氯化锌、氯化锰、氯化铬、氯化镍、氯化钴、氯化锡和氯化铅皆从生工公司订购，室温储存备用。

试验方法：

通过水热合成法制备金属元素掺杂的纳米酶，首先，0.82g的无水氯化铁通过磁力搅拌完全溶于40ml的乙二醇中，形成澄清的溶液。接着，缓慢加入3.6g的三水醋酸钠，快速搅拌，形成均匀悬浊液。再加入0.1g的无机金属盐：氯化钙、氯化镁、氯化铜、氯化锌、氯化锰、氯化铬、氯化镍、氯化钴、氯化锡、氯化铅，充分搅拌，再超声10min，使金属盐与上述溶液充分的混合均匀。然后，将溶液转移至50ml聚四氟乙烯反应釜中。最后，将反应釜置于200℃下加热12h。待反应釜自然冷却到室温后，得到黑色沉淀物，即金属元素掺杂的纳米酶。然后，用乙醇和水洗涤产物三次。最终，将得到的黑色沉淀物分散在乙醇中，放置4℃冰箱待用；然后，对纳米酶进行物理化学表征(形貌、粒径、Zeta电势、元素分析)。

试验结果：

运用扫描电子显微镜和透射电子显微镜检测纳米酶的形态及粒径，如图1和图2所示，可以观察到大量单分散的黑色的纳米酶颗粒，这些纳米酶形貌良好，大致呈椭球形，尺寸均一。与单独的Fe₃O₄纳米酶相比，钙掺杂纳米酶后，形态没有改变，粒径变小；镁掺杂纳米酶后，形态和粒径没有改变；铬、锡和铅掺杂纳米酶，粒径变小，纳米酶表面发生了褶皱，比表面积变大。

运用能谱仪(Energy Dispersive Spectrometer，EDS)检测Fe₃O₄纳米酶掺杂的金属元素含量。如图3所示，除了Ca-Fe₃O₄4和Cu-Fe₃O₄表面的钙、铜元素的量比较少，其余的金属含量均很高。

运用动态光散射技术检测金属元素掺杂Fe₃O₄纳米酶表面所携带的电荷特征。如图4所示，锰、铬、镍、钴、锡和铅掺杂后可以显著提高纳米酶表面的正电荷，其中铅掺杂提高最为显著，其次是铬。表面电荷的多少将会影响纳米酶的催化效率，这些掺杂后改变表面电荷的金属元素可以改善纳米酶的催化活性。

实施例2：金属元素掺杂增强Fe₃O₄纳米酶过氧化物酶活性

试验材料：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，TMB)从Sigma公司订购，室温避光储存备用。30％H2O2、醋酸钠皆从生工公司订购，室温储存备用。

方法：催化底物H2O2的酶促动力学参数测定，检测方法是取适量的纳米酶，溶于200μl的0.1M醋酸钠缓冲液(pH 4.5)，加入4μl的TMB溶液(10mg/ml，溶于DMSO)，调整H₂O₂的量，酶标仪检测酶标仪检测652nm下的光吸收值，时间扫描300s，反应温度37℃。对于纳米酶，加入H2O2的浓度梯是0、18.625、37.125、74.25、148.5、297、594、1188mM。应用GraphPadPrism7软件对实验数据进行统计分析其比活，即一分钟催化1μM的TMB产物所需的纳米酶的量。

运用酶动力学曲线来检测金属掺杂对Fe₃O₄的过氧化物酶样活性的影响。如图5所示，与Fe₃O₄组相比，Cr-Fe₃O₄的过氧化物酶活性极显著提高；其次，Ni-Fe₃O₄、Sn-Fe₃O₄、Cu-Fe₃O₄、Mn-Fe₃O₄、Co-Fe₃O₄和Pb-Fe₃O₄的过氧化物酶活性也显著提高；而Ca-Fe₃O₄、Mg-Fe₃O₄和Zn-Fe₃O₄的过氧化物酶活性无明显变化。

实施例3：金属元素掺杂增强Fe₃O₄纳米酶过氧化氢酶活性

试验材料：30％H2O2、醋酸钠皆从生工公司订购，室温储存备用。

方法：催化底物H2O2的酶促动力学参数测定，检测方法是取适量的纳米酶，溶于5ml的0.1M醋酸钠缓冲液(pH 7.4)，加入不同H2O2的量，利用溶氧仪检测氧气产生的速度。应用GraphPad Prism7软件对实验数据进行统计分析，采用Michaelis-Menten kinetics分析催化参数并比较催化效率。

