CN117285728A - 胶原基水凝胶及其制备方法、体外三维模型及其培养方法、药物检测的方法 - Google Patents

胶原基水凝胶及其制备方法、体外三维模型及其培养方法、药物检测的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种胶原基水凝胶及其制备方法、体外三维模型及其培养方法、药物检测的方法，属于组织工程技术领域。制备方法包括：将I型胶原溶于酸溶液中，调节pH至中性，形成中性胶原溶液；在中性胶原溶液中加入金属配体复合物光引发剂与过硫酸钠光引发剂，经避光处理，形成水凝胶预聚溶液；水凝胶预聚溶液经光交联，形成胶原基水凝胶。本发明采用光固化方式形成结构致密的胶原基水凝胶，制备方法简单，原料易得，成本较低，且形成的水凝胶呈透明状，成分明确，无细胞毒性，生物活性与机械性能好，满足细胞三维培养与监控细胞生长状态的需求。

Description

胶原基水凝胶及其制备方法、体外三维模型及其培养方法、药 物检测的方法
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种胶原基水凝胶及其制备方法、体外三维模型及其培养方法、药物检测的方法。
背景技术
类器官是一种三维细胞培养物，在结构以及功能上高度模拟人体器官，能够模拟器官类似的空间结构并且分化出对应功能，具备细胞增殖分化、自我更新、自组装、可长期培养、遗传稳定性等特点，为药物筛和毒理学研究等多种生物医学应用提供了宝贵的组织来源。
在类器官的培养过程中，细胞外基质(ECM)对组织的生物力学特性起着重要的作用，影响细胞行为和命运，其中，胶原作为细胞外基质的主要成分，具有促进细胞生长、分化、粘附和迁移等作用。
然而，BME成分的异质性限制了对其物理生化特性精确调控。此外，BME机械性能较弱，对概括肿瘤组织力学具有内在的局限性，难以适应各种独特的肿瘤微环境。
此外，脱细胞基质，类器官相应器官来源的脱细胞基质具有相类似的基质材料组分和因子，然而，脱细胞基质中的成分不明确，无法控制实验参数的设置及实验分析。Matrigel目前被应用于体外三维器官器官培养中，然而由于Matrigel成分不明确，批次间不稳定，极大地限制了在规模化和标准化进行类器官培养和类器官药筛药敏中的使用。
合成水凝胶可以解决天然基质胶成分不明确、动物来源、批次不稳定等问题，然而，合成工艺相对复杂，纯PIC水凝胶生物相容性较差，一般需接枝促进细胞黏附；胶原蛋白的应用则受到力学性能差和温度影响对其浓度的限制，不足以支撑细胞三维培养。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种胶原基水凝胶及其制备方法、体外三维模型及其培养方法、药物检测的方法。
本发明的一方面，提出一种胶原基水凝胶的制备方法，所述制备方法包括：
将I型胶原溶于酸溶液中，调节pH至中性，形成中性胶原溶液；
在所述中性胶原溶液中加入金属配体复合物光引发剂与过硫酸钠光引发剂，经避光处理，形成水凝胶预聚溶液；
所述水凝胶预聚溶液经光交联，形成胶原基水凝胶。
可选地，所述金属配体复合物光引发剂采用氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物。
可选地，在所述水凝胶预聚溶液中，所述氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物的浓度范围为0.0005～0.005mol/L；和/或，
所述过硫酸钠的浓度为0.005～0.05mol/L；和/或，
所述I型胶原浓度为1～10mg/mL。
可选地，所述避光处理的时间范围为15～60min；和/或，
所述光交联的时间范围为0.5～5min。
可选地，所述水凝胶预聚溶液经光交联，还包括：
在所述水凝胶预聚溶液中加入温敏材料，所述I型胶原经光交联形成第一网络结构，所述温敏材料经热交联形成第二网络结构，所述第一网络结构与所述第二网络结构交错互穿。
可选地，所述水凝胶预聚溶液经光交联，还包括：
在所述水凝胶预聚溶液中加入光敏材料，以及苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中的任一种光引发剂，所述I型胶原与所述光敏材料经光交联分别形成交错互穿的第一网络结构与第三网络结构。
本发明的另一方面，提出一种胶原基水凝胶，所述胶原基水凝胶采用前文记载的所述制备方法制得。
本发明的另一方面，提出一种胶原基水凝胶，包括由I型胶原在金属配体复合物光引发剂与过硫酸钠光引发剂作用下经光交联形成的第一网络结构；以及，
由温敏材料经热交联形成的第二网络结构；和/或，
