CN113278604A - 固定化脂肪酶催化酯水解拆分2-苯基丁酸对映体的方法 - Google Patents

固定化脂肪酶催化酯水解拆分2-苯基丁酸对映体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物催化技术领域，公开了一种固定化脂肪酶催化酯水解拆分2‑苯基丁酸对映体的方法，利用共价连接法将利用大分子修饰剂修饰后的南极假丝假丝酵母脂肪酶(CAL‑A)与载体UiO‑66结合，制备新型的固定化酶，以立体选择性催化2‑苯基丁酸酯水解反应得到(S)‑2‑苯基丁酸和(R)‑2‑苯基丁酸酯。与游离酶相比，固定化酶在相同条件下显著提高了酶的催化活性，具备更高的立体选择性，此外，固定化酶具有高的热稳定性，对pH耐受度，便于循环使用，容易与产物分离，显著降低了技术成本，而且操作简便，绿色环保。

Description

固定化脂肪酶催化酯水解拆分2-苯基丁酸对映体的方法
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，通过水溶性酶分子修饰剂聚乙二醇(PEG)对南极假丝酵母脂肪酶A(CAL-A)进行酶分子修饰后，利用金属有机框架化合物(MOFs)UIO-66固定CAL-A酶，应用于立体选择性催化酯水解拆分2-苯基丁酸对映体。
背景技术
2-苯基丁酸(2-PBA)是一类应用广泛的医药中间体，可用于合成抗血栓药物吲哚布芬。酶的立体选择性催化反应可直接将化学合成的外消旋体转化成单一对映体。而且酶作为一种天然的高分子催化剂，具有立体选择性高、反应条件温和、无污染等诸多优点，使其在食品、医药、精细化工等工业领域有着极为广阔的应用前景。但游离酶从反应体系中分离难度大，难以循环利用等缺点增加了其作为催化剂的成本；游离酶使用过程中容易变性，并且对温度、pH等反应条件要求较为苛刻，上述不足使游离酶难以在工业中得到更为广泛的应用。因此，固定化酶的概念和技术得以提出和发展。
酶的固定化，即通过化学或物理的处理方法使原来水溶性的酶与固态的水不溶性载体相结合或被载体包埋。载体材料的结构和性能对固定化酶的性能有着巨大的影响，近年来，常用载体按组成可分为高分子载体、无机载体、复合载体以及新型载体等。高分子材料具有使用寿命较短，传质性能较差等不足；无机载体具有稳定性好，成本低，寿命长等优点，但使用无机材料制备的固定化酶的负载率一般而言较低。相较于上述固定化材料，金属有机框架化合物(MOFs)作为一类新型固定化载体日益受到重视。MOFs是一类由金属离子为节点，多齿有机配体作为连接体合成的多孔晶体材料。MOFs结构可针对具体的应用进行设计和调节，具有高比表面积、孔体积、易调节的孔道尺寸，以及良好的热稳定性且合成条件较温和等优点。因此MOFs固定化酶已经成为当前的热点研究方向。常采用的固定化方法主要分为表面吸附、共价连接、孔内包埋以及共沉淀法等。
现有技术中，关于2-苯基丁酸对映体的制备，已经公开了应用酶催化水解外消旋2-苯基丁酸酯，以制备2-苯基丁酸对映体的相关技术。如公开号为CN108546720A的专利中，公开了一种立体选择性酶催化水解制备(S)-2-苯基丁酸的方法，其利用脂肪酶高效选择性催化水解外消旋2-苯基丁酸酯，制备(S)-2-苯基丁酸，并在反应体系中加入了环糊精，提高了底物转化率。但由于其采用的是游离酶，仍然存在游离酶从反应体系中分离难度大、难以循环利用等缺点，增加了催化剂的成本。在2-苯基丁酸对映体的制备时，如何在保证酶的催化性能的基础上，将酶固定化，以降低酶从反应体系中分离的难度以及提高酶的循环使用性能，是亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过共价连接法将聚乙二醇(PEG)修饰过的CAL-A固定于MOFs材料UIO-66表面的方法，并将固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66应用于立体选择性催化酯水解拆分2-苯基丁酸对映体，通过固定化，可以实现与反应体系迅速分离，具有较高的热稳定性，以及对pH的耐受度，并提高了酶的循环使用性能，显著降低了技术成本。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种固定化脂肪酶催化酯水解拆分2-苯基丁酸对映体的方法，是将CAL-A以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的EDC/NHS共价连接法固定于UIO-66材料上制备固定化脂肪酶，再通过固定化脂肪酶立体选择性催化2-苯基丁酸酯水解反应，以磷酸缓冲溶液为反应介质，得到(S)-2-苯基丁酸和(R)-2-苯基丁酸酯。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用酶的立体选择性催化拆分2-苯基丁酸对映体，具有绿色、高效、反应条件温和等优点；制备固定化酶作为催化剂，可强化酶的稳定性和操作范围，降低条件控制的苛刻程度，使该技术工业应用更便利，也能很好地解决酶的回收和循环利用问题，降低催化剂使用成本。本方法实施操作简便，绿色环保，产物和酶易于分离，酶催化剂的重复使用性能好。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
本发明将聚乙二醇(PEG)修饰过的南极假丝酵母脂肪酶A(CAL-A)，以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的EDC/NHS共价连接法固定于金属有机框架化合物(MOFs)UIO-66材料上制备固定化脂肪酶PEG-CAL-A@UiO-66，再通过固定化脂肪酶立体选择性催化2-苯基丁酸酯水解反应，以磷酸缓冲溶液为反应介质，得到(S)-2-苯基丁酸和(R)-2-苯基丁酸酯。
