CN114349182B - 一种采用金属有机骨架ZIF-8固定化漆酶降解不同pH溶液中双酚A的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采用金属有机骨架ZIF‑8固定化漆酶降解不同pH溶液中双酚A的方法，在ZIF‑8的基础上利用模板剂三甲基乙酸调节ZIF‑8的孔道大小，得到具有高度有序介孔的MZIF‑8。并以戊二醛作为交联剂使漆酶分子在MZIF‑8表面和孔道内部沉淀交联，得到固定化漆酶金属有机骨架复合材料FL@MZIF‑8。以内分泌干扰物双酚A作为降解底物，开展对双酚A的降解初步研究。本发明的方法采用金属有机骨架ZIF‑8对漆酶进行固定化，实现对不同pH溶液中双酚A的降解是十分可观的。验证了优化孔道之后的ZIF‑8对固定的漆酶具有一定的保护作用，为极端水环境中的污染物降解提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种水污染处理技术，尤其涉及一种采用金属有机骨架ZIF-8固定化漆酶降解不同pH溶液中双酚A的方法。
背景技术
近些年来，环境内分泌干扰物(EDCs)因其对环境安全和人体健康的不良影响而引起了人们的极大关注。作为最常见的内分泌干扰物，双酚A(BPA)经常被用作制造许多聚合物组分的原料，例如环氧树脂、聚苯醚树脂、聚碳酸酯和聚砜树脂。它还可用于橡胶抗氧化剂、增塑剂、杀虫剂、阻燃剂、涂料、热稳定剂、电子产品、食品包装、汽车、水瓶和其他精细化工材料。大量BPA被丢弃到大气、湖泊、土壤、河流、沉积物等自然资源中。美国环保局最近指出，每年至少有100万镑BPA释放到环境中。有报道称BPA在地下水和地表水中的浓度在0.1到800μg·L-1之间，足以导致男性的不育以及乳腺癌和前列腺癌发病率的增加。因此，开发一种高效、简单的方法来处理这种污染物具有非常重要的意义。
然而，目前国内外对BPA的处理方法往往技术昂贵、耗时，并会产生一些有毒的副产物，例如光催化氧化、芬顿反应、臭氧催化氧化、超声波氧化等一些高级氧化方法，通过产生羟基自由基可以有效地氧化降解此类化合物。相较之下利用生物降解策略来降解污染物是一种比物理化学过程更安全、更经济的替代方法。BPA可被微生物中的氧化酶代谢或生物降解。在这些酶中，漆酶因其高活性和低特异性而在降解BPA方面引起了更多的关注。漆酶是一种胞外酶，广泛存在于真菌、植物、昆虫和一些细菌中。它属于铜多酚氧化酶，在两个活性中心含有四个铜离子。近年来，大量的研究已经证明漆酶能够通过单电子氧化机制催化多种底物，包括酚、多酚、氯化酚、多胺、染料、芳香族底物和一些无机化合物。然而，游离态的漆酶在各行各业，特别是废水处理中的实际应用还不多见。这主要是因为游离态的漆酶是消耗性的，暴露在实际环境中很容易失去活性，其较差的储存和操作稳定性通常会给实际行业带来相当高的成本。因此，为了获得性能更好的漆酶，人们在过去的几年里做了大量的工作。其中固定化酶可以改善它们的性质，包括储存和操作的稳定性，更好的控制水溶液中的酶反应，以及重复使用的可能性。人们研究了各种固定化材料，如多孔纳米材料，有机、无机薄膜，天然矿物材料，磁性微球和有机凝胶。以及各种的固定化方法，包括吸附、包埋、化学共价结合和交联。这些方法各有利弊，固定化漆酶的催化活性和效率主要取决于固定化载体的固定化工艺。因此，选择合适的载体材料和技术是非常关键的。
