CN112708614A - 一种共固定化双酶的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种共固定化双酶的制备方法和应用，属于酶工程领域。本发明提供的共固定化α‑葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶在重复操作8次后，活性仍保留到原始活性的60.99％左右；并且，在4℃储存25天后，共固定化酶的相对酶活保留在80％以上，而游离酶的相对酶活下降到50％以下。因此，本发明所得共固定化α‑葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶具有重要的工业应用价值和科学研究价值。

Description

一种共固定化双酶的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种共固定化双酶的制备方法和应用，属于酶工程领域。

背景技术

葡萄糖6-磷酸(G6P)作为一种有用的生物合成中间体，参与糖酵解、淀粉和糖原生物合成途径。G6P经葡萄糖6-磷酸异构酶催化后，可以转化为果糖6-磷酸，果糖6-磷酸是生产D-塔格糖(D-Tagatose)等低聚糖的重要前体。

D-塔格糖是一种天然且罕见的己糖，仅少量存在于水果、可可和乳制品中。D-塔格糖具有很多健康益处，例如，其具有降血糖和抗癌的功能，有助于预防心血管疾病、中风和其他血管疾病；且其甜度与蔗糖相似但热量是蔗糖的三分之一，因此可作为潜在的功能性甜味剂。目前，D-塔格糖主要由L-阿拉伯糖异构酶催化D-半乳糖生成。然而，由于D-半乳糖成本高，且该工艺存在副产物多、酶稳定性差等缺点，不适用于大规模生产D-塔格糖。有一种合成D-塔格糖的有效途径是利用四种酶，即α-葡聚糖磷酸化酶(αGP)、磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、葡萄糖6-磷酸异构酶(PGI)和塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶(TBPA)将糖类化合物转化为D-塔格糖。其中，α-葡聚糖磷酸化酶(E.C.2.4.1.1)，来源于Dictyoglomusturgidum，可催化α-1,4葡聚糖的可逆磷酸解及催化多糖如淀粉、糖原、麦芽糖糊精合成α-葡萄糖1-磷酸(G1P)，在贮藏多糖中起关键作用。磷酸葡萄糖变位酶(E.C.5.4.2.2)，来源于Thermococcuskodakarensis，能将G1P转化为G6P。

然而，涉及多种游离酶的级联反应由于寿命短、稳定性低、生产效率低等缺点，在工业应用中存在局限性。为了解决这些缺点，需要开发一种多酶共固定化策略，在一个生物反应器中进行复杂的级联反应，以提高储藏稳定性、热稳定性和D-塔格糖产量。与单酶固定化相比，多酶共固定化消除了中间产物而提高了催化效率。此外，由于酶可多次应用于工业生产过程中，从而降低了生产成本。因此，共固定化是一种有效的合成D-塔格糖的途径。但是目前还未能解决将α-葡聚糖磷酸化酶与磷酸葡萄糖变位酶进行固定并用于制备G6P的研究，若能找到一种比较高效地固定化双酶的方法，将对于G6P的制备大有益处。

发明内容

为解决目前存在的还未有固定化酶α-葡聚糖磷酸化酶与磷酸葡萄糖变位酶双酶的技术，本发明提供一种以金属有机骨架纳米颗粒MOFs为新型固定化载体固定α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶的方法，并将其应用于催化麦芽糊精，得到具有高酶活性和稳定性且可重复使用的固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶。

本发明提供了一种共固定α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶的方法，以金属有机骨架材料MOFs为载体，包埋α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶。

在一种实施方式中，所述金属有机骨架材料MOFs载体是以醋酸锌和2-甲基咪唑为原料制备得到。

在一种实施方式中，将α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶的酶液混合得到混合酶液，向混合酶液中加入1～10mL的2-甲基咪唑溶液，混合后再加入等体积的醋酸锌溶液，在25℃下，150～250r/min下搅拌20～30min，搅拌结束后静置1～2h，离心后收集沉淀，并将沉淀冻干。

