CN106039420A - 用于软骨与软骨下骨一体化修复的纤维蛋白材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于软骨与软骨下骨一体化修复的纤维蛋白材料及其制备方法,该纤维蛋白材料是凝血酶作用下凝胶化的纤维蛋白原支架,支架中含有相互连通的大孔结构。支架中纤维蛋白原的干细胞亲和性有利于实现体内干细胞的募集与粘附;高亲水性的化学结构能够促进干细胞向软骨细胞的分化及软骨细胞表型的保持;高浓度纤维蛋白原提高了力学性能,提升力支架材料的耐降解性能;大孔结构促进了物质交换及生物信号交流。具有大孔结构的纤维蛋白软骨修复材料移植到体内后,具有良好的生物相容性,可实现软骨和软骨下骨缺损的原位诱导再生,达到原位再生修复的目的,具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种软骨修复材料及其制备方法,尤其是用于软骨与软骨下骨一体化修复的具有大孔结构的纤维蛋白材料及其制备方法。
背景技术
关节软骨是一种致密的结缔组织,在关节运动中起到承担负载、缓冲应力,减小关节面之间摩擦的作用。关节软骨很容易受到损伤,过度肥胖、关节炎、运动创伤等因素都可能给关节带来损害。由于关节软骨内部的低脉管结构,一旦受到损伤基本没有自我修复的能力,小尺寸的损伤也会导致关节软骨的进行性退变,给病患带来很大的痛苦,其治疗一直是临床上一个难以完全攻克的挑战。传统的软骨修复手段有很多种,例如自体软骨细胞移植、骨髓刺激术,骨软骨移植等等。这些方法都存在着一些问题,例如自体软骨细胞要求病人经历二次手术,而且体外软骨细胞扩增过程中容易发生去分化,丧失软骨细胞的表型。骨髓刺激术后新生的软骨通常是纤维化软骨,在生物学和力学性能上明显不如正常的透明软骨,而骨软骨移植需要解决供体不足的问题。此外,在软骨组织的修复过程中,软骨下骨的一体化修复是保持再生软骨组织结构和功能的前提条件,因为软骨下骨为软骨组织提供必要的物理支撑和营养供应。
当前通过组织工程技术可以实现软骨结构和功能的重建与再生。但该技术需要用到各种生物活性因子,如细胞生长因子、DNAs等,以及活细胞,如软骨细胞、骨髓间充质干细胞。如果要同时实现软骨下骨的一体化修复,则往往需要对支架组成和结构等进行分层设计,即上层通常为不含有钙质材料用于软骨再生,下层需要采用含有钙质的材料用于骨修复与再生。如此复杂的材料组成、结构、生物活性因子、活细胞等组合,导致该技术在临床应用方面进展非常缓慢,复合修复体的应用也存在诸多限制。
具有关节软骨诱导再生能力的支架材料能够有效地促进关节软骨结构和功能的修复和再生。选择支架材料时需要考虑材料的软骨诱导再生能力、力学性能、组织相容性、免疫原性、体内降解性等问题。纤维蛋白原是经批准可应用于临床的医用材料。在组织再生领域纤维蛋白原主要以可注射性水凝胶的形式应用在软组织再生和创口粘合方面。相对较弱的力学性能及较快的降解速度限制了纤维蛋白原的更广泛应用。研究表明纤维蛋白原对于干细胞有特异性的粘附和募集作用,同时纤维蛋白胶的亲水性有利于保持软骨细胞的表型,因此可以选用纤维蛋白原实现关节软骨缺损的诱导再生。高浓度的纤维蛋白可以提高支架材料的力学性能、减缓其降解速率,为细胞增殖和细胞外基质的沉积提供时间维度上的支撑。合适的孔隙率及孔径为组织再生过程中细胞的渗透及物质交换提供空间维度的支持。传统的纤维蛋白水凝胶致密的网络结构无法保证细胞与外界环境之间足够的信号交流。采用致孔剂制备大孔支架是组织工程用支架制备过程中常用的技术手段。结合该手段,赋予纤维蛋白胶大孔结构,可以提高组织再生过程中细胞与细胞以及新生组织与原生组织之间的相互信号沟通,更好地实现新生组织的结构和功能化重塑。
发明内容
本发明的目的是提供一种可在软骨缺损处原位诱导软骨和软骨下骨组织一体化再生的具有大孔结构的纤维蛋白软骨修复材料及其制备方法。
本发明的用于软骨与软骨下骨一体化修复的纤维蛋白材料,它是凝血酶作用下凝胶化的纤维蛋白原支架,支架中含有相互连通的大孔结构,大孔孔径为100~200μm,支架的孔隙率为80%~90%。
用于软骨与软骨下骨一体化修复的纤维蛋白材料的制备方法,其步骤如下:
