CN101503729B - 消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于生物酶拆分消旋体的方法，尤其是指消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法。本发明采用的技术方案为：一种消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法，以乙酸乙烯酯为原料，在生物酶的作用下，在有机溶剂中反应制备R-(+)-1-苯基乙醇类化合物和S-(-)-1-苯基乙醇类化合物，其反应方程式为：
Description
技术领域
本发明涉及一种基于生物酶拆分消旋体的方法，尤其是指消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法。
背景技术
手性单体R-(+)-1-苯基乙醇类化合物和S-(-)-1-苯基乙醇类化合物一种重要的化工中间体和医药中间体，通常用于有机合成药物中间体。近年来在农业，制药业和香料生产中受到越来越多的关注。有很多关于拆分消旋体1-苯乙醇制备R-(+)-1-苯基乙醇类化合物和S-(-)-1-苯基乙醇类化合物的方法已经公开并申请了部分专利。专利PL194403利用芹菜(Apium graveolens)根部破碎组织在缓冲溶液中进行反应，得到了R-(+)-1-苯乙醇和29％的副产物苯乙酮，没有得到S-(-)-1-苯乙醇。专利WO2002072514使用Pd(OAc)2和金雀花碱作催化剂，得到了纯净的S-(-)-1-苯基乙醇手性体，收率为37％。但却没有得到R手性体。该方法使用重金属Pd和金雀花碱催化剂，不但对环境造成污染，而且生产的成本较高，不适合大规模的工业生产。专利WO2001090396使用酶和贵金属螯合试剂拆分消旋1-苯乙醇，得到了32％的S-(-)-1-苯乙醇和62％的R-乙酸苯乙酯。但是因为有贵金属催化剂的存在，加上收率不高，因此也不适合规模化生产。为此我们克隆了一批脂肪酶和酯酶，选用高选择性的酶，用酶拆分后，碱液处理生成的酯类化合物，得到了ee值很高的单体R-(+)-1-苯基乙醇类化合物和S-(-)-1-苯基乙醇类化合物。应用该方法可以大大降低成本，来满足社会对R-(+)-1-苯基乙醇类化合物或S-(-)-1-苯基乙醇类的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种以生物酶作为拆分剂、温和、收率高、环境友好、成本低的消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法。
本发明采用的技术方案为：一种消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法，以消旋1-苯基乙醇类化合物为原料在乙酸乙烯酯和生物酶的作用下，在有机溶剂中反应制备R-(+)-1-苯基乙醇类化合物和S-(-)-1-苯基乙醇类化合物，其反应方程式为：
其中，R为氢，p-CN，o-CN，或m-CN，所述消旋1-苯基乙醇类化合物为消旋1-苯乙醇或消旋4-(1-羟乙基)氰苯；所述生物酶为大肠杆菌K-12中b3825基因编码的酯酶XL9，b0349基因编码的酯酶XL6，b0494基因编码的酯酶XL13，b2154基因编码的酯酶XL19，b4377基因编码的酯酶XL14以及b3412基因编码的酯酶XL23中的一种或几种生物酶的混合。所述消旋1-苯基乙醇类化合物与乙酸乙烯酯的质量之比为1∶0.5～10，所述消旋1-苯基乙醇类化合物与生物酶的质量之比为1∶0.001～0.1；所述有机溶剂为二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、环己烷或硝基甲烷的任一种；所述消旋1-苯基乙醇类化合物与所述有机溶剂的体积比为1∶0～0.2，且有机溶剂的用量不为0。
更进一步的，所述的消旋1-苯基乙醇类化合物∶乙酸乙烯酯的质量之比为1∶1～1∶10，所述的消旋1-苯基乙醇类化合物∶生物酶的质量之比为1∶0.005～1∶0.01。
进一步的，所述反应的温度为15-60℃，所述反应的时间为5～72小时。
较为具体的，所述的消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法按如下步骤进行：
a.按照消旋1-苯基乙醇类化合物与乙酸乙烯酯的质量之比为1∶1～10，消旋1-苯基乙醇类化合物与生物酶的质量之比为1∶0.005～0.01，消旋1-苯基乙醇类化合物与有机溶剂的体积比为1∶0～0.2，且有机溶剂的用量不为0的投料比将消旋1-苯基乙醇类化合物，生物酶，乙酸乙烯酯和有机溶剂依次投入到反应器；