在一种实施方式中，所述醋酸锌溶液与2-甲基咪唑溶液的浓度比为1:(1～4)。

在一种实施方式中，所述α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶的浓度均不低于1mg/mL。

在一种实施方式中，α-葡聚糖磷酸化酶与磷酸葡萄糖变位酶的酶活比为1:(1～2)。

本发明提供了所述方法制备得到的固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶。

本发明提供了一种制备6-磷酸葡萄糖的方法，将所述固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶催化麦芽糊精生成6-磷酸葡萄糖。

在一种实施方式中，将所述固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶在pH6.0～7.0、60～70℃下，反应5～15min。

在一种实施方式中，麦芽糊精的质量为固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶的10～20倍。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的共固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶制备过程简单，节约资源，节约成本，高效制备G6P；为多酶共固定化提供有效的策略，同时有利于后续高效地制备D-塔格糖。

2、本发明所制备的共固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶可重复利用。在最适反应条件下，重复操作8次后相对酶活性仍高于60％。

3、本发明所制备的共固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶具有良好的储存稳定性。在4℃条件下保存25天，相对酶活性仍保持在81.29％。

附图说明

图1是本发明制备的ZIF-8的SEM扫描电镜图。

图2是本发明制备的共固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶重复操作8次后的相对酶活。

图3是本发明制备的共固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶及游离酶在4℃下保存25天的储存稳定性图。

具体实施方式

种子和发酵培养基：酵母提取物0.5％、胰蛋白胨1％、氯化钠1％，调pH至7.0。

实施例1：α-葡聚糖磷酸化酶及磷酸葡萄糖变位酶的制备

重组菌的构建：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-葡聚糖磷酸化酶的编码基因，和SEQ ID NO.2所示的磷酸葡萄糖变位酶的编码基因分别连接至pET-22b(+)载体，转入E.coli BL21宿主细胞中，构建得到表达相应酶的重组菌。

将重组菌接种至含50μM氨苄青霉素的种子培养基，于37℃、200r/min摇床中恒温培养12h，然后以2％的接种量接种至发酵培养基，于37℃、200r/min的摇床中恒温培养至菌液在600nm处的吸光度达到0.6–0.8。之后加入0.5mM的IPTG诱导6h，收集发酵液于4℃、8000r/min离心10min，收集菌体，并采用Ni²⁺亲和层析法进行酶纯化，分别得到纯化后的α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶。

实施例2：α-葡聚糖磷酸化酶及磷酸葡萄糖变位酶的酶活测定

(1)α-葡聚糖磷酸化酶酶活测定

采用双酶偶联法测定α-葡聚糖磷酸化酶的活性。酶反应的总体系为1mL，底物为麦芽糊精。1mL磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)中含有5g/L麦芽糊精、5mM MgCl₂和1U/mL磷酸葡萄糖变位酶，在反应开始前加入10μgα-葡聚糖磷酸化酶，于70℃反应10min，反应结束后，立即放入沸水浴中停止酶反应(10min)，反应液在12 000r/min下离心5min。产物6-磷酸葡萄糖(G6P)的检测方法如下：取0.1mL反应液与3mL HEPES缓冲液((100mM，pH 7.0)混匀，缓冲液中含有2mM MgCl₂，0.2mM NAD⁺以及0.7U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)，于30℃反应10min，在340nm处测定吸光值。

(2)磷酸葡萄糖变位酶酶活测定

磷酸葡萄糖变位酶的活性测定是以1-磷酸葡萄糖(G1P)为底物，酶反应总体系为1mL。反应体系包含5mM G1P、5mM MgCl₂、50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和10μg磷酸葡萄糖变位酶，于70℃反应10min，灭酶10min，离心5min后检测产物G6P的量，检测方法同α-葡聚糖磷酸化酶。

酶活定义：在标准反应条件(pH 7.0，70℃)下，每分钟生成1μmol G6P所需的酶量为1U。

经纯化后，α-葡聚糖磷酸化酶的酶浓度为1.67mg/mL，比酶活为30.28U/mg。磷酸葡萄糖变位酶的酶浓度为1.0mg/mL，比酶活为45.5U/mg。

实施例3：金属有机骨架材料ZIF-8的制备

将5mL浓度为20mM的醋酸锌溶液加入等体积的浓度为80mM的2-甲基咪唑溶液中，在25℃下，转速为200r/min的磁力搅拌器上恒速搅拌30min。静置1h后，8 000r/min离心15min，用去离子水洗涤收集的沉淀。将得到的样品冻干后获得ZIF-8纳米复合材料，用冷场发射扫描电子显微镜观察ZIF-8的形态。结果如图1所示，表明ZIF-8具有典型的菱形十二面体结构，平均直径约为300nm。