1)将质量浓度为10~20%聚己内酯的二氯甲烷溶液加到质量浓度为1~2%的聚乙烯醇水溶液中,聚乙烯醇水溶液与聚己内酯的二氯甲烷溶液的体积比为5~10,以1000~1300 rpm的转速机械搅拌直至二氯甲烷完全挥发,所得聚己内酯微球经过反复水洗后干燥,标准筛筛分选择粒径为100~200μm的聚己内酯微球作为致孔剂;
2)将研磨后的纤维蛋白原粉末与步骤1)所得聚己内酯微球按照1:1~3:1的质量比充分混匀,混合物置于聚乙烯模具中压实,排除内部空气,将模具置于65 oC下,使聚己内酯微球熔融粘结,然后冷却至室温;
3)将25 U/mL的凝血酶溶液加到步骤2)的含有纤维蛋白原粉末与聚己内酯微球混合物的聚乙烯模具中,混合物中纤维蛋白原粉末与所加凝血酶溶液的质量体积比为50%,待凝血酶完全浸润混合物后将模具置于37 oC保持12~24小时,得到凝胶化的纤维蛋白原;
4)将步骤3)所得凝胶化的纤维蛋白原从模具中移出,转移到丙酮溶液中浸泡,脱除聚己内酯微球,浸泡在水中脱除丙酮,冷冻干燥。
本发明的优点:
本发明的具有大孔结构的纤维蛋白软骨和软骨下骨一体化修复材料,以纤维蛋白胶三维支架作为基质,纤维蛋白原的干细胞亲和性有利于实现体内干细胞的募集与粘附;高亲水性的化学结构能够促进干细胞向软骨细胞的分化及软骨细胞表型的保持;高浓度纤维蛋白原提高了力学性能,提升力支架材料的耐降解性能;大孔结构促进了物质交换及生物信号交流。
本发明的具有大孔结构的纤维蛋白软骨修复材料,其干态压缩模量为1~4 MPa,湿态压缩模量约为5~15 kPa。支架在培养基(含体积分数为10%的胎牛血清)中降解40天(37oC)后,仅有约50%的质量损失。
本发明在诱导软骨再生过程中不涉及细胞的植入,避免了种子细胞使用过程中复杂的细胞行为调控、免疫排斥反应、病原体引入等问题。具有大孔结构的纤维蛋白软骨修复材料移植到体内后,具有良好的生物相容性,可实现软骨和软骨下骨缺损的原位诱导再生,达到原位再生修复的目的,具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为聚己内酯微球扫描电镜图。
图2为大孔纤维蛋白软骨修复材料扫描电镜图。
图3为大孔纤维蛋白基软骨修复材料植入骨软骨缺损12周后的大体观察。
图4为大孔纤维蛋白基软骨修复材料植入骨软骨缺损12周后的HE图。
图5为大孔纤维蛋白基软骨修复材料植入骨软骨缺损12周后的粘多糖染色。
图6大孔纤维蛋白基软骨修复材料植入骨软骨缺损12周后的II型胶原免疫组化染色图。
具体实施方式
下面结合实施实例对本发明进行详细说明,但这些实施例并不用于限制本发明。
实施例1:
1)将50 mL质量浓度为20%的聚己内酯的二氯甲烷溶液加到500 mL质量浓度为1%的聚乙烯醇水溶液中,以1300 rpm的转速机械搅拌直至二氯甲烷完全挥发,所得聚己内酯微球经过反复水洗后置于50 oC下干燥,标准筛筛分选择粒径为100~200μm 的聚己内酯微球作为致孔剂。聚己内酯微球的扫描电镜图见图1,由图可见微球形貌规则,粒径分布在100~200μm之间。
2)将研磨后的纤维蛋白原粉末与步骤1)所得聚己内酯微球按照1.5:1的质量比充分混匀,混合物置于聚乙烯模具中压实,排除内部空气,将模具置于65 oC下1小时,使聚己内酯微球熔融粘结,然后冷却至室温。
3)将25 U/mL的凝血酶溶液加到步骤2)的含有纤维蛋白原粉末与聚己内酯微球混合物的聚乙烯模具中,混合物中纤维蛋白原粉末与所加凝血酶溶液的质量体积比为50%,待凝血酶完全浸润混合物后将模具置于37 oC保持24小时,得到凝胶化的纤维蛋白原。
4)将步骤3)中所得凝胶化的纤维蛋白原从模具中移出,转移到丙酮溶液中浸泡,脱除聚己内酯微球,浸泡在水中脱除丙酮,冷冻干燥,得到具有大孔结构的纤维蛋白软骨修复材料。其扫描电镜图见图2,由图可见支架内部具有明显的大孔结构,大孔孔径为100~200μm,支架的孔隙率约为80%。
实施例2:
1)将20 mL质量浓度为10%的聚己内酯的二氯甲烷溶液加到100 mL质量浓度为2%的聚乙烯醇水溶液中,以1000 rpm的转速机械搅拌直至二氯甲烷完全挥发,所得聚己内酯微球经过反复水洗后置于50 oC下干燥,标准筛筛分选择粒径为100~200μm 的聚己内酯微球作为致孔剂。
