CN110055288A - 一种用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，包括步骤：将过渡金属离子、磷酸缓冲液及酪氨酸酶溶液低温混合后静置，使酪氨酸酶固定在过渡金属离子与磷酸根离子结合生成的复合物上，形成酪氨酸酶纳米花；将酪氨酸酶纳米花加入单酚化合物溶液中，并加入金属螯合剂及还原剂形成酶促反应体系，在预定温度下进行酶促反应，合成多酚类化合物。本发明解决了现有技术中通过酪氨酸酶催化合成多酚类化合物产率不高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及酶的固定化及酶催化技术领域，尤其涉及一种用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法。
背景技术
多酚类化合物是指苯环上有两个或两个以上羟基的物质，其独特的多羟基结构使其性质更优于单酚类化合物，具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病、抗心血管疾病和抗衰老等活性，具有较大的应用和研究价值。
目前，多酚类化合物的合成大部分通过化学法，但是过程复杂，既不绿色环保且反应伴随副产物的产生、产率低，所以生物合成法越来越受到关注和重视。酪氨酸酶又称多酚氧化酶，是结构复杂的含铜氧化还原酶，能够催化一元酚氧化成邻位的二元酚，并进一步将二元酚氧化成邻苯醌。传统固定化酪氨酸酶的方法有：将酪氨酸酶包埋进尼龙膜、海藻酸钙、聚丙烯酰胺中，或将其共价吸附于纤维素、壳聚糖、沸石上，还有将酪氨酸酶与硫酸铵和戊二醛进行沉淀交联的无载体固定化技术（Cross-linked enzyme aggregate, CLEA），具体可参阅现有文献“Xu D Y , Chen J Y , Yang Z . Use of cross-linked tyrosinaseaggregates as catalyst for synthesis of L-DOPA[J]. Biochemical EngineeringJournal, 63(2012):88-94.”所述，目的都是为了提高酶的催化，以此来合成人们所需的多酚类化合物，但在制备成本以及多酚类化合物的产率方面，酶的这些固定化技术还有待提高。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，旨在解决现有技术中通过酪氨酸酶催化合成多酚类化合物产率不高的问题。
本发明的技术方案如下：
一种用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，包括步骤：
将过渡金属离子、磷酸缓冲液及酪氨酸酶溶液低温混合后静置，使酪氨酸酶固定在过渡金属离子与磷酸根离子结合生成的复合物上，形成酪氨酸酶纳米花；
将酪氨酸酶纳米花加入单酚化合物溶液中，并加入金属螯合剂及还原剂形成酶促反应体系，在预定温度下进行酶促反应，合成多酚类化合物。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，所述过渡金属离子、磷酸缓冲液及酪氨酸酶溶液的混合液中，过渡金属离子的浓度为0～100mM，磷酸缓冲液的浓度为0～100mM。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，低温混合的温度为4℃。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，所述酶促反应体系的pH为4.0～7.5。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，所述预定温度为10℃～50℃。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，酶促反应体系中，酪氨酸酶纳米花为0~4mg/mL。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，所述磷酸缓冲液含NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，所述过渡金属离子为Cu2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Zn2+或Mn2+。