b.控制温度在20～60℃，进行反应，期间用TLC硅胶板或者气相色谱进行跟踪监测，直至反应基本完毕；
c.蒸去未反应的乙酸乙烯酯和有机溶剂，加入饱和的碳酸钠溶液调节pH＝9～10处理得到R-1-乙酸苯基乙酯类化合物和S-(-)-1-苯基乙醇类化合物；
d.将R-1-苯基乙醇类化合物的乙酸酯用NaOH溶液水解，反应完毕后调节pH＝8～9，后用乙酸乙酯萃取，蒸去有机溶剂得到R-(+)-1-苯基乙醇类化合物的乙酸酯。
其中TLC小板(还是硅胶板)跟踪监测反应的展开剂是乙酸乙酯∶石油醚(V∶V＝1∶5)的混合试剂，通过监测反应中新产生的点的浓度和剩下的点的浓度的基本一致来判断反应的终点，也可以气相监测反应进度，通过监测气相色谱中R-(+)-1-苯乙醇的基本消失来判断反应终点。
本发明以生物酶为拆分剂、反应温和、收率高、环境友好、成本较低，具有较大的实施价值和社会效益。
具体实施方式
以下具体实施例来说明本发明的技术方案，但保护的范围并不仅限于此。
具体的试剂来源如下：
1.1-苯乙醇，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，批号：09449。
2.乙酸乙烯酯，国药集团化学试剂有限公司，批号：80138628。
3.1，2-二氯乙烷，上海凌峰化学试剂有限公司，批号：080126。
4.二氯甲烷，浙江杭州双林化工试剂厂，批号：20080509。
5.环己烷，浙江杭州双林化工试剂厂，批号：20080619。
6.甲苯，上海人杰化工有限公司，批号：20071123。
7.二甲苯，上海高东化工实业有限公司，批号：20080421。
8.硝基甲烷，浙江杭州双林化工试剂厂，批号：20080511。
具体的生物酶来源如下：
1.脂肪酶AYS“天野”，大和化成株式会社。
2.大肠杆菌K-12中b3825基因编码的酯酶XL9，b3825基因序列：
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由浙江大学生物工程研究所于洪巍教授课题组制备。
3.大肠杆菌K-12中b0349基因编码的酯酶XL6，b0349基因序列：
ATGCAGGAGAAGATGATGAGTTATCAGCCACAAACCGAAGCCGCCACCAGCCGTTTTCTGAATGTAGAAGAAGCGGGTAAAACGCTGCGCATCCATTTTAATGACTGCGGACAAGGCGACGAAACCGTTGTCCTGCTGCATGGTTCCGGCCCGGGTGCTACTGGCTGGGCGAACTTCAGCCGCAATATCGATCCGCTGGTAGAGGCGGGCTATCGGGTGATCCTGCTGGATTGTCCGGGTTGGGGCAAGAGCGATTCGGTCGTTAATAGTGGTTCGCGATCGGATCTTAATGCACGAATCCTGAAAAGCGTGGTGGATCAACTGGATATCGCCAAAATCCACCTGCTGGGCAACTCGATGGGGGGCCATAGTTCTGTGGCGTTCACCCTTAAATGGCCGGAGCGCGTCGGCAAACTGGTGCTGATGGGCGGCGGTACGGGCGGCATGAGTTTGTTTACGCCGATGCCAACCGAAGGTATTAAGCGACTGAATCAGCTTTATCGTCAGCCGACTATCGAAAACCTGAAGCTGATGATGGATATCTTCGTTTTTGATACCAGCGATTTGACCGACGCCCTGTTTGAAGCGCGCCTGAATAATATGCTGTCGCGCCGCGATCACCTGGAAAACTTCGTTAAGAGCCTGGAAGCTAATCCGAAACAGTTCCCGGATTTTGGCCCACGTCTGGCGGAAATCAAAGCGCAAACCCTGATTGTCTGGGGGCGCAACGACCGCTTTGTGCCGATGGATGCGGGTCTGCGTCTGCTGTCCGGCATTGCCGGTTCTGAACTGCATATCTTCCGCGACTGTGGTCACTGGGCGCAGTGGGAACATGCCGACGCTTTCAATCAACTGGTGCTGAATTTCCTCGCACGCCCTTAA
由浙江大学生物工程研究所于洪巍教授课题组制备。
4.大肠杆菌K-12中b 2154基因编码的酯酶XL19，b2154基因序列：
