CN114681626B - pH/酶双响应型介孔硅基药物载体MSN@HA及其制备方法与载药条件和靶向应用 - Google Patents

pH/酶双响应型介孔硅基药物载体MSN@HA及其制备方法与载药条件和靶向应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及介孔二氧化硅纳米粒子药物递送系统，属于高分子化合物的组合物领域，具体涉及pH/酶双响应型介孔硅基药物载体MSN@HA，利用APTES对MSN进行表面修饰引入氨基，然后通过酰胺化反应，依次修饰CMCS和HA，制备出pH和酶双重响应型载体MSN@HA。当MSN@CMCS和HA用量为20.0 mg和10.0 mg、EDC和NHS用量为50.0 mg和25.0 mg、酰胺化反应18 h以及初始药物浓度为500 mg/L时，载药性能最佳，此时的载药率为23.93%。QU@MSN@HA具有靶向性能，将其与乳腺癌细胞和巨噬细胞共培养，巨噬细胞组的细胞活性为95.79%，而乳腺癌细胞组的细胞活性仅为75.85%，两者相差了19.94%。QU@MSN@HA具有良好的肿瘤识别能力。

Description

pH/酶双响应型介孔硅基药物载体MSN@HA及其制备方法与载药条件和靶向应用
技术领域
本发明涉及介孔二氧化硅纳米粒子药物递送系统，属于高分子化合物的组合物领域，具体是涉及一种pH/酶双响应型介孔硅基药物载体MSN@HA及其制备方法和载药条件和靶向应用。
背景技术
羧甲基壳聚糖（CMCS）是壳聚糖的羧甲基化衍生物，具有良好的水溶性、抗菌活性、生物可降解和延长体内滞留时间等诸多优势，同时一定程度上可以抑制肿瘤细胞的迁移，在生物医药领域中被广大学者所认知。此外，它的分子链中含有大量的-NH2和-COOH基团，在不同的pH条件下，其电离程度变化很大；因此CMCS具有良好的pH敏感性。CD44是一类跨膜糖蛋白，研究发现CD44受体与肿瘤细胞的成瘤性和转移性有关，且在多种肿瘤细胞中过表达，因此针对CD44的靶向治疗一直被广泛研究。由于CD44肽链的N端可以与透明质酸（HA）特异结合，故被认为HA的受体。此外HA可以被肿瘤细胞内过表达的透明质酸酶（HAase）特异性降解，因此HA在肿瘤靶向和酶响应释药领域具有较大的应用前景。
发明内容
为解决上述问题，本发明采用以下的技术方案：
pH/酶双响应型介孔硅基药物载体MSN@HA，其中，利用APTES对MSN进行表面修饰引入氨基，然后通过酰胺化反应，依次修饰CMCS和HA，制备出pH和酶双重响应型载体MSN@HA。
pH/酶双响应型介孔硅基药物载体MSN@HA的制备方法，其中：所述制备方法包括如下步骤：
1）MSN的制备
将1.0 g CTAB、3.5 mL 2 M NaOH溶液和480 mL去离子水加入到一个三口烧瓶中，在80℃下磁力搅拌30 min；然后在上述混合溶液中缓慢滴加5.0 mL的TEOS，实验结束后继续反应3 h；溶液冷却到室温后，产物通过离心收集，并用无水乙醇和去离子水交替洗涤3次；最后，真空干燥12 h后得到CTAB@MSN的产物。
2）MSN-NH2的制备
烧瓶中加入0.5 g MSN和50.0 mL甲苯，超声使其充分分散，然后加入5.0 mLAPTES，在80℃下回流12 h；反应结束后，通过离心收集产物，无水乙醇洗涤数次；然后将产物置于真空干燥箱中，25℃干燥12 h即可得MSN-NH2；
3）MSN@CMCS的制备
称取0.10 g的CMCS溶解于10.0 mL的去离子水中，超声分散后加入0.25 g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC和0.15 g的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温反应4 h,使其充分活化。然后加入0.15 g的MSN@NH2的，继续反应12 h。反应结束后，离心收集，去离子水洗涤数次后，置于真空干燥箱中干燥12 h即得MSN@CMCS。
4）MSN@HA的制备
称取一定量的HA、EDC、NHS和50.0 mL的去离子水加入到三口烧瓶中，超声分散后，磁力搅拌4 h，完成HA的活化。然后加入适量的MSN@CMCS，室温反应一段时间后，离心收集，用去离子水洗涤数次后，分散于乙醇中，干燥即得MSN@HA。