金属有机骨架(MOFs)是一种由金属离子和有机配体通过配位键形成的多孔载体。由于其高孔隙率、均匀的孔径、金属节点和配体的简单修饰以及可设计的结构和功能，它们在药物递送、光子器件、催化和化学传感等各种应用中表现出优异的性能。作为一种有前途的酶固定化候选材料，MOFs由于其简单的结合过程和温和的条件而被广泛应用于酶固定化过程。理想的MOFs可以在保护酶的同时，有效的阻碍酶的浸出，并提高它们在极端条件下的稳定性。通常，有两种方法用于制备基于MOFs的固定化酶，原位合成法和合成后修饰。简单的原位合成法是在温和的条件下将天然酶固定在MOFs上。广西大学的唐爱星课题组，通过原位合成法成功将脂肪酶CRL固定到了ZIF-8，但是因为孔道结构的限制导致酶的活性有了一定的损失，并且可能会限制底物分子与MOFs骨架内酶的接触。宁波大学的张绫芷等人采用合成后修饰的方法将脂肪酶BCL固定在了氢氧化铵改性的An-ZIF-8表面，虽然可以保持较高的催化活性，但是很难避免酶从MOFs表面脱落。这是因为，大多数的MOFs都是微孔，这就限制了酶在其内部空间的渗透和包埋。介孔MOFs也因此由于其笼状介孔结构成为了是酶固定化的首选。因此，制备具有分级孔道的MOFs是解决这类问题行之有效的方法，它们的多峰孔隙率成为了成功生物催化的一个关键参数。作为MOFs的一种，由2-甲基咪唑和锌离子配位合成的ZIF-8合成条件温和，大量研究都证明了ZIF-8是酶固定化的常用载体。有研究通过多酚处理方法合成了一种多孔的ZIF-8用来封装酶，所得到的酶@ZIF-8复合物稳定性得到了大幅提高。另外也有研究采用蛋白质诱导软模板法成功制备的脂肪酶@ZIFs复合物。
本研究中，我们在普通ZIF-8的基础上利用模板剂三甲基乙酸(PA)调节ZIF-8的孔道大小，得到具有高度有序介孔的MZIF-8。并以戊二醛(GA)作为交联剂使漆酶分子在MZIF-8表面和孔道内部沉淀交联，得到固定化漆酶金属有机骨架复合材料FL@MZIF-8。以常见的内分泌干扰物双酚A作为降解底物，开展对双酚A的降解初步研究。通过设置不同的降解条件，来对比不同因素下固定化漆酶FL@MZIF-8和游离态漆酶对双酚A的降解效果。结合扫描电镜、XRD图谱的分析结果，得出MZIF-8对漆酶的高负载率和保护机制，以期对双酚A的降解进行初步的研究，为复杂水环境中双酚A的治理提供新的思路。
发明内容
本发明的目的是对采用金属有机骨架ZIF-8固定化漆酶降解水中双酚A进行初步的研究，同时为不同pH溶液双酚A的去除提供新的思路。
本发明的技术方案：
一种采用金属有机骨架ZIF-8固定化漆酶降解不同pH溶液中双酚A的方法，步骤如下：
(1)首先将2-甲基咪唑、Zn(NO3)2·6H2O和模板剂三甲基乙酸按照质量比为4:5:3～5溶解在2-3倍于总溶质质量的无水乙醇中，常温下静置2-3h后真空脱气；随后在鼓风干燥箱内50℃下干燥；干燥后的物质用体积比为1:1的甲醇、氨水混合溶液浸泡10-20min，真空脱气后在50℃下干燥；干燥后的物质用N,N-二甲基甲酰胺溶剂浸泡一天以上达到去除模板剂的目的；最后，将合成的MZIF-8用无水乙醇洗涤，在50℃下干燥后得到孔径优化的MZIF-8白色粉末；
(2)用含体积百分比8％-10％的3-氨丙基三甲氧基硅烷的无水乙醇混合溶液配置浓度为5g/L的MZIF-8分散液，在常温下以200r/min的转速振荡12-15h后用无水乙醇洗涤干净，冷冻干燥后得到氨基活化后的MZIF-8；
(3)将氨基活化后的MZIF-8分散在含体积百分比0.5％-1％戊二醛交联剂的TrisHCl缓冲液中，MZIF-8在分散液中的浓度为10g/L；在常温下孵育1-2小时后，用去离子水洗涤干净，冷冻干燥后在3℃下保存；
(4)将交联修饰后的MZIF-8分散到浓度为4mg/mL的游离漆酶溶液中，其中MZIF-8与溶液中漆酶的质量比为5:1～3；在200r/min、30℃的摇床上孵育0.5h-3h，得到FL@MZIF-8；用去离子水洗涤，冷冻干燥后保存在-20℃下；
