CN116218760A - 基于多材料悬浮生物3d打印的动脉器官芯片及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于多材料悬浮生物3D打印的动脉器官芯片及制备方法，其中生物墨水材料来源于哺乳动物软组织的脱细胞基质，本发明以猪皮脱细胞基质dECM为例，结合三联吡啶氯化钌Ru和过硫酸钠SPS，配制具有光辐照交联特性的生物墨水材料VLC‑dECM，易溶于水的PF‑127为牺牲墨水材料，通过先后在支撑浴材料VLC‑dECM中悬浮打印第一层封装人源主动脉血管平滑肌细胞的VLC‑dECM材料和第二层牺牲材料PF‑127，经过可见光交联后，使用磷酸缓冲液PBS溶解去掉牺牲材料PF‑127，形成血管通道。本发明节约了制造时间；制造的动脉器官芯片可在重力引导下实现无泵灌流，简化动脉器官芯片的整体结构；制造的动脉器官芯片具有良好的多层动脉仿生结构。

Description

基于多材料悬浮生物3D打印的动脉器官芯片及制备方法
技术领域
本发明提供一种基于多材料悬浮生物3D打印的动脉器官芯片及制备方法，属于生物组织工程技术领域。
背景技术
人体的动脉系统在血液循环中有极其重要的作用，负责将心脏内含有氧气和营养物质的血液输送至全身。当动脉系统的任何一个环节出现紊乱时，都可能会引起各种致命的疾病和并发症。与动脉相关的异常症状可导致心梗、脑梗等缺血性疾病。这些疾病是全世界每年数百万人死亡的主要原因，通常由动脉粥样硬化、血栓和动脉瘤等动脉相关疾病引发。虽然临床治疗手段已经能挽救部分患动脉相关疾病的患者，但这些动脉异常的潜在病理还不完全清楚。
大量的血管疾病模型已经建立在实验动物或平面细胞培养的基础上，然而，这两种类型的模型都面临着限制其应用的重大限制。首先，动物和人类之间的种间差异不可避免地导致病理差异和不可预测的药物反应变化。从实验动物身上获得的结果可能为临床应用提供有限甚至无效的参考。另一方面，二维细胞培养大多缺乏自然组织中存在的三维微环境，因此不能准确地反映人体生理病理机制，比如，平面衬底不仅抑制了细胞的极化和排列，而且限制了多种类型细胞之间的相互作用。
为了克服这些限制，研究动脉血管的病理机制和各种因素对病变动脉的影响，三维动脉体外芯片可以在多层次多尺度上模拟生物环境，有利于了解和研究动脉病理机制。目前，构建三维动脉血管芯片的方法包括微针模板法、基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)软光刻法和同轴生物3D打印法。微针模板法、聚二甲基硅氧烷(PDMS)软光刻法无法制备双层血管体外模型，即使同轴生物3D打印法，由于生物墨水材料和制造工艺的限制，仍无法有效实现制造多层血管芯片。因此，迫切需要能够准确反映人体动脉生理病理的动脉疾病模型，作为探究疾病机制和研发特效药物的诊断、检测和筛选平台。
综上，本发明针对现有生物3D打印制造多层动脉器官芯片的技术难题，以及生物医学领域对多层动脉器官芯片的模型需求，基于悬浮生物3D打印技术，提出一种基于多材料悬浮生物3D打印的人体动脉器官芯片制造方法。该方法涉及一种新型生物墨水的配制，该生物墨水材料具有光辐照交联特性，良好的生物相容性，流变性和可打印性。
发明内容
基于现有生物制造方法很难实现制备结构复杂，形状尺寸可控的多层动脉器官芯片，无法保证动脉器官芯片的结构形状保真度，以及现有的动脉器官芯片难以精确反映人体血管生理病理机制，且需泵控灌流的复杂程序，本发明基于生物3D打印技术，提出一种基于多材料悬浮生物3D打印的人体动脉器官芯片制造方法，通过运用多种生物墨水材料的特殊性质构建多层结构管道，并且可以仿生制造弯曲和分叉等复杂血管结构以及不同内径和壁厚的复杂动脉器官芯片模型，同时，可依赖重力作用实现无泵灌流，本发明涉及的多层动脉器官芯片可成为研究血液动力学与动脉疾病关系的利器，可用于药物筛选，病理机制研究等生物医学领域。
