CN103012673B - 固定生物酶的核壳式超顺磁性聚合物微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球及其制备方法，属于生物技术领域。本发明用亲水性更强的SiO2对超顺磁性的Fe3O4纳米粒子进行完全包覆，然后用反相悬浮聚合技术制备以Fe3O4纳米粒子为核和表面含有环氧基团的聚合物为壳的核壳式的超顺磁性聚合物微球。将上述核壳式超顺磁性聚合物微球可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶或淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为430U/g(湿酶)，经过10次循环使用后，固定化酶保留了99％的初始活性。

Description

固定生物酶的核壳式超顺磁性聚合物微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球及其制备方法，属于生物技术领域。具体地说，采用反相悬浮聚合法制备了比表面积大、球形度好、粒径分布均匀和表面含有环氧基团的核壳式超顺磁性聚合物微球。
背景技术
酶是一类由生物活体细胞产生的具有催化性能的蛋白质，故又称为生物催化剂。它能在十分温和条件下高效催化各种化学反应，因而无论在实验室还是工业上都是一种常用的催化剂。但是游离酶在催化反应过程中存在以下两方面的弊端：第一，在热、强酸、强碱、高离子强度和有机溶剂中，酶的催化活性会大大下降甚至丧失；第二，作为一类液体催化剂，在水溶液中进行反应，反应结束之后，催化剂与底物和产物分离困难，不利于催化剂的循环利用和提高产物的纯度，以上两方面大大限制了游离酶在连续化大规模生产中的应用。酶的固定化技术是一种将酶从均相催化状态转变成为多相催化状态的方法，将酶固定在特定的载体上制成固定化酶，不仅大大提高了酶的热稳定性和酸碱稳定性，而且固定化酶容易与产物和底物分离，提高了产物纯度的同时也实现了酶的重复利用，在生产过程中容易实现连续操作。
青霉素酰化酶(EC3.5.1.11)是半合成β-内酰胺类抗生素生产中最关键的酶，它既能催化青霉素及其扩环酸水解去侧链，生产半合成β-内酰胺类抗生素的重要中间体6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)，又能催化6-APA和7-ADCA与侧链缩合，生产多种半合成β-内酰胺类抗生素(如Ampicillin，Amoxicillin，Cephalexin和Cefadroxil等)。6-APA可以由青霉素酰化酶水解法和化学合成法生产，青霉素酰化酶水解法具有专一性强、反应条件温和、无污染等优点，而化学合成法反应过程复杂、反应条件苛刻，需在-40℃和高毒性的卤代溶剂中进行，易造成环境污染，不符合绿色化学的要求。因此，青霉素酰化酶水解法具有高效、经济和环保等优点，成为生产6-APA的首选方法。
磁性聚合物微球的性质及其合成方法的研究已成为近十多年来新材料研究中的热点。磁性聚合物微球结合了磁性粒子和高分子聚合物的特性，磁性粒子使材料具有一定的磁响应性，能在外加磁场的作用下实现迅速地简单分离，同时包覆的聚合物赋予材料一定的吸水性和弹性，并可通过共聚、改性等手段使材料表面带有特定的能与生物活性物质相结合的官能团，从而使磁性聚合物微球在固定化酶、细胞分离、靶向药物和免疫分析等方面都具有极其诱人的发展前景。同时，对于表面含有环氧基团的聚合物微球，环氧基团能够在室温条件下开环与酶的活性非必需侧链基团反应形成共价键，因酶与载体之间以共价键相结合，呈现良好的操作稳定性。
中国发明专利CN101183589A公开了一种带有表面官能团的磁性微球的制备方法，在磁性纳米粒子存在的条件下进行分散聚合，聚合反应结束后对磁性微球表面进行磺化使其表面带上官能团。由于聚合物是疏松的且带有大孔结构，在聚合反应过程中即使将Fe3O4粒子包覆在聚合物内部，但在聚合反应结束后用98％的浓硫酸进行磺化时，硫酸难免会通过聚合物的疏松孔道进入微球内部和Fe3O4反应使磁性粒子被破坏。
