CN109234261A

CN109234261A - 辣根过氧化物酶磁性纳米花及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109234261A
Application number: CN201810955835.0A
Authority: CN
Inventors: 罗鹏; 韩娟; 王赟; 王蕾; 李春梅; 毛艳丽; 倪良
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2038-08-21
Also published as: CN109234261B

Abstract

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种新型辣根过氧化物酶磁性纳米花及其制备方法和应用；本发明将HRP加入到配置的磷酸盐缓冲溶液中，然后将合成的磁性复合微球Fe₃O₄@PMG@IDA‑Cu²⁺加入到上述反应液中，调节恒温箱温度，持续反应一定的时间，得到磁性纳米花；并将其用于污染物双酚A的降解；本发明制备的纳米花的酶活性和催化活性得到了明显的提升，以及在不同条件下的稳定性也得到了明显的改善，酶活能够达到游离酶的183%；在25分钟内降解超过90%的双酚A，性能远优于一般的游离酶。

Description

辣根过氧化物酶磁性纳米花及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种新型辣根过氧化物酶磁性纳米花及其制备方法和应用。

背景技术

双酚A是一种重要的有机材料，它作为单体材料被广泛的应用在合成聚碳酸酯塑料和环氧树脂等生活产品中。与此同时，双酚A的使用也带来了污染，对化工行业含酚废水的处理，一直是一个难题。许多的研究已经表明双酚A对人类和动物会造成不利的影响，能够引起包括肥胖症、慢性疾病、内分泌失调以及癌症等一系列病症。因此对于从水中去除双酚A引起了广泛的关注。目前应用到降解双酚A的技术主要包括活性污泥（碳）法、生物流化床法、微生物降解法和酶降解法等。在这些方法中，在过氧化氢的作用下通过辣根过氧化物酶（HRP）降解双酚A是一种非常高效的方法，这是因为HRP具有高的催化活性、无毒性以及低的操作成本。然而仅使用游离酶进行降解存在降解条件苛刻、催化剂回收难、不易于进行工业化连续生产等诸多问题，因此，酶的固定化研究迫在眉睫。

近年来，将金属离子和目标酶相结合形成酶 - 无机杂化纳米花的研究也是酶固定化领域的一大热点，目前制备酶-无机杂化纳米花都是采用“共沉淀”法，即不同种类的酶在含有硫酸铜的磷酸缓冲溶液中培养一段时间后通过“自组装”而形成，和游离酶相比，封装在无机纳米花中的酶能够表现出非常高的稳定性，甚至与自由酶（如漆酶）相比酶活性有显著增加。采用的这个方法直接形成的纳米花的缺陷是无法从产物中快速分离固定化酶，而降低了重复利用的效率。也有报道表明可以采用其他金属离子来制备纳米花，如银离子、铁离子、金离子，虽然不同的金属离子的使用虽然对纳米花的形态有影响，但是对于酶活的影响不大。

发明内容

本发明的目的在于克服目前游离的辣根过氧化物酶活性较低，合成的固定化酶重复利用性、酶在不同的条件下对底物的催化能力不稳定等不足之处，从而合成一种新型辣根过氧化物酶磁性纳米花。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：

本发明提供一种新型的辣根过氧化物酶磁性纳米花，所述磁性纳米花具有磁性特征，呈类似于花的形状，可以通过外加磁场的作用将辣根过氧化物酶纳米花从反应产物中快速分离出来。

所述的辣根过氧化物酶磁性纳米花的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）溶液配制：

磷酸盐缓冲溶液的配制：配制Na₂HPO₄溶液并用相同浓度的NaH₂PO₄ 调节pH；所述的Na₂HPO₄溶液浓度为0.01-1M，优选为0.2M，所述pH为5-10，优选为7。

（2）辣根过氧化物酶固定化过程：

将HRP加入到配置的磷酸盐缓冲溶液中，然后将合成的磁性复合微球Fe₃O₄@PMG@IDA-Cu²⁺加入到上述反应液中，调节恒温箱温度，持续反应一定的时间，将得到的纳米花用PBS溶液和蒸馏水洗涤数次，真空干燥过夜。

所述的HRP浓度为0.3-0.7 mg/mL，优选为0.5 mg/mL。

所述反应的时间为6-10h，优选为8h；所述恒温箱温度为25℃。

步骤（2）中所述的磁性复合微球Fe₃O₄@PMG@IDA-Cu²⁺的制备方法，具体步骤如下：

S1. 磁性复合微球Fe₃O₄@PMG@IDA的制备：

（1）四氧化三铁纳米粒子（Fe₃O₄）的合成：

采用一种改进的水热法进行制备。将一定量的FeCl₃·6H₂O、一定量的NH₄AC以及一定量的二水合柠檬酸三钠溶于盛有一定体积的乙二醇的单口烧瓶(250 ml)中，一定温度的油浴加热并搅拌1 h得到黑色均一体系，之后转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜(100ml)，放入一定温度的烘箱反应16 h，冷却至室温，磁分离黑色产物，用无水乙醇洗涤几次至上清没有颜色后，置于30 ^oC真空干燥箱内干燥24 h。

其中，所述六水合氯化铁加入量为1.050-1.650 g；

所述 NH₄AC加入量为3.454-4.254 g；加入的二水合柠檬酸三钠为0.3-0.5 g；加入的乙二醇为 60-80 mL；

所述油浴中搅拌反应的温度为80-120 ^oC；

所述在不锈钢高压反应釜中反应的温度为180-220 ^oC。

（2）聚丙烯酸修饰的四氧化三铁（Fe₃O₄@MPS）微球的合成：

称取一定量的Fe₃O₄纳米粒子于250 mL的三口瓶中，加入40 mL乙醇、10 mL水和1.5 mL氨水，超声分散1 h至底部无明显沉淀。然后于一定温度的条件下边搅拌边缓慢向体系中滴加一定体积的3-(异丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷（MPS）。待反应持续进行24 h后，用永久磁体将产物从溶液中分离，用乙醇反复洗至中性，同时清洗后的溶液不会变浑浊，最后将产物置于30 ℃真空干燥箱内干燥24 h。