(5)配制pH＝3-11、浓度为25mg/L的双酚A溶液，配置过程中超声溶解；
(6)将步骤(4)得到的FL@MZIF-8分散到步骤(5)配制的双酚A溶液中，分散液浓度为14g/L；将分散液置于恒温振荡箱中以160r/min的转速在26℃下降解12h；
(7)分离：降解结束后，将混合物离心实现固液分离，取上层清液为待测清液。
本发明的有益效果：本发明的方法采用金属有机骨架ZIF-8对漆酶进行固定化，实现对不同pH溶液中双酚A的降解是十分可观的。验证了优化孔道之后的ZIF-8对固定的漆酶具有一定的保护作用，为极端水环境中的污染物降解提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明实施例一中MZIF-8的SEM图；
图2为本发明实施例一中ZIF-8的SEM图；
图3为本发明实施例二中的FL@MZIF-8的SEM图；
图4为本发明实施例二中的FL@ZIF-8的SEM图；
图5为本发明实施例三中的双酚A溶液标准曲线图；
图6为本发明实施例四中的FL@MZIF-8、MZIF-8、FL@ZIF-8和ZIF-8的XRD图；
图7为本发明实施例四中不同初始pH下固定化漆酶FL@MZIF-8和游离态漆酶对双酚A的降解效果图；
图8为本发明实施例五中不同降解温度下固定化漆酶FL@MZIF-8和游离态漆酶对双酚A的降解效果图；
图9为本发明实施例六中不同初始双酚A浓度下固定化漆酶FL@MZIF-8和游离态漆酶对双酚A的降解效果图；
图10为本发明实施例七中不同降解时间下固定化漆酶FL@MZIF-8和游离态漆酶对双酚A的降解效果图。
具体实施方式
下面将对本过程实施例作进一步的详细描述。
本发明采用金属有机骨架ZIF-8对漆酶进行固定化，实现对不同pH溶液中双酚A的降解，其具体实施方式为：
实施例一：
将6.75g2-甲基咪唑和8.15gZn(NO3)2·6H2O超声溶解在45mL无水甲醇中，加入5g三甲基乙酸(PA)后常温下静置2h。随后将混合物真空脱气10分钟后置于烘箱中在50℃下干燥3h，得到透明状晶体混合物。干燥后的混合物永40mL体积比为1：1的甲醇/氨水混合溶液浸泡，真空脱气3min后置于烘箱中在50℃下干燥3h。干燥后的固体在N,N-二甲基甲酰胺溶液中浸泡24h。最后，将溶液在8000r/min的条件下，离心5min，保留沉淀物并用无水甲醇洗涤3次，倒去上清液，得到MZIF-8分散液。将分散液置于烘箱中，在50℃下干燥5h以后得到白色粉末状的MZIF-8。
经模板剂PA处理得到的MZIF-8呈12面立方体结构，表面光滑。晶体尺寸在400nm-2μm。相比普通的ZIF-8。粒径更大，结晶度更好。
实施例二：
将50mgMZIF-8加入到含有800μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷的10mL乙醇溶液中，在常温条件下以200r/min的转速振荡12h。随后将溶液在8000r/min的条件下，离心5min，保留沉淀物并用无水乙醇洗涤三次，倒去上清液，得到氨基活化后的MZIF-8。将得到的MZIF-8分散在高纯水中，先将分散液冷冻至结冰，然后进行冷冻干燥。取50mg氨基活化之后的MZIF-8，加入到含0.5％戊二醛的5mL TrisHCl缓冲液中，在常温下孵育1h。孵育完成后的分散液在8000r/min的条件下，将其离心，离心5min，保留沉淀物并用高纯水洗涤3次后进行冷冻干燥。取干燥后的50mgMZIF-8分散在5mL的游离酶溶液(4mg/mL)中，在200r/min、30℃下的摇床上孵育2h。将溶液在8000r/min的条件下，离心5min，保留沉淀物并用去离子水洗涤三次，倒去上清液，得到FL@MZIF-8。将分散液冷冻至结冰，然后进行冷冻干燥，得到黄色粉末状的FL@MZIF-8。