ATGGAAATGCTCGAAGAGCACCGCTGTTTTGAAGGCTGGCAGCAACGCTGGCGACACGACTCCAGTACCTTAAACTGCCCGATGACGTTCAGTATCTTTCTCCCTCCACCTCGTGATCACACTCCGCCACCAGTGCTGTACTGGCTTTCCGGATTAACCTGCAATGACGAGAACTTCACCACCAAGGCGGGTGCCCAGCGGGTAGCGGCGGAACTGGGGATTGTACTGGTGATGCCAGACACCAGCCCGCGCGGCGAAAAGGTTGCCAACGACGATGGCTACGATTTAGGCCAGGGCGCAGGCTTTTATCTTAATGCCACGCAACCGCCGTGGGCGACGCATTACCGGATGTATGATTATCTGCGCGATGAATTACCGGCGCTGGTTCAGTCGCAATTTAATGTCAGCGACCGCTGCGCCATTAGCGGTCACTCAATGGGTGGTCACGGTGCGCTGATTATGGCGCTGAAAAATCCGGGTAAATACACCAGCGTTTCGGCCTTTGCGCCAATTGTGAATCCGTGCAGCGTCCCGTGGGGAATCAAAGCGTTTAGCAGCTATTTAGGTGAGGACAAAAATGCATGGCTGGAATGGGACAGTTGCGCACTGATGTATGCCAGTAACGCGCAGGATGCGATCCCGACGCTTATCGATCAGGGCGATAATGATCAGTTTCTTGCCGACCAGTTGCAACCTGCGGTACTGGCAGAAGCCGCGCGCCAGAAAGCGTGGCCGATGACGCTGCGTATTCAGCCGGGATATGATCACAGTTACTACTTCATCGCCTCTTTTATAGAGGATCACCTGCGCTTCCATGCGCAGTATTTACTGAAGTGA
由浙江大学生物工程研究所于洪巍教授课题组制备。
5.大肠杆菌K-12中b4377基因编码的酯酶XL14，b4377基因序列：
GTGGGGCAGCGAATACCTGTAACGCTTGGTAATATTGCGCCGTTGTCGCTAAGGCCGTTCCAGCCTGGACGAATAGCTCTGGTGTGCGAAGGCGGCGGACAGCGTGGAATTTTCACGGCTGGCGTGCTGGATGAGTTTATGCGCGCGCAGTTTAATCCTTTCGATCTTTATCTCGGCACATCTGCCGGGGCGCAGAACCTCTCGGCGTTTATCTGCAATCAGCCCGGTTACGCGCGCAAAGTCATCATGCGCTATACCACAAAACGCGAATTTTTCGATCCATTGCGCTTTGTCCGTGGAGGAAATCTTATCGATCTCGACTGGCTGGTGGAGGCCACTGCAAGCCAGATGCCGTTGCAAATGGATACCGCCGCGCGGTTGTTTGACAGCGGCAAATCGTTTTATATGTGCGCCTGTCGTCAGGATGACTACGCGCCGAATTACTTTTTACCAACCAAACAAAACTGGCTGGATGTGATTCGCGCCTCCAGTGCGATACCTGGCTTTTATCGTAGCGGAGTGTCGCTGGAAGGCATTAACTACCTGGATGGCGGGATCAGTGATGCGATTCCGGTTAAAGAGGCGGCAAGGCAGGGCGCTAAAACGTTGGTCGTCATTCGCACTGTGCCGTCACAAATGTACTACACGCCGCAGTGGTTCAAACGCATGGAACGCTGGCTGGGTGACAGTAGCCTGCAGCCGCTGGTCAATCTGGTGCAGCATCATGAAACCAGCTATCGTGACATTCAGCAATTTATTGAGAAACCACCGGGCAAGCTGCGGATATTCGAAATTTATCCGCCGAAGCCATTACATAGTATCGCGCTTGGCAGTCGGATTCCGGCGCTGCGTGAAGACTATAAACTTGGGCGTTTATGCGGTCGTTATTTCCTCGCCACGGTTGGCAAGCTATTAACTGAAAAAGCGCCGCTTACCCGCCATCTGGTGCCAGTGGTGACGCCGGAATCGATTGTCATTCCGCCTGCGCCAGTCGCCAACGATACGCTGGTTGCCGAAGTGAGCGACGCTCCGCAGGCGAACGACCCGACATTTAACAATGAGGATCTGGCTTGA
由浙江大学生物工程研究所于洪巍教授课题组制备。