其中，所述Fe₃O₄纳米粒子加入量为0.1-0.5 g；

所述反应时的温度为60-80 ^oC；

所述MPS加入量为0.4-0.6 mL。

（3）四氧化三铁/聚合N，N’-亚甲基双丙稀酰胺合环氧丙基核壳微球（Fe₃O₄@PMG）微球的合成：

称取一定量的Fe₃O₄@MPS微球于装有40mL乙腈的100mL的三口瓶中，超声3min使粒子均匀分散，然后加入一定量的甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、一定量的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）和一定量的2，2-偶氮二异丁腈（AIBN）进行聚合。在30分钟内将反应温度从室温加热到乙腈蒸出，然后控制反应温度，在1h中蒸馏出20mL乙腈（实际大概蒸馏出18mL），得到的材料用乙醇洗涤几次，然后真空干燥过夜。

其中，所述Fe₃O₄@MPS纳米粒子加入量为0.03-0.07g；

所述GMA加入量为100-200mg； MBA加入量为100-200 mg； AIBN加入量为4-8 mg。

（4）亚氨基二乙酸修饰的四氧化三铁/聚合N，N’-亚甲基双丙稀酰胺合环氧丙基微球（Fe₃O₄@PMG@IDA微球）的合成：

称取一定量的亚氨基二乙酸（IDA）和一定量的NaOH，将其溶解在20mL蒸馏水中并用2M的NaOH溶液将该溶液的pH调节到一个定值。之后将50mg Fe₃O₄@PMG加入到上述溶液中，在一定温度条件下机械搅拌反应12小时，得到的材料用乙醇洗涤几次，然后真空干燥过夜。

其中，所述IDA加入量为0.23-0.43 g； NaOH加入量为0.1-0.3 g；

所述溶液的pH为10-12；

所述的机械搅拌的温度为60-100 ^oC。

S2. 对Fe₃O₄@PMG@IDA表面进行Cu²⁺的修饰：

称取50mg Fe₃O₄@PMG@IDA 于烧杯中，加入一定浓度的CuSO₄用磁子搅拌一段时间，得到的材料用蒸馏水洗涤几次，然后真空干燥过夜。

其中，所述CuSO₄的浓度为0.05-0.15 M，加入量为10mL；

所述磁子搅拌时间为1-3 h。

本发明另一目的是将上述合成的新型辣根过氧化物酶磁性纳米花用于对污染物双酚A的降解。

与现有技术相比较，本发明具有如下优点：

（1）本发明将磁性四氧化三铁和应用到纳米花中，从而使得纳米花更好的重复利用，辣根过氧化物酶被固定化成磁性纳米花后活性和催化活性得到了明显的提升，以及在不同条件下的稳定性也得到了明显的改善。铜离子是在纳米花形成过程中可以在磷酸缓冲溶液中和酶形成具有花状形态的纳米微粒，显著提升酶跟底物的接触面积，从而提高酶活。本发明的制备方法中各个技术参数的选择是为了考察经过不同的化学物质修饰之后产物的形态、结构以及不同产物的化学组成。

（2）本发明进一步验证了形成磁性纳米花的一系列因素，得到其最佳形成条件为：HRP浓度为0.5mg/mL，PBS溶液的pH值为7，PBS溶液的浓度为0.2mol L^-1以及生成纳米花反应时间为8小时，在最佳条件下生成的磁性纳米花的酶活能够达到游离酶的183%。

（3）本发明制备的磁性纳米花在重复利用5次后仍有81.3%的相对酶活，而传统的磷酸铜纳米花的相对酶活不足10%，其重复利用能力有着很大的提升。在贮藏30天后，游离的HRP的相对酶活为39.2%，而磁性纳米花的相对酶活高达80.3%。此外在不同温度和pH条件下磁性纳米花的酶活都较游离酶有很大的提升。

（4）本发明将磁性纳米花应用到含双酚A的废水降解实验中，当双酚A浓度为100mg L^-1、过氧化氢浓度为100 mg L^-1、磁性纳米花用量0.25 mg L^-1、温度40℃时，其对双酚A的降解率最佳；游离酶在约35分钟能降解废水中40%的双酚A，而磁性纳米花能在25分钟内降解超过90%的双酚A，性能远优于一般的游离酶。