具体的技术方案为：
本发明提出的动脉器官芯片制造方法涉及的脱细胞基质材料来源于猪、牛、人等哺乳动物软组织，优选的，本发明以新鲜猪皮脱细胞基质(decellularized extracellularmatrix,dECM)为例，结合光引发剂三联吡啶氯化钌Ru和过硫酸钠SPS配制具有光辐照交联性质的生物墨水材料(visible light curable dECM,VLC-dECM)，易溶于水的PF-127为牺牲墨水材料，通过先后在支撑浴材料VLC-dECM中悬浮打印第一层封装人源主动脉血管平滑肌细胞(HAoSMCs)的VLC-dECM材料和第二层牺牲材料PF-127，经过可见光辐照引发交联后，使用磷酸缓冲液PBS溶解去掉牺牲材料PF-127，形成血管通道，达到制造多层动脉器官芯片的目的。此外，通过控制打印工艺参数，如打印路径，打印速度和挤出气压，能够精准实现结构和尺寸可控的复杂动脉器官芯片模型。
该方法的具体步骤包括：
步骤一、配制支撑浴墨水；
将质量浓度2％的dECM与10×DMEM溶液按体积比9：1混合，加入氢氧化钠溶液，中和材料酸性，使调节后的dECM材料pH＝7。按照1：0.6的体积比例，将pH＝7的dECM与磷酸缓冲液PBS均匀混合，然后放入生物培养箱(37℃，体积比5.0％ CO2)中20～30分钟进行预交联形成凝胶后取出，使用破壁机将dECM凝胶打碎3分钟，形成dECM微凝胶颗粒。将dECM微凝胶颗粒在高速离心机中(转速10000r/min)离心5分钟，吸出离心后的上层清液。
按照体积比1：100向dECM微凝胶颗粒均匀混入三联吡啶氯化钌Ru(浓度50mM/L的溶液)；再按照体积比1：10向dECM微凝胶颗粒均匀混入过硫酸钠SPS(浓度50mM/L的溶液)。由于混入三联吡啶氯化钌Ru和过硫酸钠SPS的dECM凝胶属于温敏和光敏材料，此操作需要在避光和温度小于15℃环境中进行。得到的混合生物墨水VLC-dECM用于支撑浴材料，以下简称0.5VLC-dECM，具有剪切恢复和光辐照交联性质。该方法提高了VLC-dECM的自愈合能力，有利于实现嵌入式悬浮打印制造。将0.5VLC-dECM墨水挤入生物3D打印机的第一喷头胶筒内，设置打印温度为15℃。
步骤二、配制打印生物墨水；
将质量浓度2％的dECM与10×DMEM溶液按体积比9：1混合，加入氢氧化钠溶液，中和材料酸性，使调节后的dECM材料pH＝7。按照1：0.7的体积比例，将pH＝7的dECM材料与磷酸缓冲液PBS均匀混合。分别按照1：200和1：20的比例依次向dECM凝胶中均匀先后混入三联吡啶氯化钌Ru(浓度50mM/L的溶液)和过硫酸钠SPS(浓度50mM/L的溶液)，由于混入三联吡啶氯化钌Ru和过硫酸钠SPS的dECM凝胶属于温敏和光敏材料，此操作需要在避光和温度小于15℃环境中进行。制备用于生物3D打印的混合生物墨水VLC-dECM，以下简称0.25VLC-dECM，具有剪切恢复和光辐照交联性质。使用移液枪将浓度为2*106cells/mL人源主动脉血管平滑肌细胞(HAoSMCs)均匀混入0.25VLC-dECM，并挤入生物3D打印机的第二喷头胶筒内，设置打印温度为15℃。
步骤三、将生物3D打印机的接收平台温度设置为15℃，在避光环境中开始进行生物3D打印。首先使用第一喷头(针头直径0.8mm)向预先制备完成的芯片框架中打印1-2mm厚度的0.5VLC-dECM材料作为动脉器官芯片的支撑浴材料，打印速度150mm/min，打印气压8kPa，其中芯片框架使用生物聚合物材料聚乙烯在打印温度120℃，挤出气压330kPa条件下，通过生物3D打印方式制造，其结构类似空心“工”字型，并设计有灌流引流口，用于引导细胞培养液流入动脉器官芯片管道内，使芯片可依赖重力作用实现无泵灌流，其材料可由其他生物聚合物材料代替；
