KR102612626B1 - 바이오 잉크 조성물, 바이오 프린터 및 이들을 이용하는 바이오 프린팅 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이오 잉크 조성물, 바이오 프린터 및 이들을 이용하는 바이오 프린팅 방법에 관한 것으로, 본 발명의 바이오 잉크는 우수한 생체 적합성을 가지고, 광 가교 시간이 빠르며, 단일 중합체로서 부가적인 공정을 요하지 않고, 높은 재현성의 스캐폴드 제작이 가능하며, 본 발명의 바이오 프린터는 바이오 잉크와 광원의 광 가교 중합 파장 범위가 일치함으로써, 빠른 프린팅 및 재현성이 뛰어난 효과를 가지고, 본 발명의 바이오 프린팅 방법을 사용하면 광조절제, 층 당 두께 및 광 노출 시간을 조절함으로써, 빠른 프린팅 및 재현성이 뛰어난 스캐폴드를 제작할 수 있다.
Description
본 발명은 바이오 잉크 조성물, 바이오 프린터 및 이들을 이용하는 바이오 프린팅 방법에 관한 것이다.
[이 발명을 지원한 사업]
주관기관: (주)노아바이오텍
사업명: 연구용역사업
과제명: 3D프린터를 활용한 소 유래 근육 및 지방 세포의 3차원 배양 기술 개발
연구기간: 2020.07.01~2023.06.30
조직 공학은 세포, 세포가 부착되어 자랄 수 있는 지지체 및 세포의 성장 및 분화를 조절할 수 있는 각종 인자를 적절히 이용하여 여러 조직의 재생 및 장기복원을 목표로 하는 연구를 통칭하는 것으로, 생체 적합성을 가지는 물질을 활용하여 기능적으로 조직 및 기관을 대체할 수 있는 인공 조직을 제작하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로, 조직 공학은 인체의 조직에서 분리하여 배양한 세포들을 생분해성 고분자 물질로 만든 다공성의 지지체(스캐폴드)에 부착시켜 이식하거나 체외에서 일정 기간 동안 배양하여 새로운 생체조직을 만드는 것이다. 즉, 세포는 부착해서 자라려는 성질이 있기 때문에 이 환경을 제공하여 줄 지지체가 필요하며, 다공성의 스캐폴드는 삼차원적 구조물을 제공하여 세포가 부착하고 분열하여 새로운 조직을 형성하도록 한다.
엔지니어링된 조직을 위한 구조물인 스캐폴드로서, 세포를 3차원 공간에서 배양하기 위한 하이드로젤을 활용한 스캐폴드가 있다. 하이드로겔 기반 스캐폴드는 수성 환경을 제공하고 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 모방하며 영양소 투과성이 우수하여 조직 공학에서 많은 주목을 받았다. 다만, 기하학적 형태의 스캐폴드를 조형하는 것과 살아있는 세포를 빠르게 실제 조직과 같은 큰 사이즈로 재현하는 것에는 한계가 있었다.
따라서, 복잡한 형태의 하이드로젤 스캐폴드를 제조하기 위하여 생체재료와 세포들의 혼합물로 구성된 바이오 잉크를 이용하여 3D 프린터로 스캐폴드를 제조하는 기술이 시도되고 있다.
대표적인 3D 바이오 프린팅 방식으로는 압출형 타입이 있다. 이는 세포가 담지되어 있는 구조적으로 무결성이 유지되는 바이오 잉크를 3차원축을 기준으로 하여 이를 이동시키며 압출하는 방식으로서, 직관적인 움직임으로 사용자가 이를 조정하기 용이한 장점을 가지고 있다.
다만, 압출형 타입의 경우 생리적 온도 유지가 필수적으로 요구되며, 세포 파괴를 방지하기 위해 일정 압력 이상을 가하기 어려운 문제가 있다. 또한, 바이오 잉크 조성물의 광 가교 결합이 일어나는 파장 범위와 3D 바이오 프린터가 방출하는 광 파장 범위의 불일치로 인해 광 반응성이 낮아 해상도가 떨어지거나, 원치 않는 과중합이 발생하는 문제가 있다. 이외에도, 점도가 낮거나 반응성이 느린 바이오 잉크 조성물을 사용하는 경우 전체 프린팅 시간이 지연되어 생산성을 저하시키고, 길어진 프린팅 시간으로 세포의 생존력이 떨어지는 문제가 있다.