附图说明

图1为Fe₃O₄(a)、Fe₃O₄@PEG@IDA (b)和HRP磁性纳米花(c)的透射电子显微镜图。

图2为Fe₃O₄(a)、Fe₃O₄@PEG@IDA (b)和HRP磁性纳米花(c)的扫描电子显

微镜图。

图3为样品Fe₃O₄(a)、Fe₃O₄@MPS (b)、Fe₃O₄@PEG (c)、Fe₃O₄@PEG@IDA

(d)、HRP (e)和HRP磁性纳米花(f)的红外光谱图。

图4为样品Fe₃O₄(a)、Fe₃O₄@PEG@IDA (b)和HRP磁性纳米花(c)的磁滞回线图。

图5为样品Fe₃O₄(a)、Fe₃O₄/MPS (b)、Fe₃O₄@PEG@IDA (c)、HRP(d)和HRP

磁性纳米花(e)的XRD图。

图6为Fe₃O₄@PEG@IDA (a)和HRP磁性纳米花 (b)的能量色散X射线光谱图。

图7为样品Fe₃O₄(a)、Fe₃O₄/MPS (b)、Fe₃O₄@PEG@IDA (c)、HRP磁性纳米花(d)的热重分析曲线图。

图8为不同酶浓度条件下HRP磁性纳米花的SEM图。

图9为不同酶浓度条件下HRP磁性纳米花的相对酶活和包封率结果图。

图10为不同时间条件下HRP磁性纳米花的SEM图。

图11为不同时间条件下HRP磁性纳米花的相对酶活和包封率结果图。

图12为不同pH条件下HRP磁性纳米花的SEM图。

图13为不同pH条件下HRP磁性纳米花的相对酶活和包封率结果图。

图14为不同浓度的PBS条件下HRP磁性纳米花的SEM图。

图15为不同PBS溶液浓度下HRP磁性纳米花的相对酶活和包封率结果图。

图16为pH值对游离酶和固定化酶的影响结果图。

图17为温度对游离酶和固定化酶的影响结果图。

图18为游离酶和固定化酶的温度稳定性验证图。

图19为游离酶和固定化酶的贮藏稳定性验证图。

图20为磁性纳米花和纯磷酸铜纳米花的循环能力验证结果图。

图21为各种反应参数对双酚A降解过程的影响：双酚A浓度（a）、

过氧化氢和双酚A的浓度比（b）、纳米花的浓度（c）、温度（d）对双酚A降解率的影响结果。

图22为磁性纳米花对双酚A降解率的影响（a）及其拟一级动力学曲线（b）。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：磁性复合微球的制备

（1）四氧化三铁纳米粒子（Fe₃O₄）的合成

采用一种改进的水热法进行制备。将1.050 g的FeCl₃·6H₂O、3.454 g的NH₄AC以及0.3g的二水合柠檬酸三钠溶于盛有60 mL的乙二醇的单口烧瓶(250 ml)中，80 ^oC的油浴加热并搅拌1 h得到黑色均一体系，之后转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜(100 ml)，放入180 ^oC的烘箱反应16 h，冷却至室温，磁分离黑色产物，用无水乙醇洗涤几次至上清没有颜色后，置于30 ^oC真空干燥箱内干燥24 h。

（2）聚丙烯酸修饰的四氧化三铁（Fe₃O₄@MPS）微球的合成

称取0.1 g的Fe₃O₄纳米粒子于250 mL的三口瓶中，加入40 mL乙醇、10 mL水和1.5 mL氨水，超声分散1 h至底部无明显沉淀。然后于60 ^oC的条件下边搅拌边缓慢向体系中滴加0.4 mL的3-(异丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷（MPS）。待反应持续进行24 h后，用永久磁体将产物从溶液中分离，用乙醇反复洗至中性，同时清洗后的溶液不会变浑浊，最后将产物置于30℃真空干燥箱内干燥24 h。

（3）Fe₃O₄@PMG微球的合成

称取0.03 g的Fe₃O₄@MPS于装有40mL的100mL的三口瓶中，超声3min使粒子均匀分散，然后加入100 mg的甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、 100 mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）和4 mg的2，2-偶氮二异丁腈（AIBN）进行聚合。在30分钟内将反应温度从室温加热到乙腈蒸出，然后控制反应温度，在1h中蒸馏出20mL乙腈（实际大概蒸馏出18mL），得到的材料用乙醇洗涤几次，然后真空干燥过夜。

（4）Fe₃O₄@PMG@IDA微球的合成

称取0.23 g的亚氨基二乙酸（IDA）和0.1 g的NaOH，将其溶解在20mL蒸馏水中并用2M的NaOH溶液将该溶液的pH调节到10。之后将50mg Fe₃O₄@PMG加入到上述溶液中，在60 ^oC条件下机械搅拌反应12小时，得到的材料用乙醇洗涤几次，然后真空干燥过夜。

（5）对Fe₃O₄@PMG@IDA表面进行Cu²⁺的修饰

称取50mg Fe₃O₄@PMG@IDA 于烧杯中，加入0.05 M的CuSO₄用磁子搅拌1 h，得到的材料用蒸馏水洗涤几次，然后真空干燥过夜。

实施例2：磁性复合微球的制备

（1）四氧化三铁纳米粒子（Fe₃O₄）的合成

采用一种改进的水热法进行制备。将1.650 g的FeCl₃·6H₂O、4.254 g的NH₄AC以及0.5g的二水合柠檬酸三钠溶于盛有80 mL的乙二醇的单口烧瓶(250 ml)中，120 ^oC的油浴加热并搅拌1 h得到黑色均一体系，之后转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜(100 ml)，放入220 ^oC的烘箱反应16 h，冷却至室温，磁分离黑色产物，用无水乙醇洗涤几次至上清没有颜色后，置于30 ^oC真空干燥箱内干燥24 h。

（2）聚丙烯酸修饰的四氧化三铁（Fe₃O₄@MPS）微球的合成

称取0.5 g的Fe₃O₄纳米粒子于250 mL的三口瓶中，加入40 mL乙醇、10 mL水和1.5 mL氨水，超声分散1 h至底部无明显沉淀。然后于80 ^oC的条件下边搅拌边缓慢向体系中滴加0.6 mL的3-(异丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷（MPS）。待反应持续进行24 h后，用永久磁体将产物从溶液中分离，用乙醇反复洗至中性，同时清洗后的溶液不会变浑浊，最后将产物置于30℃真空干燥箱内干燥24 h。

（3）Fe₃O₄@PMG微球的合成

称取0.07g的Fe₃O₄@MPS于装有40mL的100mL的三口瓶中，超声3min使粒子均匀分散，然后加入200 mg的甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、 200 mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）和 8 mg的2，2-偶氮二异丁腈（AIBN）进行聚合。在30分钟内将反应温度从室温加热到乙腈蒸出，然后控制反应温度，在1h中蒸馏出20mL乙腈（实际大概蒸馏出18mL），得到的材料用乙醇洗涤几次，然后真空干燥过夜。