经过冷冻干燥后的FL@MZIF-8外表呈黄色粉末状，12面立方体结构仍清晰可见，部分漆酶在表面的附着导致表面的凹凸不平。
实施例三：
将50mg双酚A超声溶解在800mL高纯水中，定容至1L，得到50mg/L的双酚A的溶液。取一定量的原溶液，加入一定量的去离子水稀释，配置系列浓度为5、10、15、20、25mg/L的双酚A溶液。对配好的溶液进行全波长扫描，确定双酚A溶液的吸收波长为228nm。测试不同浓度的溶液在波长228nm处的吸光度并建立标准曲线，获得双酚A浓度与吸光度大小之间的函数关系。
从图3中可以看出，标准溶液的浓度与其在波长228nm处的吸光度呈线性相关，线性拟合的相关系数R2＝0.999,说明其线性拟合程度很高，在对双酚A降解的初步探究中可用吸光度来表示双酚A的浓度。
降解实验：
取一定量的50mg/L的双酚A原溶液，加入一定量的去离子水稀释，用1mol/L的HCl或者NaOH溶液调节溶液的pH值，最后用高纯水定容，配置呈浓度为25mg/L的双酚A溶液。称取70mg的FL@MZIF-8/20mg漆酶投加到5mL的双酚A溶液中。将混合物置于恒温振荡箱中160r/min的转速在26℃下震荡12h。降解结束后，将混合物8000r/min的条件下，离心5min，取适量的上层清液，用紫外分光光度计在波长228nm处测定剩余的双酚A的浓度。
实施例四：
用1mol/L的HCl或者NaOH溶液分别将溶液的pH调节至pH＝3，5，7，9，11，配置成25mg/L的微塑料溶液。之后采用固定化漆酶FL@MZIF-8和游离态漆酶进行降解实验。
随着pH值的升高，固定态和游离态的漆酶对双酚A的降解率都是呈先上升后下降的趋势。在pH＝5时，双酚A的降解率达到最高，分别为87.73％，88.41％。但是随着pH的持续增大，游离态漆酶对双酚A的降解效果大幅度减弱，在pH＝11时，降解率达到最低的19.20％。固定化漆酶FL@MZIF-8尽管在pH＝11时，降解率也有所降低，但仍可保持65.23％可观的降解率。这主要归因于漆酶在MZIF-8孔道中的成功固定，MZIF-8保护层的适当缓冲作用，维持漆酶催化所需的酸性环境。XRD图谱中，FL@MZIF-8相较于MZIF-8特征衍射峰能量的减弱，也反映了漆酶在孔道中的成功固定化。这说明固定化漆酶酶FL@MZIF-8去除双酚A可运用在pH范围较广的实际水体中。
实施例五：
配置pH＝5，浓度为25mg/L的双酚A溶液，采用固定化漆酶FL@MZIF-8和游离态漆酶进行降解实验，将混合物置于恒温振荡器中，分别在10，30，50，70℃下振荡12h后取出。
随着pH值的升高，固定态和游离态的漆酶对双酚A的降解率都是呈先上升后下降的趋势。温度在30℃时，固定化漆酶FL@MZIF-8和游离态漆酶达到最高的降解率，分别为90.11％和92.19％。固定化漆酶FL@MZIF-8在10℃时降解率最低，为58.29％。游离态漆酶在70℃时降解率最低，为25.98％。这说明温度的改变对游离态漆酶的影响较大，固定化漆酶FL@MZIF-8受温度影响较小。这主要归因于MZIF-8保护层的刚性结构限制了漆酶的柔韧性，从而阻止了漆酶的高温变性失活。
实施例六：