步骤四、转换第二喷头(针头直径0.8mm)挤出封装HAoSMCs细胞的0.25VLC-dECM，打印速度250mm/min，打印气压8kPa，并按照G代码指令完成打印路径，形成动脉器官芯片的第一层结构；
步骤五、转换第三喷头(针头直径0.8mm)挤出牺牲材料PF-127(40％w/v)，在打印温度25℃，打印速度350mm/min，打印气压170kPa参数下，按照与步骤四同样的打印路径运动，完成打印；
步骤六、使用光照强度25mW/cm2，波长405nm的可见光照射动脉器官芯片20s，使其发生光辐照交联；
步骤七、使用磷酸缓冲液PBS去除牺牲墨水材料PF-127，形成动脉器官芯片微通道，此时动脉器官芯片模型结构制造完成；
步骤八、向动脉器官芯片模型加入适量DMEM培养液，并将模型放置温度37℃、体积比5％CO2的生物培养箱中30分钟，使VLC-dECM材料中含有的dECM发生温敏交联，与光辐照交联凝胶形成互穿网络，提升材料强度；
步骤九、取出动脉器官芯片模型，吸走DMEM培养液，向模型管道内种植密度2*106cells/mL的人脐静脉内皮细胞HUVECs，再次加入培养液，并放置温度37℃、体积比5％CO2的生物培养箱；
步骤十、培养2小时后观察细胞状态，更换新的DMEM培养液，并将动脉器官芯片放在摇床上辅助培养液在重力引导下进行无泵灌流，摇床设置为上下摆动，与水平面最大摆角设置为15°，摇摆速度30r/min，使培养液能够充分流进芯片管道，放置37℃、体积比5％CO2的生物培养箱继续培养，直到血管模型管道长满细胞形成内皮层，HAoSMCs细胞形成中膜层，此时动脉器官芯片模型已具有生物功能，可用于预测血管疾病，以及模拟药物输送。
本发明技术方案具有的技术效果：
1.本发明制备的生物墨水材料VLC-dECM，其涉及的脱细胞基质来源于哺乳动物软组织，能够为细胞的增殖和生长提供必要的生理微环境；
2.本发明制备的生物墨水材料VLC-dECM是一种具有光辐照交联特性的生物材料，还具备温敏交联特性，两种交联方式形成互穿网络，提升了材料强度，提高了动脉器官芯片成型质量；
3.本发明提出的一种基于多材料悬浮生物3D打印的人体动脉器官芯片制造方法，制造一个动脉器官芯片模型仅需120s时间，节约了制造时间，提高了生物制造效率；
4.本发明通过悬浮生物3D打印的人体动脉器官芯片，在后处理灌流过程中仅可依靠重力引导的无泵灌流，简化了芯片结构，操作简单；
5.本发明涉及到的生物墨水材料，具有血管组织特异性、高生物活性和光辐照交联的特点，其包含的材料比例经过实验验证，既保证动脉器官芯片在可见光下交联，又能保证细胞活性，提升芯片生物功能；
6.本发明制造的动脉器官芯片具有良好的多层动脉仿生结构，能够实现直路、弯曲、分叉等多种构型，且尺寸可控，可用于药物筛选、病理探究等生物医学领域。
附图说明
图1为本发明的双层血管体外模型制造流程；
图2a为本发明嵌入式悬浮生物3D打印制备双层动脉器官芯片体外模型过程示意图；
图2b为本发明双层动脉器官芯片体外模型的结构和无泵灌流动脉器官芯片框架结构；
图3为实施例的双层动脉器官芯片模型。
具体实施方式
结合实施例说明本发明的具体技术方案。
本发明提出的基于多材料悬浮生物3D打印的动脉器官芯片的制备方法，如图1所示，该方法能够制备具有结构形状高保真度的，结构和尺寸可控的多层动脉器官芯片模型，具体实现方案如下：