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，所述金属螯合剂为EDTA、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、四硫钼酸铵、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、氨基三亚甲基膦酸、羟基乙叉二膦酸、乙二胺四甲叉膦酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、水解聚马来酸酐、羟乙基乙二胺三乙酸或二羟乙基甘氨酸。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，所述还原剂为L-抗坏血酸、柠檬酸、硫脲、水合肼、氢氧化锂、硼氢化钠或盐酸羟胺。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，所述酶促反应体系中EDTA的浓度为0~100mM，L-抗坏血酸的浓度为0~100mM。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其中，所述底物为L-酪氨酸、4-羟基苯乙酸、4-羟基布洛芬苯酚酯、双酚A、对苯氧基苯酚、3-氯苯酚、对甲基苯酚、对氯苯酚、2,4-二氯苯酚、愈创木酚、白藜芦醇或紫檀茋。
有益效果：本发明利用过渡金属离子与磷酸根离子生成的复合物与酪氨酸酶的相互作用，把酪氨酸酶固定在纳米级别的过渡金属磷酸复合物上，这个固定化复合物就叫酪氨酸酶纳米花，然后用此酪氨酸酶纳米花催化合成一系列多酚类化合物，并在反应体系中引入的金属螯合剂，有效提高多酚类化合物的产率，这种固定化方法很廉价、易制备且有很高的催化性能。
附图说明
图1为实施例1所述用响应面法对酪氨酸酶纳米花的制备条件进行最优化的三维图；
图2为实施例2所述反应体系中EDTA浓度与L-多巴的产量关系图；
图 3为实施例3所述反应体系中pH初始值与L-多巴的产量关系图；
图4为实施例4所述反应体系中反应温度与L-多巴的产量关系图；
图5为实施例5所述反应体系中不同酪氨酸酶纳米花含量下L-多巴的产量与反应时间关系图；
图6为实施例6中所述反应体系条件优化前后L-多巴的产量与反应时间关系图；
图7为实施例7中酪氨酸酶纳米花与CLEA催化合成L-多巴的产量对比图；
图8为实施例8所述反应体系中反应温度与白皮杉醇产量关系图；
图9为实施例9中酪氨酸酶纳米花催化合成L-多巴以及白皮杉醇的产率与时间关系图。
具体实施方式
本发明提供一种用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，包括步骤：
S1、将过渡金属离子、磷酸缓冲液及酪氨酸酶溶液低温混合后静置，使酪氨酸酶固定在铜离子与磷酸基团根离子结合生成的复合物上，形成酪氨酸酶纳米花；
S2、将酪氨酸酶纳米花加入单酚化合物溶液中，并加入金属螯合剂及还原剂形成酶促反应体系，在预定温度下进行酶促反应，合成多酚类化合物。
本发明中，利用酶蛋白分子骨架中的一些酰胺基团与过渡金属离子协同作用形成复合物，为金属磷酸盐的形成提供了一个成核位点；在酶蛋白分子及游离金属离子的驱动下，金属磷酸盐逐渐向四周生长，形成酪氨酸酶纳米花（Nanoflower，NF），从而把酪氨酸酶固定在纳米级别的磷酸铜复合物上，然后用此酪氨酸酶纳米花催化合成一系列多酚类化合物，在反应体系中引入的金属螯合剂，能够有效提高多酚类化合物的产率。其中，所述过渡金属离子为Cu2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Zn2+或Mn2+，优选地，所述过渡金属离子为Cu2+，因为酪氨酸酶是结构复杂的含铜氧化还原酶，其可以与铜离子进行相互作用特异性结合，本发明正是利用这一特性，利用铜离子与磷酸根离子生成的复合物与酪氨酸酶相互作用，更好地把酪氨酸酶固定在纳米级别的磷酸铜复合物上，然后用此酪氨酸酶纳米花催化合成一系列多酚类化合物。
所述步骤S1中，将过渡金属离子、磷酸缓冲液及酪氨酸酶溶液低温并充分混合均匀，使得过渡金属离子、磷酸根离子及酪氨酸酶三者可以均匀分布，这样便于过渡金属离子与磷酸根离子结合形成过渡金属离子磷酸盐复合物，也使得酪氨酸酶可以均匀分布在形成的过渡金属离子磷酸盐周围及其网络结构内，混合过程具体可以采用机械搅拌或摇床震荡等方式，然后静置足够成的时间（例如1~5天），使得酪氨酸酶能够充分固定在复合物上，然后进行离心、干燥即可得到能够合成多酚类化合物的酪氨酸酶纳米花。因为考虑到温度过高容易使酪氨酸酶失活，所述混合和静置过程均需在0~5℃的低温状态下进行，例如4℃，在这温度条件下，优选地，静置时间为3.2天，得到的酪氨酸酶纳米花催化活性最佳。
