CN105543191B

CN105543191B - 一种酯酶phe21及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN105543191B
Application number: CN201610101568.1A
Authority: CN
Inventors: 胡云峰; 王依龙; 张云
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2016-02-24
Filing date: 2016-02-24
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2036-02-24
Also published as: CN105543191A

Abstract

本发明公开了一种酯酶PHE21及其编码基因和应用。本发明从海洋假单胞菌(Pseudomonadaceae oryzihabitans)HUP022中克隆到了一个酯酶基因PHE21，全长为966bp，其编码的酯酶PHE21共包含321个氨基酸。酯酶PHE21对多种金属离子、有机溶剂和表面活性剂有很好的耐受性；同时酯酶PHE21可用于制备(S)‑3‑羟基丁酸乙酯，利用重组表达的酯酶PHE21作为催化剂，制备得到了光学纯度大于99％的(S)‑3‑羟基丁酸乙酯(转化率65.15％)。酯酶PHE21具有反应专一性强、催化效率高的优点，在生物医药和精细化工领域具有非常大的应用前景。

Description

一种酯酶PHE21及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种酯酶PHE21及其编码基因和应用。

背景技术

手性化合物是一类由相同原子组成，立体结构互为镜像的一类化合物，在生物学和药学性质上具有较大的差异。如巴比妥酸盐S-(-)异构体具有抑制神经活动的作用，而R-(+)异构体却具有兴奋作用；苯并吗啡烷的2个对映体都有镇痛作用，但(-)的异构体服用后会成瘾，而(+)的异构体则不会；R型的“反应停”是孕妇用镇痛药和止痛药，而S型的“反应停”对胎儿则有致畸作用；右旋甲状腺素钠可作为降血脂药物应用，但左旋体对心脏具有严重的副作用；抗菌药氧氟沙星的右旋体能损害肝、肾功能，但左旋的氧氟沙星药效很高，且毒性极小，其在各国上市后，深受人们的欢迎。

手性化合物的合成主要有：(1)化学法，即利用对映体的物理和化学性质的差异进行分离。通常有盐析法、包结法以及组合拆分。其缺点是要求对映体之间的性质差异要大，适用的化合物不多。(2)色谱拆分，这种方法是利用填料对手性对映体吸附性质的差异来实现，其缺点是设备昂贵，普及性较差。(3)合成法，通过设计反应来进行手性化合物的化学合成。这种方法缺点在于反应过程通常比较剧烈，耗费能量，而且反应中使用大量有毒的有机溶剂。

酯酶(Esterase，EC 3.1.1.X)，是一种催化酯键水解和合成的酶的总称。水解时，其催化酯键产生甘油和脂肪酸；合成时，可将酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，产物为酯类及其他香味物质。其来源非常广泛，微生物、植物和动物中都有存在。酯酶作为生物催化剂多数可作用非天然底物，而且可拆分的底物多，立体选择性高，不需要辅助因子，是一种重要的手性催化剂。

光学纯3-羟基丁酸乙酯(EHB)是精细化工中制备多种手性产品的关键中间体，应用十分广泛。其中，(S)-(EHB)是薰衣草醇、食菌甲诱醇、核球壳菌、格哈菌素、卡包霉素和灰绿霉素前体等天然产物的手性源；(R)-(EHB)则是合成手性药物的重要中间体，如β-内酰胺酶抑制剂，L-肉碱、亚胺培南等碳青霉烯类抗生素等。但由于生产技术和生产成本方面的原因，在我国绝大多数的合成药物仍然还是以外消旋体形式出现的。

生物酶具有立体位点区域和底物的高度专一性，利用酶促反应催化具有反应条件温和、位点选择性强、副反应少、光学纯度高以及环境污染小等优点，因此开发具有光学选择性的酯酶具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术中脂肪酶价格昂贵、生产技术受到制约的不足，提供一种新的酯酶PHE21及其编码基因和应用。

本发明从一株海洋假单胞菌(Pseudomonadaceae oryzihabitans)HUP022中开发了一种新的酯酶PHE21及其编码基因PHE21，构建了含有PHE21的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得酯酶PHE21，其可应用于催化酯类反应和制备(S)-3-羟基丁酸乙酯。

本发明的第一个目的是提供一种酯酶PHE21，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的酯酶PHE21的酯酶基因PHE21。

优选，所述的酯酶基因PHE21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种含有所述的酯酶基因PHE21的重组表达载体。所述的表达载体，优选为pET28a(+)载体。

本发明还提供一种含有所述的酯酶基因PHE21的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第三个目的是提供所述的酯酶PHE21在催化酯类水解、酯化或转酯化反应中的应用。

