CN106861570A - 一种磁性复合微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种磁性复合微球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种磁性复合微球及其制备方法和应用，属于化学材料制备技术领域；本发明首先合成Fe3O4 @ SiO2 – MPS；再混合加入乙腈超声分散后，加入异丙基丙烯酰胺，甲基丙烯酸缩水甘油酯，N,N'‑亚甲基双丙烯酰胺，偶氮二异丁腈，混合后油浴加热；再蒸馏得到部分乙腈，停止反应；得到的产物用磁铁分离，并乙醇和水反复洗涤；而后放在真空干燥箱内干燥得到产物；并将其用于纤维素酶的固定化；本发明合成的磁性复合微球具有超顺磁性能，对纤维素酶的固定化可以提高其酶活恢复能力及热稳定性能，实现对纤维素酶的热保护。

Description

一种磁性复合微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种磁性复合微球及其制备方法和应用，具体涉及一种温敏性能的磁性核壳微球合成及其在纤维素酶固定化中的应用，属于化学材料制备技术领域。
背景技术
植物的主要组成部分之一就是纤维素，其含量约占植物干重的35%-50%，纤维素是世界上最广泛分布的天然碳水化合物。有效的开发利用植物中的纤维素具有十分重要的意义，能够有效的缓解能源危机、环境污染、节能减排及粮食短缺等问题。而目前对纤维素的利用总量还不到世界产量的 0.5%，大量的纤维素资源还没有得到有效、合理和广泛的应用。目前对纤维素资源的开发利用已经成为世界上许多国家研究和开发的重点，而纤维素酶是纤维素开发利用的重要方向之一，已经成为纤维素开发利用的重要途径之一。
大多数酶的活性在亲水的微环境下才能保持稳定，许多酶在高温时肽链展开暴露了其中的疏水位点并且相互聚集而失去活性，这严重阻碍了纤维素酶的实际应用。
酶固定化技术是最常用的改善酶性的工具，可以大大改善酶的稳定性、催化活性、选择性和抗抑制性。化学法固定酶的方法自20世纪50年代开始盛行，现已成为酶固定化的一种重要方法。化学法又可分为交联法和共价结合法，交联法需要双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键，从而把酶束缚在固体材料上，步骤较为繁琐。共价结合法是将酶与载体以共价键结合，可使固定化酶与载体牢固连接在一起，稳定性高，并且可重复使用。但其反应条件较为剧烈，会引起酶蛋白空间构象变化，破坏酶的活性部位，因此酶活较低，并且过程十分繁杂。在酶的固定化过程中，酶和载体具有完全不同的几何形状，将这两个不同的刚性结构进行连接，不仅要对酶进行修饰，最大程度地保留酶活，同时还必须严格考虑固定化载体的材料。
近年来，以壳聚糖、尼龙材料和棉布、磁性材料、介孔分子筛和碳纳米管为载体固定化酶在很多领域得到了广泛的研究和应用。磁性微球在磁场作用下，可被有效地分离回收和再利用，若将其应用于磁性稳态流化床中，可通过外加磁场控制其运动速度和方向，易于实现床层的散式流化，保持低的流动阻力，同时，利用磁场来控制固定化酶的分散，可避免传统搅拌对酶的机械损伤，以提高酶的稳定性，具有大规模工业化应用前景。
为了结合磁性材料优势，制备磁性硅球复合材料用作酶的固定化载体，使其既具有二氧化硅微球的一般优良性质，同时还具有磁性纳米材料的优势，具有广阔的应用前景。在保持磁性纳米粒子具有较强磁强度的情况下，实现材料进一步修饰和功能化，就可将酶固定在磁性复合微球表面，从而达到提高酶活和减少成本的目的。
因此，若能设计出一种简单的材料，又能将酶与材料共价结合而不破坏其活性位点，又能实现保护酶活性的特点，从而使后续固定化反应条件更温和、酶活力回收率更高、稳定性更强。
本发明涉及一种固定化酶磁性载体Fe3O4 @ SiO2 - p(GMA - co - NIPAM)，将其应用到制备固定化纤维素酶。高温时磁性复合物微球表面的温敏性聚合物变得疏水而包裹变性酶分子，低温时温敏聚合物变得亲水将酶释放出来，使其能再折叠恢复活性，提高其酶活恢复能力及热稳定性能。同时其磁性性能也能大大提高该固定化酶的重复使用效率。对于磁性复合物材料Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)的制备并固定化纤维素酶，国内外并无文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种用于固定化纤维素酶的磁性复合微球及其制备方法。
本发明采取的技术手段如下：
本发明首先提供一种新型的磁性复合微球Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)。
本发明还提供一种新型的磁性复合微球Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）Fe3O4 @ SiO2 - MPS的合成：
将Fe3O4分散于乙醇和水混合溶液中，再加入氨水，机械搅拌并向体系内缓慢滴加正硅酸乙酯（TEOS）反应；然后再加入甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（MPS），继续搅拌反应；磁分离产物，用乙醇洗涤几遍；在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