（4）Fe₃O₄@PMG@IDA微球的合成

称取0.43 g的亚氨基二乙酸（IDA）和0.3 g的NaOH，将其溶解在20mL蒸馏水中并用2M的NaOH溶液将该溶液的pH调节到12。之后将50mg Fe₃O₄@PMG加入到上述溶液中，在100 ^oC条件下机械搅拌反应12小时，得到的材料用乙醇洗涤几次，然后真空干燥过夜。

（5）对Fe₃O₄@PMG@IDA表面进行Cu²⁺的修饰

称取50mg Fe₃O₄@PMG@IDA 于烧杯中，加入0.15 M的CuSO₄用磁子搅拌3 h，得到的材料用蒸馏水洗涤几次，然后真空干燥过夜。

实施例3：磁性复合微球的制备

（1）四氧化三铁纳米粒子（Fe₃O₄）的合成

采用一种改进的水热法进行制备。将1.350 g的FeCl₃·6H₂O、3.854 g的NH₄AC以及0.4g的二水合柠檬酸三钠溶于盛有70 mL的乙二醇的单口烧瓶(250 ml)中，100 ℃的油浴加热并搅拌1 h得到黑色均一体系，之后转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜(100 ml)，放入200℃的烘箱反应16 h，冷却至室温，磁分离黑色产物，用无水乙醇洗涤几次至上清没有颜色后，置于30 ^oC真空干燥箱内干燥24 h。

（2）聚丙烯酸修饰的四氧化三铁（Fe₃O₄@MPS）微球的合成

称取一定量0.3 g的Fe₃O₄纳米粒子于250 mL的三口瓶中，加入40 mL乙醇、10 mL水和1.5 mL氨水，超声分散1 h至底部无明显沉淀。然后于70 ^oC的条件下边搅拌边缓慢向体系中滴加0.5 mL的3-(异丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷（MPS）。待反应持续进行24 h后，用永久磁体将产物从溶液中分离，用乙醇反复洗至中性，同时清洗后的溶液不会变浑浊，最后将产物置于30 ℃真空干燥箱内干燥24 h。

（3）Fe₃O₄@PMG微球的合成

称取0.05 g的Fe₃O₄@MPS于装有40mL的100mL的三口瓶中，超声3min使粒子均匀分散，然后加入150 mg的甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、 150 mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）和6 mg的2，2-偶氮二异丁腈（AIBN）进行聚合。在30分钟内将反应温度从室温加热到乙腈蒸出，然后控制反应温度，在1h中蒸馏出20mL乙腈（实际大概蒸馏出18mL），得到的材料用乙醇洗涤几次，然后真空干燥过夜。

（4）Fe₃O₄@PMG@IDA微球的合成

称取0.33 g的亚氨基二乙酸（IDA）和0.2 g的NaOH，将其溶解在20mL蒸馏水中并用2M的NaOH溶液将该溶液的pH调节到11。之后将50mg Fe₃O₄@PMG加入到上述溶液中，在80 ^oC条件下机械搅拌反应12小时，得到的材料用乙醇洗涤几次，然后真空干燥过夜。

（5）对Fe₃O₄@PMG@IDA表面进行Cu²⁺的修饰

称取50mg Fe₃O₄@PMG@IDA 于烧杯中，加入0.1 M的CuSO₄用磁子搅拌2 h，得到的材料用蒸馏水洗涤几次，然后真空干燥过夜。

图1为Fe₃O₄(a)、Fe₃O₄@PEG@IDA (b)和HRP磁性纳米花(c)的透射电子显微镜图；TEM图像如图1 a和1b所示，Fe₃O₄微球的平均直径约200 nm且形状和大小均匀。经GMA封装和IDA修饰后，得到的Fe₃O₄ @ PMG@IDA磁性纳米微球具有明显的核-壳结构，其直径增大到约260 nm，壳层厚度约为30 nm。图1 c是通过TEM成像的磁性纳米花的一般形态，该图表明所合成的磁性纳米花是由许多的片状晶体结构所组成，同时在晶体中有均匀的分布磁性四氧化三铁颗粒，这表明了四氧化三铁形成纳米花时能够得到很好的分散。

图2为Fe₃O₄(a)、Fe₃O₄@PEG@IDA (b)和HRP磁性纳米花(c)的扫描电子显微镜图；图2 a和2b中的SEM图表明，磁性团簇由许多小的纳米晶体组成。图2 c为通过SEM成像的磁性纳米花的一般形态， SEM图像表明所合成的磁性纳米花具有较好的外观和良好的分散性，当HRP的浓度为0.5mg / mL时，所合成的纳米花形貌性质达到最佳，其平均直径为5 μm且大小均匀。

图3为样品Fe₃O₄(a)，Fe₃O₄@MPS (b)，Fe₃O₄@PEG (c)，Fe₃O₄@PEG@IDA (d)，HRP (e)和HRP磁性纳米花(f)的红外光谱图；如曲线a所示，约1611和1401 cm^-1处的特征峰为Fe₃O₄小球表面柠檬酸盐上羧基的特征峰，583 cm^-1处的特征峰归属于Fe-O键。在进行MPS改性后，在1662 cm^-1处出现了的吸收峰为MPS上C = C键的特征吸收峰（曲线b）。曲线c上1732和1542 cm^-1处的特征峰归因于GMA中酯基的C = O伸缩振动和MBA中N-H弯曲振动。在Fe₃O₄ @PMG纳米粒子表面使用IDA改性后，在1635和1400 cm^-1出现新的特征吸收峰，分别归因于酯羰基的伸缩振动和CH₂-N的存在（曲线d）。在曲线e上观察到典型的HRP吸收峰，分别为在1451-1651 cm^-1处出现的-CONH吸收峰和在2801-3001 cm^-1处出现的-CH₂和-CH₃吸收峰。最后曲线f上1058和1163 cm^-1处的强吸收峰归因于P-O和P = O振动，证明了磷酸基团的存在。