优选，所述的酯酶PHE21在催化拆分(±)-3-羟基丁酸乙酯反应得到(S)-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述的酯酶PHE21在耐受钠盐、Co²⁺、K⁺、Zn²⁺、正戊醇和/或Triton-X100环境下进行催化的应用。

本发明的酯酶基因PHE21来自深海样品中筛选得到的一株海洋假单胞菌(Pseudomonadaceae oryzihabitans)HUP022，保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。本发明用生物信息学分析的方法，从基因组测序的假单胞菌(Pseudomonadaceaeoryzihabitans)HUP022中筛选得到酯酶基因PHE21，全长为966bp(从起始密码子到终止密码子)，编码321个氨基酸。通过克隆编码酯酶PHE21的酯酶基因PHE21并将其连接表达载体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的酯酶PHE21。酯酶PHE21可用于制备(S)-3-羟基丁酸乙酯，利用重组表达的酯酶PHE21作为催化剂，制备得到了光学纯度大于99％的(S)-3-羟基丁酸乙酯。酯酶PHE21在生物化工和生物医药等领域具有非常大的应用价值。

附图说明

图1是不同侧链长度的对硝基苯酚酯对酯酶PHE21酶活的影响。

图2是酯酶PHE21的最适pH及pH稳定性。其中，A为最适pH曲线图，B为pH稳定性曲线图。

图3是酯酶PHE21的最适反应温度和温度稳定性。其中，A为最适反应温度曲线图，B为温度稳定性曲线图。

图4是不同浓度NaCl对酯酶PHE21酶活性影响。

图5是酯酶PHE21拆分(±)-3-羟基丁酸乙酯反应GC图。A为样品(±)-3-羟基丁酸乙酯气相图，B为酯酶PHE21拆分(±)-3-羟基丁酸乙酯反应1.5h后的气相图，其中S代表(S)-3-羟基丁酸乙酯，R代表(R)-3-羟基丁酸乙酯。

图6是酯酶PHE21的蛋白表达纯化情况。其中，M为蛋白Marker，1为未经IPTG诱导的含有pET-28a(+)-PHE21的大肠杆菌BL21(DE3)，2为经IPTG诱导的含有pET-28a(+)-PHE21的大肠杆菌BL21(DE3)，3为镍柱穿透液，4为Ni柱纯化后得到的酯酶PHE21，5为经过脱盐柱后的酯酶PHE21。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

本发明的酯酶基因PHE21来自深海样品中筛选得到的一株海洋假单胞菌(Pseudomonadaceae oryzihabitans)HUP022，该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。

实施例1：酯酶基因PHE21引物设计及开放阅读框边界确定

提取假单胞菌(Pseudomonadaceae oryzihabitans)HUP022的基因组DNA，经测序验证无误后，利用生物信息学手段对基因组进行注释，分析其中的酯酶基因，确定了其中酯酶基因PHE21的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长为966bp(从起始密码子到终止密码子)，其编码的酯酶PHE21的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共321个氨基酸。根据分析得到的酯酶基因PHE21序列，设计引物如下：正向引物：5′-CACGAATTCATGCCCGACGTCTTCGCGCG-3′，下划线部分为EcoRI酶切位点；反向引物：5′-CCGCTCGAGTTAGGCGGCCTGCTGCAGATGC-3′，下划线部分为Xho I酶切位点。

实施例2：酯酶基因PHE21的克隆及载体构建

2.1PCR扩增

将实施例1设计的引物(正向引物：5′-CACGAATTCATGCCCGACGTCTTCGCGCG-3′，反向引物：5′-CCGCTCGAGTTAGGCGGCCTGCTGCAGATGC-3′)送至上海生物工程有限公司合成引物，合成的引物使用TE稀释到10μM，提取假单胞菌(Pseudomonadaceae oryzihabitans)HUP022的总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：

表1PCR反应体系

使用以下PCR扩增程序扩增酯酶基因PHE21：a.94℃变性3min；b.94℃变性30s，55～65℃退火0.5min，72℃延伸1min，进行30个循环；c.72℃延伸10min，冷却到10℃。

将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察。回收966bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20μL无菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。

2.2酶切

将纯化回收的PCR产物使用以下体系进行双酶切，酶切时间1h。酶切体系为：EcoRI2μL，XhoI2μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至30μL。酶切后纯化回收得到经过双酶切的PCR产物。