其中，所述Fe3O4 @ SiO2 - MPS合成过程中的中间产物Fe3O4的合成方法参照文献(Kamat R K, Ma W, Yang Y, et al. Adsorption and hydrolytic activity of thepolycatalytic cellulase nanocomplex on cellulose[J]. ACS applied materials &interfaces, 2013, 5(17): 8486-8494.)。
其中，所述的Fe3O4与乙醇和水混合溶液的用量比例为0.1 - 0.5 g：15 - 90 mL，其中乙醇和水的体积比为4:1；
所述的氨水与Fe3O4的比例为1 - 3 mL：0.1 - 0.5 g；
所述正硅酸乙酯（TEOS）的用量为0.5 - 1.2 mL；
所述加入正硅酸乙酯反应的条件为室温反应6-24小时；
所述加入甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（MPS）0.3 - 1.5 mL；
所述搅拌反应条件为搅拌反应12 - 48小时。
（2）Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)的合成：
取Fe3O4 @ SiO2 - MPS于单口烧瓶，加入乙腈超声分散3min，加入异丙基丙烯酰胺（NIPAM），甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA），交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（MBA），引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器；再蒸馏得到部分乙腈，停止反应；得到的产物用磁铁分离，并乙醇和水反复洗涤。而后放在真空干燥箱内干燥。
其中，所述Fe3O4 @ SiO2– MPS与乙腈用量比例为50-100mg：40-80mL；
所述异丙基丙烯酰胺（NIPAM）的用量为50 - 150mg；甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）的用量为0.05 - 0.15mL，交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）的用量为100 - 200mg，引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）用量为4-10mg。
所述油浴加热烧瓶的条件为从室温30分钟内加热到沸腾，再蒸馏1小时。
所述再蒸馏得到的乙腈为20 - 40mL。
本发明还提供该新型磁性复合微球Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM) 用于纤维素酶的固定化的应用。
将浓度为6 - 84 mg/mL的纤维素酶溶液与50-100mg载体材料的溶液混合调pH为3-8。在30℃到80℃的恒温震荡箱内震荡15分钟-2小时，用磁铁分离固定化后的磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未固定的纤维素酶，测定固定化纤维素酶的酶活。
本发明具有如下优点：
（1）本发明中所设计合成的磁性复合微球中所含聚合物PNIPAM，在高温时变得疏水而包裹变性酶分子，低温时温敏聚合物变得亲水将酶释放出来，使其能再折叠恢复活性，从而提高其酶活恢复能力及温度稳定性能，实现了对纤维素酶的热保护性能。
（2）本发明中磁性复合微球Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)具有超顺磁性能，在外界磁场存在下，在30 s内进行回收，在外界磁场消失时，均匀的分散在缓冲溶液中。
（3）本发明中制备的固定化纤维素酶在催化反应6次后，其酶活保留初始酶活的60%，当使用8次后，酶活仍然有20%。具有较好的重复利用性能。
（4）本发明中制备的固定化纤维素酶，当温度为60℃时，保留相对酶活为80%左右，而对于游离酶所剩相对酶活只有30%，可见固定化酶温度稳定性相对游离纤维素酶提高了很多，具有很大的优势。
（5）本发明中固定化纤维素酶在高温下失活后，放置在低温保存一段时间，酶活能够恢复到原来酶活的72%。
附图说明
图1为按照实施例1和3制备的Fe3O4（a）、Fe3O4 @ SiO2 - MPS（b）和Fe3O4 @ SiO2 -p (GMA - co - NIPAM) （c）的红外谱图。
图2为按实施例1和实施例4制得的Fe3O4（a）、Fe3O4 @ SiO2 - MPS（b）和Fe3O4 @SiO2 - p (GMA - co - NIPAM) （c）的TEM图。
图3为按实施例1和实施例4制得的Fe3O4（a）、Fe3O4 @ SiO2 - MPS（b）和Fe3O4 @SiO2 - p (GMA - co - NIPAM) （c）的VSM图。
图4为实施例7制得的Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)固定化纤维素酶的温度稳定性结果图。