配置pH＝5，分别配置初始浓度为10、15、20、25、30、35mg/L的双酚A溶液，采用固定化漆酶FL@MZIF-8进行降解实验。将混合物置于恒温振荡器中，在30℃下振荡12h后取出。
当溶液初始浓度在10mg/L时，BPA降解率有所降低的原因可能是低浓度的差异和驱动力导致BPA与漆酶接触较少所致。当浓度变大时，反应快速达到降解平衡，双酚A的降解率基本维持在90％左右。但是随着初始浓度的继续升高，双酚A的降解率却呈现下降的趋势，在35mg/L时双酚A的降解率最低为80.87％。这里主要归因为双酚A的降解产物在孔道内堆积阻碍了漆酶于双酚A的进一步反应降解。
实施例七：
配置初始浓度为25mg/L，pH＝5的双酚A溶液采用采用固定化漆酶FL@MZIF-8进行降解实验，混合物在恒温振荡器中分别震荡1、2、3、4、5、6、8、10、12h后取出。
从0h到6h内，双酚A的降解较快，在第6个小时降解率达到最高，为90.11％。6h之后降解速率缓慢，这主要归因于在反应初始阶段，大量的双酚A迅速聚集到FL@MZIF-8周围，此时酶和底物充分接触并发生反应；随着双酚A被降解的越来越多，则剩余的双酚A越来越少，此时和酶之间的反应逐渐达到了一个平衡点，时间的影响变得比较微弱。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (1)
1.一种采用金属有机骨架ZIF-8固定化漆酶降解不同pH溶液中双酚A的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）制备孔径优化的MZIF-8白色粉末；
具体步骤如下：首先将2-甲基咪唑、Zn(NO3)2·6H2O和模板剂三甲基乙酸按照质量比为4:5:3~5溶解在2-3倍于总溶质质量的无水乙醇中，常温下静置2-3h后真空脱气；随后在鼓风干燥箱内50℃下干燥；干燥后的物质用体积比为1:1的甲醇、氨水混合溶液浸泡10-20min，真空脱气后在50℃下干燥；干燥后的物质用N,N-二甲基甲酰胺溶剂浸泡一天以上达到去除模板剂的目的；最后，将合成的MZIF-8用无水乙醇洗涤，在50℃下干燥后得到孔径优化的MZIF-8白色粉末；
（2）制备氨基活化后的MZIF-8；
具体步骤如下：用含体积百分比8%-10%的3-氨丙基三甲氧基硅烷的无水乙醇混合溶液配置浓度为5g/L的MZIF-8分散液，在常温下以200r/min的转速振荡12-15h后用无水乙醇洗涤干净，冷冻干燥后得到氨基活化后的MZIF-8；
（3）将氨基活化后的MZIF-8分散在含体积百分比0.5%-1%戊二醛交联剂的TrisHCl缓冲液中，MZIF-8在分散液中的浓度为10g/L；在常温下孵育1-2小时后，用去离子水洗涤干净，冷冻干燥后在3℃下保存；
（4）将交联修饰后的MZIF-8分散到浓度为4mg/mL的游离漆酶溶液中，其中MZIF-8与溶液中漆酶的质量比为5:1~3；在200r/min、30℃的摇床上孵育0.5h-3h，得到FL@MZIF-8；用去离子水洗涤，冷冻干燥后保存在-20℃下；
（5）配制pH=3-11、浓度为25mg/L的双酚A溶液，配置过程中超声溶解；
（6）将步骤（4）得到的FL@MZIF-8分散到步骤（5）配制的双酚A溶液中，分散液浓度为14g/L；将分散液置于恒温振荡箱中以160r/min的转速在26℃下降解12h；
（7）分离：降解结束后，将混合物离心实现固液分离，取上层清液为待测清液。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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