CN105129863A - 四氧化三铁纳米团簇模拟酶及制备方法以及用其快速检测乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种四氧化三铁纳米团簇模拟酶及制备方法以及用其快速检测乳酸的<b>方法</b>,该模拟酶是由细小的四氧化三铁纳米晶进行自组装形成的团簇状疏松颗粒,具有较大的比表面积。该模拟酶的制备方法,包括如下步骤:将三氯化铁、无水乙酸钠溶于乙二醇中,再加入去离子水搅拌,使之形成分散均匀的溶液;将步骤A得到的溶液装入水热反应釜中,放入已升温至160℃—200℃烘箱中反应;洗涤,真空干燥后得到固体样品。本发明不仅提供了一种高效的模拟过氧化物酶材料,同时还建立了一种选择性高、简便、灵敏地检测乳酸的新方法,可广泛应用到临床医学诊断和食品安全监测方面。
Description
技术领域
本发明属于纳米技术和分析检测技术领域,具体涉及一种四氧化三铁纳米团簇模拟酶及制备方法以及用其快速检测乳酸的方法。
背景技术
自纳米材料的模拟酶特性被发现以来,纳米材料模拟酶以其制备和纯化简单、储存容易、价格低廉、性能稳定等优势已被广泛应用于免疫医学检测、葡萄糖和双氧水检测、有机污染物清除等多个领域。纳米材料模拟酶的催化活性与其比表面积有极大的关系,比表面积越大,材料表面具有催化活性位点就越多,材料类似于天然酶的催化活性就越高,因此,探寻具有大比表面积的纳米材料模拟酶具有重要的意义。
乳酸既是人体无氧糖代谢的重要产物,也是一种重要的食品添加剂。在食品科学中,乳酸含量可用于评价牛奶、水果、日常食品、蔬菜、香肠以及酒类的新鲜度和稳定性。健康人血乳酸浓度为0.5—1.7mmol/L,由于组织缺氧或者肝脏疾病会引起的人体血液中乳酸浓度的增加,因此,乳酸含量可以作为临床许多疾病(如:急性一氧化碳中毒、脓毒症、新生儿窒息、严重创伤、急性失血性休克等)的相关指示。在临床分析中,乳酸监测对于监测呼吸不充分、休克、心脏疾病和代谢失调都很重要,鉴于此,建立一套稳定、准确和成本较低的乳酸定量测试方法至关重要。
目前乳酸测定方法主要有:容量法,分光光度法和色谱分离法。这些方法有的存在特异性低,易受干扰,准确度不高的问题,而有的则需要昂贵的设备,对操作人员要求较高,因此,基于纳米材料优异的模拟酶特性建立简单、经济、高选择性、高灵敏度检测乳酸的新方法必能极大地推动临床医学中乳酸的检测水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有类过氧化物酶活性的四氧化三铁纳米团簇模拟酶;
本发明的另一个目的是提供一种四氧化三铁纳米团簇模拟酶的制备方法;
本发明的再一个目的是提供一种用四氧化三铁纳米团簇模拟酶快速检测乳酸的方法。
本发明采用以下技术方案:一种四氧化三铁纳米团簇模拟酶,它是由细小的四氧化三铁纳米晶进行自组装形成的团簇状疏松颗粒,具有较大的比表面积,其比表面积在89-103m2/g之间。它具有优良的类似于过氧化物酶的催化活性。
一种四氧化三铁纳米团簇模拟酶的制备方法,它包括如下步骤:
A、将三氯化铁、无水乙酸钠溶于乙二醇中,再加入去离子水搅拌,使之形成分散均匀的溶液,其中三氯化铁和无水乙酸钠的摩尔比为1:3—1:12,去离子水体积为0.36—0.9mL;
B、将步骤A得到的溶液装入水热反应釜中,放入已升温至160℃—200℃烘箱中,反应8—16小时,然后随炉冷却至室温;
C、倾出反应釜中的上层清液,将沉淀产物取出,分别用乙醇和去离子水至少洗涤三次,真空干燥后得到固体样品,即为四氧化三铁纳米团簇。
用上述的四氧化三铁纳米团簇模拟酶快速检测乳酸的方法,其特征在于它包括如下步骤:
D、将四氧化三铁纳米团簇模拟酶分散于水中形成四氧化三铁模拟酶储备液A,室温下储存,将乳酸氧化酶和待测乳酸的磷酸盐缓冲溶液充分混合,在37℃水浴中反应30分钟,促使产生H2O2,形成溶液B;