图5为实施例7制得的Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)固定化纤维素酶的重复操作性结果图。
图6为实施例7制得的Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)固定化纤维素酶的酶活恢复能力结果图。
具体实施方式：
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：Fe3O4的合成
将1.350g六水合氯化铁溶于70mL乙二醇，加入3.854g乙酸铵，0.400g柠檬酸三钠，油浴温度170℃下搅拌1h至溶液成均匀体系，转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中加热至200℃16h。取出后冷却至室温，磁分离产物，用乙醇洗涤至上清液透明，放在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
实施例2：Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)的合成
（1）Fe3O4 @ SiO2 - MPS的合成
将0.1 g的实施例1中产物Fe3O4分散于15mL的体积比为4:1的乙醇和水混合溶液中，再加入1 mL的氨水溶液，机械搅拌并向体系内缓慢滴加0.5mL TEOS，室温反应6小时。在体系内加入0.3mL MPS，继续搅拌反应12小时。磁分离产物，用乙醇洗涤几遍。在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
（2）Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)的合成
取50mg Fe3O4 @ SiO2 - MPS于单口烧瓶，加入40mL乙腈超声分散3min，加入50 mgNIPAM，0.05mL GMA，100mg交联剂MBA，4mg引发剂AIBN，油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器。将反应烧瓶从室温30分钟内加热到沸腾，再经过一个小时蒸馏得到20mL乙腈，停止反应。得到的产物用磁铁分离，并乙醇和水反复洗涤。而后放在真空干燥箱内干燥。
实施例3：Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)的合成
（1）Fe3O4 @ SiO2 - MPS的合成
将0.5 g的实施例1中产物Fe3O4分散于90 mL的体积比为4:1的乙醇和水混合溶液中，再加入3 mL的氨水溶液，机械搅拌并向体系内缓慢滴加1.2 mL TEOS，室温反应24小时。在体系内加入1.5 mL MPS，继续搅拌反应48小时。磁分离产物，用乙醇洗涤几遍。在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
（2）Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)的合成
取100mg Fe3O4 @ SiO2 - MPS于单口烧瓶，加入80mL乙腈超声分散3min，加入150mgNIPAM， 0.15mL GMA， 200mg交联剂MBA，10mg引发剂AIBN，油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器。将反应烧瓶从室温30分钟内加热到沸腾，再经过一个小时蒸馏得到40mL乙腈，停止反应。得到的产物用磁铁分离，并乙醇和水反复洗涤。而后放在真空干燥箱内干燥。
本发明中附图1是按实例1和实例3制得的Fe3O4（a）、Fe3O4 @ SiO2 - MPS（b）和Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM) （c）的红外图。由图中可得，596 cm-1和3432 cm-1是分别Fe - O 峰和磁性微球表面的- OH峰。1631 cm-1是磁性微球表面羧基峰。在磁性微球表面包覆二氧化硅后，可以看到3432 cm-1和1631 cm-1的峰值变弱了，796 cm-1，1087 cm-1和459 cm-1分别为Si - O - Si的振动吸收峰，反振动吸收峰和弯曲吸收峰。949 cm-1处吸收峰为Si - OH的弯曲振动峰。由此可得，二氧化硅被成功包覆在四氧化三铁磁性微球上。1400 cm-1和1632 cm-1为甲基特征吸收峰和乙烯基的伸缩振动峰。这两个峰来自于MPS，证明MPS也成功修饰在了磁性硅球上。由（c）得到1727 cm-1处吸收峰可能是来自于GMA的酯基，1386 cm-1是异丙基吸收峰，主要来自于NIPAM。3365 cm-1和1525 cm-1的吸收峰是N-H键伸缩振动和弯曲振动峰，1659 cm-1是酰胺基伸缩振动峰。
实施例4：Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)的合成
（1）Fe3O4 @ SiO2 - MPS的合成