实施例4：双酶共固定化

将酶混合液(浓度为1.67mg/mL的α-葡聚糖磷酸化酶和1mg/mL的磷酸葡萄糖变位酶，共100μL)加入5mL 2-甲基咪唑溶液(80mM)中，搅拌后立即加入与2-甲基咪唑溶液体积相等的醋酸锌溶液(20mM)。在25℃、转速为200r/min的磁力搅拌器上恒速搅拌30min。静置1h后，8 000r/min离心15min，用pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤收集的沉淀。最后，将得到的样品冻干后获得固定化αGP&PGM@ZIF-8纳米复合材料。

实施例5：固定化效率的评估

固定化酶的酶活测定：取50mg实施例4中的固定化酶，加入1mL、pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，缓冲液中含有5g/L麦芽糊精和5mM MgCl₂，于70℃反应10min。其他条件与实施例2相同。本实施例测得的双酶固定化酶活为257.2U/g_ZIF-8。

酶活回收率计算方法：固定化酶活力回收率(％)＝(固定化酶活力/用于固定化的总活力)×100％。本实验用于固定化的总活力为32U，双酶固定化酶活为257.2U/g_ZIF-8，即12.86U，计算得酶活回收率为40.19％。

固定效率定义为αGP&PGM@ZIF-8复合材料包埋的αGP-PGM酶量与初始αGP-PGM酶量的比值，即固定效率(％)＝(最初加入到溶液中的酶量-固定化后上清得酶量)/最初加入到溶液中的酶量。负载量定义为αGP&PGM@ZIF-8复合材料包埋的αGP&PGM酶的量与固定后的复合材料的重量之比，代表单位重量的复合材料可以包埋多少酶量。在检测体系中的酶的终浓度为0.4mg/mL，即体系中酶的量为0.8mg，固定上的酶的量为0.7175mg。该体系最终所制得的αGP&PGM@ZIF-8干燥粉末的质量为50mg，因此，固定效率为89.68％，负载量为14.35mg/g_ZIF-8。

实施例6：共固定化酶操作稳定性的研究

一般来说，固定化酶的可重复使用性和再生性是其经济应用和实际应用的两个关键特性。因此，为了进一步评价共固定化双酶的性能，采用批次反应对其重复使用性进行了测试。

进行第一批次反应时，往实施例4获得的固定化αGP&PGM@ZIF-8中加入pH为7.0的磷酸缓冲液，缓冲液中含有5g/L的麦芽糊精和5mM镁离子，在70℃水浴锅中反应到平衡，之后离心，洗涤沉淀，再次加入含有5g/L的麦芽糊精和5mM镁离子的pH为7.0的磷酸缓冲液，在相同条件下重复反应八次，测定每一次反应后的产物的量。

结果如图2所示，重复操作8个循环后，固定化酶αGP&PGM@ZIF-8的活性逐渐降低到原始活性的60.99％左右。在可重复使用的测量过程中，第三轮反应后观察到的活性下降可能是由于酶失活和洗涤和离心过程中的机械损伤。然而，将双酶包埋在MOF中的策略在级联反应模拟中仍显示出很大的可重用性。双酶体系的这种优势表明酶与MOF框架紧密相连。

实施例7：共固定化酶与游离酶储存稳定性的研究

将实例4中合成的固定化酶αGP&PGM@ZIF-8和游离酶(αGP和PGM)在层析柜中分别保存25天，每隔5天取一次样测定酶活，以评估固定化酶和游离酶的储存稳定性。

结果如图3所示，在4℃储存25天后，固定化酶αGP&PGM@ZIF-8的相对酶活仍保留81.29％，而游离酶(游离αGP和游离PGM)的相对酶活均降低到50％以下。这个结果表明，因为MOF框架屏蔽了外界干扰，为酶提供了一个稳定的环境，从而降低了酶的构象变化，从而提高了固定化酶的储存稳定性。