本发明实施例中PEG-CAL-A@UiO-66的典型合成步骤如下：将4mL CAL-A溶液、1mLPEG 400溶液和1mL PBS溶液(50mmol/L，pH＝6.60)混合后，在4℃摇床搅拌3h。将150mg的UiO-66和50mg EDC加入到10mL PBS溶液中(50mmol·L-1，pH＝7.50)，室温搅拌1h后，在混合溶液中加入50mg NHS，室温下继续搅拌1.5h。最后，将含有活化UiO-66的溶液与PEG修饰的酶溶液混合，在室温下搅拌24h。收集样品并用PBS溶液洗3次后冷冻干燥过夜，得到产品即为PEG-CAL-A@UiO-66。
产物的光学纯度和底物转化率采用美国Waters 1525高效液相色谱仪分析，Inertsil ODS-3色谱柱(150×4.6mm i.d.，5μm)，柱温保持在35℃。流动相由比例为64:36(v/v)含25mmol/L HP-β-CD的0.5％乙酸缓冲溶液(pH＝4.0)和甲醇组成；流动相的流速为0.8mL/min；检测波长为225nm。
实施例1
将0.005mmol外消旋2-苯基丁酸己酯和70mg固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66加入到10mL反应管中，并加入2mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.50，0.1mmoL/L)作为反应液，在转速500rpm、75℃下加热反应24h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对产率和产物对映体过剩量进行分析。分析结果表明：(S)-2-苯基丁酸的产率为74.02％，对映体过剩量为96.72％。
实施例2
将0.005mmol外消旋2-苯基丁酸己酯和70mg固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66加入到10mL反应管中，并加入2mL磷酸缓冲溶液(pH＝5.50，0.1mmoL/L)作为反应液，在转速500rpm、75℃下加热反应24h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对产率和产物对映体过剩量进行分析。分析结果表明：(S)-2-苯基丁酸的产率仍保持在69.10％，对映体过剩量为94.36％。
实施例3
将0.005mmol外消旋2-苯基丁酸己酯和70mg固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66加入到10mL反应管中，并加入2mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.50，0.1mmoL/L)作为反应液，在转速500rpm、55℃下加热反应24h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对产率和产物对映体过剩量进行分析。分析结果表明：(S)-2-苯基丁酸的产率仍保持在72.13％，对映体过剩量为97.07％。
实施例4
将0.010mmol外消旋2-苯基丁酸己酯和70mg固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66加入到10mL反应管中，并加入2mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.50，0.1mmoL/L)作为反应液，在转速500rpm、75℃下加热反应24h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对产率和产物对映体过剩量进行分析。分析结果表明：(S)-2-苯基丁酸的产率为64.00％，对映体过剩量为97.57％。
实施例5
将0.005mmol外消旋2-苯基丁酸己酯和70mg固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66加入到10mL反应管中，并加入2mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.50，0.1mmoL/L)作为反应液，在转速500rpm、75℃下加热反应24h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对产率和产物对映体过剩量进行分析。再将反应体系固液分离，固体部分冷冻干燥后回收固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66，再在相同条件下进行催化反应。分析结果表明：反应重复三次后，(S)-2-苯基丁酸的产率为67.19％，对映体过剩量为97.58％；反应重复五次后，(S)-2-苯基丁酸的产率为34.91％，对映体过剩量为97.55％。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于，将70mg固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66替换为58mg游离脂肪酶；在同等条件下，以游离脂肪酶为催化剂的反应中，(S)-2-苯基丁酸的产率仅为54.99％，对映体过剩量为87.77％。
对比例2
与实施例2相比，区别仅在于，将70mg固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66替换为58mg游离脂肪酶；在同等条件下，以游离脂肪酶为催化剂的反应中，(S)-2-苯基丁酸的产率仅为51.09％，对映体过剩量为75.67％。