中国发明专利CN101085874A公开了一种亲水性聚合物磁性微球及其制备方法和用途。用甲酰胺分散超顺磁性Fe3O4磁粉制备磁流体，与亲水性单体混合组成聚合相，搅拌下分散于含有稳定剂的疏水性有机溶剂形成悬浮相，用反相悬浮聚合技术制备了亲水性聚合物磁性微球。用上述磁性微球制备的固定化青霉素酰化酶的最高表观活性可达795IU/g(37℃，载体干重)，相当于205IU/g(28℃，载体湿重)。但该发明的制备方法存在着硬脂酸钙稳定剂洗涤困难和聚合物磁性微球机械强度低等缺点，严重影响了固定化酶的表观活性和使用寿命。
中国发明专利CN101250247A公开了一种用于生物酶固定化的磁性聚合物微球及其制备方法。将超顺磁性的Fe3O4纳米粒子、含环氧基团的单体和交联剂等分散在甲酰胺溶液中制成单体相，在搅拌下加入到用Span60和Tween20复合表面活性剂稳定的分散相中进行反相悬浮聚合，制备表面带有环氧基团的磁性聚合物微球。该发明用Tween20代替CN101085874A中的硬脂酸钙，提高了固定化酶的活性，简化了后处理的操作。但是在该发明中，纳米级的磁性粒子具有较高的表面能，在聚合反应过程中分散性不好，极易团聚成大颗粒，使制备得到的磁性聚合物微球中磁含量不等、粒径分布不均匀和形貌不均一，同时磁性粒子与聚合单体之间的亲和性不好会使部分磁性粒子不能很好地被包埋于聚合物基质内部形成核壳式结构，降低了磁性聚合物微球的比表面积，从而降低了固定化青霉素酰化酶的活性(只有330U/g，28℃，载体湿重)。
发明内容
本发明目的是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种制备比表面积大、球形度好、粒径分布均匀和表面含有环氧基团的核壳式的超顺磁性聚合物微球的方法，使以该聚合物微球为载体制备的固定化青霉素酰化酶具有较高的活性、操作稳定性和磁分离性能。
本发明目的可以通过以下技术方案来实现：先用亲水性更强的SiO2包覆超顺磁性的Fe3O4纳米粒子，然后将其分散于极性溶剂中形成磁流体，再加入含有环氧基团的功能性单体和交联剂，在引发剂作用下利用反相悬浮聚合技术制备核壳式的超顺磁性聚合物微球。
所述的超顺磁性的Fe3O4纳米粒子用共沉淀法制备，将氯化铁和硫酸亚铁溶于去离子水中，在N2保护下加热至一定温度后用氨水调节体系pH值为10～11，继续熟化1～3h，冷却至室温，用去离子水反复洗涤沉淀至中性。
所述的Fe3+盐和Fe2+盐的摩尔比为2∶1～1∶1，反应温度为35～85℃。
所述的超顺磁性的Fe3O4/SiO2纳米粒子的制备方法，将上述Fe3O4纳米粒子分散到由无水乙醇、去离子水和氨水组成的混合溶剂中，超声分散15～45min后加入正硅酸乙酯，在室温下继续反应8～16h后，用去离子水反复洗涤沉淀至中性后于50～80℃真空干燥8～16h。
所述的正硅酸乙酯和Fe3O4纳米粒子的质量比为1∶2～2∶1。
所述的核壳式的超顺磁性聚合物微球用反相悬浮聚合技术制备，将Fe3O4/SiO2纳米粒子分散到溶解有N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯和烯丙基缩水甘油醚等聚合物单体以及偶氮二异丁腈引发剂的甲酰胺溶液中，然后加入到溶解有Span60和Tween20复合分散剂(质量比为8∶3)的由正庚烷和四氯乙烯组成的混合溶剂(体积比为3∶1)中，在氮气保护下于55℃进行反相悬浮聚合反应4h，反应结束后用乙醇洗涤，正庚烷浸泡，60℃真空干燥12h。
所述的Fe3O4/SiO2纳米粒子的加入量为聚合物单体总质量的2％～10％。
所述的核壳式的超顺磁性聚合物微球，可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化。
采用中国发明专利CN101250247A中的固定化青霉素酰化酶的活性测定方法，测定以上述核壳式的超顺磁性聚合物微球为载体制备的固定化酶的活性。经过10次循环使用后的固定化酶的操作稳定性定义为第10次循环使用后的固定化酶的活性与初始活性之比。
本发明的关键在于用亲水性更强的SiO2对超顺磁性的Fe3O4纳米粒子进行完全包覆，极大地改善Fe3O4纳米粒子与亲水性聚合单体之间的相容性，形成以Fe3O4纳米粒子为核和表面含有环氧基团的聚合物为壳的核壳式的超顺磁性聚合物微球，阻止Fe3O4纳米粒子在聚合物基质中的无序嵌入，提高了聚合物微球的比表面积，有利于更多生物酶分子在其上的固定化，从而提高了固定化酶的活性。同时，SiO2的包覆也降低了Fe3O4纳米粒子的表面能，能有效阻止Fe3O4纳米粒子之间的团聚，使制得的聚合物微球球形度好(如图1所示)、粒径分布均匀(如图2所示)和磁含量均匀，从而提高了磁分离性能。