6.大肠杆菌K-12中b0494基因编码的酯酶XL19，b0494基因序列：
ATGATGAACTTCAACAATGTTTTCCGCTGGCATTTGCCCTTCCTGTTCCTGGTCCTGTTAACCTTCCGTGCCGCCGCAGCGGACACGTTATTGATTCTGGGTGATAGCCTGAGCGCCGGGTATCGAATGTCTGCCAGCGCGGCCTGGCCTGCCTTGTTGAATGATAAGTGGCAGAGTAAAACGTCGGTAGTTAATGCCAGCATCAGCGGCGACACCTCGCAACAAGGACTGGCGCGCCTTCCGGCTCTGCTGAAACAGCATCAGCCGCGTTGGGTGCTGGTTGAACTGGGCGGCAATGACGGTTTGCGTGGTTTTCAGCCACAGCAAACCGAGCAAACGCTGCGCCAGATTTTGCAGGATGTCAAAGCCGCCAACGCTGAACCATTGTTAATGCAAATACGTCTGCCTGCAAACTATGGTCGCCGTTATAATGAAGCCTTTAGCGCCATTTACCCCAAACTCGCCAAAGAGTTTGATGTTCCGCTGCTGCCCTTTTTTATGGAAGAGGTCTACCTCAAGCCACAATGGATGCAGGATGACGGTATTCATCCCAACCGCGACGCCCAGCCGTTTATTGCCGACTGGATGGCGAAGCAGTTGCAGCCTTTAGTAAATCATGACTCATAA
由浙江大学生物工程研究所于洪巍教授课题组制备。
7.以及大肠杆菌K-12中b3412基因编码的酯酶XL23，b3412基因序列：
ATGAATAACATCTGGTGGCAGACCAAAGGTCAGGGGAATGTTCATCTTGTGCTGCTGCACGGATGGGGACTGAATGCCGAAGTGTGGCGTTGCATTGACGAGGAACTTAGCTCGCATTTTACGCTGCACCTTGTTGACCTGCCCGGCTTCGGGCGTAGCCGGGGATTTGGTGCGCTGTCACTTGCTGATATGGCCGAAGCCGTGCTGCAACAGGCACCTGATAAAGCCATTTGGTTAGGCTGGAGTCTGGGCGGGCTGGTGGCAAGCCAGATTGCGTTAACCCATCCCGAGCGTGTTCAGGCGCTGGTCACCGTGGCGTCGTCACCTTGTTTTAGTGCTCGTGACGAGTGGCCGGGGATAAAACCGGACGTGCTGGCGGGATTTCAGCAGCAACTCAGTGATGATTTTCAGCGTACAGTGGAGCGGTTCCTGGCGTTACAAACCATGGGGACTGAAACGGCGCGCCAGGATGCGCGGGCGTTGAAGAAAACCGTTCTGGCGTTACCGATGCCGGAGGTTGACGTGCTTAATGGCGGGCTGGAAATCCTGAAAACGGTCGATCTCCGTCAGCCGCTGCAAAACGTGTCCATGCCGTTTTTGCGATTGTATGGCTATCTCGACGGTCTGGTGCCGCGCAAAGTGGTGCCGATGCTGGATAAACTTTGGCCTCACAGCGAATCATATATCTTCGCCAAAGCGGCCCATGCGCCATTTATTTCGCATCCGGCCGAGTTTTGTCACCTGCTGGTGGCGTTGAAGCAGAGGGTGTAG
由浙江大学生物工程研究所于洪巍教授课题组制备。
实施例1
向反应器中依次投入消旋1-苯乙醇投料量为24.4(0.02mol)g，生物酶0.5g，乙酸乙烯酯51.6g(0.6mol)和溶剂环己烷50ml，所使用的酶为脂肪酶AYS“天野”。
将装有温度计，干燥管，和磁力搅拌的250ml的三口烧瓶内，加入1-苯乙醇24.4g(0.2mol)，乙酸乙烯酯8.6g(0.1mol)，环己烷50ml，生物酶0.5g，加入完毕，将温度固定在30℃，反应5小时，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应完毕后，蒸去有机溶剂和未反应的乙酸乙烯酯，分离残留液体，得到无色的R-1-苯乙醇乙酸酯液体和无色的S-(+)-1-苯乙醇液体。
将R-1-苯基乙醇乙酸酯用5mol/L的NaOH溶液水解，反应完毕，用2mol/L的盐酸调节pH＝6～7，乙酸乙酯萃取3次，每次30ml。取有机层，将有机层液体合并，蒸去溶剂即可得到R-(+)-1-苯乙醇，无色液体。