图4为样品Fe₃O₄(a)，Fe₃O₄@PEG@IDA (b)和HRP磁性纳米花(c)的磁滞回线图；如图4所示，Fe₃O₄微球的饱和磁强度（Ms）大小为53.42 emu g^-1，在对其表面进行PMG聚合物的包裹修饰以及IDA修饰之后，合成的复合微球的饱和磁强度有着明显的降低，下降到39.91emu g^-1，最终在形成磁性纳米花之后其饱和磁化强度降低为11.03 emu g^-1。此外该磁滞回线表明所有的磁性材料在300 K时都没有明显的剩磁或矫顽力，具有超顺磁性。本发明合成的磁性纳米花在外加磁场的作用下能在30秒内快速有效的从溶液分离出来（图4插图）。

图5为样品Fe₃O₄(a)，Fe₃O₄/MPS (b)，Fe₃O₄@PEG@IDA (c)，HRP(d)和HRP磁性纳米花(e)的XRD图；图中通过X射线衍射仪分析合成的一系列磁性微球的及纳米花的晶体结构，图5 a中为Fe₃O₄、Fe₃O₄@PMG和Fe₃O₄@PMG@IDA的XRD图，如图中所示，发现三条曲线上都存在六个显著2θ峰值，分别为30.1°, 35.4°, 43.3°, 53.2°, 57.1°和62.7°，和JCSD数据卡（74-748）上Fe₃O₄的晶型值（220）（311）（400）（422）（511）（440）相一一对应。如图所示，在对磁性纳米小球进行一系列合成修饰之后，合成的复合磁性纳米微球的晶型没有发生明显的改变，这表明了在合成中四氧化三铁的结构得到了较为完整的保持。从图5 b中，XRD的分析证实了Cu₃(PO₄)₂的所有衍射峰的位置和相对强度与从JCPDS数据卡（00-022-0548）相匹配。磁性纳米花的X射线衍射图主要是由Fe₃O₄和Cu₃(PO₄)₂•3H₂O晶体组成，拟合得到JCPDS卡（19-629和00-022-0548）。因此，尖锐和强烈的特征峰证实了所合成的磁性纳米花在加入HRP也有着良好的结晶度。

图6为Fe₃O₄@PEG@IDA (a)和HRP磁性纳米花 (b)的能量色散x射线光谱；图6 (a)表明C，O，N，Fe出现在Fe₃O₄ @ PMG@IDA样品上，证明Fe₃O₄@ PMG@IDA 已通过蒸馏沉淀聚合成功合成。此外图中的Na峰和Si峰分别为合成过程中Fe₃O₄ 表面柠檬酸钠基团和硅烷化试剂MPS所引入的。类似地，磁性纳米花主要由元素C，O，N，Fe，P，Cu组成，证明所形成的纳米花的确是由Fe₃O₄ @ PMG@IDA-Cu²⁺和HRP所合成的。图中K、Na元素为配制磷酸盐缓冲溶液中所用Na₂HPO₄和KH₂PO₄所引入的。

图7为样品Fe₃O₄(a)，Fe₃O₄/MPS (b)，Fe₃O₄@PEG@IDA (c)，HRP磁性纳米花(d)的热重分析曲线；由上图中可以发现，Fe₃O₄曲线的在整个加热过程中失重较为均匀，失重约12.5%，可能是表面一些物理吸附的水分子在加热过程中挥发以及磁球表面柠檬酸盐的分解。由于Fe₃O₄结构较为稳固，Fe₃O₄@MPS同样失重不高，失重率约为15.1%，归因于磁球表面吸附的水分子、部分MPS和柠檬酸钠的失去。在合成Fe₃O₄@PMG@IDA复合磁性纳米微球后，重量损失增大至52%，表明该复合微球中磁铁矿含量为约48％。最后在形成磁性纳米花之后，样品重量损失进一步增大至63%，其中约11% 归因于HRP和PBS的组分的失去，磁性纳米花中磁铁矿含量为约37％，侧面证明该磁性纳米花具有较大的饱和磁强度。实施例4：辣根过氧化物酶固定化（辣根过氧化物酶磁性纳米花的合成）过程

（1）溶液配制：

磷酸缓冲溶液的配制：配制0.2 M Na₂HPO₄溶液并用0.2 M 100 mL NaH₂PO₄

调节pH至7.0。

（2）辣根过氧化物酶固定化过程：

将0.3 mg/mL的HRP加入到0.2 M的PBS （pH 7.0）溶液中，然后将合成的Cu²⁺修饰的磁性小球（Fe₃O₄@PMG@IDA-Cu²⁺）加入到上述反应液中，调节恒温箱温度为25℃，持续反应6 h，将得到的纳米花用PBS溶液和蒸馏水洗涤数次，真空干燥过夜。

实施例5：辣根过氧化物酶固定化（辣根过氧化物酶磁性纳米花的合成）过程

（1）溶液配制

调节pH至7.0。

（2）辣根过氧化物酶固定化过程

将0.7 mg/mL的HRP加入到0.2 M的PBS （pH 7.0）溶液中，然后将合成的Cu²⁺修饰的磁性小球（Fe₃O₄@PMG@IDA-Cu²⁺）加入到上述反应液中，调节恒温箱温度为25℃，持续反应10h，将得到的纳米花用PBS溶液和蒸馏水洗涤数次，真空干燥过夜。