由光敏材料在苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中的任一种光引发剂作用下，经光交联形成的第三网络结构；
第二网络结构和/或第三网络结构与所述第一网络结构交错互穿。
本发明的另一方面，提出一种体外三维模型的培养方法，所述培养方法包括：
形成待培养三维模型的细胞悬液；所述细胞悬液中的细胞包括细胞系、原代细胞、干细胞；
加入前文记载的所述胶原基水凝胶交联前的水凝胶预聚溶液，
将所述水凝胶预聚溶液与所述细胞悬液混合，取适量混合液加入用于培养所述细胞的培养腔或培养孔中，经过光交联，形成细胞凝胶；
向含有所述细胞凝胶的培养腔或培养孔中，加入培养基，经培养，得到体外三维模型。
本发明的另一方面，提出一种体外三维模型的培养方法，所述培养方法包括：
形成待培养类器官的细胞或细胞团悬液；所述细胞或细胞团悬液中的细胞或细胞团由肿瘤组织或非肿瘤组织经消化分离重悬得到，或者由待传代的肿瘤类器官或非肿瘤类器官经消化分离重悬得到；
获得水凝胶预聚溶液，所述水凝胶预聚溶液包含I型胶原、金属配体复合物光引发剂以及过硫酸钠光引发剂；
将所述水凝胶预聚溶液与所述细胞或细胞团悬液混合，取适量混合液加入用于培养所述类器官的培养腔或培养孔中，经过光交联，形成类器官凝胶；
向含有所述类器官凝胶的培养腔或培养孔中，加入培养基，经培养，得到肿瘤类器官或非肿瘤类器官的体外三维模型。
本发明的另一方面，提出一种体外三维模型，所述体外三维模型采用前文记载的培养方法培养形成。
本发明的另一方面，提出一种利用前文记载的体外三维模型对药物检测的方法，所述药物检测的方法包括：
向体外三维模型引入待测药物；
获取所述待测药物对所述体外三维模型的作用结果。
本发明提出一种胶原基水凝胶及其制备方法、体外三维模型及其培养方法、药物检测的方法，制备方法包括：将I型胶原溶于酸溶液中，调节pH至中性，形成中性胶原溶液；在中性胶原溶液中加入金属配体复合物光引发剂与过硫酸钠光引发剂，经避光处理，形成水凝胶预聚溶液；水凝胶预聚溶液经光交联，形成胶原基水凝胶。本发明采用光固化方式形成结构致密的胶原基水凝胶，制备方法简单，原料易得，成本较低，且形成的水凝胶呈透明状，成分明确，无细胞毒性，生物活性与机械性能好，满足细胞三维培养与监控细胞生长状态的需求。
附图说明
图1为本发明一实施例的胶原基水凝胶制备方法的流程框图；
图2为本发明另一实施例的体外三维模型的培养方法的流程框图；
图3为本发明另一实施例的体外三维模型的培养方法的流程框图；
图4为本发明另一实施例的药物检测方法的流程框图；
图5为本发明实施例1的自制胶原基水凝胶与对照组水凝胶的结构示意图；其中，图5中的(A)为1000x下对照组水凝胶电镜图，图5中的(B)
为1000x下自制胶原基水凝胶电镜图；
图6为本发明实施例2的自制胶原基水凝胶的结构示意图；其中，图6中的(A)为1000x下胶原浓度为1mg/mL自制胶原基水凝胶电镜图，图6中的(B)为1000x下胶原浓度为2mg/mL自制胶原基水凝胶电镜图，图6中的(C)为1000x下胶原浓度为10mg/mL自制胶原基水凝胶电镜图；
图7为本发明实施例3的自制胶原基水凝胶与对照组水凝胶的结构示意图；其中，图7中的(A)为1000x下对照组水凝胶电镜图，图7中的(B)
为1000x下自制胶原基水凝胶电镜图；
图8为本发明实施例4的自制胶原基水凝胶与对照组水凝胶的结构示意图；其中，图8中的(A)为1000x下对照组水凝胶电镜图，图8中的(B)
为1000x下自制胶原基水凝胶电镜图；
图9为本发明实施例5的自制胶原基水凝胶与对照组水凝胶用于培养胰腺癌类器官显微观察图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护范围。
如图1所示，本发明的一方面，提出一种胶原基水凝胶的制备方法S100，包括步骤S110～S130：
S110、将I型胶原溶于酸溶液中，调节pH至中性，形成中性胶原溶液。
具体地，将Ⅰ型胶原溶解于0.02M乙酸溶液中，加入NaOH调节pH至中性，混合均匀，得到中性胶原溶液。
在一些优选实施例中，胶原为天然提取的动物胶原或微生物法制备的重组胶原蛋白。
S120、在中性胶原溶液中加入金属配体复合物光引发剂与过硫酸钠光引发剂，经避光浸没处理，使得光引发剂渗透胶体，得到水凝胶预聚溶液。
在一些优选实施例中，金属配体复合物光引发剂采用氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物。