S-(-)-1-苯乙醇，收率17％，ee值96％；R-(+)-1-苯乙醇，收率29％，ee值98％。沸点87-89℃/10mm Hg，熔点8-11℃。
实施例2
向反应器依次投入消旋1-苯乙醇投料量为24.4g(0.2mol)，生物酶0.5g，乙酸乙烯酯86g(1mol)，所使用的酶为酯酶XL23。
加入完毕，将温度固定在30℃，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应时间为36小时。
其他操作同实施例1，得到无色的S-(-)-1-苯乙醇和R-(+)-1-苯乙醇。
S-(-)-1-苯乙醇，收率26％，ee值96％；R-(+)-1-苯乙醇，收率34％ee值98％。沸点87-89℃/10mm Hg，熔点8-11℃。
实施例3
向反应器依次投入消旋1-苯乙醇投料量为24.4g(0.2mol)，所使用的生物酶为0.5g，乙酸乙烯酯172g(2mol)，所使用的酶为酯酶XL23和酯酶XL6的混合，且二者的质量比为1∶3。
加入完毕，将温度固定在40℃，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应时间为72小时。
其他操作同实施例1，得到无色的S-(-)-1-苯乙醇和R-(+)-1-苯乙醇。
S-(-)-1-苯乙醇，收率46％，ee值98％；R-(+)-1-苯乙醇，收率49％，ee值99％。沸点87-89℃/10mm Hg，熔点8-11℃。
实施例4
向反应器依次投入消旋1-苯乙醇投料量为24.4g(0.2mol)，生物酶0.4g，乙酸乙烯酯51.6g(0.6mol)，所使用的酶为酯酶XL13。
加入完毕，将温度固定在60℃，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应时间为40小时。
其他操作同实施例1，得到无色的S-(-)-1-苯乙醇和R-(+)-1-苯乙醇。
S-(-)-1-苯乙醇，收率35％，ee值97％；R-(+)-1-苯乙醇，收率40.5％，ee值98％。沸点87-89℃/10mm Hg，熔点8-11℃。
实施例5
向反应器依次投入消旋1-苯乙醇投料量为24.4g(0.2mol)，生物酶的0.2g，乙酸乙烯酯51.6g(0.6mol)和溶剂1，2-二氯乙烷30ml，所使用的酶为酯酶XL9。
加入完毕，将温度固定在40℃，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应时间为48小时。
其他操作同实施例1，得到无色的S-(-)-1-苯乙醇和R-(+)-1-苯乙醇。
S-(-)-1-苯乙醇，收率19％，ee值97％；R-(+)-1-苯乙醇，收率32％，ee值98％。沸点87-89℃/10mm Hg，熔点8-11℃。
实施例6
向反应器依次投入消旋1-苯乙醇投料量为24.4g(0.2mol)，生物酶0.1g，乙酸乙烯酯51.6g(0.6mol)和二氯甲烷30ml，所使用的酶为酯酶XL9和脂肪酶AYS“天野”，二者质量之比为1∶1。
加入完毕，将温度固定在30℃，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应时间为48小时。
其他操作同实施例1，得到无色的S-(-)-1-苯乙醇和R-(+)-1-苯乙醇。
S-(-)-1-苯乙醇，收率8％，ee值97％；R-(+)-1-苯乙醇，收率17％，ee值97％。沸点87-89℃/10mm Hg，熔点8-11℃。
实施例7
向反应器依次投入消旋1-苯乙醇投料量为24.4g(0.2mol)，生物酶的0.3g，乙酸乙烯酯51.6g(0.6mol)和溶剂硝基甲烷20ml，所使用的酶酯酶XL19。
加入完毕，将温度固定在45℃，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应时间为72小时。
其他操作同实施例1，得到无色的S-(-)-1-苯乙醇和R-(+)-1-苯乙醇。
S-(-)-1-苯乙醇，收率19％，ee值97％；R-(+)-1-苯乙醇，收率23％，ee值98％。沸点87-89℃/10mm Hg，熔点8-11℃。
实施例8
向反应器依次投入消旋1-苯乙醇投料量为24.4g(0.2mol)，生物酶0.5g，乙酸乙烯酯51.6g(0.6mol)和溶剂环己烷50ml，所使用的酶为酯酶XL14。
加入完毕，将温度固定在45℃，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应时间为72小时。