实施例6：辣根过氧化物酶固定化（辣根过氧化物酶磁性纳米花的合成）过程

（1）溶液配制

调节pH至7.0。

（2）辣根过氧化物酶固定化过程

将0.5 mg/mL的HRP加入到0.2 M的PBS （pH 7.0）溶液中，然后将合成的Cu²⁺修饰的磁性小球（Fe₃O₄@PMG@IDA-Cu²⁺）加入到上述反应液中，调节恒温箱温度为25℃，持续反应8 h，将得到的纳米花用PBS溶液和蒸馏水洗涤数次，真空干燥过夜。

实施例7：辣根过氧化物酶磁性纳米花的合成条件优化

（1）HRP浓度对辣根过氧化物酶磁性纳米花的影响

图8为不同HRP浓度合成磁性纳米花的扫描电镜图，在小图a-f中，自组装合成纳米花时间为8小时，调节pH为7，所用的HRP的浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/mL。如图中所示，当没有加入HRP时，溶液中没有观察到大晶体状结构，只有加入HRP之后才开始出现花状纳米结构。

当使用0.1 mg mL^-1 HRP时，出现了具有一些破碎花瓣状结构的纳米花（图8b）。随着HRP浓度逐渐从0.1增加到0.5 mg·mL^-1，破碎的花瓣状结构逐渐形成花状球状结构（图8b-8d）。此外，所合成的磁性纳米花呈现出明显的多层花形态，每个磁性纳米花的平均尺寸为6μm左右。然后继续增加HRP的浓度（图8e-8f），花瓣结构逐渐消失。以上研究结果表明，HRP浓度会影响磁性纳米花的形态和大小，这会影响固定化磁性纳米花HRP的活性和负载能力。

此外图9验证了HRP浓度对磁性纳米花HRP催化剂的相对活性和负载量的影响。随着HRP浓度的增加，磁性纳米花HRP催化剂的相对活性和负载量均先增加后减小。与游离酶相比较，磁性纳米花有更大的比表面积，从而是得辣根过氧化物酶能够充分地与底物接触，增强酶的活性，且此时磁性纳米花的包封率达到最高，为83.2%。因此，磁性纳米花的花状球形结构越好，酶的活性越大。然而，当HRP浓度非常高时，磁性纳米花塌缩成球，其活性受到影响。所以根据实验结果，HRP的最佳合成浓度为0.3-0.7 mg / mL，优选为0.5mg / mL。

（2）合成时间对纳米花形成的影响

纳米花的形成包括三个步骤：（a）成核和形成初级磷酸铜晶体；（b）通过与酶骨架之间的酰胺基团的结合形成酶和Cu²⁺的团聚体；(c）纳米花的整体形成。该实施例中，保持HRP浓度（0.5 mg / mL）恒定，图10为随着时间的演变（10min，1h，2h，4h，8h和16h）形成的磁性纳米花的不同形态。在生长初期（10 min-1 h，图10a-10b），溶液中形成了Cu₃(PO₄)₂的初晶，只有少数HRP通过配位酶骨架中的酰胺基团与Cu²⁺形成配合物，这些复合物为初级晶体的成核提供了空间。随着反应时间的增加（2 h-4 h，图10c-10d），更多的HRP-Cu²⁺晶体相互结合形成大团聚体，进一步组成主要的花瓣结构。继续反应一段时间后（8 h-16 h；图10e-10f），HRP-Cu²⁺晶体聚集了更多的花瓣，并与纳米花表面相互结合，最终形成分层的花形结构。所以，合成时间选择为6-10h，优选的为8h，在此步骤中，反应8小时后获得的磁性纳米花为深蓝黑色沉淀。

图11证明了反应时间对辣根过氧化物酶磁性纳米花的相对活性和包封率的影响。当反应时间从10min增加到8h时，磁性纳米花HRP催化剂的相对活性和负载能力得到有限的提升。该结果与随时间演变形成的磁性纳米花形态的结论相一致，当完整的分层花形结构形成时，磁性纳米花HRP催化剂的相对活性和负载能力达到最佳。也就是，磁纳米花的形态和酶活性是相互对应的关系,随着时间的推移，花瓣升高和扩大,固定化酶的负载量越来越大，酶活性也相对较高。

(3) pH值对磁性纳米花合成的影响

如图12中所示，磁性纳米花在偏酸或偏碱性环境下，纳米花的层状结构均受到影响，花的形状呈现不够完好，只有当pH在7和8的时候，纳米花的层状结构保持完好。另外，图13也表明磁性纳米花随着pH的增加，酶活和包封率先升高后降低，当溶液的pH值为7.0时，相对酶活和包封率达到最大值。结果发现，形成纳米花的最佳pH与HRP最佳酶活pH相一致，而大于或小于7时，溶液pH与HRP酶活最适pH相差较大，会引起酶活损失。

(4) PBS溶液浓度对磁性纳米花形成的影响

由图14中可以看出，随着PBS浓度的增加，磁性纳米花的层状结构会越来越明显，直到PBS的浓度为0.2 mol/L时，磁性纳米花的层状结构最均匀和稳定。如图15所示，此时实验得到的磁性纳米花的相对酶活也是最大值，说明磁性纳米花层状结构越好，酶的活性越高。然而，当进一步增加PBS的浓度后，纳米花的层状结构开始出现塌缩现象，这时磁性纳米花的酶活开始下降。磁性纳米花的包封率出现先增加后保持平稳的趋势，这主要也是与磁性纳米花的结构相关，但当PBS的浓度在0.2到 1.0 mol/L时，由于层状结构塌缩缓慢，所以磁性纳米花的包封率没有出现下降的趋势。综上所述，磁性纳米花的最佳形成PBS浓度为0.2mol/L。

