KR101954125B1 - 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골 재생에 사용 가능한 해양 생물 유래의 유전자원을 활용하여 이들의 촉매형 주형으로 사용되어 형성되는 바이오 미네랄화 반응을 통해 생리활성물질을 골 이식재에 결합시키는 기술로서, 해양 생물 유래 유기 분자를 활용하여 이들에 의한 미네랄화를 통해 생리활성물질을 다양한 캐리어에 결합시킨 골 이식재(골 재생용 소재)를 제공한다. 특히, 이식 후 4~6주간 서방형으로 생리활성물질(성장인자)를 방출이 제어되는 생리활성물질 담지 골 이식재를 제조할 수 있다.

Description

서방형 생리활성물질 담지 골 이식재 및 이의 제조방법{Sustained release bioactive substance-carrying bone graft and manufacturing method thereof}

본 발명은 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

실리카는 특정 화학 종들과 공유 결합이 가능하기 때문에 새로운 하이브리드 소재(유기-무기 복합체) 합성에 중요하고, 또한 생체 적합한 소재로서 각 개별 소재의 단점을 보완할 수 있는 우수한 특성을 갖고 있다. 현재 실리카의 공업적 생산 공정은 고온, 강산 또는 강염기 조건이 요구되고 환경적으로 유해한 부산물 산생의 문제점이 있다. 그러나 해양 생명체인 스펀지와 규조류의 추출물 또는 유전학적 정보를 바탕으로 실리카를 생합성하는 효소 및 펩타이드가 발견됨으로써 이들에 의해 생산된 환경친화적 바이오실리카 및 이의 다양한 용도로의 응용성으로 인해 전 세계적으로 해양 유래 바이오 실리카 복합 소재 개발이 이슈화 되고 있다 (비특허문헌 1~4). 따라서 생물학적 합성방법을 통한 바이오실리카 소재 확보를 위한 원천 기술의 보유는 매우 중요하다.

현재 골 형성 단백질을 함유한 제품이 시장에 출시되고 있으나 단순 담금으로 생리활성물질(성장인자)을 골 이식재에 흡수시킨 형태로서 화학적 결합 부재로 이식 초기에 단백질 속방에 의한 팽윤(swelling) 현상이 보고되고 있고 방출 속도의 제어가 불가능하여 이식 초기에 다량 소실되고 부작용의 발생하였다. 초기 속방으로 인한 다량의 생리활성물질(성장인자) 방출 속도를 줄여 생리활성물질 (성장인자)의 대량 방출로 인한 부작용을 최소화할 수 있는 이식재 개발이 시급한 실정이다.

Shimizu, Cha et al. 1998; Silicatein alpha: cathepsin L-like protein in sponge biosilica. Proc Natl Acad Sci USA 95:6234-6238 Kroger, Deutzmann et al. 1999; Polycationic peptides from diatom biosilica that direct silica nanosphere formation. Science 286:1129-1132 Cha, Stucky et al. 2000; Biomimetic synthesis of ordered silica structures mediated by block copolypeptides. Nature 403:289-292. Poulsen and Kroger 2004; Silica morphogenesis by alternative processing of silaffins in the diatom Thalassiosira pseudonana. J Biol Chem 279: 42993-42999.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 해양 생물 유래 실리카 형성 유기 분자(펩타이드 또는 고분자)의 실리카 형성 반응을 통하여 골 이식재 표면에 생리활성물질이 결합된, 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재를 제조함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 해양 생물 유래 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자의 실리카 형성 반응을 통하여 골 이식재 표면에 생리활성물질이 결합된, 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 실리카 합성용 조성물을 제공한다.

상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 해양 생물 유래 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자의 실리카 형성 반응을 통하여 골 이식재 표면에 생리활성물질이 결합된, 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 골 재생에 사용 가능한 해양 생물 유래의 유전자원을 활용하여 이들의 촉매형 주형으로 사용되어 형성되는 바이오 미네랄 반응을 통해 생리활성 분자를 골 이식재에 결합시킴으로써 기존의 고정화가 어려웠던 생리활성물질 등을 생물학적 온화한 조건, 즉 상온, 상압, 중성 부근(pH 6~8)의 수용액에서 무기물에 고정화시키는데 용이하며, 생리활성물질(성장인자) 방출이 제어되는 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재(골 지지체)를 제공한다.

즉, 본 발명에 따른 골 이식재는 초기 속방으로 인한 다량의 생리활성물질(성장인자) 방출 속도를 줄일 수만 있어도 생리활성물질(성장인자)의 대량 방출로 인한 부작용을 최소화할 수 있으며 고가의 생리활성물질(성장인자)의 사용량을 줄임으로 경제적 처치 부담을 감소시킬 수 있다.

