KR102332787B1 - 해양 유래 실리카 합성 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해양 유래 실리카 합성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 해양 유래 펩타이드는 규산으로부터 실리카 합성 활성이 우수하여, 실리카와 콜라겐이 적층된 복합 골 이식재의 제조에 활용될 수 있다. 상기 복합 골 이식재는 기존 이식재에 비해 생체분자의 담지력이 향상되었으며, 담지된 분자를 지속적으로 방출하는 효과를 가지고 있는바, 손상된 골 부위에 이식시 골 재생을 촉진하는 효과가 우수하다. 따라서 본 발명에 따른 펩타이드는 실리카 합성 및 골이식 관련 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

해양 유래 실리카 합성 펩타이드 및 이의 용도 {Peptides from marine resources capable of silica formation and use thereof}

본 발명은 해양 유래 실리카 합성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

실리카는 특정 화학 종들과 공유 결합이 가능하기 때문에 새로운 하이브리드 소재(유기-무기 복합체) 합성에 중요하고, 또한 생체 적합한 소재로서 개별 소재의 단점을 보완할 수 있는 우수한 특성을 갖고 있다. 현재 실리카의 공업적 생산 공정은 고온, 강산 또는 강염기 조건이 요구되고 환경적으로 유해한 부산물 산생의 문제점이 있다. 그러나 해양 생명체인 스펀지와 규조류의 추출물 또는 유전학적 정보를 바탕으로 실리카를 생합성하는 효소 및 펩타이드가 발견됨으로써 이들에 의해 생산된 환경친화적 바이오 실리카 및 이의 다양한 용도로의 응용성으로 인해 전 세계적으로 해양 유래 바이오 실리카 복합 소재 개발이 이슈화되고 있다. 따라서 생물학적 합성방법을 통한 바이오 실리카 소재 확보를 위한 원천 기술의 보유는 매우 중요하다.

손상된 골을 수복하기 위해서는 수복용 대체제 또는 골 이식재가 필요한데 이는 손상되거나 결손된 골 부위에 이식 및 충진을 통해 골 결손 부위를 지지해 줌으로써 현재의 뼈에서 이식재로 뼈 조직이 확장되면서 손상부위가 신생 뼈로 회복되도록 돕는 역할을 한다. 대부분의 골이식재의 이러한 역할을 골전도라 한다. 그러나 충분한 골 재생을 위해서는 골 이식재가 동시에 주변의 자가 골 조직으로부터 골 결손부위로의 새로운 자가 골조직을 형성시키도록 유도하거나 재생시키는 기능이 요구된다. 이를 위해 전도성 골이식재에 골성장을 유도하는 BMP, PDGF, TGF, FGF, TGF, GDF 등 활성 인자를 도입하고, 이들 활성 인자들은 줄기세포를 골생성 세포로 전환시켜 골형성을 유도한다. 손상된 뼈를 대체하는 이식수술에서 골전도성과 골유도성 특성 및 줄기세포를 함유한 자가골을 사용하는 것이 가장 골 수복을 위한 최상의 방법이나 2차 수술 및 손상부위가 큰 경우 자가골 채취량에도 문제가 있기 때문에 골유도성 성장인자를 도입한 합성골 이식재 사용이 대안으로 인식되고 있다.

세계 최초로 rhBMP-2를 제품화에 성공한 미국은 골유도 물질로 인해 골이식재 시장의 규모가 기존 규모의 2배 이상으로 성장하였다. 그러나 성장인자가 담지된 골이식재는 rhBMP2을 골이식재와 물리적으로 결합시켜 흡착시키는 방식으로서 단백질과 골이식재간의 화학적 결합 부재로 이식 초기 속방에 의한 연조직 팽창 및 비정상적 골 형성과 같은 부작용이 보고되고 있고 고가의 제조 원가로 특히 국내에서는 시장을 크게 점유하지 못하고 있다.

상기한 바와 같이, 골형성 단백질을 함유한 제품이 시장에 출시되고 있으나 BMP2의 반감기가 짧기 때문에 방출된 BMP2는 생체 활성을 빨리 잃게 될 수 있고, 또한 단순 담금으로 성장인자를 캐리어에 흡수시킨 형태로서 화학적 결합 부재로 이식 초기에 속방된 BMP2는 확산을 통한 급격한 손실로 인해 임상 치료시 치료 효과를 위해 다량의 BMP-2가 사용되게 되고 이는 높은 치료비 발생뿐 아니라 연조직 팽창, 이소성 골 형성등 골 재생 및 면역 반응을 포함한 바람직하지 못한 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서 성장인자를 잘 담지할 뿐 아니라 이식 후 서방형으로 성장 인자를 방출 시킬 수 있는 캐리어 개발이 요구된다. 또한 성장인자의 서방형 방출을 위해 골이식재와 성장인자를 일체형으로 담지시킨 제제들에 대한 특허는 존재하나 실제 상용화시 성장인자와 골이식재가 합체된 일체형 의료기기의 경우 멸균을 동시에 시킬 시 성장인자의 파괴 우려가 있고 골이식재의 유통 및 보관에도 제한이 있어 이식 전 바로 섞어도 성장인자가 효과적으로 이식재에 담지되고 이식 후에도 담지된 성장인자가 서방형으로 방출하게 하는 캐리어 개발은 상용화에 더 유리할 것이다.