附图说明
图1为超顺磁性聚合物微球的扫描电镜图；
图2为超顺磁性聚合物微球的粒径分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
对比例
将3.650g FeCl3·6H2O和2.080g FeSO4·7H2O溶于100mL去离子水中，在N2保护下加热至65℃，然后在剧烈搅拌下用滴液漏斗逐滴滴加25wt％的氨水溶液至pH＝11，在65℃下熟化2h后，冷却至室温，用去离子水反复洗涤沉淀至中性后于60℃真空干燥12h，得到1.570g超顺磁性的Fe3O4纳米粒子。
在装有恒温水浴夹套的玻璃反应器中，分别接好搅拌器、冷凝管和导气管，加入体积比为3∶1的正庚烷和四氯乙烯混合液120mL，升温至55℃后加入1.070g由Span60和Tween20按质量比8∶3复配成的复合分散剂，混合均匀后，再加入17.5mL溶有0.550g Fe3O4纳米粒子、3.900g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.540g甲基丙烯酰胺、1.35ml甲基丙烯酸缩水甘油酯、1.35ml烯丙基缩水甘油醚和0.550g偶氮二异丁腈的甲酰胺溶液。在氮气保护下于55℃进行反相悬浮聚合反应4h。反应结束后用50mL乙醇洗涤3次，50mL乙醇和50mL正庚烷各浸泡48h，60℃真空干燥12h后，得到粒径在60～140目的超顺磁性聚合物微球占71％。将上述制备的超顺磁性聚合物微球用于青霉素酰化酶的固定化，固定化酶的活性为231U/g(湿酶)，经过10次循环使用后的操作稳定性为93％。
实施例1
1、超顺磁性的Fe3O4/SiO2纳米粒子的制备
将3.650g FeCl3·6H2O和2.080g FeSO4·7H2O溶于100mL去离子水中，在N2保护下加热至65℃，然后在剧烈搅拌下用滴液漏斗逐滴滴加25wt％的氨水溶液至pH＝11，在65℃下熟化2h后，冷却至室温，用去离子水反复洗涤沉淀至中性。
将上述Fe3O4纳米粒子加入到由120mL无水乙醇、30mL去离子水和3.75mL氨水(25wt％)组成的混合溶剂中，超声分散30min后滴加2.100g正硅酸乙酯，然后在室温下搅拌12h，用去离子水反复洗涤沉淀至中性后于60℃真空干燥12h，得到超顺磁性的Fe3O4/SiO2纳米粒子。
2、核壳式的超顺磁性聚合物微球的制备
在装有恒温水浴夹套的玻璃反应器中，分别接好搅拌器、冷凝管和导气管，加入体积比为3∶1的正庚烷和四氯乙烯混合液120mL，升温至55℃后加入1.070g由Span60和Tween20按质量比8∶3复配成的复合分散剂，混合均匀后，再加入17.5mL溶有0.550g Fe3O4/SiO2纳米粒子、3.900g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.540g甲基丙烯酰胺、1.35ml甲基丙烯酸缩水甘油酯、1.35ml烯丙基缩水甘油醚和0.550g偶氮二异丁腈的甲酰胺溶液。在氮气保护下于55℃进行反相悬浮聚合反应4h。反应结束后用50mL乙醇洗涤3次，50mL乙醇和50mL正庚烷各浸泡48h，60℃真空干燥12h后，得到粒径在60～140目的超顺磁性聚合物微球占90％。将上述制备的顺磁性聚合物微球用于青霉素酰化酶的固定化，固定化酶的活性为430U/g(湿酶)，经过10次循环使用后的操作稳定性为99％。
实施例2
将实施例1中FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O的质量分别改为2.000g和2.080g，其他过程与实施例1相同，得到粒径在60～140目的超顺磁性聚合物微球占92％，相应的固定化青霉素酰化酶的活性为318U/g(湿酶)，经过10次循环使用后的操作稳定性为89％。
实施例3
将实施例1中FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O的质量分别改为4.003g和2.080g，其他过程与实施例1相同，得到粒径在60～140目的超顺磁性聚合物微球占84％，相应的固定化青霉素酰化酶的活性为298U/g(湿酶)，经过10次循环使用后的操作稳定性为87％。
实施例4