도 1은 해양 생물 유래 SFP의 HAp와의 결합력을 증가시키기 위해 6개의 글루타믹 엑시드를 결합시킨 CBP에 매개의 실리카 형성 반응에 의한 HAp의 미네랄화 (A) 및 CBP의 실리카 형성(B)을 확인한 것이다.
도 2는 해양 생물 유래 SFP의 실리카 형성 반응에 의한 HAp의 미네랄화 및 BMP2 펩타이드의 HAp로의 고정화를 나타낸 것이다.
도 3은 유전자 발현 분석을 통한 해양 생물 유래 SFP의 실리카 형성 반응에 의한 BMP2의 HAp로의 고정화 효과를 분석한 것이다.
도 4는 Alizarin red S 염색을 이용한 골 미네랄화 분석과 이를 통한 해양 생물 유래 SFP의 실리카 형성 반응에 의한 BMP2의 HAp로의 고정화 효과를 분석한 것이다.
도 5는 해양 생물 유래 SFP의 실리카 형성 반응에 의한 GFP의 HAp 골이식재로의 고정화를 나타낸 것이다.
도 6은 해양 생물 유래 SFP의 실리카 형성 반응에 의한 GFP의 HAp 결합 후 GFP 방출 거동을 나타낸 것이다.
도 7은 치과 골 이식재의 젖음성 테스트를 나타낸 것이다.
도 8은 시판 골 이식재 D 제품의 실리카 미네랄화 골 이식재 표면 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 해양 생물 유래 실리카 형성 유기 분자에 의한 골 이식재의 실리카 미네랄화 및 생리활성물질 결합 모식도를 나타낸 것이다[(A) 생리활성물질을 실리카 형성 반응에 의해 골 이식재에 고정화시켜 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재를 제조하는 과정, (B) 유기 분자에 의해 실리카 미네랄화된 골 이식재에 생리활성물질을 후 담지하여 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재를 제조하는 과정].
도 10은 해양 생물 유래 실리카 형성 유기 분자에 의한 실리카 미네랄화된 골이식재의 rhBMP2의 담지 후 초기 4시간(A), 312시간(B)까지 rhBMP2 방출 거동을 나타낸 것이다.
도 11은 실리카 미네랄화 및 고분자로 코팅된 골 이식재의 rhBMP2의 담지량을 비교한 것이다.
도 12는 손상 뼈 모델을 이용한 해양 생물 유래 실리카 형성 유기 분자에 의한 실리카 미네랄화된 골 이식재 및 rhBMP2가 담지된 골 이식재의 골 재생 능력을 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

용어, "실리카 형성 펩타이드(Silica forming peptide, SFP)" 또는 "실리카 합성 활성이 있는 펩타이드"는 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성(형성)할 수 있는 펩타이드를 총칭한다.

용어, "실리카 형성 고분자"는 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성(형성)할 수 있는 고분자를 총칭한다.

용어, "생리활성물질”은 조직 재생과정에서 치유능력을 촉진하는 생물학적 물질을 의미한다.

용어, “실리카 미네랄화 반응” 또는 “실리카 형성 반응”은 유기 소재 또는 유기분자에 의한 실리카 미네랄을 형성하는 반응을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 실리카 합성 펩타이드를 포함하는, 실리카 합성용 조성물에 관한 것이다.

상기 실리카 합성 펩타이드는 해양 생명체 유래의 펩타이드(서열번호 3의 Ect_p1)에 칼슘 결합이 가능한 글루타믹 엑시드 잔기를 첨가한 서열번호 1(SSRSSSHRRHDHHDHRRGSEEEEEE)로 표시되는 펩타이드 CBP로서 실리카를 합성할 수 있는 활성을 가지고 있다.

상기 조성물은 실리카 전구체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 실리카 전구체는 테트라메톡시 실란, 테트라메틸 오르토실리케이트, 테트라에틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 본 발명에 따른 실리카 합성용 조성물은 하이드록시아파타이트를 추가로 포함할 수 있다.

상온 및 상압의 조건에서 중성 즉, pH 6 에서 8의 수용액 하에서 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성할 수 있다. 본 발명의 실리카 합성방법을 보다 구체적으로 설명하면, Tris-HCl 용액 또는 인산완충용액 (pH 6 내지 8)에 녹아 있는 실리카 전구체 및 실리카 형성 펩타이드를 혼합하고, 상온, 상압의 조건에서 반응시킨 후 원심분리하여 실리카를 침전시킴으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 해양 생물 유래 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자의 실리카 형성 반응을 통하여 골 이식재 표면에 생리활성물질이 결합된, 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재에 관한 것이다.

상기 해양 생물 유래 실리카 형성 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 갈조류인 엑토카퍼스 실리쿨로서스 (Ectocarpus siliculosus) 유래의 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(Ect_p1) (특허 제 10-1473059, 실리카 합성 펩타이드 및 이의 용도), 갈조류인 엑토카퍼스 실리쿨로서스(Ectocarpus siliculosus) 유래의 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 (Ect_p2) (특허 제 10-1473059, 실리카 합성 펩타이드 및 이의 용도), 살핑고에카 에스피(Salpingoeca sp.) 유래의 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(Sal_p1) (특허 제 10-1473059, 실리카 합성 펩타이드 및 이의 용도), 볼복스 유래의 서열번호 6, 7, 그리고 8의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(Vol_p1, Vol_p2, 그리고 Vol_p3) (특허 제 10-1473059, 실리카 합성 펩타이드 및 이의 용도)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 해양 생물 유래 실리카 형성 고분자는 키토산, 키토산 올리고당, 콜라겐, 히알루론산, 알긴산, 알긴산 알카리 금속염, 후코이단, 풀루란, 셀룰로오스, 하이드록시메틸프로필셀룰로오스, 덱스트린, 덱스트란, 폴리덱스트로오스, 잔탄검, 젤란검 및 카라기난으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 실리카 형성 반응은 실리카 전구체를 추가하여 실시할 수 있다. 상기 실리카 전구체는 테트라메톡시 실란, 테트라메틸 오르토실리케이트, 테트라에틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 생리활성물질은 제2형 골 형성 단백질(Bone Morphogenic Protein-2, BMP2), 혈소판유래 성장인자(Platelet derived growth factor, PDGF), 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 형질전환 성장인자(Transforming growth factor beta 1, TGF-beta1) 및 표피 성장 인자(Epidermal growth factor, EGF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 골 이식재는 생물유래 골미네랄의 분말 및 다공성 블록, 합성 수산화아파타이트의 분말 및 다공성 블록, 트리칼슘인산의 분말 및 다공성 블록, 모노칼슘인산의 분말 및 다공성 블럭, 이산화규소(실리카)로 이루어진 골 이식재, 실리카와 고분자의 혼합체로 이루어진 골충진 이식재로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 골 이식재에 해양 생물 유래 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자, 실리카 전구체 및 생리활성물질을 실리카 형성 반응시키는 단계를 포함하는, 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재의 제조방법에 관한 것이다.