따라서, 직관적인 움직임을 가지며, 기하하적 스캐폴드의 제조가 가능한 3D 바이오 프린팅 기술을 적절하게 이용하기 위해서는, 생리적 온도가 유지되면서도 세포에 압력이 가해지지 않고 신속한 제조가 가능하고 과중합이 발생하지 않는 바이오 잉크용 조성물 및 3D 바이오 프린팅 방법에 대한 개발이 필요하다.
본 발명은 우수한 생체 적합성을 가지고, 광 가교 시간이 빠르며, 단일 중합체로서 부가적인 공정을 요하지 않고, 높은 재현성의 스캐폴드 제작이 가능한 바이오 잉크 조성물, 바이오 프린터 및 상기 바이오 잉크 조성물과 바이오 프린터를 이용하여 빠른 반응성을 나타내면서도 과중합의 발생이 방지되며 세포의 생존력이 높은 바이오 프린팅 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 세포, 광경화성 고분자, 광개시제 및 상기 광개시제와 다른 흡수 또는 투과 특성을 가지는 광조절제를 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
본 발명은 일 실시예로서, 항생제를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 항생제가 페니실린-스트렙토마이신일 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 광경화성 고분자는 젤라틴 메타크릴레이트(gelatin methacrylate)일 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 광개시제는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 4-(2-히드록시에톡시)페닐-(2-히드록시-2-프로필)케톤, 에오신 와이(Eoxin-Y), 로즈벵갈 (rose bengal) 및 리보플라빈 (riboflavin vitamin B2)로 이루어지는 그룸에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 광조절제는 아조계, 크산텐계, 시아닌계, 프탈로시아닌계, 안트라퀴논계, 메틴계, 쿠마린계, 니트로계, 포르피린계, 인디고계, 스쿠아릴륨계 및 트리아릴메탄계로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 색소를 포함할 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 광조절제는 바이오 잉크 조성물의 광 가교 파장 범위를 조절하는 것일 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 세포는 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germcell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, pH 조절제를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 pH 조절제가 DPBS일 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 조성물 총 중량에 대하여, 광경화성 고분자 1 내지 20%(w/v), 광개시제 0.001 내지 1%(w/v) 및 광조절제 0.01 내지 1%(w/v)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 광원; 상기 바이오 잉크 조성물을 수용하는 레진 탱크; Z 축으로 이동 가능하고, 상기 광원의 광 조사에 의하여 상기 바이오 잉크 조성물이 광 가교 반응하는 중합 플레이트; 및 상기 광원의 광 조사 시간 및 상기 중합 플레이트의 이동을 제어하는 제어부를 포함하는 바이오 프린터를 제공한다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 상기 중합 플레이트는 Z 축 방향으로 이동하며, 스캐폴드를 한 층당 소정의 두께로 연속해서 적층 출력하는 것일 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 제어부는, 상기 광원의 조사 시간을 바이오 잉크 조성물의 점탄성 계수에 대한 탄젠트 델타 값이 상승하는 시간으로 제어할 수 있다.
또한, 본 발명은 광원을 포함하는 바이오 프린터로 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 바이오 잉크 조성물을 광 조사하여 스캐폴드를 생산하는 바이오 프린팅 방법으로서, 바이오 프린터의 광원이 방출하는 파장 범위에 바이오 잉크 조성물의 최대 광 흡수 파장이 포함되도록 광 조절제를 바이오 잉크 조성물에 첨가는 단계를 포함하는 바이오 프린팅 방법을 제공한다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 바이오 잉크 조성물에 대한 광원의 조사 시간은 바이오 잉크 조성물의 점탄성 계수에 대한 탄젠트 델타 값이 상승하는 시간으로 제어하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 광 조사 시간이 3 내지 10초일 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 스캐폴드는 바이오 잉크 조성물이 광 조사에 의하여 광 가교된 것으로, Z-축방향으로 한 층당 소정의 두께로 연속해서 적층된 형태일 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 출력하는 단계에서 한 층당 두께는 25 내지 150μm일 수 있다.
본 발명의 바이오 잉크는 우수한 생체 적합성을 가지고, 광 가교 시간이 빠르며, 단일 중합체로서 부가적인 공정을 요하지 않고, 높은 재현성의 스캐폴드 제작이 가능하다.
또한, 본 발명의 바이오 프린터는 바이오 잉크와 광원의 광 가교 중합 파장 범위가 일치함으로써, 빠른 프린팅 및 재현성이 뛰어난 효과를 가진다.