本发明所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法中，磷酸缓冲液含NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4，即所述磷酸缓冲液添加有氯离子，氯离子的加入能够提高制备体系中的离子强度，一方面在电荷相互作用下有利于纳米花的成型，另一方面使得酶蛋白的分布更加均一、稳定。有利于纳米花后期的形成。
具体的，在所述过渡金属离子、磷酸缓冲液及酪氨酸酶溶液的混合液中，过渡金属离子的浓度为0～100mM，磷酸缓冲液的浓度为0～100mM；优选地，铜离子的浓度为4～8mM，磷酸缓冲液的浓度为5～10mM，过渡金属离子及磷酸缓冲液浓度过低无法形成能够有效固定酪氨酸酶的复合物，而浓度过高则会让磷酸盐以晶体析出反而不利于酪氨酸酶的固定，同时过渡金属离子浓度过高容易让酪氨酸酶中毒变性。
优选地，酪氨酸酶的体积分数为50%～80%；所述酪氨酸酶的制备方法如下：将白色双孢菇与50mM磷酸缓冲液按1:2的质量（g）体积（mL）比在匀浆机中进行捣碎，并过滤、离心，取上清液即为酪氨酸酶液。
更优地，当所述过渡金属离子为铜离子并以硫酸铜的形式加入体系中时，通过响应面法对制备酪氨酸酶纳米花条件进行了优化，结果为：硫酸铜浓度为5.33mM，磷酸缓冲液的浓度为8.69mM。
所述步骤S2中，将步骤S1中制得的酪氨酸酶纳米花加入单酚化合物溶液中，同时加入金属螯合剂及还原剂形成酶促反应体系，调整体系pH后在预定温度下进行酶促反应，即可以合成多酚类化合物。
酪氨酸酶是含铜金属酶，每个亚基含有2个铜离子，铜离子与氧分子的结合方式的不同，使得酪氨酸酶形成四种不同形态：氧化态（Exoy）、还原态（Emet）、脱氧态（Edeoxy）、失活态（Edeact）。酪氨酸酶在酶促反应前是处于氧化态的，在进行酶促反应时，苯酚上的氧原子去质子化后与氧化态酪氨酸酶（Exoy）活性中心的铜离子配位形成复合物，此复合物再通过亲核取代反应，由单酚变为邻苯二酚，最后邻苯二酚经过分裂过程直接生成邻苯醌和脱氧态的酪氨酸酶（Edeoxy），酶在氧气的作用下，会重新形成氧化态酪氨酸酶（Exoy），持续反应。而L-酪氨酸、4-羟基苯乙酸、白藜芦醇和紫檀茋等单酚化合物均可以与酪氨酸酶结合进行上述酶促反应。因此，所述底物可以为L-酪氨酸、4-羟基苯乙酸、白藜芦醇或紫檀茋，对应合成的多酚类化合物分别为L-多巴、3,4-二羟基苯乙酸、白皮杉醇和3'-羟基紫檀茋。
优选地，所述酶促反应体系的pH为4.0～7.5，pH值过低或过高均会影响酪氨酸酶纳米花的活性而降低多酚类化合物的合成效率。
优选地，加热进行酶促反应的温度为10℃～50℃（例如为25℃），升温可以提高酶活性而加快酶促反应进行，从而提高多酚类化合物的合成效率，但是温度过高容易导致酶失活反而会降低合成效率。
所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法中，酶促反应体系中，加入的酪氨酸酶纳米花的含量为2mg/mL，酶含量的增加可以加快酶促反应，酶量已经达到饱和，继续增加反而会影响合成效率，从经济节约的角度上，选择2mg/mL当做是反应的最适酶含量。
在本发明中，金属螯合剂能够消除酪氨酸酶纳米花在酶促反应过程中有可能释放的部分金属离子，从而提高多酚类化合物的产率；而还原剂则用于将酶促反应生成的邻苯醌类物质还原为邻苯酚类物质，从而实现多酚类化合物的合成。所述金属螯合剂可以为乙二胺四乙酸（EDTA）、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、四硫钼酸铵、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、氨基三亚甲基膦酸、羟基乙叉二膦酸、乙二胺四甲叉膦酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、水解聚马来酸酐、羟乙基乙二胺三乙酸或二羟乙基甘氨酸；所述还原剂可以为L-抗坏血酸、柠檬酸、硫脲、水合肼、氢氧化锂、硼氢化钠或盐酸羟胺。具体地，所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法中的金属螯合剂为EDTA、所述还原剂为L-抗坏血酸。EDTA能够很好地消除酪氨酸酶纳米花在酶促反应过程中可能释放的部分金属离子，而L-抗坏血酸则可以高效地将醌类物质还原为双酚类物质，进一步提高多酚类化合物的产量。其中，所述酶促反应体系中EDTA的浓度为0~100mM，L-抗坏血酸的浓度为0~100mM。优选地，EDTA的浓度为20mM，L-抗坏血酸的浓度为12mM。