상기 실리카 형성 반응은 실리카 전구체를 추가하여 실시할 수 있다. 상기 실리카 형성 반응을 구체적으로 설명하면, 골 이식재 100 중량부에 대하여 Tris-HCl 용액 또는 인산완충용액 (pH 6 내지 8)에 녹아 있는 실리카 전구체 0.1 중량부 내지 40 중량부(바람직하게는 1 중량부 내지 30 중량부), 생리활성물질 0.001 내지 0.1 중량부, 및 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자 0.01 중량부 내지 5 중량부(바람직하게는 0.01 중량부 내지 2 중량부)로 혼합하고, 상온, 상압의 조건에서 진탕 반응시킨다.

보다 상세하게는 골 이식재 100 중량부를 에탄올에 넣어 교반 후 원심분리하여 에탄올을 제거하고 증류수로 세척한다. 그런 다음, 인산완충식염수(PBS)를 넣고 여기에 0.01 중량부 내지 5 중량부(바람직하게는 0.01 중량부 내지 2 중량부)의 해양 생물 유래 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자를 첨가 후 교반하여 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자가 골 이식재에 결합하도록 한 후, 0.001 중량부 내지 0.1 중량부의 생리활성물질을 첨가하고 실리카 전구체 0.1 중량부 내지 40 중량부(바람직하게는 1 중량부 내지 30 중량부)를 첨가, 교반한다. 그런 다음 원심분리를 통해 결합되지 않은 분자 및 미반응 물질들을 제거하고 회수된 골 이식재를 다시 PBS로 세척한다. 다시 PBS를 넣고 실리카-펩타이드 또는 고분자-생리활성물질-골 이식재 복합체 제조를 1회 내지 3회 반복한다. 마지막으로 제조된 복합체를 동결건조하여 보관한다. 모든 과정은 상온, 상압, 중성 및 무균 상태에서 수행한다.

첨부도면 도 9의 A는 해양 생물 유래 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자를 이용한 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재의 제조과정의 일례를 나타낸다.

또한, 본 발명은 골 이식재에 해양 생물 유래 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자 및 실리카 전구체를 실리카 형성 반응시켜 실리카- 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자-골이식재 복합체를 제조하는 단계; 및

상기 복합체에 생리활성물질을 담지시키는 단계

를 포함하는, 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재의 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는 골 이식재 100 중량부를 에탄올에 넣어 교반 후 해양 생물 유래 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자 0.01 중량부 내지 5 중량부(바람직하게는 0.01 중량부 내지 2 중량부)를 첨가 후 교반한다. 여기에 실리카 전구체 0.1 중량부 내지 40 중량부(바람직하게는 1 중량부 내지 30 중량부)를 첨가한 후 상온에서 교반 후 암모니아수 0.01 중량부 내지 1 중량부를 첨가하여 12시간 이상 교반시킨다. 교반 후 원심분리를 통해 결합되지 않은 분자 및 미반응 물질들을 제거하고 회수된 골 이식재를 다시 증류수로 세척한다. 다시 에탄올에 넣고 실리카-펩타이드 또는 고분자-골 이식재 복합체 제조를 1회 내지 3회 반복한다. 마지막으로 제조된 복합체를 동결 건조하여 보관한다. 모든 과정은 상온, 상압, 중성 및 무균 상태에서 수행한다. 이렇게 제조된 복합체 건조물에 0.001 중량부 내지 0.1 중량부의 생리활성물질을 담지시킨다. 상기 생리활성물질 담지는 실리카 형성 반응으로 고정화된 골 이식재에 생리활성물질을 물리적 흡착방법(ex, 침지법) 등의 통상적으로 사용되는 담지법으로 실시 가능하다.

첨부도면 도 9의 B는 해양 생물 유래 실리카 형성 펩타이드 또는 고분자를 실리카 형성 반응시켜 제조된 복합체에 생리활성물질을 담지시킨 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재의 제조과정의 일례를 나타낸다.