pH/酶双响应型介孔硅基药物载体MSN@HA的载药条件，其中：当MSN@CMCS和HA用量为20.0 mg和10.0 mg、EDC和NHS用量为50.0 mg和25.0 mg、酰胺化反应18 h以及初始药物浓度为500 mg/L时，载药性能最佳，此时的载药率为23.93%。
pH/酶双响应型介孔硅基药物载体MSN@HA在乳腺癌细胞中的靶向应用。
本发明的有益效果：
当MSN@CMCS和HA用量为20.0 mg和10.0 mg、EDC和NHS用量为50.0 mg和25.0 mg、酰胺化反应18 h以及初始药物浓度为500 mg/L时，载药性能最佳，此时的载药率为23.93%。
QU@MSN@HA具有靶向性能，将其与乳腺癌细胞和巨噬细胞共培养，巨噬细胞组的细胞活性为95.79%，而乳腺癌细胞组的细胞活性仅为75.85%，两者相差了19.94%。QU@MSN@HA具有良好的肿瘤识别能力。
附图说明
图1 MSN@HA的制备示意图
图2 MSN@CMCS和HA用量比对载药率的影响
图3 EDC和NHS用量比对载药率的影响
图4 酰化反应时间对载药率的影响
图5 投药量对载药率的影响
图6 MSN、MSN-NH2、MSN@CMCS和MSN@HA的红外光谱图
图7 MSN、MSN@CMCS和MSN@HA的电镜图和粒径分布图
图中：a—MSN的SEM；b—MSN@CMCS的SEM；c—MSN@HA的SEM；d—MSN的TEM；e—MSN@CMCS的TEM；f—MSN@HA的TEM
图8 MSN、MSN-NH2、MSN@CMCS和MSN@HA的XPS能谱
图中：a—XPS全谱图；b—MSN@HA的C1s谱图；c—MSN@CMCS的N1s谱图；d—MSN@HA的N1s谱图
图9 MSN和MSN@HA的比表面积（a）与孔径分布图（b）
图10 不同pH条件下的释药曲线图
图11 QU@MSN@HA在不同浓度HA酶下的释药曲线
图12 不同浓度下游离QU组、MSN@HA组和QU@MSN@HA组的细胞活性图
图13 QU@MSN@HA与巨噬细胞和乳腺癌细胞共培养后的的细胞活性图。
具体实施方式
下面通过实施例和对比例对本发明作进一步的详细说明。
一、MSN@HA的制备
利用APTES对MSN进行表面修饰引入氨基，然后通过酰胺化反应，依次修饰CMCS和HA，制备出pH和酶双重响应型载体MSN@HA
1）MSN的制备
将1.0 g CTAB、3.5 mL 2 M NaOH溶液和480 mL去离子水加入到一个三口烧瓶中，在80℃下磁力搅拌30 min。然后在上述混合溶液中缓慢滴加5.0 mL的TEOS，实验结束后继续反应3 h。溶液冷却到室温后，产物通过离心（7300 rpm，10 min）收集，并用无水乙醇和去离子水交替洗涤3次。最后，真空干燥12 h后得到CTAB@MSN的产物。
为了保持介孔结构的有序性，采用酸萃取法去除模板剂CTAB。将1.0 g CTAB@MSN置于盐酸-甲醇（VHCL:VM = 1:100）的混合物中，60℃下回流12 h。然后，样品通过分离，清洗和干燥得到了MSN。
2）MSN-NH2的制备
烧瓶中加入0.5 g MSN和50.0 mL甲苯，超声使其充分分散，然后加入5.0 mL
APTES，在80℃下回流12 h。反应结束后，通过离心收集产物（8000 rpm，10 min），无水乙醇洗涤数次。然后将产物置于真空干燥箱中，25℃干燥12 h即可得MSN-NH2。
3）MSN@CMCS的制备
称取0.10 g的CMCS溶解于10.0 mL的去离子水中，超声分散后加入0.25 g的EDC和0.15 g的NHS，室温反应4 h, 使其充分活化。然后加入0.15 g的MSN@NH2的，继续反应12 h。反应结束后，离心收集（12000 rpm，10 min），去离子水洗涤数次后，置于真空干燥箱中干燥12 h即得MSN@CMCS。
4）MSN@HA的制备
称取一定量的HA、EDC、NHS和50.0 mL的去离子水加入到三口烧瓶中，超声分散后，磁力搅拌4 h，完成HA的活化。然后加入适量的MSN@CMCS，室温反应一段时间后，离心收集（12000 rpm，10 min），用去离子水洗涤数次后，分散于乙醇中，干燥即得MSN@HA。
二、性能评价