基于上述方法，本发明申请还提供了一种酪氨酸酶纳米花，其中，由如上所述的方法将酪氨酸酶固定而成。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
L-多巴含量检测：取出2mL反应液并在10000rpm条件下离心1min后，取1mL上清液进行HPLC检测(剩余溶液经过涡旋震荡5s后倒回原反应体系)；
检测条件：C18柱子：日本GL Sciences, Inc公司，inertsil ODS-SP，4.6 × 150 mm,5μm ）底物和产物可以用紫外检测器（Shimadzu SPD-16型号）检测，流动相 A为去离子水：甲醇：磷酸=979.5：19.5:1（v/v/v) PH=2.0，进样量 10μL；流速为1.0mL/min，检测波长为282nm，柱温箱温度为27℃。
实施例1 对酪氨酸酶纳米花的制备条件进行优化
利用Design Expert 8.0.6作图软件，选择Box-Behnken Design 作为优化反应的模型，以静置天数（2～4）、硫酸铜溶液浓度（5 mM～15 mM）、磷酸缓冲液浓度（0～20 mM）为三个自变量，将制得的酪氨酸酶纳米花进行活性测定，以紫外可见分光光度计中475nm下的吸光值为因变量，按照软件自动给出的17个实验组进行试验。其三维模拟结果如图1所示。
从图1可以看出，三维图像中球面的顶点，为制备NF的最优条件（[Cu2+] 5.33mM，[PBS] 8.69mM，静置天数 3.2天）
实施例2 对EDTA初始浓度进行优化
反应体系（100mM pH 6.5～7.5 磷酸缓冲液）的体积为10mL，NF的质量为20mg，底物L-酪氨酸初始浓度为2mM，L-抗坏血酸初始浓度为12mM， EDTA初始浓度分别为10mM、20mM、40mM、60mM、80mM、100mM；反应体系初始pH分别为6.73、6.75、6.23、6.01、6.08、5.90。然后在30℃ 250rpm的摇床中进行酶促反应，反应时间为1.5h，然后检测反应液中L-多巴含量，并分别计算产量，其结果如图2所示。
从图2中可以看出，EDTA初始浓度在0～20mM内产率不断增加，在20mM之后，L-多巴的产率不增反减，考虑到产率和成本的因素，选择EDTA初始浓度为20mM为反应最适条件。
实施例3 对反应体系初始pH进行优化
由于EDTA初始浓度为20mM时，pH也是最大的，所以必须探究反应体系pH对于多巴产量的影响。
反应体系（100mM或200mM pH 5.0～8.0的磷酸缓冲液）体积为10mL，NF的质量20mg，底物L-酪氨酸初始浓度为2mM，L-抗坏血酸初始浓度为12mM，EDTA初始浓度为20mM。反应体系初始pH分别为4.04、4.31、4.68、5.15、5.63、5.94、6.22、6.42、6.95、7.20，在30℃250rpm的摇床中进行酶促反应，反应时间为1.5h。反应至1.5h时检测反应液中L-多巴含量，并分别计算产量，其结果如图3所示。
从图3中可以看出，在反应进行到1.5h时，反应体系初始pH为5.15时，L-多巴的产量达到最大，在pH为5.15之后时，产量不断下降。所以选择pH6.0，100mM磷酸缓冲液当做是溶解底物及EDTA的缓冲液，并使得初始pH达到5.15。同时也充分证明了例2中EDTA初始浓度为20mM的确为最佳产率条件。
实施例4 对反应体系温度进行优化
反应体系（100mM，pH6.0的磷酸缓冲液）体积为10mL，NF的质量为20mg，底物L-酪氨酸初始浓度为2mM，L-抗坏血酸初始浓度为12mM， EDTA初始浓度为20mM。在250rpm的不同温度的摇床中进行酶促反应(10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)，反应时间为3.0h。反应至3h后检测反应液中L-多巴含量，并分别计算产量，其结果如图4所示。
从图4中可以看出，在反应进行到1.5h时，反应体系温度为25℃时，L-多巴的产量达到最大，在25℃之后时，产量不断下降。所以选择25℃当做是摇床催化L-酪氨酸合成L-多巴的最佳条件。
实施例5 对反应体系酪氨酸酶纳米花含量进行优化