상기에서 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재와 관련하여 기술한 모든 내용이 서방형 생리활성물질 담지 골 이식재의 제조방법에 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

제조예 1: CBP 제조

HAp에 결합력을 증진시키기 위해 실리카 형성 펩타이드에 6개의 글루타믹 엑시드를 첨가하였다. 펩타이드는 Genscript 사 (GenScript USA Inc. NJ, USA) 또는 펩트론(Peptron, Dajeon, Korea)에 의뢰하여 90% 이상의 순도로 합성 제작하였다.

제조예 2: CBP 실리카 형성 확인

Ect_p1에 칼슘 결합 가능한 glutamic acid 잔기를 첨가한 CBP (SSRSSSHRRHDHHDHRRGSEEEEEE, 서열번호 1)의 실리카 형성능을 확인하기 위해, 0.1mg/ml 농도의 CBP가 포함된 인산완충용액 1 ml를 0.1 g의 HAp와 하룻밤 반응시킨 후 1M 농도의 가수분해된 실리카 전구체(tetramethoxysilane, TMOS)를 20㎕ 첨가한 후 2시간 동안 교반하였다. 교반 후 원심분리를 통해 결합되지 않은 분자 및 미반응 물질들을 제거하고 회수된 HAp를 다시 증류수로 3번 세척하였다. 다시 PBS 1 ml를 넣고 펩타이드-실리카-HAp 복합체 제조를 반복하였다. 이때는 1mg/ml SFP 를 50㎕ 첨가하여 30분간 교반하고 1 M 농도의 가수분해된 실리카 전구체를 10㎕ 첨가한 후 2시간 동안 교반하였다. 교반 후 원심분리를 통해 결합되지 않은 분자 및 미반응 물질들을 제거하고 회수된 HAp를 다시 증류수로 3번 세척하였다. 마지막으로 제조된 복합체를 동결건조하여 보관하였다. 모든 과정은 무균상태에서 수행하였다. 대조구로는 실리카 반응 시 CBP가 없는 동일한 조건으로 실리카 전구체 존재하에 실리카 반응을 유도하였다. HAp의 표면에 실리카가 형성된 상태를 SEM 이미지로 확인하였고(도 1의 A) 표면에 침전된 실리카 양은 molybdate-blue 법을 이용하여 정량하였다(도 1의 B). 정량법을 간단히 설명하면 먼저 실리카 미네랄화된 물질을 1M NaOH에 95 ℃에서 30분간 용해시킨 후 1M HCl을 넣어 중화시켰다. 이 혼합물을 0.1N 황산 중에 녹아있는 2 mg/ml 농도의 암모늄 헵타몰리브데이트 용액을 동량의 부피로 첨가하고 5분간 정치 후, 동량의 부피의 50 mg/ml 옥살산 용액과 동량의 환원 완충액 (100 mM 아스코르 빈산액)을 순차적으로 첨가하였다. 이 혼합물의 흡광도를 마이크로 플레이트 판독기(Infinite M200 PRO, TECAN, Austria)를 사용하여 700 nm에서 측정하였다. 표준 실리카 용액은 메타 규산 나트륨을 사용하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 실리카가 HAp 골이식재 표면에 침전된 것이 CBP 존재 하에서는 확연히 관찰되었고 정량을 통해서도 10배 이상의 실리카 침전 반응이 유도되었음을 확인하였다.

실시예 1: HAp에 BMP2 펩타이드 고정화 및 해양 생물 유래 실리카 형성 분자 매개의 실리카 미네랄화에 의한 골 재생 촉진 효과 확인

100 mM 하이드록시아파타이트(HAp) 분말 (~200nm 크기) 100 ㎕에 HAp와의 결합력을 증가시키기 위해 Genscript사(GenScript USA Inc. NJ, USA))로부터 합성한 6개의 글루타믹 엑시드 아미노산 잔기 6개가 BMP2 펩타이드 카르복시기 말단에 붙은 BMP2 펩타이드(KIPKASSVPTELSAISTLYLGGKGSSEEEEEE, 서열번호 9)를 제작하고 2㎎/ml의 농도 BMP2 펩타이드를 5㎕ 넣은 후 10분간 전반응을 시켜 HAp에 결합하도록 한 후 여기에 1 mg/mL의 해양 생물 유래 실리카 형성 펩타이드(SFP) 50㎕, 가수분해된 1 M TMOS(tetramethoxysilane)를 20㎕를 넣어 최종 부피가 500㎕의 1× PBS(phosphate buffered saline) 반응계에서 하룻밤 진탕 반응시켰다. 이때 SFP로는 3종류의 SFP을 사용하였다. 3종류 SFP는 각각 CBP(SSRSSSHRRHDHHDHRRGSEEEEEE, 서열번호 1), R5(SSKKSGSYSGSKGSKRRIL, 서열번호 2), Ect_p1(SSRSSSHRRHDHHDHRRGS, 서열번호 3)이다.