在另一些优选实施例中，在水凝胶预聚溶液中，I型胶原浓度为1～10mg/mL，氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂的浓度为0.0005～0.005mol/L，过硫酸钠光引发剂的浓度为0.005～0.05mol/L，上述I型胶原优选浓度有利于提高水凝胶机械强度与生物活性，在胶原浓度较高时，水凝胶仍保持透明，利于细胞培养观察；在上述光引发剂的优选浓度下，反应速度较快，成胶速度快，有效提高类器官培养效率，且毒性较低，进一步提高类器官培养的成功率。
在另一些优选实施例中，避光浸没处理的时间范围为15～60min，利于光引发剂渗透胶体。
在另一些优选实施例中，上述水凝胶预聚溶液可以经过滤膜过滤处理，得到无菌溶液，用于细胞培养，例如，经0.22微米过滤膜过滤处理。
S130、水凝胶预聚溶液在240～500nm的光照射下交联一定时间，形成结构致密的胶原基水凝胶，该胶原基水凝胶具有第一网络结构。
在一些优选实施例中，光交联的时间范围为0.5～5min。
在本实施方式中，通过选取合适的光引发剂，将I型胶原采用光固化的方式形成结构致密的胶原基水凝胶，有效提高交联密度，该制备方法简单，原料易得，成本较低，且形成的水凝胶呈透明状，成分明确，无细胞毒性，生物活性与机械性能好，满足细胞三维培养与监控细胞生长状态的需求。
进一步地，在本实施方式中，除了形成单一组分的胶原基水凝胶外，还可以将I型胶原与其他材料复合，形成互穿网络的胶原基水凝胶。例如，将温敏材料与I型胶原复合，或者，将光敏材料与I型胶原复合，当然，还可以同时将温敏材料、光敏材料与I型胶原复合，形成胶原基水凝胶。
示例性地，将温敏材料与I型胶原复合，形成互穿网络的胶原基水凝胶，具体包括下述步骤：
S1、将Ⅰ型胶原溶解于0.02M乙酸溶液中，加入NaOH调节pH至中性，得到中性胶原溶液。
在一些优选实施例中，胶原为天然提取的动物胶原或微生物法制备的重组胶原蛋白。
S2、在中性胶原溶液中加入氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物与过硫酸钠溶液光引发剂，避光均匀混合，形成水凝胶预聚溶液。
在一些优选实施例中，在水凝胶预聚溶液中，I型胶原浓度为0.5-10mg/mL，氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物的浓度为0.0005-0.005mol/L；过硫酸钠的浓度为0.005-0.05mol/L。
S3、在水凝胶预聚溶液中加入温敏材料，先在240～500nm波长的光照射下交联一定时间，使得I型胶原在光引发剂作用下经光交联形成第一网络结构，后在25～37℃水浴温度下交联一定时间，使得温敏材料经热交联形成第二网络结构，第一网络结构和第二网络结构交错互穿，得到互穿网络且结构致密的胶原基水凝胶，用于模拟器官类似的空间结构。
在另一些优选实施例中，温敏材料浓度为0.1％～30％(质量体积比)，在浓度低于太低，无法成胶，在浓度太高，溶液粘度过高，操作困难。
在一些优选实施例中，温敏材料为聚异腈多肽(PIC)、聚氧乙烯聚氧丙烯醚(Pluronic F-127)中的一种。聚氧乙烯聚氧丙烯醚(Pluronic F-127)优选浓度为：10％-30％(质量体积比)；聚异腈多肽(PIC)的优选浓度：0.1％～1％(质量体积比)。
在另一些优选实施例中，光交联时间范围为0.5～5min；热交联时间范围为15～60min。
需要说明的是，在将本实施方式的水凝胶用于细胞培养时，上述热交联过程可以为细胞培养过程，例如，将上述水凝胶放入95％湿度、5％CO2、37℃的培养箱中进行细胞培养，同步实现温敏材料的热交联过程，实现双交联，有效提高交联密度，增强机械性能，无需增加额外交联步骤，仅需一步光交联即可得到互穿网络水凝胶，制备工艺简单。
在本实施方式中，温敏材料与I型胶原复合时，在光引发条件下，I型胶原上的络氨酸残基氧化偶联反应形成第一网络结构，在热引发条件下，温敏材料，形成第二网络结构，且该第二网络结构与第一网络形成两层互穿网络的水凝胶。例如采用温敏材料为聚异腈多肽(PIC)、聚氧乙烯聚氧丙烯醚(Pluronic F-127)中的任一者，其疏水链端聚集形成第二网络结构，由于极性基团，网络间形成氢键作用，与第一网络结构形成两层互穿网络的水凝胶。
进一步地，将光敏材料与I型胶原复合，形成互穿网络的胶原基水凝胶，具体包括下述步骤：
S1、将Ⅰ型胶原溶解于0.02M乙酸溶液中，加入NaOH调节pH至中性，得到中性胶原溶液。
S2、在中性胶原溶液中加入氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物与过硫酸钠溶液光引发剂，避光均匀混合，形成水凝胶预聚溶液。