将实施例1中制备Fe3O4纳米粒子的熟化温度改为35℃，其他过程与实施例1相同，得到粒径在60～140目的超顺磁性聚合物微球占83％，相应的固定化青霉素酰化酶的活性为412U/g(湿酶)，经过10次循环使用后的操作稳定性为93％。
实施例5
将实施例1中制备Fe3O4纳米粒子的熟化温度改为85℃，其他过程与实施例1相同，得到粒径在60～140目的超顺磁性聚合物微球占80％，相应的固定化青霉素酰化酶的活性为398U/g(湿酶)，经过10次循环使用后的操作稳定性为96％。
实施例6
将实施例1中正硅酸乙酯的用量改为1.400g，其他过程与实施例1相同，得到粒径在60～140目的超顺磁性聚合物微球占85％，相应的固定化青霉素酰化酶的活性为365U/g(湿酶)，经过10次循环使用后的操作稳定性为90％。
实施例7
将实施例1中正硅酸乙酯的用量改为2.800g，其他过程与实施例1相同，得到粒径在60～140目的超顺磁性聚合物微球占72％，相应的固定化青霉素酰化酶的活性为397U/g(湿酶)，经过10次循环使用后的操作稳定性为95％。
实施例8
将实施例1中Fe3O4/SiO2纳米粒子的质量改为0.450g，其他过程与实施例1相同，得到粒径在60～140目的超顺磁性聚合物微球占89％，相应的固定化青霉素酰化酶的活性为298U/g(湿酶)，经过10次循环使用后的操作稳定性为88％。
实施例9
将实施例1中Fe3O4/SiO2纳米粒子的质量改为0.840g，其他过程与实施例1相同，得到粒径在60～140目的超顺磁性聚合物微球占81％，相应的固定化青霉素酰化酶的活性为265U/g(湿酶)，经过10次循环使用后的操作稳定性为92％。

Claims (5)

1.一种用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，用亲水性更强的SiO2对超顺磁性的Fe3O4纳米粒子进行完全包覆，然后用反相悬浮聚合技术制备以Fe3O4纳米粒子为核和表面含有环氧基团的聚合物为壳的核壳式的超顺磁性聚合物微球；
所述的核壳式超顺磁性聚合物微球的制备方法，具体包括如下步骤：
将氯化铁和硫酸亚铁溶于去离子水中，在N2保护下加热至一定温度后用氨水调节体系pH值为10～11，继续熟化1～3h，冷却至室温，用去离子水反复洗涤沉淀至中性，得到超顺磁性的Fe3O4纳米粒子；
将上述Fe3O4纳米粒子分散到由无水乙醇、去离子水和氨水组成的混合溶剂中，超声分散15～45min后加入正硅酸乙酯，在室温下继续反应8～16h后，用去离子水反复洗涤沉淀至中性后于50～80℃真空干燥8～16h，得到超顺磁性的Fe3O4/SiO2纳米粒子；
将上述Fe3O4/SiO2纳米粒子分散到溶解有N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯和烯丙基缩水甘油醚以及偶氮二异丁腈引发剂的甲酰胺溶液中，然后加入到溶解有Span60和Tween20复合分散剂的由正庚烷和四氯乙烯组成的混合溶剂中，在氮气保护下于55℃进行反相悬浮聚合反应4h，反应结束后用乙醇洗涤，正庚烷浸泡，60℃真空干燥12h，得到核壳式的超顺磁性聚合物微球。
2.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，在制备超顺磁性的Fe3O4纳米粒子过程中，所述的氯化铁和硫酸亚铁的摩尔比为2∶1～1∶1，反应温度为35～85℃。
3.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，在制备超顺磁性的Fe3O4/SiO2纳米粒子过程中，所述的正硅酸乙酯和Fe3O4纳米粒子的质量比为1∶2～2∶1。
4.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，在制备核壳式的超顺磁性聚合物微球过程中，所述的Fe3O4/SiO2纳米粒子的加入量为聚合物单体总质量的2％～10％。
5.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，所述的核壳式超顺磁性聚合物微球可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶或淀粉酶的固定化。
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