反应体系（100mM，pH6.0的磷酸缓冲液）体积为10mL，NF的质量分别为10mg、20mg、30mg、40mg。底物L-酪氨酸初始浓度为2mM，L-抗坏血酸初始浓度为12mM，EDTA初始浓度为20mM。在250rpm 25℃的摇床中进行酶促反应，反应时间为3.0h并在反应过程中每隔0.5h检测反应液中L-多巴含量，并分别计算产量，其结果如图5所示。
从图5中可以看出，在不同酶量下的Time course图像中，当NF含量为40mg时，在第1h时L-多巴的产量就已经达到了1.29mM。当酶量为30mg和20mg时，在第1h时L-多巴的产量就已分别达到1.28mM和1.21mM。而在酶量只有10mg时，反应进行到第1.5h，产量仅达到1.17mM。从经济节约的角度上，选择NF量20mg当做是反应的最适酶量。
实施例6 反应体系优化前后的比较
优化前：反应体系（50mM pH7.0磷酸缓冲液）的体积为10mL，NF的质量为20mg，底物L-酪氨酸初始浓度为2mM，L-抗坏血酸初始浓度为12mM，EDTA初始浓度为50mM。反应体系初始pH为5.73。在30℃ 250rpm的摇床中进行酶促反应，反应时间为3.0h，并在反应过程中每隔0.5h检测反应液中L-多巴含量，并计算产量；
优化后：反应体系（100mM，pH6.0的磷酸缓冲液）体积为10mL，NF的质量为20mg，底物L-酪氨酸初始浓度为2mM，L-抗坏血酸初始浓度为12mM，EDTA初始浓度为20mM，反应体系终pH为5.04。在250rpm 25℃的摇床中进行酶促反应，反应时间为3.0h，并在反应过程中每隔0.5h检测反应液中L-多巴含量，并计算产量。
将反应体系优化前的产量及反应体系优化后的产量进行对比，其结果如图6所示，可见L-多巴产量相比优化前有大幅提升，反应1.0h，产量高达1.2mM。
实施例7 NF与CLEA分别催化合成L-多巴产量比较
制备体系：CLEA（250mL酪氨酸酶液+90%饱和度的(NH4)2SO4+1%戊二醛）4℃条件下搅拌16h后离心、干燥，称量后得0.52g CLEA。
NF（250mL酪氨酸酶液+[CuSO4]初始 5.33mM，[PBS]初始 8.69mM）4℃条件下静置3.2天后离心、干燥、称量后得0.34g NF。
CLEA反应体系（50mM，pH7.0的磷酸缓冲液）体积为10mL，CLEA质量为10mg，底物L-酪氨酸初始浓度为2mM，L-抗坏血酸初始浓度为12mM。在250rpm 25℃的摇床中进行反应，反应时间为2.0h。
NF反应体系（100mM，pH6.0的磷酸缓冲液）体积为10mL，NF质量为10mg，底物L-酪氨酸初始浓度为2mM，L-抗坏血酸初始浓度为12mM， EDTA初始浓度为20mM，在250rpm 25℃的摇床中进行反应，反应时间为2.0h。反应至2.0h后检测反应液中L-多巴含量，并计算产量，其结果如图7所示。
从图7中可以看出，在相同体积酪氨酸酶液制备固定化酶情况下，取相同质量CLEA和NF催化L-多巴的Time course图像中，CLEA在反应进行到第2.0h时，L-多巴达到最大产量为1.0mM，而NF在反应进行到第2h时，L-多巴就已经达到最大产量为1.29mM。所以可以说明NF活性要比CLEA好。
实施例8 对NF催化合成白皮杉醇反应体系温度进行优化
反应体系（200mM pH6.5 磷酸缓冲液）的体积为2mL，NF的质量为10mg，底物白藜芦醇初始浓度为20mM，EDTA初始浓度为20mM，L-抗坏血酸初始浓度为60mM；反应体系初始pH为6.14。然后在不同温度（20℃、25℃、30℃、40℃、50℃） 220rpm的摇床中进行酶促反应，反应时间为3.0h，期间每隔0.5h取一次样然后检测反应液中白皮杉醇含量，并分别计算产量，其结果如图8所示。
从图8中可以看出，反应温度在20℃～30℃之间，白皮杉醇的产量波动不大，在第3.0h时产量基本在15mM，从酪氨酸酶酶自身的最适反应温度来看，选择催化合成白皮杉醇最适温度为25℃。
实施例9 用NF催化合成L-多巴及白皮杉醇产率随时间变化
合成L-多巴：反应体系（100mM，pH6.0的磷酸缓冲液）体积为10mL，NF的质量为20mg，底物L-酪氨酸初始浓度为2mM，L-抗坏血酸初始浓度为12mM，EDTA初始浓度为20mM，反应体系终pH为5.04。在250rpm 25℃的摇床中进行酶促反应，反应时间为3h，并在反应过程中每隔0.5h检测反应液中L-多巴含量，并计算产率，其结果如图9所示；