대조구로는 100 mM HAp 100 ㎕만 넣은 경우, 100 mM HAp 100 ㎕와 2㎎/ml의 BMP2 펩타이드 5㎕를 넣은 경우, 그리고 100 mM HAp 100 ㎕, 2㎎/ml의 BMP2 펩타이드 5㎕, 그리고 가수분해된 1M TMOS를 20㎕를 넣은 경우로 최종 부피가 500㎕의 1× PBS 반응계에서 하룻밤 진탕 반응시켰다. 반응을 종결한 후 13000 rpm에서 2분간 원심분리 후 반응액을 제거 후 침전물을 회수하여 증류수로 부유시켜 다시 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 이 방법을 3회 반복하여 HAp에 결합되지 않은 성분들을 제거하고 침전물을 70% 에탄올에 부유시켜 하룻밤 정치시켜 살균한 후 다시 원심분리를 통해 에탄올을 제거하고 살균된 증류수로 원심분리를 이용한 세척 과정을 3회 반복하였다. SFP에 의한 미네랄화된 HAp의 침전량은 대조군에 비해 1.5배 증가하였고 침강 속도는 SFP 없는 반응 대조군들이 바로 침전되는 것에 비해 부유상태로 있다가 서서히 침강하였다 (도 2).

골세포 분화에 미치는 효과를 보기 위해 preosteoblast인 MC3T3 E1 세포를 12 well plate에 well 당 5 ×10⁵ cells을 접종하고 하루 배양 후 다음날 제조된 HAp를 500㎕ 부유액 중 100㎕를 첨가하여 배양하였다. 배양 배지로는 10% FBS(Fetal bovine serum)와 1% 항생제가 포함된 alpha-MEM 배지에서 3일간 배양 후 같은 배지에 10mM beta-glycerophosphate와 50 μM 아스코르브산(ascorbic acid)이 더 첨가된 분화 배지를 바꾸어 배양하였다. 7일, 14일간 배양 후 유전자 발현을 분석하였고 도 2에 나타내었다. 결과 골 분화 마커인 ALP(alkaline phosphatase)와 골 미네랄화에 관여하는 osteocalcin의 발현이 실리카 미네랄화로 인한 BMP2 고정화된 HAp 처리 그룹에서 유의적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 무엇보다 HAp에 단순히 BMP2를 첨가한 경우 세척 과정에서 BMP2가 쉽게 제거되어 HAp만 처리한 그룹과 차이를 나타내지 않았다(도 3). 3주 후 Alizarin Red S를 이용한 골 미네랄화 반응을 분석한 결과 HAp 단독 처리보다는 실리카와 BMP2가 처리된 그룹에서 유의적으로 Alizarin Red S로 붉게 염색된 칼슘침전 부분이 증가됨을 통해 골 미네랄화가 증가됨을 관찰할 수 있었다(도 4). 대조구로 사용한 R5 펩타이드에 의한 실리카 형성 반응 보다 CBP 및 Ect_p1을 이용한 실리카 미네랄화를 통한 HAp를 처리시 골 미네랄화가 더 증가하였는데 이는 본 발명에 사용한 해양 생물 유래 실리카 형성 분자의 기능성이 우수함을 가정케 하였다. CBP와 Ect_p1의 경우 R5와 달리 칼슘결합이 가능한 산성 아미노산의 존재가 골 미네랄화를 촉진하였을 것으로 추정하였다.

실시예 2: 해양 생물 유래 실리카 형성 분자의 실리카 미네랄화를 이용한 녹색형광단백질의 골 이식재 부착 및 방출

실리카 형성 분자의 실리카 미네랄화 반응에 의한 기능성 분자의 골 이식재 결합을 확인하기 위해 녹색형광단백질(GFP)을 실리카 미네랄화로 골이식재 표면에 고정화시켜 미네랄화에 의한 결합 없이 단순히 GFP를 현재 사용되는 방법처럼 침지법에 의해 골이식재에 결합시키는 방법과 비교하였다 (도 5). 반응은 50 μg의 GFP, 10 μg의 CBP, 10 mg의 골이식재(HAp)가 들어있는 50 mM 인산 완충용액 (pH 7.6) 100 ㎕에 최종 가수분해된 TMOS 농도가 10 mM인 상태에서 30분간 진탕 반응시켰다. 도 4에서 보는 것 같이 대조구에는 아무것도 처리하지 않은 HAp 골이식재이고 두 번째 라인의 골이식재는 GFP 용액에 담가 흡착시키는 방법, 그리고 세 번째 라인은 HAp 골이식재와 실리카 형성 분자 그리고 GFP를 넣고 실리카 전구체를 넣어 실리카 미네랄화를 통해 골 이식재에 GFP를 결합시킨 방법이다. 형광현미경으로 골 이식재 표면에 결합된 GFP를 확인한 결과 단순 침지법에 의해서는 GFP가 없는 골 이식재와 크게 차이가 없어 보였으나 실리카 미네랄화에 의한 결합법에서는 골 이식재에 GFP가 고정화된 것을 선명하게 관찰할 수 있었다.