S3、在水凝胶预聚溶液中加入光敏材料与一定量的光引发剂，在240～500nm照射下交联，使得I型胶原与光敏材料在各自对应的光引发剂作用下，分别形成交错互穿的第一网络结构和第三网络结构，以得到互穿网络的胶原基水凝胶，用于模拟器官类似的空间结构。
在一些优选实施例中，光敏材料为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)、甲基丙烯酰化海藻酸钠(AlgMA)、甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)、甲基丙烯酰化丝素蛋白(SilMA)、甲基丙烯酰化硫酸软骨素(ChSMA)、甲基丙烯酰化肝素(HepMA)中的一种；
在另一些优选实施例中，光敏材料浓度为0.5～20％(质量体积比)，在浓度低于0.5％时，水凝胶较软或无法成胶，无法支撑细胞的三维生长，在浓度高于20％时，水凝胶变硬，与细胞的相容性较差。
在另一些优选实施例中，上述步骤S3中光敏材料的光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯(TPO)、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2959)中的任一种。
在本实施方式中，光敏材料与I型胶原复合时，在光引发条件下，I型胶原上的络氨酸残基氧化偶联反应形成第一网络结构，光敏材料上的双键发生聚合反应形成第三网络结构，两层网络结构通过胶原上的羧基与部分双键化的光敏材料上的氨基等结构联系起来，形成两层互穿网络的水凝胶。
更进一步地，将温敏材料、光敏材料与I型胶原复合，形成互穿网络的胶原基水凝胶，具体包括下述步骤：
S1、将Ⅰ型胶原溶解于0.02M乙酸溶液中，加入NaOH调节pH至中性，得到中性胶原溶液。
S2、在中性胶原溶液中加入氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物与过硫酸钠溶液光引发剂，避光均匀混合，形成水凝胶预聚溶液。
S3、在水凝胶预聚溶液中分别加入光敏材料与光引发剂，以及温敏材料，先在240～500nm的光照射下交联一定时间，使得I型胶原、光敏材料在各自对应的光引发剂作用下分别形成第一网络结构和第三网络结构，后在25～37℃水浴下交联一定时间，使得温敏材料经热交联形成第二网络结构，即得到相互交错的三层网络结构的胶原基水凝胶，用于模拟器官类似的空间结构。
需要说明的是，在上述制备过程中，温敏材料及其浓度、光敏材料及其浓度、以及步骤S3中的光引发剂，热交联、光交联的时间均与前文记载的相同。
在本实施方式中，光敏材料、温敏材料同时与I型胶原复合时，在光引发条件下，I型胶原上的络氨酸残基氧化偶联反应形成第一网络结构，光敏材料上的双键发生聚合反应形成第三网络结构，在热引发条件下，温敏材料例如疏水链端聚集形成第二网络结构，由于极性基团，网络间形成氢键作用，形成三层互穿网络的水凝胶。
本发明的另一方面，提出一种胶原基水凝胶，该胶原基水凝胶采用前文记载的方法形成，具体制备过程请参考前文记载，在此不再赘述。
具体地，胶原基水凝胶包括有由I型胶原在金属配体复合物光引发剂与过硫酸钠光引发剂作用下经光交联形成的第一网络结构。其中，金属配体复合物光引发剂优选氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物。
进一步地，胶原基水凝胶还可以包括有交错互穿的第一网络结构和第二网络结构，其中，第二网络结构由温敏材料经热交联形成，该温敏材料优选为聚异腈多肽(PIC)、聚氧乙烯聚氧丙烯醚(Pluronic F-127)中的一种。
更进一步地，胶原基水凝胶还可以包括有交错互穿的第一网络结构和第三网络结构，其中，第三网络结构由光敏材料以及苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯(TPO)、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2959)中的任一种光引发剂经光交联形成。
在一些优选实施例中，光敏材料为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)、甲基丙烯酰化海藻酸钠(AlgMA)、甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)、甲基丙烯酰化丝素蛋白(SilMA)、甲基丙烯酰化硫酸软骨素(ChSMA)、甲基丙烯酰化肝素(HepMA)中的一种。