국내특허출원번호 : 10-2012-0109601

Shimizu, Cha et al. 1998; Silicatein alpha: cathepsin L-like protein in sponge biosilica. Proc Natl Acad Sci USA 95:6234-6238 Kroger, Deutzmann et al. 1999; Polycationic peptides from diatom biosilica that direct silica nanosphere formation. Science 286:1129-1132 Cha, Stucky et al. 2000; Biomimetic synthesis of ordered silica structures mediated by block copolypeptides. Nature 403:289-292.

이에 본 발명자들은, 새로운 골이식재를 개발하기 위한 노력을 계속한 결과, 해양 유래 실리카 합성 펩타이드를 발굴하고, 이를 골이식재 표면에 코팅함으로써 실리카와 콜라겐이 적층된 구조를 형성하였으며, 이로 인해 생체분자의 담지력이 향상되고, 담지된 분자를 지속적으로 방출하는 용시용재용 캐리어로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 실리카 합성활성을 갖는 신규한 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 펩타이드를 포함하는 실리카 합성용 조성물, 골이식용 또는 골충진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 펩타이드를 이용한 골이식재 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 실리카 합성활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는, 실리카 합성용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는, 골이식용 또는 골충진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코팅하는 단계를 포함하는, 골이식재 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 해양 유래 펩타이드는 규산으로부터 실리카 합성 활성이 우수하여, 실리카와 콜라겐이 적층된 복합 골 이식재의 제조에 활용될 수 있다. 상기 복합 골 이식재는 기존 골 이식재에 비해 생체분자의 담지력이 향상되었으며, 담지된 분자를 지속적으로 방출하는 효과를 가지고 있는바, 손상된 골 부위에 이식시 골 재생을 촉진하는 효과가 우수하다. 따라서 본 발명에 따른 펩타이드는 실리카 합성 및 골이식 관련 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 펩타이드 및 실리카/콜라겐이 적층된 골이식재 제작 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 실리카/콜라겐 코팅에 따른 골이식재 표면을 관찰한 도이다.
도 3은 본 발명에 사용한 펩타이드의 실리카 형성능을 확인한 도(A) 및 실리카 적층된 골이식재의 변형 GFP 결합력을 확인한 도(B)이다.
도 4는 골이식재 표면 코팅에 따른 성장인자 결합 방식을 확인한 도이다.
도 5는 변형 GFP와 BMP2의 실리카/콜라겐 복합 골이식재에 대한 담지 효과를 확인한 도이다.
도 6은 손상뼈 모델을 이용한 골이식재의 골재생 속도를 확인한 도이다.
도 7은 MT-Goldner 콜라겐/골 염색을 통한 재생 골 조직의 골형성을 나타낸 도이다.
도 8은 재생 조직 내 골이식재, 경조직, 및 연조직 비율을 확인한 도이다.
도 9는 MT-Goldner 및 H&E 염색을 통해 재생 골 조직의 확대상을 비교한 도이다.
도 10은 동물 모델에서 골이식재에 의한 골 재생 속도를 확인한 도이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 실리카 합성활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.

본 발명에 있어서, 용어 "실리카 합성 활성을 갖는 펩타이드" 또는 “실리카 형성 펩타이드(Silica forming peptide, SFP)"는 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성(형성)할 수 있는 펩타이드를 총칭한다.

본 발명에 있어서, 용어 “실리카 형성 반응” 또는 “실리카 미네랄화 반응”은 유기 소재 또는 유기분자에 의한 실리카 미네랄을 형성하는 반응을 의미한다.

본 발명에 따른 실리카 합성활성을 갖는 펩타이드는 E6Ectp1이라고도 표기하며, 해양 생명체 유래의 펩타이드인 Ect1의 N 말단에 칼슘결합이 가능한 글루타믹 엑시드 잔기와 연결시퀀스인 글라이신 2개가 추가된 8개의 아미노산을 추가로 결합시켜 제조하였다.

구체적인 아미노산 서열은 다음과 같다.

E6Ectp1 : EEEEEEGGSSRSSSHRRHDHHDHRRGS (서열번호 1)

상기 펩타이드는 펩타이드를 합성하는 당해 분야의 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템 또는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.

상기 펩타이드는 상온 및 상압의 조건에서 및 중성 부근 약산 또는 약염기의 수용액 하에서 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성할 수 있으며, 특히, 펩타이드의 말단의 변형을 통해 반응기들이 골이식재에 결합하기보다 실리카 형성반응에 더 관여할 수 있어, 공지된 실리카 합성 펩타이드에 비해 더욱 우수한 활성을 가지고 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 실리카 합성용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 골이식용 또는 골충진용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 실리카 전구체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 실리카 전구체는 테트라메톡시 실란, 테트라메틸 오르토실리케이트, 테트라에틸 오르토실리케이트, 메틸트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다.

상기 조성물은 하이드록시아파타이트 또는 트리칼슘 포스페이트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 하이드록시아파타이트 또는 트리칼슘 포스페이트는 합성 분말 또는 다공성 블록일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 골형성 관련 생리활성물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어, "생리활성물질”은 조직 재생과정에서 치유능력을 촉진하는 생물학적 물질을 의미한다.