实施例8：辣根过氧化物酶磁性纳米花酶学性质的研究

（1）pH值对磁性纳米花酶活的影响

为了探讨pH环境对合成的磁性纳米花酶活的影响，配制了pH值为5~8.5的PBS缓冲溶液用于制备磁性纳米花分散液以及参比的游离酶分散液。如图16所示，在相同的pH条件下，磁性纳米花的活性要高于游离酶，且都在pH为7.0的条件下取得最高的活性，表明在该pH条件下磁性纳米花的酶活达到最高。与游离的HRP相比，磁性纳米花在非最佳pH值时与游离酶相比具有更稳定的酶活，这表明合成的磁性纳米花具有更好的pH稳定性。

（2）体系温度对磁性纳米花酶活的影响

在恒温箱中将0.7 mL 4-AAP溶液和0.75 mL过氧化氢溶液移入比色皿中，加入0.05mLHRP和磁性纳米花，在25℃~60℃之间调节恒温箱的温度，测得不同温度下的酶活。如图17所示，当温度从25℃升到45℃时，两者的相对酶活均增大，这可能是由于随着温度的增大，分子动能增大，磁性纳米花和游离的HRP和底物接触的频率增加，从而提升了酶活。随着温度的进一步提高，磁性纳米花和游离的HRP的相对酶活开始减小，这可能是由于过高的温度使得磁性纳米花和游离酶发生了部分的变性失活，部分多肽链变形粘连，降低了其整体的催化活性。在这个实验中，HRP和磁性复合微球所形成磁性纳米花能让HRP较好的分散在其中，能够有效的增强其酶活性。此外，纳米花的层状结构可以在相对高的温度下延迟HRP结构的变形，这表明磁性纳米花比游离酶具有更好的耐热性。

（3）磁性纳米花温度稳定性的验证

图18为在60℃下5小时内测试磁性纳米花温度稳定性的数据图，图中表明随着时间的增加，游离酶和磁性纳米花的活性均发生了一定的降低，但很明显磁性纳米花酶活降低的程度要低于游离酶。在5小时之后所得的游离酶的相对酶活仅仅为69.7%，而磁性纳米花能达到83.2%，这可能是由于磁性纳米花的层状花瓣结构具有更好的温度稳定性，能够更好的保持酶活，这在实际应用时是一个非常重要的优点。

（4）磁性纳米花贮藏稳定性的验证

酶的贮藏稳定性也是酶的一种重要的性质，与日常的应用息息相关。为了探讨合成的磁性纳米花和游离HRP的贮藏稳定性，将一系列上述两种样品分别放置在4℃冰箱内恒温保存，每隔固定的时间取出，在其最佳的测试条件下测其酶活，以最佳酶活为基础，得到的相对酶活的数据图。由图19可以发现，经过15天之后，游离酶的相对酶活仅为初始的51.8%，而磁性纳米花的相对酶活仍然超过85.2%；在经过30天之后，磁性纳米花的酶活仍在80%以上，而游离酶的酶活已经不足40%；随着时间的进一步延长，当贮存时间达到60天时，磁性纳米花的酶活约为78.4%，而游离酶的酶活已经不足35%。结果发现，随着时间的推移，游离酶的酶活损失越来越大，然而在形成磁性纳米花后其贮藏稳定性有了显著的提升，这与热稳定性数据一致。

（5）磁性纳米花重复利用能力

为了验证磁性纳米花的可重复使用性，设计了几个连续反应批次用于研究了磁性纳米花和普通纳米花（Cu₃(PO₄)₂·3H₂O-HRP）的活性（图20）。与初始酶活相比，磁性纳米花和普通纳米花的活性均随着重复使用次数而减少。循环反应6次之后，普通纳米花的活性降低至其初始活性的5.3％。相比之下，磁性纳米花保留了的初始活性的74.3％，展现出十分优异的重复利用性能，具有较好的实际应用价值。实验结果表明，磁性纳米花不仅可以提高酶整体的催化活性和贮藏稳定性，而且将HRP固定在磁性载体上还可以有效的促进酶产物的分离和酶的回收，因此磁性纳米花具有优良的重复使用性。

实施例9：辣根过氧化物酶磁性纳米花降解双酚A

双酚A的降解受到很多因素的影响，这里主要讨论以下几个重要的因素，分别是：双酚A的浓度、过氧化氢和双酚A的浓度比、加入的磁性纳米花的浓度以及反应体系的温度。具体实验结果见图21。

（1）双酚A的浓度

向浓度范围为25 mg L^-1-300 mg L^-1的一系列双酚A溶液中加入相同量的磁性纳米花，控制反应的总体积为5 mL，将这一系列溶液移入恒温震荡箱，调节一定的温度，然后加入相同量的H₂O₂并开始反应（酶通过催化过氧化氢氧化双酚A，达到降解的目的，所以这里涉及到H₂O₂）。如图21 a所示，当双酚A的浓度很低的时候，其降解率随着浓度的增大而增大，当其浓度达到100 mg L^-1时降解率达到最大值62.4%，这是由于在刚开始浓度较低的时候，浓度的增加有利于降解反应的正向进行。而当继续增加双酚A的浓度时候，发现双酚A的降解率慢慢下降了，这可能是由于生成的降解产物的浓度的提升抑制了催化反应的正向进行。故选取最佳的双酚A浓度为100 mg L^-1。

（2）过氧化氢和双酚A的浓度比

向一系列浓度为100 mg L^-1的双酚A溶液加入相同量的磁性纳米花，控制总反应体积为5mL，将溶液转移到恒温震荡箱调节温度恒定，加入不同量的H₂O₂使得最终反应液中H₂O₂浓度为50 mg L^-1-200 mg L^-1。如图21 b所示，当H₂O₂与双酚A的比例小于1时，双酚A的降解率随着H₂O₂的增加而增加，最大降解率达到72.1%，此时的H₂O₂起到了正向的助催化的作用。当H₂O₂的浓度进一步增加的时候，降解率反而慢慢降低了，这可能是由于过量的H₂O₂会氧化酶活性中心的铁离子而导致其不能传递电子，从而削弱了它的催化降解能力。故选用最佳的H₂O₂浓度为100 mg L^-1。