E、将四氧化三铁模拟酶储备液A、溶液B和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的乙醇溶液加入到乙酸-乙酸钠缓冲溶液中充分混合,在水浴中反应10分钟,取出,放入冰水终止反应,最后外加磁场去除四氧化三铁纳米团簇,即得到最终反应液;
F、取步骤E中的最终反应液,测定在652nm处的吸光度值,比色检测乳酸的浓度。
优选的,所述步骤D中的四氧化三铁纳米团簇模拟酶储备液A范围为:0.5mg/ml—3mg/ml。
优选的,所述步骤E中的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的乙醇溶液浓度范围为:20mM—36mM。
优选的,所述步骤E中乙酸-乙酸钠缓冲溶液pH值范围为3.0—6.0。
优选的,所述步骤E中反应温度范围为25℃—55℃。
优选的,检测乳酸的线性范围为5.0×10-6mol/L—2.0×10-3mol/L,检测限为1.0×10-6mol/L。
本发明的显著优点是:
1)本发明四氧化三铁纳米团簇模拟酶是通过改进的溶剂热法制备的,该方法在制备四氧化三铁纳米团簇时不引入表面活性剂,通过加入一定量的去离子水来促使反应过程中产生的许多细小的Fe3O4纳米晶进行自组装形成的团簇状疏松颗粒,颗粒比表面积较大,具有优良的类过氧化物酶活性。通过调节三氯化铁、无水乙酸钠和去离子水的加入量,能够制备不同粒径大小的四氧化三铁纳米团簇,平均粒径范围为40nm—200nm。
本发明四氧化三铁纳米团簇较其他形貌和粒径的Fe3O4纳米颗粒具有较高的模拟过氧化物酶催化能力,稳定的、可重复利用。
2)本发明检测乳酸过程的原理是:先利用待测样品中的乳酸在乳酸氧化酶的催化下可与空气中O2反应产生H2O2,再利用四氧化三铁纳米团簇模拟过氧化酶物特性,高效催化产生的H2O2与过氧化物酶底物——还原型四甲基联苯胺(TMB)发生的显色反应,在H2O2被催化还原的同时,无色的TMB发生氧化而显色;待测样品中乳酸浓度越大,溶液蓝色越深,紫外吸收强度就越强,因此,即可采用目视比色法来半定量检测乳酸的浓度,又可通过紫外分光光度计测定在652nm处TMB氧化产物的紫外吸收值来准确定量检测乳酸的浓度。
本发明检测乳酸的方法,涉及的化学反应过程,如反应式(1)和(2)所示:
3)本发明可通过反应溶液颜色深浅不同来指示不同浓度的乳酸,通过肉眼可判断乳酸是否超标,不必借助任何仪器,因此检测成本低,操作简便;
4)基于四氧化三铁纳米团簇模拟酶优异的类过氧化物酶活性,本发明建立了高灵敏、低成本、简便检测乳酸的方法。本发明的反应条件温和,检测速度快,灵敏度高,选择性好,可实现乳酸的可视化快速识别和检测,具有较高的实用价值,可广泛应用到临床医学诊断和食品安全监测方面。
附图说明
图1为实施例1具体反应条件下所制备的四氧化三铁纳米团簇的透射电镜图;
图2为实施例1具体反应条件下所制备的四氧化三铁纳米团簇的X射线衍射图;
图3为实施例1具体反应条件下制备的四氧化三铁纳米团簇在室温下的磁滞回线图;
图4为实施例2和实施例4具体反应条件下所制备的四氧化三铁纳米团簇的透射电镜图;
图5为四氧化三铁纳米团簇、Fe3O4微球和Fe3O4立方体的透射电镜照片图;
图6为四氧化三铁纳米团簇、Fe3O4微球和Fe3O4立方体三种模拟过氧化物酶的催化能力对比图;
图7为四氧化三铁纳米团簇、Fe3O4微球和Fe3O4立方体的N2吸附脱附等温线图;
图8为不同浓度乳酸在反应体系中所生成产物的紫外-可见吸收光谱及其颜色变化图;
图9为乳酸响应的标准曲线图。
具体实施方式
下面的实施例可以进一步说明本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例1-四氧化三铁纳米团簇模拟酶的制备:
1)将2.5mmol三氯化铁和15mmol无水乙酸钠溶于40mL乙二醇中,再加入0.54mL去离子水搅拌,使之形成分散均匀的溶液;
2)将步骤1得到的溶液装入水热釜中,放入已升温至180℃的烘箱中反应12小时,然后随炉冷却至室温;