质粒pET-28a(+)的双酶切：挑取含有质粒pET-28a(+)的大肠杆菌DH5α单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用EcoRI和XhoI按以下体系双酶切，酶切时间1h。酶切体系为：EcoRI 2μL，XhoI2μL，质粒DNA<1μg，灭菌的双蒸水加至20μL。酶切后纯化回收得到经过双酶切的pET-28a(+)载体。

上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen，Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)，质粒提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。

2.3连接

将经过双酶切的PCR产物和pET-28a(+)载体按照3∶1的摩尔比例进行连接。连接使用的T4连接酶购自北京全式金生物技术有限公司，连接使用的酶量为5U/5μL连接体系，连接温度为25℃，连接时间30min。由此得到连接产物。

2.4转化及筛选

取5μL连接产物于50μL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，后于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm转速下，孵育培养1h。取一定量的菌液涂布于含100μL/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mL LB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。

2.5基因核苷酸序列测定

将筛选的正确阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与酯酶基因PHE21核苷酸序列进行比对，确认是将酯酶基因PHE21(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)插入到pET-28a(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有酯酶基因PHE21的pET-28a(+)质粒(命名为pET-28a(+)-PHE21)，可用于进行下一步试验。

实施例3：酯酶基因PHE21在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达

3.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制备

1、将少量大肠杆菌BL21(DE3)菌种接入5mL LB试管液中，37℃过夜摇培，250rpm；

2、按1％体积比的接种量将过夜摇培后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种到300mlLB摇瓶中，37℃摇培3-4h(≥300rpm)，得到原培养物；

3、将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至0℃，将原培养物分装至冰预冷的离心管(50mL)，冰置数分钟；

4、4℃，4000rpm离心10min回收细胞，去上清；

5、用冰预冷的10mL 0.1M的CaCl₂重悬细胞，4℃，4000rpm离心10min回收细胞；

6、重复5，用10mL 0.1M的CaCl₂重悬细胞，冰浴1h以上；

7、4℃，4000rpm离心10min回收细胞；

8、每50mL原培养物得到的回收细胞用2mL含体积分数15％DMSO的0.1MCaCl₂来重悬，分装于1.5mL离心管，100μL每管，-80℃保藏。由此得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

3.2转化

取实施例2中得到的pET-28a(+)-PHE21质粒0.5～1μL与50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，于42℃水浴锅热激45s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm培养1h。培养物离心后涂布50μL/mL的卡那霉素LB平板，培养15h后挑选单菌。由此得到含有pET-28a(+)-PHE21的大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例4：酯酶PHE21的表达和纯化

4.1蛋白诱导

含有pET-28a(+)-PHE21的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中37℃培养至OD600为0.5左右，加IPTG至终浓度0.2mM，20℃培养16个小时。300mL菌液4000rpm，4℃离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体2次，4000rpm，10min收集菌体。用30mL(50mM，pH 7.4)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声400w，超5s，停5s，破碎10min，4℃，10000rmp离心10min，收集上清。上清于-80℃冷冻过夜，冷冻干燥制备成粗酶粉。

4.2酯酶PHE21的纯化

用镍离子亲和层析柱对步骤4.1中收集的上清进行纯化得纯化的酯酶PHE21(图6)，纯化的蛋白大小约37kD，符合理论预期。具体实施方案如下：使用10mM的咪唑洗脱5个柱体积，30mM咪唑洗脱30个柱体积，最后使用100～1000mM咪唑洗脱5个柱体积，收集中间3.5mL。用脱盐柱SephadexG25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。

4.3酯酶PHE21酶活测定

酯酶PHE21活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①配制10mM的对硝基苯酚酯；②在1mL反应体系中加入940μL Na₂HPO₄/NaH₂PO₄buffer(50mM，pH 8.0)，40μL乙醇，10μL浓度为0.40～0.86mg/mL酯酶PHE21纯酶液；③于35℃下，3～5min后，410nm测定吸光度。

酶活单位定义：1min内水解对硝基苯酚酯，释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活单位。

实施例5：酯酶PHE21的酶学性质

5.1水解不同长度的对硝基苯酚酯

按照4.3的测定条件，比较酯酶PHE21作用不同长度的对硝基苯酚酯，结果如图1，说明酯酶PHE21对长链对硝基苯酚酯特异性差，而对于短链对硝基苯酚酯的作用效果较好，最佳的底物是C4，即对硝基苯酚丁酸酯。

5.2最适pH和pH稳定性

配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表2所示，其浓度均为50mM：

表2不同缓冲体系的pH

将4.3中测定条件所述的缓冲液(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄buffer)按照表2中的缓冲溶液分别进行替换，以对硝基苯酚丁酸酯为底物，测定不同pH的缓冲溶液对酯酶PHE21的酶活力的影响，结果说明酯酶PHE21酶活在Na₂HPO₄/NaH₂PO₄pH为8.0时活性最高(图2A)，pH高于8.0、小于7.0活性都会急剧下降。