상기 골형성 관련 생리활성물질은 골형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP), 형질전환 성장 인자(Transforming growth factor, TGF), 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 혈소판 유래 성장인자(Platelet derived growth factor, PDGF), 표피 성장 인자(Epidermal growth factor, EGF), 및 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 조성물은 하이드록시아파타이트 또는 트리칼슘 포스페이트 표면에 서열번호 1의 아미노산로 이루어진 펩타이드, 실리카 전구체 및 콜라겐이 코팅된 형태일 수 있으며, 상기 콜라겐은 펩타이드 및 실리카 전구체의 상위 또는 하위에서 하이드록시아파타이트 또는 트리칼슘 포스페이트를 코팅하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 생리활성물질을 서방형으로 방출할 수 있다.

상기 조성물은 치과용 골이식용 또는 골충진용일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 골이식재 표면에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코팅하는 단계를 포함하는, 골이식재 제조 방법을 제공한다.

상기 방법은 (1) 골이식재에 서열번호 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코팅하는 단계; (2) 단계 1의 골이식재에 실리카 전구체를 코팅하는 단계; 및 (3) 단계 2의 골이식재에 콜라겐을 코팅하는 단계로 수행되거나, (1) 골이식재에 콜라겐을 코팅하는 단계; (2) 단계 1의 골이식재에 서열번호 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코팅하는 단계; 및 (3) 단계 2의 골이식재에 실리카 전구체를 코팅하는 단계;로 수행될 수 있다.

이때 최종 단계가 실리카 전구체를 코팅하는 단계로 끝나는 경우, 콜라겐으로 코팅하는 단계로 끝나는 경우에 비해 생리활성물질의 결합력이 약간 증가하며,

최종 단계가 콜라겐으로 코팅하는 단계로 끝나는 경우, 실리카 전구체를 코팅하는 단계로 끝나는 경우에 비해 골이식재의 이식 시 혈액과의 뭉침 현상이 더 좋은 것으로 나타나는바, 최종 단계는 콜라겐으로 코팅하는 단계로 끝나는 경우가 바람직하다.

상기 (1) 내지 (3) 의 단계는 1 내지 20회 반복할 수 있으며, 바람직하게는 2회 반복될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 방법은 (4) 골이식재 표면에 골형성 관련 생리활성물질을 코팅하는 단계;를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 (4) 단계는 용시에 실시할 수 있다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 해양 유래 실리카 합성 활성을 갖는 신규 펩타이드의 제조

해양 생물체 유래 펩타이드인 Ect1의 N 말단에 8개의 아미노산(칼슘결합이 가능한 글루타믹 엑시드 잔기와 연결시퀀스인 글라이신 2개)을 추가로 결합시켜 신규 펩타이드를 제조하였다. 이하에서는 E6Ectp1 또는 실리카 합성 펩타이드(SFP)라고 표시하였다.

구체적인 아미노산 서열은 다음과 같다.

E6Ectp1 : EEEEEEGGSSRSSSHRRHDHHDHRRGS (서열번호 1)

실시예 2. 해양 유래 신규 펩타이드가 코팅된 실리카/콜라겐 복합 골 이식재(Col/E6Ectp1Si@HA)의 제조

크기가 0.6~1mm 크기의 그래뉼 타입의 하이드록시 아파타이트(HA) 1g에 0.1 내지 0.5㎎/mL의 실시예 1에서 제조한 해양 유래 펩타이드(E6Ectp1)를 1mL 넣은 후 4℃에서 하룻밤 전반응을 수행하였다. 이후 3차 증류수로 1번 가볍게 수세하여 결합되지 않은 펩타이드를 제거하였다. 다음으로, 실리카 코팅을 위해, TEOS 0.75 ml를 25mL의 에탄올에 녹이고 여기에 1M HCl 10㎕를 포함하는 3% 규산(silicic acid)을 만든 후 상기 규산을 안정화하기 위해 72mM 콜린 염화물(cholin chloride) 25mL를 넣어 최종 부피가 50mL인 1.5% 규산을 준비하였다. 상기 1.5% 규산 10mL를 수세한 골이식재에 넣고 상온에서 6시간 내지 24시간 동안 진탕반응시켰다. 그 후, 증류수로 10번 수세한 후 상온에서 건조하였으며, 콜라겐 코팅을 수행하기 위해, 제1형 콜라겐 0.01 내지 0.05% 가 함유된 1×PBS에 상기 과정을 수행한 그래뉼 타입의 하이드록시 아파타이트(HA)를 넣고 6시간 내지 24시간 동안 상온에서 진탕반응시켰다. 반응을 종결한 후 비결합 콜라겐을 제거하고 건조시킨 후 증류수로 3번 수세하였으며, HA 표면에 다시 실리카 합성 펩타이드/실리카/콜라겐을 적층하기 위해 반응을 반복하였다. 이 반응은 다시 한번 반복 가능하며 총 2회 또는 3회 코팅을 실시하였고 최종 반응을 종결한 후 건조시키고 증류수로 3번 수세한 후 Biosafety cabinet에서 다시 건조시켰다. 이상의 실험 과정을 도 1의 오른쪽 과정에 나타내었으며, 모든 과정은 무균 과정으로 진행하였다.