3)倾出反应釜中的上层清液,将沉淀产物取出,分别用乙醇和去离子水洗涤三次,在60℃真空干燥箱中干燥10小时后得到固体样品即为四氧化三铁纳米团簇。
对所得到的四氧化三铁纳米团簇的形貌、结构和磁性能表征如图1-3所示:
从图1(A)透射电镜中观察到四氧化三铁纳米团簇是由许多很小的Fe3O4纳米颗粒自组装而成的,团簇平均粒径在200nm左右,图1(B)选取一个四氧化三铁纳米团簇线圈出的部分进行高分辨透射电镜表征,由图1(C)可看到四氧化三铁纳米团簇表面暴露晶面的间距是0.299nm,为(220)晶面。
从图2得到四氧化三铁纳米团簇的X射线衍射(XRD)图与反尖晶石型Fe3O4(JCSPDS,19-0629)标准衍射谱吻合,采用Scherrer公式计算团簇中Fe3O4纳米晶的晶粒度为2.5nm。
从图3可看到所得到的四氧化三铁纳米团簇具有超顺磁特性,且饱和磁化强度较大。
实施例2-6,四氧化三铁纳米团簇模拟酶的制备:步骤同实施例1,原料具体用量及反应条件见表1。
实施例2和实施例4具体反应条件下得到的四氧化三铁纳米团簇的形貌表征分别如图4(A)和图4(B)所示,其中图4(A)和(B)中的小插图为选取的一个四氧化三铁纳米团簇在高放大倍数下的透射电镜图片。
从图4可看到实施例2和实施例4具体反应条件下得到的四氧化三铁纳米团簇平均粒径分别在40nm和130nm左右,这两种四氧化三铁纳米团簇依然是由许多很小的Fe3O4纳米晶自组装形成的团簇状疏松颗粒。
《四氧化三铁纳米团簇模拟过氧化物酶特性的表征》
将100μL浓度为1mg/mL四氧化三铁纳米团簇模拟酶储备液、100μL浓度为100μMH2O2水溶液和100μl浓度为30mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的乙醇溶液,加入到2700μL乙酸-乙酸钠缓冲溶液中(pH=3.8)充分混合后,在50℃水浴中反应10分钟后,取出,放入冰水终止反应,最后外加磁场去除四氧化三铁纳米团簇,得到的最终反应液在最大吸收波长652nm处测定其吸光度值。此外,在同等条件下,分别测试Fe3O4微球和Fe3O4立方体对H2O2与TMB反应的催化能力。(图5为四氧化三铁纳米团簇、Fe3O4微球和Fe3O4立方体的透射电镜,图6为四氧化三铁纳米团簇(a)、Fe3O4微球(b)和Fe3O4立方体(c)模拟过氧化物酶的催化能力对比图,图7为四氧化三铁纳米团簇(A线)、Fe3O4微球(B线)和Fe3O4立方体(C线)的N2吸附脱附等温线,计算出他们各自的比表面积分别为89.2、21.5和10.7m2/g)。
从图6可看到,四氧化三铁纳米团簇可催化H2O2氧化过氧化物酶底物TMB的反应,具有优良的模拟过氧化物酶特性,而且其催化能力较其他形貌和粒径的Fe3O4纳米颗粒都要强。
从图7可看到,四氧化三铁纳米团簇相对于Fe3O4微球和Fe3O4立方体具有较大的比表面积,而由图1(C)显示其表面暴露的晶面为220面,文献报道Fe3O4这一晶面具有较高的催化活性,这是四氧化三铁纳米团簇具有优良模拟过氧化物酶催化特性的根本原因。
实施例7-四氧化三铁纳米团簇模拟酶作为类过氧化物酶对乳酸的检测步骤如下:
1)将5mg四氧化三铁纳米团簇分散于5ml水中形成1mg/mL四氧化三铁纳米团簇模拟酶储备液A,室温下储存备用;
2)将40μL浓度为0.02U/μL乳酸氧化酶和100μL待测乳酸的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0)充分混合,在37℃水浴中反应30分钟,促使产生H2O2,形成溶液B;
3)将100μL浓度为1mg/mL四氧化三铁纳米团簇模拟酶储备液A、140μL溶液B和100μL浓度为30mM的TMB的乙醇溶液加入到2660μLpH=3.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中充分混合,在50℃的水浴中反应10分钟后,取出,放入冰水终止反应,最后外加磁场去除四氧化三铁纳米团簇,即得到最终反应液,在最大吸收波长652nm处测定其吸光度值(图8示出了不同浓度乳酸在反应体系中所生成产物的紫外-可见吸收光谱及其颜色变化,图9示出了乳酸响应的标准曲线)。