其他操作同实施例1，得到无色的S-(-)-1-苯乙醇和R-(+)-1-苯乙醇。
S-(-)-1-苯乙醇，收率41％，ee值98％；R-(+)-1-苯乙醇，收率47％，ee值99％。沸点87-89℃/10mm Hg，熔点8-11℃。
实施例9
向反应器依次投入消旋1-苯乙醇投料量为24.4g(0.2mol)，生物酶0.5g，乙酸乙烯酯86g(1mol)，所使用的酶为酯酶XL19和酯酶XL6的混合酶，二者质量比为5∶1。
加入完毕，将温度固定在60℃，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应时间为60小时。
其他操作同实施例1，得到无色的S-(-)-1-苯乙醇和R-(+)-1-苯乙醇。
S-(-)-1-苯乙醇，收率43％，ee值99％；R-(+)-1-苯乙醇，收率46％，ee值99％。沸点87-89℃/10mm Hg，熔点8-11℃。
实施例10
向反应器依次投入消旋4-(1-羟乙基)氰苯投料量为29.3g(0.2mol)，生物酶0.5g，乙酸乙烯酯86g(1mol)，所使用的酶为酯酶XL19和酯酶XL23的混合酶，二者质量比为5∶1。
加入完毕，将温度固定在45℃，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应时间为60小时。
其他操作同实施例1，得到无色的(S)-4-(1-羟乙基)氰苯和(R)-4-(1-羟乙基)氰苯。
(S)-4-(1-羟乙基)氰苯，收率40％，ee值99％；(R)-4-(1-羟乙基)氰苯，收率46％，ee值99％。
实施例11
向反应器依次投入消旋4-(1-羟乙基)氰苯投料量为29.3g(0.2mol)，生物酶0.02g，乙酸乙烯酯86g(1mol)，所使用的酶为酯酶XL19和酯酶XL23的混合酶，二者质量比为5∶1。
加入完毕，将温度固定在45℃，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应时间为60小时。
其他操作同实施例1，得到无色的(S)-4-(1-羟乙基)氰苯和(R)-4-(1-羟乙基)氰苯。
(S)-4-(1-羟乙基)氰苯，收率19％，ee值97％；(R)-4-(1-羟乙基)氰苯，收率26％，ee值96％。
实施例12
向反应器依次投入消旋4-(1-羟乙基)氰苯投料量为29.3g(0.2mol)，生物酶2.2g，乙酸乙烯酯86g(1mol)，所使用的酶为酯酶XL13和酯酶XL23的混合酶，二者质量比为3∶1。
加入完毕，将温度固定在45℃，期间TLC小板监测或气相色谱监测，反应时间为40小时。
其他操作同实施例1，得到无色的(S)-4-(1-羟乙基)氰苯和(R)-4-(1-羟乙基)氰苯。
(S)-4-(1-羟乙基)氰苯，收率45％，ee值99％；(R)-4-(1-羟乙基)氰苯，收率48％，ee值99％。
序列表
<110>浙江大学
<120>消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法
<130>专利PL194403、WO2002072514、WO2001090396
<140>2008101626712
<141>2009-02-27
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1023
<212>DNA
<213>大肠杆菌K-12(Escherichia coli K-12)
<400>1
atgtttcagc agcaaaaaga ctgggaaaca agagaaaacg cgtttgctgc ttttaccatg 60
ggaccgctga ctgatttctg gcgtcagcgt gatgaagcag agtttactgg tgtggatgac 120
attccggtgc gctttgtccg ttttcgcgca cagcaccatg accgggtggt agtcatctgc 180
ccggggcgta ttgagagcta cgtaaaatat gcggaactgg cctatgacct gttccatttg 240
gggtttgatg tcttaatcat cgaccatcgc gggcagggac gttccggtcg cctgttagcc 300
gatccgcatc tcgggcatgt taatcgcttt aatgattatg ttgatgatct ggcggcattc 360
tggcagcagg aggttcagcc cggtccgtgg cgtaaacgct atatactggc acattcgatg 420