采用“单因素实验法”，以载药率为评价标准，依次考察MSN@CMCS和HA质量比、EDC和NHS质量比、反应时间以及投药量四个因素对MSN@HA的载药性能的影响，探索MAN@HA的最佳制备工艺条件。
1）MSN@CMCS和HA最佳用量比考察
在10.0 mg的HA、50.0 mL去离子水、50.0 mg EDC、25.0 mg NHS和酰化反应时间12h的条件下，改变MSN@CMCS的加入量（5.0 mg、10.0 mg、15.0 mg、20.0 mg、30.0 mg），药物负载实验在500 mg/L的QU溶液中进行，结果如图2。
从图2可以发现，随着MSN@CMCS质量的增加，MSN@HA的载药率先增加后降低。当MSN@CMCS的质量为20.0 mg时，最大载药率是14.5%。这是因为当MSN@CMCS用量小于20.0 mg时，MSN@CMCS增加使HA的结合位点增加，导致每个MSN@CMCS上HA的相对含量下降，最大程度的保留了介孔孔道，提高了载药率。由于纳米粒子具有易团聚性能，随着MSN@CMCS用量的进一步增加，可能粒子间发生团聚，孔道数量减少，从而降低了载药率，故认为当HA的用量为10.0 mg时，MSN@CMCS的用量为20.0 mg。
2）EDC和NHS最佳用量比考察
在10.0 mg的HA、50.0 mL去离子水、20.0 mg MSN@CMCS和酰化反应时间12 h的条件下，加入不同质量比的EDC和NHS（15.0 mg和60.0 mg、25.0 mg和50.0 mg、37.5 mg和37.5mg、50.0 mg和25.0 mg、60.0 mg和15.0 mg），结果如图3。
从图3中可以看出，随着NHS质量的减少，MSN@HA对QU的载药率先增大后减少，当EDC和NHS的质量比为2:1时，载药率达到最大值14.5%，与MSN@CMCS和HA最佳用量比时的载药率相同，说明了在本实验方案中EDC和NHS的最佳用量用量比为2:1。
3）酰胺化反应时间考察
在10.0 mg的HA、50.0 mL去离子水、20.0 mg MSN@CMCS、 50.0 mg EDC和25.0 mgNHS条件下，改变酰胺化反应时间（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h），结果如图4所示。
从图4中可以知道，随着酰胺化反应时间的增加，MSN@HA对QU的负载性能先增大后减小，在酰胺化反应18 h时，制备出的MSN@HA的负载性能最佳，载药率为17.5%。
4）最佳投药量考察
在10.0 mg的HA、50.0 mL去离子水、20.0 mg MSN@CMCS、酰胺化反应时间12 h 、25.0 mg NHS和50.0 mg EDC的条件下，分别加入10.0 mL不同浓度的槲皮素溶液（10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、500 mg/L和700 mg/），结果见图5。
从图中我们可以知道，随着药物初始浓度的增加，载药率逐渐增加。当初始浓度为500 mg/L时，载药率趋于平缓达到23.93%；虽然继续增加初始浓度，载药率会略微增加，但是会造成药物的浪费，因此认为在此实验方案中，最佳初始浓度为500 mg/L。
FTIR分析
采用KBr压片法，分别对MSN、MSN-NH2、MSN@CMCS和MSN@HA进行红外光谱表征，结果如图6所示。
从图中可以看到，在MSN的曲线中，1631 cm-1和3461 cm-1是-OH的面内弯曲振动和伸缩振动峰。808 cm-1、973 cm-1和1087 cm-1分别是Si-O的弯曲振动、对称伸缩振动和不对称伸缩振动峰，说明了成功制备出MSN。在MSN-NH2的曲线中，出现了三个新峰，其中2933 cm-1是-CH2的伸缩振动峰，1560 cm-1和1334 cm-1分别是-NH2的面内弯曲振动和-C-N的伸缩振动峰，说明了APTES成功修饰在MSN表面。在MSN@CMCS曲线中，我们可以发现，1633 cm-1处的吸收峰有所增强并发生了一定程度的蓝移，这是因为酰胺键中-C=O叠加的效果；此外，在1411 cm-1和1321 cm-1出现了CMCS的特征吸收峰，暗示了MSN@CMCS的制备成功。在MSN@HA谱图中，894 cm-1处的新峰是-C-H的弯曲振动吸收峰；1149 cm-1是C-O-C的不对称吸收振动峰，暗示了HA成功修饰在MSN@CMCS表面。