다른 방법으로, HA 표면을 먼저 콜라겐으로 코팅한 후 실리카를 코팅하기 위한 과정은 도 1의 왼쪽 과정에 나타내었다. 이를 위해, 상기 그래뉼 타입의 하이드록시아파타이트 (HA)를 제1형 콜라겐 0.01 내지 0.05% 가 함유된 1×PBS에 넣어 6시간 내지 24시간 동안 상온에서 진탕반응시켜 콜라겐으로 코팅한 후, 해양유래 펩타이드(E6Ectp1)와 반응시켰다. 그 후 실리카 코팅을 한 후 세척하여 건조시킨 후, 상기 과정을 반복하기 위해서 다시 콜라겐을 코팅하고 실리카 합성 펩타이드와 반응시킨 후 실리카를 코팅하는 과정을 거쳐 건조 시키는 것으로 마무리하거나 필요한 경우 마지막 단계에 콜라겐을 다시 한번 최종 코팅한 후 건조시켰다.

대조군은 코팅 과정을 거치지 않은 하이드록시 아파타이트를 이용하였으며, 비교군은 도 1의 왼쪽 과정 중에서 실리카 합성 펩타이드 코팅 후 실리카 형성 반응으로 실리카를 적층 시키는 단계만을 적용하였으며, 콜라겐 코팅 없이 건조시켰다.

제조된 골이식재인 Col-E6Ectp1Si-HA의 표면을 주사 전자 현미경 관찰 (SEM)으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군인 아무 코팅도 하지 않은 하이드록시 아파타이트(HA) 그래뉼의 표면은 매끈한 표면을 나타내며, 비교군인 실리카 합성 펩타이드 코팅 후 실리카로만 코팅된 HA는 거친 표면을 나타내었다. 이에 비해, 본 발명에 따라 실리카 합성 펩타이드, 실리카 및 콜라겐을 2번에 걸쳐 코팅한 HA 표면은 대조군에 비해 표면 거칠기가 증가하였으며, 콜라겐 파이버에 의한 섬유조직이 관찰되었다.

실시예 3. 해양 유래 신규 펩타이드가 코팅된 βTCP 기반의 실리카/콜라겐 복합 골 이식재(Col/E6Ectp1Si@βTCP/Col)의 제조

0.6mm~1mm의 HA 대신 beta-TCP 그래뉼 1g을 실시예 2와 동일한 방법으로 도 1의 오른쪽 과정에 따라 실리카 합성 펩타이드/실리카/콜라겐 코팅을 2회 반복하여 제조하였다. 이후 제1형 콜라겐 0.07g~0.15g을 0.2M 아세트산 3~5mL에 녹여 젤 형태가 되게 한 후 상기 실리카/콜라겐이 코팅된 βTCP 기반의 골이식재와 섞어 반죽한 후, 2 mL 주사기, 또는 2 mm x 8 mm 구멍이 있는 실리콘 틀에 넣어 동결 건조하였으며, 투석막에 넣어 PBS로 1회 24시간씩 2회 투석하였다. 마지막으로 증류수로 1회 24시간 투석 후 동결건조 후 사용하였다.

대조군은 0.6mm~1mm의 beta-TCP 그래뉼 1g을 이용하였으며, 제1형 콜라겐 0.07g~0.15g을 0.2M 아세트산 3~5mL에 녹여 젤 형태가 되게 한 후 상기 실리카/콜라겐이 코팅된 βTCP 기반의 골이식재와 섞어 반죽하고, 2 mL 주사기, 또는 2 mm x 8 mm 구멍이 있는 실리콘 틀에 넣어 동결 건조하였다. 이를 투석막에 넣어 PBS로 1회 24시간씩 2회 투석하였다. 마지막으로 증류수로 1회 24시간 투석 후 동결건조 후 사용하였다.

실험예1 . 해양 유래 신규 펩타이드의 실리카 합성 효과 검증

실시예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드인 E6Ectp1의 실리카 형성 활성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 하이드록시 아파타이트 그래뉼을 대조군(HA)으로 하고 HA 1g에 5mg/mL의 서열번호 1의 펩타이드(E6Ectp1)를 넣어 12시간 4℃에서 반응시켰다. 펩타이드가 결합된 HA를 20mM 규산(silicic acid)이 포함된 PBS 용액에 담가 하룻밤 진탕 반응 시켰다(E6Ectp1Si@HA). 비교군으로 펩타이드 없이 같은 조건에서 HA를 담가 진탕 반응시킨 후(Si-HA), 각 골이식재의 실리카 양을 XPS로 분석하였다. 그 결과를 도 3A에 나타내었다.

도 3의 A에 나타낸 바와 같이, 대조군(HA)에서는 실리카가 검출되지 않았으며, 비교군의 경우 골이식재 성분 중 실리카가 약 0.19%를 차지한데 비해, 본 발명의 펩타이드를 코팅한 골이식재에서는 약 3.7%의 실리카가 검출되었다. 이를 통해 본 발명에 따른 해양 유래 펩타이드의 실리카 형성 능력을 확인하였다.