更进一步地，胶原基水凝胶还可以包括有交错互穿的第一网络结构、第二网络结构以及第三网络结构，其中，第二网络结构由温敏材料经热交联形成，第三网络结构由光敏材料和对应的光引发剂经光交联形成，即，形成三层网络结构的胶原基水凝胶。
本发明以I型胶原成分为主，形成多种互穿网络结构的胶原基水凝胶，能够模拟不同器官类似的空间结构，利于细胞三维培养，具有促进细胞黏附、存活、增殖的微环境，满足细胞培养需求。
如图2所示，本发明的另一方面，提出一种体外三维模型的培养方法S400，包括S410～S440：
S410、形成待培养三维模型的细胞悬液；该细胞悬液中的细胞包括细胞系、原代细胞、干细胞。
S420、加入胶原基水凝胶交联前的水凝胶预聚溶液，该水凝胶预聚溶液的形成过程请参考前文记载。
应当理解的是，步骤S420中的凝胶预聚溶液除了为单一组分的胶原基水凝胶预聚溶液外，还可以为多组分的胶原基水凝胶预聚液。
在一些优选实施例中，凝胶预聚溶液包括I型胶原、金属配体复合物光引发剂、过硫酸钠光引发剂，以及温敏材料。
在另一些优选实施例中，凝胶预聚溶液包括I型胶原、金属配体复合物光引发剂、过硫酸钠光引发剂，以及光敏材料与苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中的任一种光引发剂。
在另一些优选实施例中，凝胶预聚溶液包括I型胶原、金属配体复合物光引发剂、过硫酸钠光引发剂，以及光敏材料与苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中的任一种光引发剂，以及温敏材料。
S430、将水凝胶预聚溶液与细胞悬液混合，取适量混合液加入用于培养所述细胞的培养腔或培养孔中，经过光交联，形成细胞凝胶。
S440、向含有细胞凝胶的培养腔或培养孔中，加入培养基，经培养，得到体外三维模型。
如图3所示，本发明的另一方面，提出一种体外三维模型的培养方法S200，包括步骤S210～S240：
S210、形成待培养类器官的细胞或细胞团悬液；该细胞或细胞团悬液中的细胞或细胞团由肿瘤组织或非肿瘤组织经消化分离得到，或者由待传代的肿瘤类器官或非肿瘤类器官经消化分离得到。
需要说明的是，待培养的类器官可以为肿瘤类器官，例如，肝癌类器官、结直肠癌类器官、肺癌类器官、胰腺癌类器官等；还可以为非肿瘤类器官，例如，结直肠类器官、肺类器官、肝类器官、胰腺类器官等。
S220、获得凝胶预聚溶液，该凝胶预聚溶液包含I型胶原、金属配体复合物光引发剂以及过硫酸钠光引发剂。
应当理解的是，步骤S220中的凝胶预聚溶液除了为单一组分的胶原基水凝胶预聚溶液外，还可以为多组分的胶原基水凝胶预聚液。
在一些优选实施例中，凝胶预聚溶液包括I型胶原、金属配体复合物光引发剂、过硫酸钠光引发剂，以及温敏材料。
在另一些优选实施例中，凝胶预聚溶液包括I型胶原、金属配体复合物光引发剂、过硫酸钠光引发剂，以及光敏材料与苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中的任一种光引发剂。
在另一些优选实施例中，凝胶预聚溶液包括I型胶原、金属配体复合物光引发剂、过硫酸钠光引发剂，以及光敏材料与苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中的任一种光引发剂，以及温敏材料。
S230、将凝胶预聚溶液与细胞悬液混合，取适量混合液加入用于培养类器官的培养腔或培养孔中，经240～500nm光照射下交联，形成类器官凝胶。
需要说明的是，在步骤S220中的凝胶预聚溶液中包括有温敏材料时，还需要经热交联，形成类器官水凝胶，当然，上述热交联的过程可以与细胞培养过程同步进行，在满足细胞培养需求中无需增加额外交联步骤，简化制备过程。
S240、向含有类器官凝胶的培养腔或培养孔中，加入培养基，经培养，得到肿瘤类器官或非肿瘤类器官的体外三维模型。
本发明将胶原基水凝胶用于三维细胞培养时，形成可靠的类器官体外模型，满足类器官所需的机械强度和生物活性，培养方法简单，易于操作。
本发明的另一方面，提出一种体外三维模型，采用前文记载的培养方法可培养出多种类器官体外三维模型，具体培养方法请参考前文记载，在此不再赘述。
具体地，体外三维模型包括有非肿瘤类器官体外三维模型和肿瘤类器官体外三维模型，其中，非肿瘤类器官体外三维模型包括有胰腺类器官、结直肠类器官、肺类器官、肝类器官等体外三维模型；肿瘤类器官体外三维模型包括有胰腺癌类器官、结直肠癌类器官、肺癌类器官、肝癌类器官等体外三维模型。
如图4所示，本发明的另一方面，提出一种利用体外肿瘤三维模型对药物检测的方法S300，包括步骤S310～S320：