运用溶氧仪来检测金属掺杂对Fe₃O₄的过氧化氢酶样活性的影响。如图6所示，与Fe₃O₄相比，Co-Fe₃O₄的过氧化氢酶活性极显著提高；其次，Mn-Fe₃O₄、Pb-Fe₃O₄、Cu-Fe₃O₄、Ca-Fe₃O₄、Ni-Fe₃O₄、Cr-Fe₃O₄的过氧化氢酶活性显著提高；而Mg-Fe₃O₄、Zn-Fe₃O₄的过氧化氢酶活性没有显著差异。

实施例4：金属元素掺杂增强Fe₃O₄纳米酶超氧化物歧化酶(SOD)活性

试验材料：超氧化物歧化酶检测试剂盒从生工公司订购，室温储存备用。

方法：根据SOD检测试剂盒

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至560mm，蒸水调调零。

2、将试剂三用蒸馏水稀释两倍，用多少配多少。(试剂三和蒸馏水1：1稀释)。

3、测定前将试剂一、二和四25℃(其他物种)水溶5min以上。

4、样本测定(在EP管或96孔板中依次加入下列试剂)。

	A	B	C
				试剂名称(ul)	样本本身	测定管	对照管
试剂一		45	45
				试剂二		100	100
试剂三		2	2
				样本	18	18
试剂四		35	35
				蒸馏水	182		18

5、充分混匀，室温静置30min后，560nm处测定各管吸收度值A。

SOD活性计算：

抑制百分率的计算

抑制百分率＝(A对照管-A测定管)÷A对照管×100％

抑制百分率在10％-90％范围之内。

SOD酶活性计算：

在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率位50％时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(U/mL)

SOD酶活性计算：

SOD活性(U/mL)

＝[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷V样×样本稀释倍数＝11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)乘以样本稀释倍数

V反总：反应体系总体积，0.2mL；

V样：加入反应体系中样本体积，0.018mL；

试验结果：

运用超氧化物歧化酶试剂盒对金属掺杂的Fe₃O₄的超氧化物歧化酶活性进行检测，如图7所示，与Fe₃O₄相比，Cr-Fe₃O₄的超氧化物歧化酶活性极显著增加。其他金属掺杂的Fe₃O₄纳米酶的超氧化物歧化酶活性没有显著增加。

本发明提供了通过掺杂金属元素提高Fe₃O₄纳米酶催化活性的方法，这种掺杂金属元素提高纳米酶催化活性的方法反应体系简单、产量高、成本低，具有潜在的应用前景。

Claims (10)

1.一种制备催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶的方法，其特征在于，所述方法包括在制备Fe₃O₄纳米颗粒的过程中掺杂入金属元素的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fe₃O₄纳米颗粒通过水热法、非水溶剂热法、共沉淀法、微乳液法和/或微波等离子法制备；优选，水热法和/或非水溶剂热法。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将铁源与溶剂按比例溶解，得反应液A；

(2)向反应液A中加入碱性溶液，得反应液B；

(3)向反应液B中加入金属元素，得反应液C；

(4)将反应液C置于反应釜中，加热得到催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述金属元素选自铬、钙、镁、铜、锌、锰、镍、钴、锡、铅中的一种或多种；优选的，所述金属元素以金属盐的形式加入；更优选的，所述金属盐为卤化盐、硫酸盐和/或磷酸盐。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述催化活性包括过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性中的一种或多种。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶剂为醇类溶剂、醚类溶剂、酮类溶剂、烃类溶剂、酯类溶剂中的一种或多种；优选的，所述溶剂为醇类溶剂；更优选的，所述醇类溶剂为乙二醇、丙三醇、乙醇、聚乙二醇中的一种或多种；更优选的，所述铁源与溶剂的摩尔比为1:1-1000。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述碱性溶液选自醋酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、NH₄ ⁺中的一种或多种，优选，醋酸钠、柠檬酸钠和/或碳酸氢钠；更优选的，所述碱性溶液的终浓度为0.01-1mol/L。

8.一种催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶，其特征在于，所述催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶为掺杂铬、钙、镁、铜、锌、锰、镍、钴、锡、铅中的一种或多种金属元素的Fe₃O₄纳米酶；优选的，所述催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶由权利要求1-6任一方法制备得到。

9.一种提高Fe₃O₄纳米酶催化活性方法，所述方法包括在Fe₃O₄纳米酶中掺杂入金属元素的步骤；所述催化活性包括过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性中的一种或多种；所述金属元素选自铬、钙、镁、铜、锌、锰、镍、钴、锡、铅中的一种或多种。

10.权利要求8所述的催化活性提高的Fe₃O₄纳米酶的应用，所述应用选自如下I-VII中的任意一种或几种：

I、制备催化剂；

II、制备肿瘤诊断试剂和/或制备治疗肿瘤的药物；

III、检测血糖和/或尿酸；

IV、制备药物载体和/或造影剂；

V、制备抗菌药物；

VI、环境检测和/或污水治理；

VII、农药和/或神经毒剂检测。