다음으로, 실리카 코팅에 의한 활성분자 결합능력을 확인하기 위해, BMP2와 유사한 표면 전하를 갖도록 제조된 변형 GFP(BMP2-like protein)를 이용하여 골이식재에 결합시킨 후, 결합된 양과 비결합된 양을 비교하였다. 그 결과를 도 3B에 나타내었다.

도 3의 B에 나타낸 바와 같이, 반응 30분 후 결합된 단백질 중 방출된 양과 골이식재에 남아 있는 양을 비교한 결과, 대조군에 비해 본 발명의 펩타이드를 코팅한 군에서 변형 GFP 단백질의 결합 증가를 확인하였다.

실험예 2. 해양 유래 신규 펩타이드를 이용한 실리카/콜라겐 복합 골 이식재(Col/E6Ectp1Si@HA)의 성장인자 담지 및 방출 효과 검증

실시예 2에서 제조한 해양 유래 펩타이드가 코팅된 골이식재의 성장인자 담지 및 방출 효과를 검증하기 위한 실험을 수행하였다. 먼저, 담지 물질로 rhBMP2에 FITC를 라벨링하여 FITC-BMP2를 제조하였다. 각각의 골이식재에 FITC-BMP2를 담지 시키고 30분 후 골이식재에 결합하지 않은 FITC-BMP2를 형광광도계로 측정 (excitation 485 nm/emission 535 nm)한 후, 결합된 FITC-BMP2 양을 비교하였다. 그 결과를 도 4A에 나타내었다.

도 4A에 나타낸 바와 같이, HA에는 넣어준 양 대비 10%만이 결합하였으나, 본 발명의 Col/E6Ectp1Si@HA에는 35%의 FITC-BMP2가 결합하였다. 즉, 본 발명의 해양유래 펩타이드 및 실리카/콜라겐 복합 코팅에 의해 FITC-BMP2의 담지력이 대조군에 비해 3배 이상 증가하였음을 확인하였다.

다음으로, 결합된 FITC-BMP2의 골이식재로부터의 방출패턴을 관찰하였다. 그 결과를 도 4B에 나타내었다.

도 4B에 나타낸 바와 같이, HA는 1일 후 20%, 9일 후 95%가 방출되었으며, 비교군인 E6Ectp1Si@HA는 1일 후 5% 미만이 방출되었고 10일 이후 30%가 방출된 후 거의 방출되지 않았다. 이에 반해, 본 발명의 Col/E6Ectp1Si@HA는 1일 후 5% 미만이 방출되었고 3일까지는 E6Ectp1Si@HA와 유사한 방출패턴을 보이다가 3일 이후 급격한 방출 증가를 나타내었다. 상기 실험 결과를 통해, 실리카 단독 코팅이 가지고 있는 문제점, 즉, 방출 속도가 너무 느린 점을 콜라겐/실리카 코팅을 통해 조절할 수 있음을 확인하였다.

상기 패턴을 정량화 하기 위하여 Korsemeyer-Peppas Model 식(아래 식)을 이용하여 FITC-BMP2의 방출 거동 및 속도를 측정하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[n=release exponent, k=release rate constant, R2=correlation co-efficient, Mt=released amount at time t, and M∞loaded amount]

상기 언급한 바와 같이, 본 발명자들은 실리카와 콜라겐의 조합을 통해 초기 방출속도 (K)를 조절할 수 있을 뿐 아니라 지속적 방출과 관련된 n 값을 조절할 수 있을 것으로 판단하였다. 이를 위해 등전점이 hBMP2와 유사한 변형 GFP를 이용하여 단백질 결합 및 방출 패턴을 조사하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 골이식재의 코팅 방법에 따라 rhBMP2와 변형 GFP의 결합패턴이 유사하게 나타남을 확인하였다.

따라서 변형 GFP를 이용하여 시간에 따른 방출 패턴을 조사하고 최적의 결합 및 방출 속도를 나타내는 골이식재를 조사하였다. 각 골이식재에 대한 변형 GFP의 방출 속도 및 패턴을 Korsemeyer-Peppas Model 식으로 계산하여 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 실리카와 콜라겐으로 1번 코팅시 모델 단백질의 초기 방출 속도가 50% 이상 줄고 초기 방출 이후 HA와 비슷하게 방출이 거의 일어나지 않으나, 실리카와 콜라겐을 2번 코팅하였을 때는 초기 방출 속도는 줄어든 반면 지속적 확산 속도는 증가한 것으로 나타났다. 또한, 실리카와 콜라겐을 3번 코팅하였을 때는 오히려 초기 방출 속도가 2번 코팅시보다 약간 증가하였으나 확산 속도는 낮았다. 따라서 실리카 및 콜라겐 2번 코팅을 최적으로 판단하였다.