HAp에 결합된 GFP의 방출 속도를 확인하기 위해 1 μmoles의 HAp, GFP 115 μg이 혼합된 100 ㎕의 50 mM 인산완충용액(pH 7.6), 1 μmoles의 HAp, GFP 115 μg, 그리고 산 가수분해된 5 μmoles의 TMOS가 혼합된 100 ㎕의 50 mM 인산완충용액 (pH 7.6), 그리고 1 μmoles의 HAp, GFP 115 μg, CBP 10 μg 그리고 산 가수분해된 5 μmoles의 TMOS가 혼합된 100 ㎕의 50 mM 인산완충용액(pH 7.6)을 각각 준비하여 실리카 형성 반응을 통해 GFP와 HAp를 결합시킨 후 원심분리를 통해 결합되지 않은 GFP를 제거하였다. 원심분리 후 결합되지 않은 GFP 농도를 결산하고 사용한 단백질양으로부터 이를 빼 주어 결합된 단백질 양을 계산한 결과 HAp와 GFP를 단순히 섞은 경우 3%의 GFP만이 HAp에 결합되었고 촉매제 없이 Sol-Gel 반응에 의해 형성되는 실리카 형성 반응을 통해 HAp에 결합된 경우와 CBP 매개로 실리카 형성 반응을 통해 HAp에 결합된 두 경우는 약 65%의 GFP가 HAp에 결합되었다(도 6의 A). 원심분리를 통해 HAp로부터 GFP분리하여 매회 추출되어 나오는 GFP양을 측정한 결과 단순 흡착의 경우 3회 만에 GFP가 다 빠져나왔으나 실리카를 통해 결합시킨 경우 4회까지는 빠르게 방출되다가 그 이후는 서서히 방출되었다(도 6의 B). 실리카 형성 CBP를 사용한 경우 단순 Sol-Gel 반응에 의한 실리카 결합 방식보다 초기 방출 속도가 40% 정도 감소하였다.

실시예 3: 해양 생물 유래 실리카 형성 유기 고분자에 의한 골 이식재 실리카 미네랄화 및 이를 통한 골 이식소재의 습윤성 증가

골 이식재의 해양 생물 유래 유기 고분자 및 생체 고분자에 의한 실리카 미네랄화 반응은 1g의 합성골 및 이종 골 이식재(A: 대웅제약 Novosis, B: 오스코텍 InduCera, C: 나이벡 OCS-B, D: 제노스 OSTEONII)를 10 ml의 100% 에탄올에 담근 후 상온에서 30분간 진탕 반응 후 1% 키토산 용액 1 ml(키토산 10 mg)를 넣고 상온에서 다시 30분간 진탕 반응시켰다. 이 후 200 ㎕(200 mg)의 TEOS를 넣고 상온에서 2시간 동안 진탕 반응시킨 후 25% 암모니아수 500 ㎕를 넣고 하룻밤동안 상온에서 진탕 반응시켰다. 원심분리를 통해 반응액을 제거하고 증류수로 3번 골 이식재를 세척한 후 다시 10 ml의 100% 에탄올를 넣고 다시 전날의 반응을 반복하였다. 이때, 1% 키토산 용액 1 ml (키토산 10 mg) 첨가 후 30분간 교반 후 TEOS 100 ㎕ (100 mg)를 첨가하여 상온에서 2시간 더 교반시킨 후 25% 암모니아수 200 ㎕를 첨가하여 하룻밤 진탕 반응시켰다. 원심분리를 통해 결합되지 않은 분자 및 미반응 물질들을 제거하고 회수된 HAp를 다시 증류수로 3번 세척하였다. 마지막으로 제조된 복합체를 동결 건조하였다. 실리카만 처리한 경우는 위의 방법에서 고분자인 키토산 없이 암모니아에 의해서만 실리카를 형성시켰다. 시판 골이식재의 실리카 미네랄화를 통해 골 이식재의 습윤성 증가 정도를 혈액과의 섞임 현상을 통해 확인하였다.

도 7에서는 4종의 제품에 대해 마우스 혈액을 한 방울 떨어뜨린 후 혈액에 대한 젖음성을 비교한 결과 A, B 제품은 혈액을 한 방울 넣자 마자 골 이식재로 혈액이 잘 흡수되었고, C 제품은 혈액이 바로 흡수되지 않고 천천히 흡수되었고 D 제품은 시간이 지나도 섞이지 않았다. A와 D 제품을 실리카 미네랄 처리와 해양 생물 유래 유기 고분자인 키토산을 통한 실리카 미네랄 처리를 한 후 젖음성을 비교한 결과 A는 처리하지 않은 경우나 처리한 경우 혈액 흡수에 차이를 나타내지 않은 반면 D의 경우는 실리카 미네랄 처리와 키토산을 통한 실리카 미네랄 처리를 한 경우 바로 혈액을 흡수하였다. 또한, 키토산을 통한 실리카 미네랄 처리한 경우 A와 D에서 둘 다 혈액에 의한 골이식재의 뭉침이 더 잘 일어남을 볼 수 있었다 (도 7). 치과용 골 이식재는 이식 전 식염수나 혈액에 적신 후 이식을 하게 되는데 혈액과 잘 융합 시 이식 치료를 위한 처치가 용이할 수 있고 특히 잘 뭉쳐질수록 좋다. 골 이식재에 실리카 미네랄화 반응을 통해 표면에 실리카를 도입하였을 때 습윤성이 증가됨을 확인하였고 도 6에서 보이는 것처럼 주사 전자현미경 관찰을 통해 해양 생물 유래 고분자인 키토산에 의한 실리카 미네랄화를 통해서는 골이식재 표면의 거칠기가 증가하여 표면적이 증가하고 이로 인해 혈액과의 섞임뿐만 아니라 뭉침 현상도 좋아졌을 것으로 사료되었다 (도 8).