步骤一、配制支撑浴墨水。优化的，以新鲜猪皮脱细胞基质dECM为例，将质量浓度2％的dECM与10×DMEM溶液按体积比9：1混合，加入氢氧化钠溶液，中和材料酸性，使调节后的dECM材料pH＝7。按照体积1：0.6的比例，将pH＝7的dECM与磷酸缓冲液PBS均匀混合，然后放入生物培养箱(37℃，体积比5.0％ CO2)中20～30分钟进行预交联形成凝胶后取出，使用破壁机将dECM凝胶打碎3分钟，形成dECM微凝胶颗粒。将dECM微凝胶颗粒在高速离心机中(转速10000r/min)离心5分钟，吸出离心后的上层清液。最后分别依次按照1：100和1：10的比例先后向dECM微凝胶颗粒均匀混入三联吡啶氯化钌Ru和过硫酸钠SPS(浓度50mM/L的溶液)。由于混入三联吡啶氯化钌Ru和过硫酸钠SPS的dECM凝胶属于温敏和光敏材料，此操作需要在避光和温度小于15℃环境中进行。最终制备混合生物墨水VLC-dECM用于支撑浴材料，以下简称0.5VLC-dECM，具有剪切恢复和光辐照交联性质。该方法提高了VLC-dECM的自愈合能力，有利于实现嵌入式悬浮打印制造。将0.5VLC-dECM墨水挤入生物3D打印机的第一喷头(1)胶筒内，设置打印温度为15℃。
步骤二、配制打印生物墨水。优选的，以新鲜猪皮脱细胞基质为例，将质量浓度2％的dECM与10×DMEM溶液按体积9：1混合，加入氢氧化钠溶液，中和材料酸性，使调节后的dECM材料pH＝7。按照体积比1：0.7的比例，将pH＝7的dECM材料与磷酸缓冲液PBS均匀混合。分别依次按照1：200和1：20的比例先后向dECM凝胶中均匀混入三联吡啶氯化钌Ru和过硫酸钠SPS(浓度50mM/L的溶液)，由于混入三联吡啶氯化钌Ru和过硫酸钠SPS的dECM凝胶属于温敏和光敏材料，此操作需要在避光和温度小于15℃环境中进行。制备用于生物3D打印的混合生物墨水VLC-dECM，以下简称0.25VLC-dECM，具有剪切恢复和光辐照交联性质。使用移液枪将浓度为2*106cells/mL人源主动脉血管平滑肌细胞(HAoSMCs)均匀混入0.25VLC-dECM，并挤入生物3D打印机的第二喷头(2)胶筒内，设置打印温度为15℃。
步骤三、将生物3D打印机的接收平台温度设置为15℃，在避光环境中开始进行生物3D打印。首先使用第一喷头(1)(针头直径0.8mm)向预先制备完成的芯片框架中打印1-2mm厚度的0.5VLC-dECM材料作为动脉器官芯片的支撑浴材料，打印速度150mm/min，打印气压8kPa如图2a中的(i)所示。其中芯片框架使用生物聚合物材料聚乙烯在打印温度120℃，挤出气压330kPa条件下，通过生物3D打印方式制造，其结构类似空心“工”字型，如图2b所示，该结构设计有无泵灌流引流口，辅助动脉器官芯片依靠重力诱导培养液灌流到芯片管道，其材料可由其他生物聚合物材料代替。
步骤四、转换第二喷头(2)(针头直径0.8mm)挤出封装HAoSMCs细胞的0.25VLC-dECM，打印速度250mm/min，打印气压8kPa，并按照G代码指令完成打印路径，形成动脉器官芯片的第一层结构，如图2a中的(ii)所示；
步骤五、转换第三喷头(3)(针头直径0.8mm)挤出牺牲材料PF-127(40％w/v)，在打印温度25℃，打印速度350mm/min，打印气压170kPa参数下，按照与步骤四同样的打印路径运动，完成打印，如图2a中的(iii)所示；
步骤六、使用光照强度25mW/cm2，波长405nm的可见光照射动脉器官芯片20s，使其发生光辐照交联，如图2a中的(iv)所示；
步骤七、使用磷酸缓冲液PBS去除牺牲墨水材料PF-127，如图2a中的(v)所示，形成动脉器官芯片微通道，此时动脉器官芯片模型结构制造完成；
步骤八、向动脉器官芯片模型加入适量DMEM培养液，并将模型放置温度37℃，5％CO2的生物培养箱中30分钟，使VLC-dECM材料中含有的dECM发生温敏交联，与光辐照交联凝胶形成互穿网络，提升材料强度；
步骤九、取出动脉器官芯片模型，吸走DMEM培养液，向模型管道内种植密度2*106cells/mL的人脐静脉内皮细胞HUVECs，再次加入培养液，并放置温度37℃、体积比5％CO2的生物培养箱；