S310、向体外肿瘤三维模型引入待测药物；
S320、获取待测药物对体外肿瘤三维模型的作用结果。
在本实施方式中，基于上述体外肿瘤三维模型，例如是肿瘤类器官体外模型，可模拟人体特异性微环境、细胞外基质等的复杂性，实现药物筛选。
具体地，在孔板上针对体外肿瘤三维模型进行常规药物敏感性测试，可以包括如下步骤：
(1)配制合适浓度的含药培养基，
(2)体外肿瘤三维模型置于非动态培养环境的培养孔中，例如：96孔板的培养孔中；
(4)观察并记录体外肿瘤三维模型的生长状态，吸除培养孔中的培养基，每孔加入100μL含有药液的培养基，放入37℃、5％CO2的培养箱进行培养；
(4)第3-5天观察并记录体外肿瘤三维模型的生长状态；
(5)用CTG检测试剂盒进行活性检测。每孔加入100μL CTG检测试剂，使用震荡仪震荡5min，放室温孵育25min；孵育结束后，使用化学发光酶标仪进行检测。
进一步地，在动态培养下对体外肿瘤三维模型进行常规药物敏感性测试，可以包括如下步骤：
(1)配制合适浓度的含药培养基：
(2)培养形成的体外肿瘤三维模型置于动态培养环境的培养腔中，例如采用具有三腔室相连通的芯片，体外肿瘤三维模型置于中间腔室中；
(3)观察并记录体外肿瘤三维模型的生长状态。吸除芯片中的培养基，加入含有药液的培养基。芯片左右两侧孔加入50μL培养基，中间孔加入30μL培养基；
(4)加药后把芯片放入摇摆灌注仪，3°/120min，进行流动培养；
(5)第3天-5天观察并记录体外肿瘤三维模型的生长状态，往中间孔补充30μL含药培养基；
(6)用CTG检测试剂盒进行活性检测。两侧孔弃掉全部培养基，加入20μL CTG稀释液(CTG试剂原液与培养基的1∶1稀释)，加入50μLCTG原液，吹打混匀，使用震荡仪震荡5min，放室温孵育25min，将所有裂解液取出，放入四周和底部完全不透明的96孔板。使用化学发光酶标仪进行检测。
下面将结合几个具体实施例进一步说明胶原基水凝胶的制备方法以及具体应用：
实施例1
本实施例给出了单一组分的胶原基水凝胶的制备方法，包括：
S1、将鼠尾Ⅰ型胶原溶解于0.02M乙酸溶液中，加入NaOH调节pH至中性，混合均匀，得到终浓度为2mg/mL中性胶原蛋白溶液。
S2、在中性胶原蛋白溶液中加入氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂与过硫酸钠光引发剂，避光浸没30min，使得光引发剂渗透胶体，得到水凝胶预聚溶液，其中，氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂的浓度为0.015％，过硫酸钠的浓度为0.005％。
S3、将水凝胶预聚溶液在405nm波长照射下交联1min，即得到结构致密的胶原基水凝胶。
需要说明的是，在将步骤S3得到的胶原基水凝胶用于细胞培养时，可根据需要使I型胶原发生温敏固化，以进一步提升交联密度，增加机械强度。
如图5中的(A)所示，对照组为单一组分2mg/mL胶原蛋白，37℃固化30min制备得到水凝胶的结构图。将对照组与本实施例的两种水凝胶冷冻干燥后，用扫描电子显微镜观察，如图5中的(A)和(B)所示，本实施例的胶原基水凝胶具有多孔结构，利于支撑细胞三维生长。
实施例2
本实施例的胶原基水凝胶的制备方法与实施例1相同，差别仅在于改变中性胶原蛋白溶液的浓度、氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂的浓度以及过硫酸钠光引发剂的浓度，具体如下：
图6(A)给出了中性胶原蛋白溶液的浓度分比为1mg/mL，氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂的浓度为0.0005mol/L，过硫酸钠光引发剂为0.005mol/L对应形成的水凝胶电镜结果。
图6(B)给出了中性胶原蛋白溶液的浓度分比为2mg/mL，氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂的浓度为0.001mol/L，过硫酸钠光引发剂为0.01mol/L对应形成的水凝胶电镜结果。
图6(C)给出了中性胶原蛋白溶液的浓度分比为10mg/mL，氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂的浓度为0.005mol/L，过硫酸钠光引发剂为0.05mol/L对应形成的水凝胶电镜结果。
综上，如图6所示，本实施例形成的各水凝胶冷冻干燥后，采用扫描电子显微镜观察，本实施例的胶原基水凝胶具有多孔结构，利于支撑细胞三维生长。
实施例3