Monolith NT.115를 이용한 Microscale Thermophoresis를 통해 결합 친화도(binding affinity)를 측정한 결과, 실리카 합성 펩타이드와 골성장인자인 BMP2 간에는 의미있는 결합 양식이 나타나지 않았으며, 이를 통해 본 발명에 따른 펩타이드 코팅이 실리카 형성을 촉진하나 BMP2의 결합에는 영향을 주지 않는 것으로 판단하였다. 또한, MC3T3 E1 마우스 조골세포를 이용한 골분화 및 골형성에 미치는 영향분석에서도 본 발명에 따른 펩타이드 코팅이 유의미한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 다만, 무기물로만 이루어진 실리카에 비해 펩타이드 매개로 형성된 유무기복합 실리카의 경우, 펩타이드가 실리카의 분해 속도에 영향을 주어 결합된 BMP2의 방출 속도에는 영향을 미침을 확인하였다.

실험예 3. 해양 유래 신규 펩타이드를 이용한 실리카/콜라겐 복합 골 이식재 (Col/Si) ₂ @HA)의 골 재생 능력 검증

실시예 2에서 제조한 해양 유래 펩타이드 매개 실리카 및 콜라겐이 코팅된 골이식재를 이용하여, 골 재생 능력을 확인하였다. 이때 실험예 2의 결과를 토대로 실리카 및 콜라겐 코팅은 2회 수행하였다. 아무 처리 하지 않은 시판 합성골 이식재인 Novosis HA를 대조군 캐리어(HA)로 사용하였다.

구체적으로, SD(Sprague-Dawley) 랫트의 두개골에 골 결손부위(8 mm)를 만들었으며, 실험예 2와 같은 방법으로 제조한 HA에 rhBMP2를 담지한 골 이식재를 결손 부위에 이식하였다. 동물 한 마리당 결손 부위에 최종 1, 2.5, 5 μg의 rhBMP2가 각각 담지 되도록 PBS에 녹인 rhBMP2의 농도를 조절하여 이식 30분 전에 캐리어에 섞은 후 사용하였다. 골이식재를 이식한 후, 손상골의 회복 양상을 1주부터 6주에 걸쳐 microCT 촬영을 통해 확인하였으며, 8주째에 최종 희생된 동물의 조직을 관찰하였다. rhBMP2를 처리하지 않은 Novosis HA 그룹, rhBMP2를 흡착시킨 Novosis HA 그룹(HA+BMP), 그리고 본 발명에 따른 골이식재에 rhBMP2를 흡착시킨 그룹((Col/Si)2@HA+BMP2)간의 골재생 속도를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 성장인자의 양과 골재생력 사이의 관계가 비례 관계가 아니며 골 재생을 위한 최적 농도가 필요함을 확인하였다. 이것은 캐리어의 특성과도 관계가 있다. 구체적으로, 대조군인 HA 처리군의 경우 2.5 ㎍ 사용시 가장 높은 골 재생을 나타내었고 첫 주에 골 재생이 높게 나타났다. 반면, 5 ㎍ 사용시에는 조기 골 재생으로 4주에 골 재생이 거의 멈춤으로 인해 충분한 골 재생이 저해되었고, 1 ㎍ 사용시에는 초기에 방출되어 남은 기간동안 골 재생이 진행되기에 성장인자가 부족한 것으로 판단되었다. 반면, 본 발명의 해양 유래 펩타이드가 코팅된 골이식재((Col/Si)2@HA)는 2.5 ㎍ 사용 시 가장 높은 골 재생을 나타내었으며 1 ㎍ 사용한 경우와 유의적 차이는 없었다. 또한, 2.5 ㎍ 사용시 초기 골 형성 속도는 HA 보나 낮으나 2주 후부터는 골 형성 속도가 더 빨라 6주에 가장 높은 골 형성률을 보였다. 또한, 1 ㎍ 사용 시에는 HA에 의한 골 재생에 비해 22% 이상 골 재생이 증가하였다. 이러한 현상은 캐리어와 성장인자간의 결합력이 강해 소량의 성장인자를 오랫동안 담지하고 서방형으로 방출함으로써 지속적 골 재생 촉진이 가능한 것에 기인한 결과이다.

다음으로, 1 ㎍ 의 rhBMP2가 담지된 골이식재를 이식한 동물들의 8주 후 골 재생을 조직학적으로 관찰하였다. 그 결과를 도 7 내지 도 9에 나타내었다.

도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, MT-Goldner 콜라겐/골 염색결과, 본 발명의 해양 유래 펩타이드가 코팅된 골이식재((Col/Si)2@HA+BMP2)에 의해 재생된 골 조직은 이식재와 골과의 결합이 우수하며 성숙골 속에 이식재가 매몰되어 있음을 확인하였다. 반면, 대조군인 HA+BMP에 의해 재생된 골 조직은 신생골 형성이 관찰되나 섬유성 결합조직의 증식이 뚜렷하여 복합 골이식재에 비해 경조직 비율이 낮았다.

또한, 도 9에 나타낸 바와 같이 각 처리군의 확대된 상을 비교해 볼 때, BMP2를 처리하지 않은 군(HA)에서는 신생골이 거의 형성되지 않으나 본 발명의 해양 유래 펩타이드가 코팅된 골이식재((Col/Si)2@HA+BMP2) 처리 군에서는 골막 아래로 골이 매끈하게 형성된 것을 확인할 수 있는데 이는 이식재로부터 지속적으로 BMP2가 방출되어 골유도를 한 것으로 판단된다.