对比例3
与实施例3相比，区别仅在于，将70mg固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66替换为58mg游离脂肪酶；在同等条件下，以游离脂肪酶为催化剂的反应中，(S)-2-苯基丁酸的产率仅为48.76％，对映体过剩量为78.74％。
对比例4
与实施例4相比，区别仅在于，所述外消旋2-苯基丁酸己酯的加入量为0.015mmol；在同等条件下，(S)-2-苯基丁酸的产率仅为51.69％，对映体过剩量为97.81％。
对比例5
与实施例4相比，区别仅在于，所述外消旋2-苯基丁酸己酯的加入量为0.020mmol；在同等条件下，(S)-2-苯基丁酸的产率仅为45.81％，对映体过剩量为97.91％。
对比例6
与实施例4相比，区别仅在于，所述外消旋2-苯基丁酸己酯的加入量为0.025mmol；在同等条件下，(S)-2-苯基丁酸的产率仅为38.83％，对映体过剩量为98.53％。
本发明利用共价连接法，通过酶与载体形成共价键而实现固定化，并将固定化酶应用于催化酯的水解反应。
本发明EDC/NHS共价连接法中，EDC和NHS只是促发MOF载体材料的羧基和脂肪酶分子中的氨基形成酰胺键，而本身并没有成为固定化酶中的一部分。因此，通过此方法固定化酶，不仅结合力较强，而且能够有效的保护酶的催化结构，固定化过程绿色高效。
本发明利用水溶性大分子修饰剂聚乙二醇(PEG)进行酶分子修饰，能够有效保护酶的催化构象，经过修饰后再进行酶的固定化。
本发明以MOFs作为固定载体，而MOFs作为非常有潜力的一类酶固定化载体，其具有丰富多样的可设计和调节的结构，不仅具有高比表面积和孔体积，而且制备条件温和，能较好地保持酶的活性和选择性。
与游离酶对比，此固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66不仅可以实现与反应体系迅速分离，而且具有较高的热稳定性，以及对pH的耐受度。更重要的是，该技术提高了酶的循环使用性能，显著降低了技术成本，具有操作简便，污染少等优点，符合绿色化学理念。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种固定化脂肪酶催化酯水解拆分2-苯基丁酸对映体的方法，其特征在于，所述的方法是以共价连接法制备固定化脂肪酶，再通过固定化脂肪酶立体选择性催化2-苯基丁酸酯水解反应得到(S)-2-苯基丁酸和(R)-2-苯基丁酸酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的共价连接法制备固定化脂肪酶，是以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的共价连接法制备固定化脂肪酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括预先采用聚乙二醇对脂肪酶进行酶分子修饰。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，固定化脂肪酶的制备步骤：将南极假丝酵母脂肪酶溶液、聚乙二醇和磷酸缓冲溶液混合搅拌，获得聚乙二醇修饰的酶溶液；以MOFs材料UIO-66作为固定化载体，在反应容器中加入经研磨粉碎的固定化载体和含1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺的磷酸缓冲溶液并搅拌，再加入N-羟基琥珀酰亚胺后搅拌，获得活化载体溶液；将聚乙二醇修饰的酶溶液与活化载体溶液混合搅拌，反应结束后，过滤并收集固体部分，将所得固体冷冻干燥后，得到固定化脂肪酶PEG-CAL-A@UiO-66。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述MOFs材料UIO-66以ZrCl4和对苯二甲酸为前驱体，在DMF溶剂中通过自组装反应合成。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，南极假丝酵母脂肪酶溶液、聚乙二醇和磷酸缓冲溶液以体积计的用量比为4:1:11； MOFs材料UIO-66、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺以重量计的用量比为3:1:1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化脂肪酶立体选择性催化2-苯基丁酸酯水解的步骤：在反应容器内加入外消旋2-苯基丁酸酯和固定化脂肪酶，再加入磷酸缓冲溶液作为反应液，搅拌反应，反应结束后，取样进行检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，外消旋2-苯基丁酸酯是从2-苯基丁酸甲酯、2-苯基丁酸乙酯、2-苯基丁酸丙酯、2-苯基丁酸异丙酯、2-苯基丁酸正丁酯、2-苯基丁酸异丁酯、2-苯基丁酸叔丁酯、2-苯基丁酸戊酯、2-苯基丁酸己酯中选择。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，磷酸缓冲溶液的pH为5.5-7.5，以磷酸缓冲溶液作为反应介质，每毫升反应介质投入2-苯基丁酸酯0.001-0.005mmol，每毫升反应介质投入固定化脂肪酶PEG-CAL-A@UiO-66量为10-80mg，反应温度30-90℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化酶可重复利用，操作步骤为：水解反应结束后，过滤将固定化酶从反应介质中分离，固定化酶经冷冻干燥后重复使用。
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