本实施例给出了复合胶原基水凝胶的制备方法，包括：
S1、将重组Ⅰ型胶原溶解于0.02M乙酸溶液中，加入NaOH调节pH至中性，混合均匀，得到2mg/mL中性胶原溶液；
S2、在中性胶原溶液中加入0.001mol/L氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂与0.01mol/L过硫酸钠光引发剂，避光均匀混合，形成水凝胶预聚溶液。
S3、将10％Pluronic F-127溶液加入水凝胶预聚溶液中，混合溶液先在405nm波长照射下交联1min，后在37℃水浴条件下热交联30min，即得到结构致密的胶原基水凝胶。
如图7中的(A)所示，对照组为单一组分2mg/mL胶原蛋白，加入0.015％氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂与0.005％过硫酸钠光引发剂，在405nm波长照射下交联1min制备得到结构致密的胶原基水凝胶。将对照组与本实施例的两种水凝胶冷冻干燥后，用扫描电子显微镜观察，如图7中的(A)和(B)所示，本实施例自制水凝胶具有多孔结构，且孔较致密，可以支撑细胞的三维生长。
实施例4
本实施例给出了复合胶原基水凝胶的制备方法，包括：
S1、将猪皮Ⅰ型胶原溶解于0.02M乙酸溶液中，加入NaOH调节pH至中性，混合均匀，得到2mg/mL中性胶原溶液。
S2、中性胶原溶液中加入0.001mol/L氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂与0.01mol/L过硫酸钠光引发剂，避光均匀混合，得到水凝胶预聚溶液。
S3、在水凝胶预聚溶液中加入2％GelMA溶液与0.1％LAP光引发剂，；以及，将0.2％聚异腈多肽(PIC)溶液加入上述混合溶液，之后，先在405nm波长照射下交联1min，再放入95％湿度、5％CO2、37℃培养箱放置30min，即得到光固化与温固化双交联的胶原基水凝胶。
如图8中的(A)所示，对照组为单一组分2mg/mL胶原蛋白，加入0.015％氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂与0.005％过硫酸钠光引发剂，在405nm波长照射下交联1min制备得到胶原基水凝胶。将对照组与本实施例的两种水凝胶冷冻干燥后，用扫描电子显微镜观察，如图8中的(A)和(B)所示，本实施例自制水凝胶具有多孔结构，且孔较致密，可以支撑细胞的三维生长。
实施例5
本实施例将胶原基水凝胶用于胰腺癌类器官培养，培养方法包括：
S1、将鼠尾Ⅰ型胶原溶解于0.02M乙酸溶液中，加入NaOH调节pH至中性，混合均匀，得到2mg/mL中性胶原溶液。
S2、在中性胶原溶液中加入0.001mol/L氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物光引发剂与0.01mol/L过硫酸钠光引发剂，避光均匀混合，之后，在上述混合溶液中加入2％(质量体积比)GelMA溶液与0.1％(质量体积比)LAP光引发剂，形成水凝胶预聚溶液。
S3、获取类器官的细胞悬液，具体包括：选择待传代的胰腺癌类器官，将提前预冷的PBS加入至24孔板中，每孔加入1mL PBS，收集到离心管中，4℃冷藏15min，后离心(1000rpm，5min)去除上清，得到类器官沉淀；加入Tryple E酶解1min，后离心(1000rpm，5min)去除上清，得到沉淀；加入PBS再次离心(1000rpm，5min)，去除多余酶液，得到沉淀，再将沉淀重悬，得到细胞悬液。
S4、将水凝胶预聚溶液与细胞悬液以85：15(v/v)比例混匀，滴胶24孔板，每孔30微升，在405nm波长下固化15min成胶，加入胰腺癌培养基培养观察；另外，对照组为商用基质胶Matrigel与沉淀的细胞悬液均匀混合，滴胶24孔板，每孔30微升，在37℃固化30min成胶，加入胰腺癌培养基培养观察。
如图9所示，与对照组相比，自制水凝胶培养胰腺癌类器官状态较好，随着时间的增加呈现增长趋势，表明本实施例自制水凝胶具有三维细胞培养类器官的能力。
本发明提出一种胶原基水凝胶及其制备方法、体外三维模型及其培养方法、药物检测的方法，具有以下有益效果：
第一、本发明的制备方法简单，材料易获得，制备成本低廉，且形成的胶原基水凝胶呈透明状，成分明确，无细胞毒性，具有较好的机械性能与生物活性，具有促进细胞黏附、存活、增殖的微环境，可以支撑细胞三维生长，适合应用于细胞培养观察以及非肿瘤类器官或肿瘤类器官培养和药物筛选；