실험예 4. 해양 유래 신규 펩타이드가 코팅된 βTCP 기반의 실리카/콜라겐 복합 골 이식재((Col/Si)@βTCP/Col)의 동물 모델에서의 활성 검증

실시예 3에서 제조한 해양 유래 신규 펩타이드가 코팅된 βTCP 기반의 실리카/콜라겐 복합 골 이식재를 이용하였으며, 이때 실험예 2의 결과를 토대로 실리카 및 콜라겐 코팅은 2회 수행하여 제작하였다. 여기에 골이식재 중량 대비 10% 소 1형 콜라겐이 혼합된 골이식재(2mm x 8 mm 크기의 원반형)를 이용하여, 골 재생 능력을 확인하였다. 아무 처리 하지 않은 βTCP와 10% 콜라겐이 혼합된 βTCP/Col을 대조군 캐리어로 사용하였다.

구체적으로, SD(Sprague-Dawley) 랫트의 두개골에 골 결손부위(8mm)를 만들었으며, 실험예 2와 유사한 방법으로 골이식재에 rhBMP2를 담지한 골 이식재를 결손 부위에 이식하였다. 동물 한 마리당 결손 부위에 최종 1 μg의 rhBMP2가 각각 담지 되도록 PBS에 녹인 rhBMP2의 농도를 조절하여 이식 30분 전에 캐리어에 섞은 후 사용하였다. 골이식재를 이식한 후, 손상골의 회복 양상을 1주부터 8주에 걸쳐 microCT 촬영을 통해 골재생을 확인하였다. rhBMP2를 처리하지 않은 βTCP/Col 그룹, rhBMP2를 흡착시킨 βTCP/Col 그룹(βTCP/Col+BMP), 그리고 본 발명에 따른 골이식재에 rhBMP2를 흡착시킨 그룹((Col/Si)@βTCP/Col+BMP)간의 골재생 속도를 표 3 내지 5, 및 도 10에 나타내었다.

βTCP/collagen의 μCT 측정을 통한 신생골 형성 %

	1	2	4	6	8
βTCP/Col +PBS-1	48.29412	52.56049	67.36846	60.74038	62.34507
βTCP/Col +PBS-2	47.67299	57.21153	62.26699	64.94307	67.1265
βTCP/Col +PBS-3	50.78956	57.30784	67.52425	69.71064	69.54137
βTCP/Col +PBS-4	48.09954	45.36222	53.75279	52.58632	60.26937
mean	48.71405	53.11052	62.72812	61.9951	64.82058
sd	1.407777	5.620631	6.462838	7.264515	4.260078

βTCP/collagen+rhBMP2(1 μg)의 μCT 측정을 통한 신생골 형성 %

	1	2	4	6	8
βTCP/Col +BMP-1	40.91572	48.91413	62.39724	67.024	70.45852
βTCP/Col +BMP-2	52.40068	59.54967	69.86605	71.33	72.70087
βTCP/Col +BMP-3	44.97122	57.84023	69.23038	72.48051	75.44627
βTCP/Col +BMP-4	54.96161	42.33732	41.9939	43.10462	42.89169
mean	48.31231	52.16034	60.87189	63.48478	65.37434
sd	6.501292	8.03934	13.03156	13.78825	15.12658

(Col/Si)@βTCP/collagen+rhBMP2(1 μg)의 μCT 측정을 통한 신생골 형성 %

	1	2	4	6	8
(Col/Si)@βTCP/collagen+BMP-1	41.57968	49.83504	60.94675	68.67336	73.39701
(Col/Si)@βTCP/collagen+BMP-2	46.55464	50.7691	60.97675	66.01051	75.51372
(Col/Si)@βTCP/collagen+BMP-3	49.0798	41.97737	55.59293	63.37739	74.42508
(Col/Si)@βTCP/collagen+BMP-4	47.16493	54.63935	71.08763	78.98929	83.37954
mean	46.09476	49.30522	62.15102	69.26264	76.67884
sd	3.196517	5.309551	6.473039	6.835386	4.549972

표 3 내지 5 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 8주 실험 후 rhBMP2 담지에 의한 골재생 속도를 비교한 결과, 본 발명에 따른 (Col/Si)@βTCP/Col 처리군이 βTCP/Col 처리군에 비해 골재생 속도가 약 17% 증가하였다. 구체적으로, βTCP/Col+BMP 그룹은 초기에는 더 빠른 골형성을 나타내다가 4주 이후 매우 천천히 골 생성이 되는 반면, 본 발명에 따른 (Col/Si)@βTCP/Col+BMP 그룹은 초기에는 골생성 속도가 느리나 4주 이후부터 더 빠르게 신생골이 형성되었고 이는 담지된 rhBMP2가 βTCP/Col+BMP 그룹에서 초기에 빨리 방출되는 것에 비해 (Col/Si)@βTCP/Col+ BMP 그룹은 rhBMP2가 초기부터 후반까지 서서히 지속적으로 방출되어 신생골 형성이 증가하는 것에 의한 결과이다.