실시예 4: 해양 유래 실리카 형성 유기 분자에 의한 실리카 미네랄화된 골 이식재의 활성 분자 담지 및 방출

도 9의 A에 나타낸 방법에 따라 인공골 다공성 그래뉼인 하이드록시아파타이트(HAp) 1 g을 10 ml의 100% 에탄올에 넣어 30분간 자석 막대로 교반 후 원심분리하여 에탄올을 제거하고 증류수로 3번 원심분리법을 이용하여 HAp를 세척하였다. 그리고 PBS 9 ml를 넣고 여기에 1mg/ml 농도의 칼슘결합 잔기가 추가된 실리카 형성 펩타이드(CBP)를 1ml (CBP 1 mg) 첨가하여 30분간 교반하여 펩타이드가 HAp에 결합하도록 한 후 Genscript사에서 생산된 rhBMP2를 0.5 ml(0.25 mg) 첨가하고 1M 농도의 가수분해된 TMOS를 0.2 ml(30 mg) 첨가한 후 2시간 동안 교반하였다. 교반 후 원심분리를 통해 결합되지 않은 분자 및 미반응 물질들을 제거하고 회수된 HAp를 다시 PBS로 3번 세척하였다. 다시 PBS 를 넣고 CBP-실리카-rhBMP2-HAp 복합체 제조를 반복하였다. 이때, 1mg/ml SFP를 0.5 ml(SFP 0.5 mg) 첨가하여 30분간 교반하고 0.5 mg/ml 농도의 rhBMP2를 0.5 ml(0.25 mg) 첨가하고 1 M 농도의 가수분해된 실리카 전구체 TMOS를 0.1 ml(15 mg) 첨가한 후 2시간 동안 교반하였다. 교반 후 원심분리를 통해 결합되지 않은 분자 및 미반응 물질들을 제거하고 회수된 HAp를 다시 PBS로 3번 세척하였다. 마지막으로 제조된 복합체를 동결 건조한 골 이식재(CBP-rhBMP2-SiO2)를 제작하였다. 모든 과정은 상온, 상압, 중성 및 무균 상태에서 수행하였다.

도 9의 A 방법으로 골 이식재 제작 시 rhBMP2를 넣지 않은 상태로 CBP에 의한 실리카 형성 반응만으로 골 이식재를 제작할 수 있으며(CBP-SiO2), 이렇게 만들어진 골 이식재 1g당 0.5 mg/ml 농도의 rhBMP2를 1 ml(0.5 mg)를 넣어 물리적 흡착시킨 후 결합하지 않은 rhBMP2는 제거한 골 이식재(CBP-SiO2+rhBMP2)도 제작하였다. 아무 처리하지 않은 HAp에 rhBMP2를 물리적으로 흡착시킨 골 이식재(HA+rhBMP2)를 대조구로 제작하였다.

도 9의 B에 나타난 방법에 따라 콜라겐으로 인공골 하이드록시아파타이트(HAp) 1 g을 10 ml의 100% 에탄올에 넣어 30분간 자석 막대로 교반 후 1% 중량비로 콜라겐을 1 ml(콜라겐 10 mg) 넣은 후 30분간 교반하였다. 여기에 TEOS(99%~100%)를 0.2 ml(0.2 g) 첨가한 후 2시간 더 상온에서 교반 후 25% 중량비의 암모니아수 0.5 ml를 첨가하여 12시간 이상 교반하였다. 교반 후 원심분리를 통해 결합되지 않은 분자 및 미반응 물질들을 제거하고 회수된 HAp를 다시 증류수로 3번 세척하였다. 다시 100% 에탄올 10 ml에 넣고 실리카-콜라겐-HAp 복합체 제조를 반복하였다. 이때, 1% 중량비의 콜라겐 1 ml(콜라겐 10 mg) 를 첨가하고 30분간 교반하였다. 여기에 TEOS(99%~100%)를 0.1 ml(0.1 g) 첨가한 후 2시간 더 상온에서 교반 후 25% 중량비의 암모니아수 0.2 ml를 첨가하여 12시간 이상 교반하였다. 교반 후 원심분리를 통해 결합되지 않은 분자 및 미반응 물질들을 제거하고 회수된 HAp를 다시 증류수로 3번 세척하였다. 모든 과정은 상온, 상압, 중성 및 무균 상태에서 수행하였다.

마지막으로 제조된 콜라겐=-실리카-골 이식재 복합체를 동결 건조하여 콜라겐-실리카가 코팅된 골 이식재를 제작하고 1g 이식재당 0.5 mg/ml 농도의 rhBMP2를 1 ml (0.5 mg)을 넣어 물리적으로 흡착시킨 후 결합하지 않은 rhBMP2는 제거한 골 이식재(Collagen-SiO2+rhBMP2)를 제작하고 rhBMP2의 방출 양상을 비교하였다(도 10).

아무 처리하지 않은 대조구인 하이드록시 아파타이트 골이식재에 결합시킨 경우(HA+rhBMP2), 30분 이내에 담지된 rhBMP2의 70% 이상이 방출되고, 3시간에 80% 이상 방출되었고 CBP 매개의 실리카 형성 반응을 통해 형성된 실리카 코팅된 CBP-SiO2 이식재(CBP-SiO2+rhBMP2)는 30분에 50%, 3시간에 65% rhBMP2를 방출하므로 초기 방출 양을 18% 정도 감소시켰다. rhBMP2를 실리카로 encapsulation시켜 골 이식재에 고정화한 경우(CBP-rhBMP2-SiO2)는 3시간까지 초기 방출양을 더욱 감소시켜 약 75%까지 감소시켰다. 콜라겐과 실리카를 함께 사용하여 코팅한 경우(Collagen-SiO2+rhBMP2) 초기 3시간의 rhBMP2 방출량은 대조구 대비 50% 감소하였다.