SEM和TEM分析
采用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）对MSN、MSN@CMCS和MSN@HA进行形貌分析，结果如图7所示。
从图7a和7d可以看出，制备的MSN为球形颗粒，具有较好的分散性，孔道结构清晰可见。另外从MSN粒径分布图可以发现，MSN的平均粒径为67 nm；从图7b、7e和MSN@CMCS粒径分布图可以看出，MSN@CMCS的形状变为类球型，颗粒之间出现粘连现象，颗粒表面变得粗糙，而且MSN@CMCS的平均粒径增大至75 nm，这些暗示了CMCS成功修饰在MSN表面。从图7c、7f和MSN@HA粒径分布图可以看出，MSN@HA表面粗糙程度进一步增加，形状变为椭球形，平均粒径进一步增至86 nm，说明成功制备出了MSN@HA。
XPS分析
为了进一步确认-NH2、CMCS和HA的成功修饰，用XPS分析MSN、MSN-NH2、MSN@CMCS和MSN@HA的表面元素，结果见图8。
从图8a中可以发现，在MSN中存在Si、O和C三种元素，其中少量C元素的存在，可能是MSN中存在少量的模板剂CTAB；在MSN-NH2中，检测出了N元素，有利证明了APTES的成功修饰；在MSN@HA中，检测出C、N、O和Si四种元素，其中C和N元素峰强的增加以及Si元素峰强的下降，暗示了HA的成功修饰。由于XPS分析的是材料表面元素，Si元素的存在说明了CMCS和HA并未完全包覆MSN，仍保留有少量的MSN界面。从图b可知，谱图中出现了284.5 eV、285.7eV、286.3 eV和287.8 eV四个吸收峰对应四种碳键，它们分别是-C-O-、-C-C-、-C=O-NH-和-C=O-官能团。另外通过比较c和d可以发现，MSN@CMCS中-NH-C=O的结合能为401.1 eV，而MSN@HA中-NH-C=O的结合能为401.45 eV，增加了0.34 eV。根据元素失去电子，结合能增大的原理，推测可能是由于更多的N元素与吸电子基团（-C=O-）结合所导致，暗示了HA的成功修饰。
N2吸附/脱附分析
用BET分析仪分析了MSN、MSN-NH2、MSN@CMCS和MSN@HA的比表面积、孔径和孔体积，结果见图9和表1。
从图9a来看，MSN的N2吸附/解吸曲线在相对压力P/P0接近1时，出现了属于Langmuir Ⅳ型等温线的滞后环。同时，结合图9b可以看出，MSN的孔径集中在2.81 nm左右，说明制备的MSN属于介孔材料。另外根据表1可知，MSN的比表面积、孔径和孔体积分别是1046.85 m2/g、2.81 nm和1.24 cm3/g。与MSN相比，MSN@HA的比表面积、孔径和孔体积分别下降到64.47 m2/g、1.96 nm和0.26 cm3/g，暗示了MSN@HA的制备成功。另外从表7中发现，MSN@CMCS的孔径略大于MSN-NH2，这是因为在CMCS成功修饰后，CMCS分子链间出现大孔结构，致使平均孔径增加。
表1 MSN和MSN@HA的孔结构参数
三、释放性能评价以槲皮素（QU）为模型药物
QU@MSN@HA的体外释药研究
1）不同pH下QU@MSN@HA的释药性能
为了模拟QU@MSN@HA在健康组织（pH = 7.4）和肿瘤环境（pH = 5、6.5）的释药性能，研究了QU@MSN@HA在不同PBS溶液中药物的释放行为（pH = 5、6.5和7.4），结果如图10所示。
从图中可以看出，72 h后QU@MSN@HA在不同pH缓冲液中的累积释放量分别为32.3%、37.6%和43.1%，这表明随着溶液pH的下降，累计释药量在逐渐增加，说明了QU@MSN@HA具有良好的pH响应能力。这主要是因为，在酸性环境CMCS和HA中的-NH2发生质子化变成-NH3 +，且随着pH的下降，质子化程度增加，导致分子链间静电斥力增强，介孔孔道打开开始释放药物。
2）不同浓度HA酶下QU@MSN@HA的释药性能