值得注意的是，共固定化酶αGP&PGM@ZIF-8具有良好的可重复使用性和储存稳定性，表明共固定化酶具有工业化应用的潜力。因此，在MOF纳米材料中共固定化αGP&PGM是一种经济、技术上可行的策略。

对比例1

具体实施方式参见实施例3，将醋酸锌溶液的浓度变为10mM、20mM、30mM、40mM，2-甲基咪唑溶液浓度为80mM，制备得到ZIF-8；再按照实施例4中双酶固定的方法，将α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶进行固定，得到固定化的复合材料；对固定化的复合材料进行酶活回收率及蛋白承载量的测定，结果显示当醋酸锌浓度为20mM时，固定化酶酶活回收率达到40％，而醋酸锌溶液为其他浓度时，酶活回收率为10％～35％，蛋白承载量为5～14mg/g_ZIF-8。

对比例2

具体实施方式参见实施例3，醋酸锌溶液的浓度为20mM，2-甲基咪唑溶液浓度变为20mM、40mM、80mM、160mM、240mM，制备得到ZIF-8；再按照实施例4中双酶固定的方法，将α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶进行固定，得到固定化的复合材料；对固定化的复合材料进行酶活回收率及蛋白承载量的测定，结果显示当2-甲基咪唑溶液浓度为80mM时效果最好，酶活回收率为40.19％，蛋白承载量为14.35mg/g_ZIF-8，而2-甲基咪唑溶液为其他浓度时，酶活回收率为5％～35％，蛋白承载量为3～14mg/g_ZIF-8。

对比例3

具体实施方式参见实施例3，醋酸锌溶液的浓度为20mM，将醋酸锌溶液与2-甲基咪唑溶液浓度比替换为1：1、1：4、1：10，制备得到ZIF-8；再按照实施例4中双酶固定的方法，将α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶进行固定，得到固定化的复合材料；对固定化的复合材料进行酶活回收率及蛋白承载量的测定，结果显示当醋酸锌溶液与2-甲基咪唑溶液的比例为1：1时的蛋白承载量较高，但当醋酸锌溶液与2-甲基咪唑溶液的比例为1：4时，酶活回收率为40％，1：1和1：10时酶活回收率分别为35.5％、12％，表明Zn与有机配体中的N配位时，最佳的配比为1：4。

对比例4

(1)具体实施方式参见实施例4，将浓度为1.67mg/mL的α-葡聚糖磷酸化酶，加入5mL2-甲基咪唑溶液(80mM)中，搅拌后立即加入等体积的醋酸锌溶液(20mM)。在25℃、转速为200r/min的磁力搅拌器上恒速搅拌30min，再加入1mg/mL的磷酸葡萄糖变位酶，在25℃、转速为200r/min的磁力搅拌器上恒速搅拌30min，静置1h后，8 000r/min离心15min，用pH7.0的磷酸缓冲液洗涤收集的沉淀。将得到的样品冻干后得到固定化的复合材料；对固定化的复合材料进行酶活回收率，结果显示，酶活回收率为5.88％。

(2)具体实施方式参见实施例4，将浓度为1mg/mL的磷酸葡萄糖变位酶加入5mL 2-甲基咪唑溶液(80mM)中，搅拌后立即加入等体积的醋酸锌溶液(20mM)。在25℃、转速为200r/min的磁力搅拌器上恒速搅拌30min。再加入浓度为1.67mg/mL的α-葡聚糖磷酸化酶，在25℃、转速为200r/min的磁力搅拌器上恒速搅拌30min静置1h后，8 000r/min离心15min，用pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤收集的沉淀。将得到的样品冻干后得到固定化的复合材料；对固定化的复合材料进行酶活回收率，结果显示，酶活回收率为31％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种共固定化双酶的制备方法和应用