重组酯酶PHE21在不同的缓冲液中分别处理0h、1h、6h、12h，按4.3中测定条件(以对硝基苯酚丁酸酯作为底物)测定酯酶酶活，结果说明酯酶PHE21可以长时间在不同的pH条件下保持较高酶活，其对pH的耐受性较强，在pH为8.0缓冲液中稳定性最高(图2B)。

5.3最适温度和温度稳定性

在pH8.0，50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄作为缓冲溶液，按4.3中的反应混合液(以对硝基苯酚丁酸酯作为底物)置于不同的温度(25～85℃)下处理1h后，加入等量的酯酶PHE21，在各自的温度下反应1～5min，405nm测定酶活。结果说明，酯酶PHE21最适反应温度在65℃(图3A)。

将酯酶PHE21在25～85℃经不同时间预处理，于65℃，pH8.0，50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄的缓冲溶液中，按4.3测定方法(以对硝基苯酚丁酸酯作为底物)测定酯酶PHE21酶活。结果说明，酯酶PHE21在25℃-35℃的稳定性最好，随着温度升高，稳定性逐渐降低，55℃处理20min后酶活基本为0(图3B)。

5.4NaCl浓度对酯酶PHE21酶活性的影响

将酯酶PHE21加入到含有不同浓度NaCl，pH8.0，50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄的缓冲溶液中，按4.3测定方法(以对硝基苯酚丁酸酯作为底物)在各自的温度下反应1～5min，405nm测定酶活。结果说明，酯酶PHE21在0.1M的NaCl溶液反应酶活残余122.62％，当浓度升到0.2M时酶活残余113.12％，在NaCl浓度为1M时，酯酶PHE21酶活力残余仍大于90％。说明酯酶PHE21是耐钠盐的酯酶(图4)。

5.5金属离子抑制

以50mM pH8.0的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄为溶剂配制不同金属离子溶液，每种金属离子浓度均为1mM，将酯酶PHE21酶液在各种金属离子溶液中4℃下处理12h；以不加金属离子的50mM、pH8.0的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄溶液为对照(Control)。再按照4.3中的测定方法(以对硝基苯酚丁酸酯作为底物)测定酶活，结果见表3，Co²⁺、K⁺、Zn²⁺对酯酶PHE21酶活有促进作用，其它金属离子对酯酶PHE21活性均没有明显影响。

表3金属离子对酯酶PHE21酶活力的影响

5.6有机溶剂和表面活性剂对酯酶PHE21酶活性的影响

将酯酶PHE21加入到表4中的有机溶剂和表面活性剂溶液中处理12h(对照为蒸馏水，其他溶液的浓度为体积分数)，然后按照4.3的测定方法(以对硝基苯酚丁酸酯作为底物)测定酶活。结果表明正戊醇、Triton-X100能极大地促进酯酶PHE21酶活，最高达到144.98±5.02，SDS抑制酯酶PHE21的活性。

表4有机溶剂、变性剂和抑制剂对酯酶PHE21酶活性的影响

实施例6：酯酶PHE21在拆分(±)-3-羟基丁酸乙酯中的应用

本法采用在水相中拆分(±)-3-羟基丁酸乙酯。

1)在优化的条件下，即在0.5ml 50mM PH8.0的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液中，加入60μL 0.388mg/mL的酯酶PHE21纯酶液，0.01％(v/v)的Triton X-100，于40℃，200rpm条件下，拆分100mM的(±)-3-羟基丁酸乙酯，在1.5h内可得到大于99％光学纯度的(S)-3-羟基丁酸乙酯，转化率为65.15％(图5)。

具体分析条件为：采用福立气相色谱仪，配有手性柱(30m×0.25mm Cyclosil Bchirl column)和氢离子火焰检测器。仪器分析条件设置为：注射器温度220℃，检测器温度250℃，载气为N2，流速1.2mL/min，采用梯度升温进行分析：80℃保持1min，15℃/min，120℃保持1min，10℃/min到220℃，保持1min。

Claims

1.酯酶PHE21在催化拆分(±)-3-羟基丁酸乙酯反应得到(S)-3-羟基丁酸乙酯中的应用，所述的酯酶PHE21的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，为所述的酯酶PHE21在耐受钠盐、Co²⁺、K⁺、Zn²⁺、正戊醇和/或Triton-X100环境下进行催化的应用。