第二、本发明将光敏材料和/或温敏材料与I型胶原复合，形成互穿网络结构的胶原基水凝胶，双交联方式使交联效果加倍，机械性能更好，且在满足细胞培养需求中不增加额外交联步骤，制备方法简单。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种胶原基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将I型胶原溶于酸溶液中，调节pH至中性，形成中性胶原溶液；
在所述中性胶原溶液中加入金属配体复合物光引发剂与过硫酸钠光引发剂，经避光处理，形成水凝胶预聚溶液；
所述水凝胶预聚溶液经光交联，形成胶原基水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述金属配体复合物光引发剂采用氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述水凝胶预聚溶液中，所述氯化三(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物的浓度范围为0.0005～0.005mol/L；和/或，
所述过硫酸钠的浓度为0.005～0.05mol/L；和/或，
所述I型胶原浓度为1～10mg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述避光处理的时间范围为15～60min；和/或，
所述光交联的时间范围为0.5～5min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水凝胶预聚溶液经光交联，还包括：
在所述水凝胶预聚溶液中加入温敏材料，所述I型胶原经光交联形成第一网络结构，所述温敏材料经热交联形成第二网络结构，所述第一网络结构与所述第二网络结构交错互穿。
6.根据权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述水凝胶预聚溶液经光交联，还包括：
在所述水凝胶预聚溶液中加入光敏材料，以及苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中的任一种光引发剂，所述I型胶原与所述光敏材料经光交联分别形成交错互穿的第一网络结构与第三网络结构。
7.一种胶原基水凝胶，其特征在于，所述胶原基水凝胶采用权利要求1至6任一项所述的制备方法制得。
8.一种胶原基水凝胶，其特征在于，包括由I型胶原在金属配体复合物光引发剂与过硫酸钠光引发剂作用下经光交联形成的第一网络结构；以及，
由温敏材料经热交联形成的第二网络结构；和/或，
由光敏材料在苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中的任一种光引发剂作用下，经光交联形成的第三网络结构；
第二网络结构和/或第三网络结构与所述第一网络结构交错互穿。
9.一种体外三维模型的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：
形成待培养三维模型的细胞悬液；所述细胞悬液中的细胞包括细胞系、原代细胞、干细胞；
加入权利要求1-7任一项所述胶原基水凝胶交联前的水凝胶预聚溶液，
将所述水凝胶预聚溶液与所述细胞悬液混合，取适量混合液加入用于培养所述细胞的培养腔或培养孔中，经过光交联，形成细胞凝胶；
向含有所述细胞凝胶的培养腔或培养孔中，加入培养基，经培养，得到体外三维模型。
10.一种体外三维模型的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：
形成待培养类器官的细胞或细胞团悬液；所述细胞或细胞团悬液中的细胞或细胞团由肿瘤组织或非肿瘤组织经消化分离重悬得到，或者由待传代的肿瘤类器官或非肿瘤类器官经消化分离重悬得到；
获得水凝胶预聚溶液，所述水凝胶预聚溶液包含I型胶原、金属配体复合物光引发剂以及过硫酸钠光引发剂；
将所述水凝胶预聚溶液与所述细胞或细胞团悬液混合，取适量混合液加入用于培养所述类器官的培养腔或培养孔中，经过光交联，形成类器官凝胶；
向含有所述类器官凝胶的培养腔或培养孔中，加入培养基，经培养，得到肿瘤类器官或非肿瘤类器官的体外三维模型。
11.一种体外三维模型，其特征在于，所述体外三维模型采用权利要求9或10所述的培养方法培养形成。
12.一种利用如权利要求11所述的体外三维模型对药物检测的方法，其特征在于，所述药物检测的方法包括：
向体外三维模型引入待测药物；
获取所述待测药物对所述体外三维模型的作用结果。
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