在不同浓度HA酶（0、50 μg/mL、100 μg/mL），研究QU@MSN@HA药物的释放行为，结果如图11所示。从图中可以发现，72 h后，游离状态的QU在pH = 5的缓冲液中的累积释放量最多达到85.78%。另外，当HA酶浓度为0、50 μg/mL、100 μg/mL时，72 h后QU@MSN@HA的累计释放量分别为 43.15%、55.65%和63.73%，说明随着HA酶浓度的增加，QU@MSN@HA的累计释放量逐渐增加。这是因为在HA酶存在的条件下，表面HA的分解相对增强了CMCS@HA中-NH2的质子化程度，同时HA包覆层被分解成小分子基团，使MSN表面包覆层的厚度下降，缩短了药物的释放路径，增加了药物的释放量。此外，通过对比QU@MSN@HA（HA酶100 μg/mL）与QU的释放量可以发现，两者的释放量相差22.05%，暗示了MSN@HA可以降低药物的释放速率，从而达到缓释的效果。
 QU@MSN@HA的细胞毒性评价
为了进一步评估MSN@HA的生物安全性，选择乳腺癌细胞作为指定细胞，并将其与载体共培养，通过CCK8方法检测乳腺癌细胞的存活率，其结果见图12。
从图12a可以看出，在2.5~20.0 μg/mL的载体浓度范围内，细胞存活率高于80%，表明MSN@HA具有良好的生物相容性。从图12b可以看出，游离的QU对乳腺癌细胞具有一定的杀伤力。然而，在相同浓度下，QU@MSN@HA的细胞活力低于游离的QU，这可能是因为QU@MSN@HA表面修饰有HA基团，使其更容易被肿瘤细胞吸收，增加QU对乳腺癌细胞的杀伤力。
QU@MSN@HA的靶向性研究
为了初步考察QU@MSN@HA的靶向性能，将其与乳腺癌细胞和巨噬细胞共培养，其结果见图13。从图中我们可以发现，巨噬细胞组的细胞活性为95.79%，而乳腺癌细胞组的细胞活性仅为75.85%，两者相差了19.94%。这可能是因为乳腺癌细胞表面含有CD44受体，HA的存在使QU@MSN@HA更容易被细胞所摄取，从而增加QU对癌细胞的杀伤力，说明了QU@MSN@HA具有良好的肿瘤识别能力。

Claims (2)

1.pH/酶双响应型介孔硅基药物载体MSN@HA，其特征在于，利用APTES对MSN进行表面修饰引入氨基，然后通过酰胺化反应，依次修饰羧甲基壳聚糖CMCS和透明质酸HA，制备出pH和酶双重响应型载体MSN@HA；其制备方法包括如下步骤：
1）MSN的制备
将1.0 g CTAB、3.5 mL 2 M NaOH溶液和480 mL去离子水加入到一个三口烧瓶中，在80℃下磁力搅拌30 min；然后在上述混合溶液中缓慢滴加5.0 mL的TEOS，继续反应3 h；溶液冷却到室温后，产物通过离心收集，并用无水乙醇和去离子水交替洗涤3次；最后，真空干燥12 h后得到产物CTAB@MSN；
采用酸萃取法去除模板剂CTAB：将1.0 g CTAB@MSN置于盐酸-甲醇VHCl:VM= 1:100的混合物中，60℃下回流12 h；然后，样品通过分离、清洗和干燥得到MSN；
2）MSN-NH2的制备
烧瓶中加入0.5 g MSN和50.0 mL甲苯，超声使其充分分散，然后加入5.0 mL APTES，在80℃下回流12 h；反应结束后，通过离心收集产物，无水乙醇洗涤数次；然后将产物置于真空干燥箱中，25℃干燥12 h即得MSN-NH2；
3）MSN@CMCS的制备
称取0.10 g的CMCS溶解于10.0 mL的去离子水中，超声分散后加入0.25 g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC和0.15 g的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温反应4 h， 使其充分活化；然后加入0.15 g的MSN@NH2，继续反应12 h；反应结束后，离心收集，去离子水洗涤数次后，置于真空干燥箱中干燥12 h即得MSN@CMCS；
4）MSN@HA的制备
称取一定量的HA、EDC、NHS和50.0 mL的去离子水加入到三口烧瓶中，超声分散后，磁力搅拌4 h，完成HA的活化；然后加入适量的MSN@CMCS，室温反应一段时间后，离心收集，用去离子水洗涤数次后，分散于乙醇中，干燥即得MSN@HA。
2.如权利要求1所述pH/酶双响应型介孔硅基药物载体MSN@HA在制备靶向乳腺癌细胞的药物中的应用。
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