ggcggtgcga tctccacatt atttctgcaa cgccatccag gtgtatgtga cgccattgcg 480
ctaactgcgc caatgtttgg gatcgtgatt cgtatgccgt catttatggc acggcagatc 540
ctcaactggg ccgaagcgca tccacgtttc cgtgatggct atgcaatagg caccgggcgc 600
tggcgcgcgt tgccgtttgc tatcaacgta ctgacccaca gcagacagcg atatcgacgt 660
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taa 1023
<210>2
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<213>大肠杆菌K-12(Escherichia coli K-12)
<400>2
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aatgtagaag aagcgggtaa aacgctgcgc atccatttta atgactgcgg acaaggcgac 120
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cgcaatatcg atccgctggt agaggcgggc tatcgggtga tcctgctgga ttgtccgggt 240
tggggcaaga gcgattcggt cgttaatagt ggttcgcgat cggatcttaa tgcacgaatc 300
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gggggccata gttctgtggc gttcaccctt aaatggccgg agcgcgtcgg caaactggtg 420
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cagttcccgg attttggccc acgtctggcg gaaatcaaag cgcaaaccct gattgtctgg 720
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<210>3
<211>837
<212>DNA
<213>大肠杆菌K-12(Escherichia coliK-12)
<400>3
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attagcggtc actcaatggg tggtcacggt gcgctgatta tggcgctgaa aaatccgggt 480
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<212>DNA
<213>大肠杆菌K-12(Escherichia coli K-12)
<400>4
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cagcctggac gaatagctct ggtgtgcgaa ggcggcggac agcgtggaat tttcacggct 120
ggcgtgctgg atgagtttat gcgcgcgcag tttaatcctt tcgatcttta tctcggcaca 180
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<210>5
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<212>DNA
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627
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<211>771
<212>DNA
<213>大肠杆菌K-12(Escherichia coli K-12)
<400>6
atgaataaca tctggtggca gaccaaaggt caggggaatg ttcatcttgt gctgctgcac 60