2)将研磨后的纤维蛋白原粉末与步骤1)所得聚己内酯微球按照1:1的质量比充分混匀,混合物置于聚乙烯模具中压实,排除内部空气,将模具置于65 oC下30分钟,使聚己内酯微球熔融粘结,然后冷却至室温。
3)将25 U/mL的凝血酶溶液加到步骤2)的含有纤维蛋白原粉末与聚己内酯微球混合物的聚乙烯模具中,混合物中纤维蛋白原粉末与所加凝血酶溶液的质量体积比为50%,待凝血酶完全浸润混合物后将模具置于37 oC保持24小时,得到凝胶化的纤维蛋白原。
4)将步骤3)中所得凝胶化的纤维蛋白原从模具中移出,转移到丙酮溶液中浸泡,脱除聚己内酯微球,浸泡在水中脱除丙酮,冷冻干燥,得到具有大孔结构的纤维蛋白软骨修复材料,大孔孔径为100~200μm,支架的孔隙率约为80%。
实施例3:
1)将50 mL质量浓度为20%的聚己内酯的二氯甲烷溶液加到250 mL质量浓度为1%的聚乙烯醇水溶液中,以1000 rpm的转速机械搅拌直至有机溶剂完全挥发,所得聚己内酯微球经过反复水洗后置于50 oC下干燥,标准筛筛分选择粒径为100~200 μm 的聚己内酯微球作为致孔剂。
2)将研磨后的商业化纤维蛋白原粉末与步骤1)所得聚己内酯微球按照3:1的质量比充分混匀,混合物置于聚乙烯模具中压实,排除内部空气,将模具置于65 oC下1小时,使聚己内酯微球熔融粘结,然后冷却至室温。
3)将25 U/mL的凝血酶溶液加到步骤2)的含有纤维蛋白原粉末与聚己内酯微球混合物的聚乙烯模具中,混合物中纤维蛋白原粉末与所加凝血酶溶液的质量体积比为50%,待凝血酶完全浸润混合物后将模具置于37 oC保持10小时,得到凝胶化的纤维蛋白原。
4)将步骤3)中所得凝胶化的纤维蛋白原从模具中移出,转移到丙酮溶液中浸泡,脱除聚己内酯微球,浸泡在水中脱除丙酮,冷冻干燥,得到具有大孔结构的纤维蛋白软骨修复材料,大孔孔径为100~200μm,支架的孔隙率约为80%。
5)将步骤4)得到的纤维蛋白软骨修复材料,移植到兔股关节滑槽的骨软骨缺损处,其中缺损的直径和深度皆为4毫米。12周之后缺损的修复效果,大体观察见图3,组织切片的HE染色结果见图4,组织切片的粘多糖染色见图5,II型胶原的免疫组化染色见图6。
由图3可见,新生软骨表面光滑,与周围组织的结合性良好。由图4,图5和图6中组织切片染色可见,缺损部位的软骨与软骨下骨均得到良好修复,软骨层中具有大量的粘多糖及II型胶原的沉积,软骨与软骨下骨紧密结合,具有明显的潮线结构。说明本发明的具有大孔结构的纤维蛋白软骨修复材料能够有效实现软骨与软骨下骨的一体化修复。
Claims (2)
1. 用于软骨与软骨下骨一体化修复的纤维蛋白材料,其特征在于它是凝血酶作用下凝胶化的纤维蛋白原支架,支架中含有相互连通的大孔结构,大孔孔径为100~200 μm,支架的孔隙率为80~90%。
2.如权利要求1所述的用于软骨与软骨下骨一体化修复的纤维蛋白材料的制备方法,其步骤如下:
1)将质量浓度为10~20%聚己内酯的二氯甲烷溶液加到质量浓度为1~2%的聚乙烯醇水溶液中,聚乙烯醇水溶液与聚己内酯的二氯甲烷溶液的体积比为5~10,以1000~1300 rpm的转速机械搅拌直至二氯甲烷完全挥发,所得聚己内酯微球经过反复水洗后干燥,标准筛筛分选择粒径为100~200 μm的聚己内酯微球作为致孔剂;
2)将研磨后的纤维蛋白原粉末与步骤1)所得聚己内酯微球按照1:1~3:1的质量比充分混匀,混合物置于聚乙烯模具中压实,排除内部空气,将模具置于65 oC下,使聚己内酯微球熔融粘结,然后冷却至室温;
3)将25 U/mL的凝血酶溶液加到步骤2)的含有纤维蛋白原粉末与聚己内酯微球混合物的聚乙烯模具中,混合物中纤维蛋白原粉末与所加凝血酶溶液的质量体积比为50%,待凝血酶完全浸润混合物后将模具置于37 oC保持12~24小时,得到凝胶化的纤维蛋白原;
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GR01 | Patent grant | ||
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