0.3g的实施例1中产物Fe3O4分散于50 mL的体积比为4:1的乙醇和水混合溶液中，再加入1.5 mL的氨水溶液，机械搅拌并向体系内缓慢滴加0.8 mL TEOS，室温反应12小时。在体系内加入0.5 mL MPS，继续搅拌反应24小时。磁分离产物，用乙醇洗涤几遍。在50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
（2）Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)的合成
取50mg Fe3O4 @ SiO2 - MPS于单口烧瓶，加入40mL乙腈超声分散3min，加入150mgNIPAM，0.05mL GMA， 200mg交联剂MBA，8mg引发剂AIBN，油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器。将反应烧瓶从室温30分钟内加热到沸腾，再经过一个小时蒸馏得到20mL乙腈，停止反应。得到的产物用磁铁分离，并乙醇和水反复洗涤。而后放在真空干燥箱内干燥。
本发明中附图2是按实施例1和实施例4制得的Fe3O4（a）、Fe3O4 @ SiO2 - MPS（b）和Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM) （c）的TEM图。由图可以看出，通过改进水热法合成的四氧化三铁粒子是大小均匀约为250nm的表面粗糙的球形。加了二氧化硅层后，粒径变为280nm，磁性硅球呈现均匀的核壳结构。加入聚合物后，磁性复合微球的粒径增大到350nm左右，呈现核壳结构。
本发明中附图3是按实施例1和实施例4制得的Fe3O4（a）、Fe3O4 @ SiO2 - MPS（b）和Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM) （c）的VSM图。试验中测量了三种样品的饱和磁化强度(Ms)，Fe3O4（a）的饱和磁化强度是57 emu g-1，在引入二氧化硅层和聚合物p (GMA -co - NIPAM)层后，磁性微球的饱和磁化强度值分别变为32 和 8 emu g-1。此外，从附图3中的插图照片可以看出，Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)磁性复合微球的磁性足以使磁性微球在30秒内从溶液中完全分离。
实施例5：Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)固定化纤维素酶的制备
将1mL浓度为6 mg/mL的纤维素酶溶液与50mg本发明中实施例4制备的载体材料Fe3O4@ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)的混合调pH为3。在30℃的恒温震荡箱内震荡15分钟，用磁铁分离固定化后的磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未固定的纤维素酶。测定固定化酶的酶活。
实施例6：Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)固定化纤维素酶的制备
将1mL浓度为84mg/mL的纤维素酶溶液与100mg按照本发明中实施例4制备的载体材料Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)混合调pH为3。在80℃的恒温震荡箱内震荡2小时，用磁铁分离固定化后的磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未固定的纤维素酶。测定固定化酶的酶活。
实施例7：Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)固定化纤维素酶的制备
将1mL浓度为48 mg/mL的纤维素酶溶液与64mg按照本发明中实施例4制备的载体材料Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)混合, 调pH为4.6。在30℃的恒温震荡箱内震荡30分钟，用磁铁分离固定化后的磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未固定的纤维素酶。测定固定化酶的酶活。
本发明中附图4是按实施例7制得的Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM) 固定化纤维素酶和游离纤维素酶的温度稳定性图。将固定化纤维素酶和游离纤维素酶在30℃-80℃温育30分钟，然后测其保留酶活，得到固定化酶和游离纤维素酶的温度稳定性。从图中可以看出，随着温度的升高，固定化酶和游离酶的相对酶活力都有所降低，但游离酶降低的速度比固定化酶快。这是由于高温使酶蛋白变性失活所致。随之温度的升高，酶催化活性越低，以致60℃时，游离酶所剩酶活只有30%。而对于固定化酶，当温度为60℃时，保留酶活为80%左右。由此可知，通过固定化的纤维素酶的温度稳定性有了一定程度的提高。
本发明中附图5是按实施例7制得的Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM) 固定化纤维素酶的温度稳定性图。将固定化纤维素酶加入到底物溶液中，测定其活性，然后用缓冲溶液清洗固定化纤维素酶3次。然后将该固定化纤维素酶再次加入到新的底物溶液中，进行下一次催化反应，测定其活性，循环几次。在反应六次后，其酶活保留初始酶活的60%，当使用8次后，酶活仍然有20%。显示出很好的操作稳定性，而其中酶活下降的原因可能是因为固定化纤维素酶在每次进行催化反应后，经过缓冲溶液冲洗，冲掉了一部分纤维素酶。或者有可能催化结束后，催化产物葡萄糖被固定化纤维素酶带到下一次的催化反应中，抑制了反应。