合成白皮杉醇：反应体系（200mM，pH6.5的磷酸缓冲液）体积为2mL，NF的质量为10mg，底物白藜芦醇初始浓度为20mM，L-抗坏血酸初始浓度为60mM，EDTA初始浓度为20mM，反应体系终pH为6.12。在220rpm 30℃的摇床中进行酶促反应，反应时间为3h，并在反应过程中每隔0.5h检测反应液中白皮杉醇含量，并计算产率，其结果如图9所示。
从图9中可以看出，由于还原剂L-抗坏血酸量被消耗殆尽，NF催化合成L-多巴在反应进行到1.0h时达到最大产率60%，而在NF催化合成白皮杉醇的反应中L-抗坏血酸量足够，所以在反应进行到第3.0h达到最大产率75%，说明NF在一定催化条件下，同样能合成除L-多巴之外的多酚类化合物。
综上所述，本发明所提供的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，利用铜离子与磷酸根离子生成的复合物与酪氨酸酶的相互作用，实现酪氨酸酶的固定而形成酪氨酸酶纳米花，然后用固定化的酪氨酸酶纳米花催化合成一些多酚类化合物，且在反应体系中引入的金属螯合剂，能够在一定程度上消除酪氨酸酶纳米花在反应过程中所释放的金属离子，提高多酚类化合物的产率，这种固定化方法很廉价、易制备且有很高的催化性能，避免以复杂的化学手段合成一些难以分离的副反应产物，提高了生产效率。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其特征在于，包括步骤：
将过渡金属离子、磷酸缓冲液及酪氨酸酶溶液低温混合后静置，使酪氨酸酶固定在过渡金属离子离子与磷酸根离子结合生成的复合物上，形成酪氨酸酶纳米花；
将酪氨酸酶纳米花加入单酚化合物溶液中，并加入金属螯合剂及还原剂形成酶促反应体系，在预定温度下进行酶促反应，合成多酚类化合物。
2.根据权利要求1所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其特征在于，所述过渡金属离子、磷酸缓冲液及酪氨酸酶溶液的混合液中，过渡金属离子的浓度为0～100mM，磷酸缓冲液的浓度为0～100mM。
3.根据权利要求1所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其特征在于，所述的过渡金属离子为铜离子。
4.根据权利要求1所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其特征在于，所述酶促反应体系的pH为4.0～7.5。
5.根据权利要求1所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其特征在于，所述预定温度为10℃～50℃。
6.根据权利要求1所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液含NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4。
7.根据权利要求1所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其特征在于，所述金属螯合剂为EDTA、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、四硫钼酸铵、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、氨基三亚甲基膦酸、羟基乙叉二膦酸、乙二胺四甲叉膦酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、水解聚马来酸酐、羟乙基乙二胺三乙酸或二羟乙基甘氨酸。
8.根据权利要求1所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其特征在于，所述还原剂为L-抗坏血酸、柠檬酸、硫脲、水合肼、氢氧化锂、硼氢化钠或盐酸羟胺。
9.根据权利要求1所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其特征在于，金属螯合剂为EDTA且还原剂为L-抗坏血酸，所述酶促反应体系中EDTA的浓度为0~100mM，L-抗坏血酸的浓度为0~100 mM。
10.根据权利要求1所述的用新型酶固定化技术合成多酚类化合物的方法，其特征在于，所述单酚化合物为L-酪氨酸、4-羟基苯乙酸、4-羟基布洛芬苯酚酯、双酚A、对苯氧基苯酚、3-氯苯酚、对甲基苯酚、对氯苯酚、2,4-二氯苯酚、愈创木酚、白藜芦醇或紫檀茋。
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