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tggagtctgg gcgggctggt ggcaagccag attgcgttaa cccatcccga gcgtgttcag 300
gcgctggtca ccgtggcgtc gtcaccttgt tttagtgctc gtgacgagtg gccggggata 360
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gagcggttcc tggcgttaca aaccatgggg actgaaacgg cgcgccagga tgcgcgggcg 480
ttgaagaaaa ccgttctggc gttaccgatg ccggaggttg acgtgcttaa tggcgggctg 540
gaaatcctga aaacggtcga tctccgtcag ccgctgcaaa acgtgtccat gccgtttttg 600
cgattgtatg gctatctcga cggtctggtg ccgcgcaaag tggtgccgat gctggataaa 660
ctttggcctc acagcgaatc atatatcttc gccaaagcgg cccatgcgcc atttatttcg 720
catccggccg agttttgtca cctgctggtg gcgttgaagc agagggtgta g 771
Claims (5)
1.一种消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法，其特征在于：以消旋1-苯基乙醇类化合物为原料在乙酸乙烯酯和生物酶的作用下，在有机溶剂中反应制备R-(+)-1-苯基乙醇类化合物和S-(-)-1-苯基乙醇类化合物，其反应方程式为：
其中，R为氢，p-CN，o-CN，或m-CN，所述消旋1-苯基乙醇类化合物为消旋1-苯乙醇或消旋4-(1-羟乙基)氰苯；
所述生物酶为大肠杆菌K-12中b3825基因编码的酯酶XL9，b0349基因编码的酯酶XL6，b0494基因编码的酯酶XL13，b2154基因编码的酯酶XL19，b4377基因编码的酯酶XL14以及b3412基因编码的酯酶XL23中的一种或几种的混合；
所述消旋1-苯基乙醇类化合物与乙酸乙烯酯的质量之比为1∶0.5～10，所述消旋1-苯基乙醇类化合物与生物酶的质量之比为1∶0.001～0.1；
所述有机溶剂为二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、环己烷或硝基甲烷的任一种；
所述消旋1-苯基乙醇类化合物与所述有机溶剂的体积比为1∶0～0.2，且有机溶剂的用量不为0。
2.根据权利要求1所述的消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法，其特征在于：所述的消旋1-苯基乙醇类化合物∶乙酸乙烯酯的质量之比为1∶1～1∶10，所述的消旋1-苯基乙醇类化合物∶生物酶的质量之比为1∶0.005～1∶0.01。
3.根据权利要求1所述的消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法，其特征在于：所述反应的温度为15-60℃。
4.根据权利要求1所述的消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法，其特征在于：所述反应的时间为5～72小时。
5.根据权利要求1所述的消旋1-苯基乙醇类化合物的酶拆分方法，其特征在于：反应按照以下步骤进行：
a.按照消旋1-苯基乙醇类化合物与乙酸乙烯酯的质量之比为1∶1～10，消旋1-苯基乙醇类化合物与生物酶的质量之比为1∶0.005～0.01，消旋1-苯基乙醇类化合物与有机溶剂的体积比为1∶0～0.2，且有机溶剂的用量不为0的投料比将消旋1-苯基乙醇类化合物，生物酶，乙烯乙酸酯和有机溶剂依次投入到反应器；
b.控制温度在20～60℃，进行反应，期间用TLC硅胶板或者气相色谱进行跟踪监测，直至反应基本完毕；
c.蒸去未反应的乙烯乙酸酯和有机溶剂，加入饱和的碳酸钠溶液调节pH＝9～10处理得到R-1-乙酸苯基乙酯类化合物和S-(-)-1-苯基乙醇类化合物；
d.将R-1-苯基乙醇类化合物的乙酸酯用NaOH溶液水解，反应完毕后调节pH＝8～9，后用乙酸乙酯萃取，蒸去有机溶剂得到R-(+)-1-苯基乙醇类化合物的乙酸酯。
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