50 mg의 골 이식재당 0.5mg/ml의 rhBMP2를 100 ㎕ 넣고 골 이식재에 30분간 결합시킨 후 원심분리를 통해 결합하지 않은 rhBMP2 농도를 Bradford 법으로 측정하여 골이식재(BG)에 결합된 rhBMP2를 계산하였다. 코팅하지 않은 대조구 HAp와 결합한 rhBMP2 양은 mg 골 이식재 당 0.35 μg 이었으며 CBP에 의한 실리카 형성반응으로 실리카 코팅시킨 골 이식재(CBP-SiO2@HAp) 는 0.73 μg, 콜라겐만 사용한 경우(Collagen@HAp) 0.66 μg, 콜라겐-실리카 처리된 골이식재(Collagen-SiO2@HAp) 0.75 μg을 나타내었다 (도 11). 골 이식재에 실리카 코팅 및 고분자 결합을 통해 rhBMP2와의 물리적 흡착력이 증가하였다. 흡착력의 증가가 HA 대조구 대비 rhBMP2의 초기 속방 속도를 감소시키는 것으로 사료되었다.

실시예 5: 해양 생물 유래 실리카 형성 유기 분자에 의한 실리카 미네랄화된 골이식재의 골 재생 능력

고려대학교 동물실험 윤리위원회의 승인을 받아 오리엔트바이오 (㈜ 오리엔트바이오, 성남시, 대한민국)로부터 구매한 Sprague-Dawley rat의 두개골에 0.8cm 지름의 원모양으로 기계를 이용하여 잘라낸 후 이식재 삽입하여 손상 골의 회복 양상을 3~12주에 걸쳐 microCT 촬영을 통해 확인하였다. 아무 처리하지 않은 골 이식재를 대조구로 사용하고 CBP 매개의 실리카 형성반응을 통해 HAp 표면에 실리카로 코팅한 이식재(CBP-SiO2), 그리고 CBP 매개의 실리카 형성 반응 시 rhBMP2를 넣어 실리카 형성되면서 rhBMP2가 HAp 표면에 고정화되도록 한 골이식재 (CBP-BMP2-SiO2)의 골 형성 능력을 비교하여 3, 6, 9, 그리고 12주 후 손상 부위의 골 형성 과정의 microCT 사진을 도 12에 나타내었다. 대조구에서는 신생 골 형성이 손상부위 뼈 있는 가장자리에서 약간 자라나고 내부를 채우지 못하였으나 CBP-SiO2 처리군과 CBP-BMP2-SiO2에서는 신생골이 형성되어 손상부위에 차 들어가는 것을 확인할 수 있었다. BMP2가 고정화된 경우 신생 뼈 형성 속도가 더 빠르게 나타났는데 Image J 프로그램을 사용하여 신생 골의 면적을 계산한 결과 CBP-SiO2 에서 3주차에 29%, 6주차에 47%, 9주차에 50%, 그리고 12주차에 82% 정도 신생 뼈가 형성되었고 BMP2 고정화된 것은 3주차에 49%, 6주차에 63%, 9주차에 89%, 그리고 12주차에 92% 정도 신생 뼈가 형성되었다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Sustained release bioactive substance-carrying bone graft and manufacturing method thereof <130> P1713C0254 <150> KR 10-2016-0042763 <151> 2016-04-07 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBP <400> 1 Ser Ser Arg Ser Ser Ser His Arg Arg His Asp His His Asp His Arg 1 5 10 15 Arg Gly Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu 20 25 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R5 <400> 2 Ser Ser Lys Lys Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Gly Ser Lys Arg 1 5 10 15 Arg Ile Leu <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ect_p1 <400> 3 Ser Ser Arg Ser Ser Ser His Arg Arg His Asp His His Asp His Arg 1 5 10 15 Arg Gly Ser <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ect_p2 <400> 4 Ser Ser Lys Lys Ser Gly Glu Arg His His Arg Ser Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal_p1 <400> 5 Cys Gly Arg Arg Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Cys 1 5 10 15 Gly Arg Arg Arg 20 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Vol_p1 <400> 6 Ser Gly Arg Arg Arg Gly Ser Arg Arg Arg Gly Ser Arg Arg Arg 1 5 10 15 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Vol_p2 <400> 7 Ser Arg Leu Arg Gly Arg Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Vol_p3 <400> 8 Ser Ser His Arg His His His Asp His His Asp His His His 1 5 10 <210> 9 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP2 <400> 9 Lys Ile Pro Lys Ala Ser Ser Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser 1 5 10 15 Thr Leu Tyr Leu Gly Gly Lys Gly Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu 20 25 30

Claims (18)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 실리카 합성용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 조성물은 실리카 전구체를 추가로 포함하는, 실리카 합성용 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 실리카 전구체는 테트라메톡시 실란, 테트라메틸 오르토실리케이트, 테트라에틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 실리카 합성용 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 조성물은 하이드록시아파타이트를 추가로 포함하는, 실리카 합성용 조성물.
   
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