步骤十、培养2小时后观察细胞状态，更换新的DMEM培养液，并将动脉器官芯片放在摇床上辅助培养液在重力引导下进行无泵灌流，摇床设置为上下摆动，与水平面最大摆角设置为15°，摇摆速度30r/min，使培养液能够充分流进芯片管道，放置37℃、体积比5％CO2的生物培养箱继续培养，直到血管模型管道长满细胞形成内皮层，HAoSMCs细胞形成中膜层，此时动脉器官芯片模型已具有生物功能，可用于预测血管疾病，以及模拟药物输送。根据需求动脉器官芯片模型可以为多种结构，如图2b所示。
为清楚展示本发明提出的一种基于多材料悬浮生物3D打印的人体动脉器官芯片制造方法，分别在0.25VLC-dECM材料和PF-127材料中均匀混入红色和蓝色荧光粒子，使用倒置荧光显微镜观察动脉器官芯片成型情况，如图3为实施例得到的双层动脉器官芯片模型，将该模型置于摇床上，在摇床的摆动作用下，细胞培养液依靠重力作用通过引流口流入动脉器官芯片管道内部，并伴随摇床进行往复循环流动。
本发明提出的一种基于多材料悬浮生物3D打印的人体动脉器官芯片制造方法具有广阔的应用前景，可在打印的动脉器官芯片模型样品管道内种植人体脐静脉内皮细胞进行模拟血液灌流，使分叉结构的血管体外模型在分叉位置出现内皮层损伤，由此可以预测人体血管分叉结构位置容易发生血管疾病，如内皮层损伤诱发的动脉粥样硬化等。

Claims (7)

1.基于多材料悬浮生物3D打印的动脉器官芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以脱细胞基质dECM水凝胶为基础，配置光辐照交联的生物墨水VLC-dECM，通过在预先使用3D打印构建的芯片框架中沉积VLC-dECM微凝胶颗粒作为支撑浴，并在支撑浴中依次定位悬浮打印封装平滑肌细胞的VLC-dECM生物墨水和PluronicF127牺牲材料，经过可见光辐照交联后除去PF127，并定植内皮细胞，形成具有平滑肌细胞/内皮细胞的双层仿生动脉芯片。
2.根据权利要求1所述的基于多材料悬浮生物3D打印的动脉器官芯片的制备方法，其特征在于，所述脱细胞基质来源于哺乳动物的软组织；所述软组织包括主动脉、真皮、骨骼肌和胃黏膜中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的基于多材料悬浮生物3D打印的动脉器官芯片的制备方法，其特征在于，所述光辐照交联为光引发剂三联吡啶氯化钌Ru/过硫酸钠SPS在可见光辐照下激发的脱细胞基质水凝胶交联；所述光辐照波长不小于405nm。
4.根据权利要求1所述的基于多材料悬浮生物3D打印的动脉器官芯片的制备方法，其特征在于，所述VLC-dECM微凝胶颗粒支撑浴具有剪切恢复和光辐照交联性质。
5.根据权利要求1所述的基于多材料悬浮生物3D打印的动脉器官芯片的制备方法，其特征在于，所述芯片框架依靠重力实现无泵化灌流。
6.根据权利要求1所述的基于多材料悬浮生物3D打印的动脉器官芯片的制备方法，其特征在于，所述的脱细胞基质来源为猪皮脱细胞基质dECM，包括以下步骤：
步骤一、配制支撑浴墨水；
将质量浓度2％的dECM与10×DMEM溶液按体积比9：1混合，加入氢氧化钠溶液，中和材料酸性，使调节后的dECM材料pH＝7；按照1：0.6的体积比，将dECM与磷酸缓冲液PBS均匀混合，然后放入生物培养箱，条件为37℃，体积比5.0％CO2，培养20～30分钟，进行预交联形成凝胶后取出，使用破壁机将dECM凝胶打碎3分钟，形成dECM微凝胶颗粒；
将dECM微凝胶颗粒在高速离心机中，转速10000r/min，离心5分钟，吸出离心后的上层清液；
按照体积比1：100的比例向dECM微凝胶颗粒均匀混入三联吡啶氯化钌Ru，制备浓度50mM/L的溶液；此操作在避光和温度小于15℃环境中进行；