이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 신규한 해양 유래 펩타이드는 규산으로부터 실리카 합성 활성이 우수하여, 실리카와 콜라겐이 적층된 복합골 이식재의 제조에 활용될 수 있으며, 상기 복합골 이식재는 기존 이식재에 비해 생체분자의 담지력이 향상되었을 뿐만 아니라 담지된 분자를 지속적으로 방출하는 효과를 가지고 있는바, 손상된 골 부위에 이식 시 골 재생을 촉진하는 효과가 우수함을 확인하였다.

<110> Korea University Research and Business Foundation, Sejong Campus <120> Peptides from marine resources capable of silica formation and use thereof <130> 1-1 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E6Ectp1 <400> 1 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser His Arg 1 5 10 15 Arg His Asp His His Asp His Arg Arg Gly Ser 20 25

Claims (22)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 실리카 합성활성을 갖는 펩타이드.
2. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 실리카 합성용 조성물.
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 조성물은 실리카 전구체를 추가로 포함하는 것인, 실리카 합성용 조성물.
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 실리카 전구체는 테트라메톡시 실란, 테트라메틸 오르토실리케이트, 테트라에틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 실리카 합성용 조성물.
5. 청구항 2에 있어서,
   상기 조성물은 콜라겐을 추가로 포함하는 건인, 실리카 합성용 조성물.
6. 청구항 2에 있어서,
   상기 조성물은 하이드록시아파타이트 또는 트리칼슘 포스페이트를 추가로 포함하는 것인, 실리카 합성용 조성물.
7. 청구항 2에 있어서,
   상기 조성물은 골형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP), 형질전환 성장 인자(Transforming growth factor, TGF), 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 혈소판 유래 성장인자(Platelet derived growth factor, PDGF), 표피 성장 인자(Epidermal growth factor, EGF), 및 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 골형성 관련 생리활성물질을 추가로 포함하는 것인, 실리카 합성용 조성물.
8. 삭제
9. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 골이식용 또는 골충진용 조성물.
10. 청구항 9에 있어서,
    상기 조성물은 실리카 전구체를 추가로 포함하는 것인, 골이식용 또는 골충진용 조성물.
11. 청구항 9에 있어서,
    상기 조성물은 콜라겐을 추가로 포함하는 것인, 골이식용 또는 골충진용 조성물.
12. 청구항 9에 있어서,
    상기 조성물은 하이드록시아파타이트 또는 트리칼슘 포스페이트를 추가로 포함하는 것인, 골이식용 또는 골충진용 조성물.
13. 청구항 9에 있어서,
    상기 조성물은 하이드록시아파타이트 또는 트리칼슘 포스페이트 표면에 서열번호 1의 아미노산로 이루어진 펩타이드, 실리카 전구체 및 콜라겐이 코팅된 것을 포함하는 것인, 골이식용 또는 골충진용 조성물.
14. 청구항 9에 있어서,
    상기 조성물은 골형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP), 형질전환 성장 인자(Transforming growth factor, TGF), 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 혈소판 유래 성장인자(Platelet derived growth factor, PDGF), 표피 성장 인자(Epidermal growth factor, EGF), 및 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 골형성 관련 생리활성물질을 추가로 포함하는 것인, 골이식용 또는 골충진용 조성물.
15. 삭제
16. 청구항 14에 있어서,
    상기 조성물은 골형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP), 형질전환 성장 인자(Transforming growth factor, TGF), 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 혈소판 유래 성장인자(Platelet derived growth factor, PDGF), 표피 성장 인자(Epidermal growth factor, EGF), 및 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 골형성 관련 생리활성물질을 서방형으로 방출하는 것을 특징으로 하는, 골이식용 또는 골충진용 조성물.
17. 청구항 9에 있어서,
    상기 조성물은 치과용 골이식용 또는 골충진용인, 골이식용 또는 골충진용 조성물.
18. 골이식재 표면에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코팅하는 단계를 포함하는, 골이식재 제조 방법.
19. 청구항 18에 있어서,
    상기 방법은
    (1) 골이식재에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코팅하는 단계;
    (2) 단계 1의 골이식재에 실리카 전구체를 코팅하는 단계; 및
    (3) 단계 2의 골이식재에 콜라겐을 코팅하는 단계를 포함하며, 상기 (1) 내지 (3)의 단계를 1 내지 20회 반복하는 것인, 골이식재 제조 방법.
20. 청구항 18에 있어서,
    상기 방법은
    (1) 골이식재에 콜라겐을 코팅하는 단계;
    (2) 단계 1의 골이식재에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코팅하는 단계; 및
    (3) 단계 2의 골이식재에 실리카 전구체를 코팅하는 단계;를 포함하며, 상기 (1) 내지 (3)의 단계를 1 내지 20회 반복하는 것인, 골이식재 제조 방법.
21. 청구항 19 또는 20에 있어서,
    (4) 골이식재 표면에 골형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP), 형질전환 성장 인자(Transforming growth factor, TGF), 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 혈소판 유래 성장인자(Platelet derived growth factor, PDGF), 표피 성장 인자(Epidermal growth factor, EGF), 및 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 골형성 관련 생리활성물질을 코팅하는 단계;를 추가로 포함하는 것인, 골이식재 제조 방법.
22. 청구항 21에 있어서,
    상기 (4) 단계는 용시(用時)에 실시하는 것인, 골이식재 제조 방법.

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