（3）磁性纳米花的浓度

向一系列浓度为100 mg L^-1的双酚A溶液加入不同量的磁性纳米花，控制总反应体积为5mL，使得纳米花在反应体系中浓度为0.05 mg L^-1~0.3 mg L^-1，将溶液转移到恒温震荡箱调节温度恒定，加入H₂O₂使得最终反应液中H₂O₂浓度为100 mg L^-1。由图21 c可知，双酚A的降解率随着磁性纳米花量的增加而增加，其增加速率由一开始的非常急速到之后的逐渐变缓直至双酚A的降解率不在增加。纳米花的增加的确能够提高双酚A的降解效率，但是过度的加入磁性纳米花会导致生成的降解产物极具增多，部分会侵蚀包裹纳米花的结构，致使其活性降低。故选取最佳的磁性纳米花浓度为0.25 mg L^-1。

（4）反应体系的温度

向一系列浓度为100 mg L-1的双酚A溶液加入相同量的磁性纳米花，控制总反应体积为5mL，使得纳米花在反应体系中浓度为0.25 mg L-1，将溶液分别转移到温度不同恒温震荡箱调节温度范围为20℃~80℃，加入H2O2使得最终反应液中H2O2浓度为100 mg L-1。由图21 d可知，温度对双酚A的降解催化影响并不大，综合图中数据和经济效益，选用40℃为最佳的操作温度。

（5）降解实验

在本实施例中使用双酚A作为底物来研究磁性纳米花的催化活性。图22 a展现了不同催化剂（磁性纳米花和自由HRP）对双酚A的去除能力。实验中双酚A的初始浓度为为100 mg/ L，在加入游离HRP后其降解率随着时间的增加而缓慢增加，并在40min内达到平衡。相比之下，在磁性纳米花体系中，双酚A基本在25min内就达到了降解平衡，且磁性纳米花对双酚A具有较高的降解效率。

该实施例中双酚A的降解过程可以采用拟一级动力学进行分析。如图22 b所示，-ln Isub（Isub是最大降解率减去实时降解率所得的值）与时间呈近似线性关系。基于线性关系，当使用磁性纳米花和游离辣根过氧化物物酶时，平均反应速率常数（k）分别为0.2132min^-1和0.0921min^-1。此外，经测定的磁性纳米花的酶活性为468.5U / mg，为游离HRP的（256U / mg）183％。与游离HRP相比，磁性纳米花的催化活性的提高可能是由于其具有高表面积和稳点的纳米花层状结构，使得底物能够更易接触到HRP的活性位点，并且其优异的重复利用能力对于纳米花的实际应用具有重要的意义。

Claims

1.一种辣根过氧化物酶磁性纳米花，其特征在于，所述磁性纳米花具有磁性，呈花状。

2.权利要求1所述的辣根过氧化物酶磁性纳米花的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）溶液配制：

磷酸盐缓冲溶液的配制：配制Na₂HPO₄溶液并用相同浓度的NaH₂PO₄ 调节pH；

（2）辣根过氧化物酶固定化过程：

3.根据权利要求2所述的辣根过氧化物酶磁性纳米花的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的Na₂HPO₄溶液浓度为0.01-1M，优选为0.2M，所述pH为5-10，优选为7。

4.根据权利要求2所述的辣根过氧化物酶磁性纳米花的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的HRP浓度为0.3-0.7 mg/mL，优选为0.5 mg/mL。

5.根据权利要求2所述的辣根过氧化物酶磁性纳米花的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述反应的时间为6-10h，优选为8h；所述恒温箱温度为25℃。

6.根据权利要求2所述的辣根过氧化物酶磁性纳米花的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的磁性复合微球Fe₃O₄@PMG@IDA-Cu²⁺的制备方法，具体步骤如下：

S1.亚氨基二乙酸修饰的四氧化三铁/聚合N，N’-亚甲基双丙稀酰胺合环氧丙基微球（Fe₃O₄@PMG@IDA微球）的合成：

称取一定量的亚氨基二乙酸和一定量NaOH，将其溶解在蒸馏水中并用NaOH溶液调节pH值；之后将Fe₃O₄@PMG加入到上述溶液中，在一定温度条件下机械搅拌反应，得到的材料用乙醇洗涤，然后真空干燥过夜；

S2. 对Fe₃O₄@PMG@IDA表面进行Cu²⁺的修饰：

称取Fe₃O₄@PMG@IDA 于烧杯中，加入一定浓度的CuSO₄用磁子搅拌一段时间，得到的材料用蒸馏水洗涤后真空干燥过夜。

7.根据权利要求6所述的辣根过氧化物酶磁性纳米花的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述的IDA加入量、NaOH和Fe₃O₄@PMG的质量比为0.23-0.43g:0.1-0.3g:50mg；所述调节溶液的pH为10-12。

8.根据权利要求6所述的辣根过氧化物酶磁性纳米花的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述机械搅拌的温度为60-100 ^oC，反应12小时。

9.根据权利要求6所述的辣根过氧化物酶磁性纳米花的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述Fe₃O₄@PMG@ID和CuSO₄的用量比为50mg ：10mL，其中，所述CuSO₄的浓度为0.05-0.15M；所述磁子搅拌时间为1-3 h。

10.权利要求1所述的辣根过氧化物酶磁性纳米花用于对污染物双酚A的降解。