按照体积比1：10的比例向已经加入三联吡啶氯化钌Ru的dECM微凝胶颗粒均匀混入过硫酸钠SPS，制备浓度50mM/L的溶液；此操作在避光和温度小于15℃环境中进行；
得到的混合生物墨水VLC-dECM用于支撑浴材料，以下简称0.5VLC-dECM，具有剪切恢复和光辐照交联性质；将0.5VLC-dECM墨水挤入生物3D打印机的第一喷头(1)胶筒内，设置打印温度为15℃；
步骤二、配制打印生物墨水；
将质量浓度2％的dECM与10×DMEM溶液按体积9：1混合，加入氢氧化钠溶液，中和材料酸性，使调节后的dECM材料pH＝7；按照1：0.7的体积比例，将dECM材料与磷酸缓冲液PBS均匀混合；
按照体积比1：200的比例向dECM凝胶中均匀混入三联吡啶氯化钌Ru，制备浓度50mM/L的溶液；此操作在避光和温度小于15℃环境中进行；
按照体积比1：20的比例向已经加入三联吡啶氯化钌Ru的dECM微凝胶颗粒均匀混入过硫酸钠SPS，制备浓度50mM/L的溶液；此操作在避光和温度小于15℃环境中进行；
制备得到用于生物3D打印的混合生物墨水VLC-dECM，以下简称0.25VLC-dECM，具有剪切恢复和光辐照交联性质；
使用移液枪将浓度为2*106cells/mL人源主动脉血管平滑肌细胞HAoSMCs均匀混入0.25VLC-dECM，并挤入生物3D打印机的第二喷头(2)胶筒内，设置打印温度为15℃；
步骤三、将生物3D打印机的接收平台温度设置为15℃，在避光环境中开始进行生物3D打印；首先使用针头直径0.8mm的第一喷头(1)向预先制备完成的芯片框架中打印1-2mm厚度的0.5VLC-dECM材料作为动脉器官芯片的支撑浴材料，打印速度150mm/min，打印气压8kPa，其中芯片框架使用生物聚合物材料聚乙烯在打印温度120℃，挤出气压330kPa条件下，通过生物3D打印方式制造，其结构为空心“工”字型，并设计有灌流引流口，用于引导细胞培养液流入动脉器官芯片管道内，辅助无泵灌流；
步骤四、转换针头直径0.8mm的第二喷头(2)挤出封装HAoSMCs细胞的0.25VLC-dECM，打印速度250mm/min，打印气压8kPa，并按照G代码指令完成打印路径，形成动脉器官芯片的第一层结构；
步骤五、转换针头直径0.8mm的第三喷头(3)挤出牺牲材料PF-127，牺牲材料PF-127为40％w/v溶液，在打印温度25℃，打印速度350mm/min，打印气压170kPa参数下，按照与步骤四同样的打印路径运动，完成打印；
步骤六、使用光照强度25mW/cm2，波长405nm的可见光照射动脉器官芯片20s，使其发生光辐照交联；
步骤七、使用磷酸缓冲液PBS去除牺牲墨水材料PF-127，形成动脉器官芯片微通道，此时动脉器官芯片模型结构制造完成；
步骤八、向动脉器官芯片模型加入适量DMEM培养液，并将模型放置温度37℃、体积比5％CO2的生物培养箱中30分钟，使VLC-dECM材料中含有的dECM发生温敏交联，与光辐照交联凝胶形成互穿网络；
步骤九、取出动脉器官芯片模型，吸走DMEM培养液，向模型管道内种植密度2*106cells/mL的人脐静脉内皮细胞HUVECs，再次加入培养液，并放置温度37℃、体积比5％CO2的生物培养箱；
步骤十、培养2小时后观察细胞状态，更换新的DMEM培养液，并将动脉器官芯片放在摇床上辅助培养液在重力引导下进行无泵灌流，摇床设置为上下摆动，与水平面最大摆角设置为15°，摇摆速度30r/min，使培养液能够充分灌注芯片管道，放置37℃、体积比5％CO2的生物培养箱继续培养，直到血管模型管道长满细胞形成内皮层，HAoSMCs细胞形成中膜层。
7.基于多材料悬浮生物3D打印的动脉器官芯片，其特征在于，根据权利要求1-6任一项所述的制备方法所得。
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