<130> BAA210132A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1713

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagagaag attatttgga aaaattgaga aaagaagaaa tcatagccta tttctccatg 60

gagattgctt taattagcga catccccacc tatagtggag gactgggagt tcttgcggga 120

gatacagtaa gaactgcagc agaccttaat atacccttca tagcgataac ccaacttagt 180

agaaagggat attttaaaca agagatagat aaagatggaa atcaaattga atacccagta 240

aactgggatc ctgaaaaatt tctcaccaag cttcccttta agactaatgt ggagatagaa 300

gggagaaatg tctctattca accttgggtt tattattgga cttccctaca tggacataaa 360

gtacctgtaa tttttctcga tactaatctt cctgaaaact ctgaagaaga taaaaatata 420

accgatgtcc tttatggagg agatttagcc cataggctaa aacaagagat aatcttaggt 480

attggagggg caaaggtaat aaaacaattg ggccttagag taagaaagta tcatttaaat 540

gagggacatt cttctttatt aaccttagaa ctactcaaag atgaactttc ttcagggaag 600

agtttagaag aagcagaaaa aaatgtgaaa gaaaaatgtg tatttaccac ccatactcct 660

gtagaagctg gacacgataa gtttccttat gatatggtaa caaaaataat gggaaactac 720

atttccatag atattattaa gaaattcgca ggaaatgata ttcttaacat gacccttctt 780

gccctaaatc tttctggata tgttaatggt gtggccaaaa ggcatcagga aatctctctc 840

caaatgtttc ctggacatag aattcatgcc attaccaatg gagttcactc ttttacctgg 900

acttctccaa gttttagaaa acttttcgac aaatacatcc caggatgggc caccgaacca 960

gagcttttat caagagctca attcattccc aatgaagaga tatggaatgc tcacatggaa 1020

gcaaaaagag atctgataaa attaatttcc aatgagacag gagttcaatt tgatgagaat 1080

gtacttacta tcggctttgc aagaagagct actgcctata aaagacctca tttacttttt 1140

tctgatatca acagacttaa gaaagtaaaa agaaaaggac caattcaaat tgtctacgct 1200

ggaaaagctc accccaaaga tattgagggg aagaaactta taaaggagat ttatgaatat 1260

ataaaagctc ttgagaatga tataaagatc gtttatttac aagactataa tttagatatg 1320

gcaaaaaaga tcatagcagg tgtagatgta tggctaaata ctccccaaag acctcttgag 1380

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gatggatggt ggatagaggg acatgtggaa gggtataccg gatggtccat tggaccttct 1500

ccctttgagg aaaaaagtat cgaaaaccat gttcaagaag aaatagacga tctatataac 1560

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tatattactg aggcatattt taaaatagga taa 1713

<210> 2

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catatgatgg gaaagctctt tggaacgttt ggcgttaggg ggatagcgaa cgaggagata 60

accccagagt tcgcccttaa aatcggcatg gcctttggaa cactcctcaa gagggaaggt 120

agagaaaggc cgctcgtcgt tgtcggcagg gatacgaggg tgagcggtga aatgctcaag 180

gacgccctca tcagcggact tttgagtacc ggttgcgacg tcatagacgt tgggatagct 240

ccaacccctg caatccagtg ggccaccaat cacttcaatg ccgacggtgg agcggtcata 300

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gcaagggagt accttgagct tgggattaag ttgcttgaag aagcgcttaa gggccaccac 1380

caccaccacc actaactcga g 1401

Claims (10)

1.一种共固定α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶的方法，其特征在于，以金属有机骨架材料MOFs为载体，包埋α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属有机骨架材料MOFs载体是以醋酸锌和2-甲基咪唑为原料制备得到。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶的酶液混合得到混合酶液，向混合酶液中加入1～10mL的2-甲基咪唑溶液，混合后再加入等体积的醋酸锌溶液，在25℃下，150～250r/min下搅拌20～30min，搅拌结束后静置1～2h，离心后收集沉淀，并将沉淀冻干。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述醋酸锌溶液与2-甲基咪唑溶液的浓度比为1:(1～4)。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶的浓度均不低于1mg/mL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，α-葡聚糖磷酸化酶与磷酸葡萄糖变位酶的酶活比为1:(1～2)。

7.权利要求1-6任一所述方法制备得到的固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶。

8.一种制备6-磷酸葡萄糖的方法，其特征在于，将权利要求7所述固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶催化麦芽糊精生成6-磷酸葡萄糖。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶在pH6.0～7.0、60～70℃下，反应5～15min。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，麦芽糊精的质量为固定化α-葡聚糖磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶质量的10～20倍。

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