从图8数据可以看到,该方法对乳酸有很好的比色响应;从图9数据可以看到,乳酸检测的线性范围为5.0×10-6mol/L—2.0×10-3mol/L,检测限为1.0×10-6mol/L,其线性方程为y=0.01999x+12,相关系数r=0.99154。
实施例8、与实施例7检测步骤相同,区别在于:四氧化三铁纳米团簇模拟酶储备液的浓度为0.5mg/mL,TMB的乙醇溶液浓度为36mM,乙酸-乙酸钠缓冲溶液的pH值为3.0,反应温度为55℃。
实施例9、与实施例7检测步骤相同,区别在于:四氧化三铁纳米团簇模拟酶储备液的浓度为3mg/mL,TMB的乙醇溶液浓度为20mM,乙酸-乙酸钠缓冲溶液的pH值为6.0,反应温度为45℃。
实施例10、与实施例7检测步骤相同,区别在于:四氧化三铁纳米团簇模拟酶储备液的浓度为3mg/mL,TMB的乙醇溶液浓度为36mM,乙酸-乙酸钠缓冲溶液的pH值为3.8,反应温度为25℃。
Claims (8)
1.一种四氧化三铁纳米团簇模拟酶,其特征在于:它是由细小的四氧化三铁纳米晶进行自组装形成的团簇状疏松颗粒,具有较大的比表面积,其比表面积在89-103m2/g之间。
2.一种四氧化三铁纳米团簇模拟酶的制备方法,其特征在于它包括如下步骤:
A、将三氯化铁、无水乙酸钠溶于乙二醇中,再加入去离子水搅拌,使之形成分散均匀的溶液,其中三氯化铁和无水乙酸钠的摩尔比为1:3—1:12,去离子水体积为0.36—0.9mL;
B、将步骤A得到的溶液装入水热反应釜中,放入已升温至160℃—200℃烘箱中,反应8—16小时,然后随炉冷却至室温;
C、倾出反应釜中的上层清液,将沉淀产物取出,分别用乙醇和去离子水至少洗涤三次,真空干燥后得到固体样品,即为四氧化三铁纳米团簇。
3.用权利要求1所述的四氧化三铁纳米团簇模拟酶快速检测乳酸的方法,其特征在于它包括如下步骤:
D、将四氧化三铁纳米团簇模拟酶分散于水中形成四氧化三铁模拟酶储备液A,室温下储存,将乳酸氧化酶和待测乳酸的磷酸盐缓冲溶液充分混合,在37℃水浴中反应30分钟,促使产生H2O2,形成溶液B;
E、将四氧化三铁模拟酶储备液A、溶液B和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的乙醇溶液加入到乙酸-乙酸钠缓冲溶液中充分混合,在水浴中反应10分钟,取出,放入冰水终止反应,最后外加磁场去除四氧化三铁纳米团簇,即得到最终反应液;
F、取步骤E中的最终反应液,测定在652nm处的吸光度值,比色检测乳酸的浓度。
4.根据权利要求3所述的四氧化三铁纳米团簇模拟酶快速检测乳酸的方法,其特征在于:所述步骤D中的四氧化三铁纳米团簇模拟酶储备液A范围为:0.5mg/ml—3mg/ml。
5.根据权利要求3或4所述的四氧化三铁纳米团簇模拟酶快速检测乳酸的方法,其特征在于:所述步骤E中的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的乙醇溶液浓度范围为:20mM—36mM。
6.根据权利要求5所述的四氧化三铁纳米团簇模拟酶快速检测乳酸的方法,其特征在于:所述步骤E中乙酸-乙酸钠缓冲溶液pH值范围为3.0—6.0。
7.根据权利要求6所述的四氧化三铁纳米团簇模拟酶快速检测乳酸的方法,其特征在于:所述步骤E中反应温度范围为25℃—55℃。
8.根据权利要求7所述的四氧化三铁纳米团簇模拟酶快速检测乳酸的方法,其特征在于:检测乳酸的线性范围为5.0×10-6mol/L—2.0×10-3mol/L,检测限为1.0×10-6mol/L。
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