附图6是按实施例7制得的Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM) 固定化纤维素酶的温度稳定性图。将固定化纤维素酶和纤维素酶放在80℃温度下5分钟，然后放在50℃或者4℃环境下恢复30分钟或1小时，测试其高温失活后的纤维素酶活。得到其酶活受热恢复能力。由图中可以看出，游离酶经过高温失活后，再放置到低温条件下，酶活只保留原来酶活的20%左右，而固定化酶（IC）在4度环境保存30分钟后酶活大约恢复到原来酶活的60%，60分钟后达到原来酶活的70%。在50度保存30分钟后酶活恢复到原来酶活的50%左右，60分钟后达到53%左右，相比较而言，固定化酶有高温失活后，降温使其酶活恢复的能力。这是因为载体材料上含有一种温敏性单体NIPAM，该单体可以在临界温度上下发生形态的转变，由此推断，正是因为这种单体在高温下的凝聚使得酶分子在高温下变形失活受到了限制，当温度恢复，NIPAM恢复原来的形态，而酶分子也没有因为高温下多肽聚集发生变形失活，从而保护了酶分子的结构稳定性，具有较强的酶活恢复能力。

Claims (10)

1.一种磁性复合微球，其特征在于，所述微球粒径为350nm，呈现核壳结构。
2.权利要求1所述一种磁性复合微球的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
（1）Fe3O4 @ SiO2 - MPS的合成：
将Fe3O4分散于乙醇和水混合溶液中，再加入氨水，机械搅拌并向体系内缓慢滴加正硅酸乙酯反应；然后再加入甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷，继续搅拌反应；磁分离产物，用乙醇洗涤几遍；在真空干燥箱内干燥至恒重得到Fe3O4 @ SiO2 - MPS；
（2）Fe3O4 @ SiO2 - p (GMA - co - NIPAM)的合成：
取Fe3O4 @ SiO2 - MPS于单口烧瓶，加入乙腈超声分散后，加入异丙基丙烯酰胺，甲基丙烯酸缩水甘油酯，交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，引发剂偶氮二异丁腈，油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器；再蒸馏得到部分乙腈，停止反应；得到的产物用磁铁分离，并乙醇和水反复洗涤；而后放在真空干燥箱内干燥。
3. 根据权利要求2所述的一种磁性复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的Fe3O4与乙醇和水混合溶液的用量比例为0.1 - 0.5 g：15 - 90 mL，其中乙醇和水的体积比为4:1。
4. 根据权利要求2所述的一种磁性复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的氨水与Fe3O4的比例为1 - 3 mL：0.1 - 0.5 g；
所述正硅酸乙酯（TEOS）的用量为0.5 - 1.2 mL；
所述加入正硅酸乙酯反应的条件为室温反应6-24小时。
5. 根据权利要求2所述的一种磁性复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述加入甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（MPS）0.3 - 1.5 mL；所述搅拌反应条件为搅拌反应12 - 48小时。
6. 根据权利要求2所述的一种磁性复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述Fe3O4 @ SiO2 – MPS与乙腈用量比例为50-100mg：40-80mL 。
7. 根据权利要求2所述的一种磁性复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述异丙基丙烯酰胺的用量为50 - 150mg；甲基丙烯酸缩水甘油酯的用量为0.05 - 0.15mL；交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的用量为100 - 200mg；引发剂偶氮二异丁腈的用量为4-10mg。
8.根据权利要求2所述的一种磁性复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述油浴加热烧瓶的条件为从室温30分钟内加热到沸腾，再蒸馏1小时。
9.根据权利要求2所述的一种磁性复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述再蒸馏得到部分乙腈为20-40mL。
10.权利要求1所述的磁性复合微球在纤维素酶的固定化中的应用。
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