또한, 본 발명의 바이오 프린팅 방법을 사용하면 광조절제, 층 당 두께 및 광 노출 시간을 조절함으로써, 빠른 프린팅 및 재현성이 뛰어난 스캐폴드를 제작할 수 있다.
도 1은 젤라틴 메타크릴레이트의 합성 과정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 젤라틴과 젤라틴 메타크릴레이트의 FTIR 스펙트럼이다.
도 3은 젤라틴과 젤라틴 메타크릴레이트의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 4는 바이오 프린터의 개략도 및 출력된 스캐폴드의 측면을 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조예 및 비교예의 광 흡수 파장대를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조예(하단) 및 비교예(상단)의 바이오 잉크 조성물을 이용하여 출력한 스캐폴드이다.
도 7은 광조절제의 종류에 따른 바이오 잉크 조성물의 반응 파장대를 나타내는 그래프이다.
도 8은 바이오 프린터의 광원의 파장대(빨강) 및 분석 실험에 사용된 LED omnicure의 파장대(검정)을 나타내는 그래프(a) 및 바이오 잉크의 유변학적 겔화 역학을 나타내는 그래프이다.
도 9는 프린팅 정확성을 평가하기 위해 사용한 14개의 속이 빈 튜브를 가진 모델과 그 규격을 나타내는 이미지이다.
도 10은 광 조사 시간이 10초(a), 8초(b) 및 7초(c)인 경우 스캐폴드의 결과물을 나타내는 이미지이다.
도 11은 본 발명의 제조예에 따른 바이오 잉크를 사용하여 제조된 스캐폴드의 SEM 분석을 위한 샘플을 나타낸 이미지(a), 시간의 변화에 따른 샘플 내부의 기공 크기 변화를 나타낸 이미지(b), 시간의 경과에 따른 샘플 내부 기공 크기의 분산도(c 내지 e) 및 시간의 경과에 따른 샘플 내부 기공의 이미지(f 내지 h)이다.
도 12는 본 발명의 제조예에 따른 바이오 잉크를 사용하여 제조된 스캐폴드를 5일간 배양한고, F-actin(빨강) 및 DAPI(파랑)을 염색한 후 촬영한 전체이미지(상단), 10x 배율 이미지(중단) 및 20x 배율 이미지(하단)이다.
도 13은 본 발명의 제조예에 따른 바이오 잉크를 사용하여 제조된 스캐폴드의 Live/Dead 이미지(a) 및 5일간 세포 생존율을 나타낸 Live/Dead 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 제조예에 따른 바이오 잉크를 사용하여 제조된 스캐폴드의 5일간 세포 증식을 보여주는 CCK-8 및 WST-1 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 제조예에 따른 바이오 잉크를 사용하여 제조된 스캐폴드의 모델링 대상인 사람의 귀 형상 이미지(A), 출력된 스캐폴드(B) 및 시간의 경과에 따른 출력된 스캐폴드의 4x 배율 현미경 이미지(C)이다.
도 2는 젤라틴과 젤라틴 메타크릴레이트의 FTIR 스펙트럼이다.
도 3은 젤라틴과 젤라틴 메타크릴레이트의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 4는 바이오 프린터의 개략도 및 출력된 스캐폴드의 측면을 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조예 및 비교예의 광 흡수 파장대를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조예(하단) 및 비교예(상단)의 바이오 잉크 조성물을 이용하여 출력한 스캐폴드이다.
도 7은 광조절제의 종류에 따른 바이오 잉크 조성물의 반응 파장대를 나타내는 그래프이다.
도 8은 바이오 프린터의 광원의 파장대(빨강) 및 분석 실험에 사용된 LED omnicure의 파장대(검정)을 나타내는 그래프(a) 및 바이오 잉크의 유변학적 겔화 역학을 나타내는 그래프이다.
도 9는 프린팅 정확성을 평가하기 위해 사용한 14개의 속이 빈 튜브를 가진 모델과 그 규격을 나타내는 이미지이다.
도 10은 광 조사 시간이 10초(a), 8초(b) 및 7초(c)인 경우 스캐폴드의 결과물을 나타내는 이미지이다.
도 11은 본 발명의 제조예에 따른 바이오 잉크를 사용하여 제조된 스캐폴드의 SEM 분석을 위한 샘플을 나타낸 이미지(a), 시간의 변화에 따른 샘플 내부의 기공 크기 변화를 나타낸 이미지(b), 시간의 경과에 따른 샘플 내부 기공 크기의 분산도(c 내지 e) 및 시간의 경과에 따른 샘플 내부 기공의 이미지(f 내지 h)이다.
도 12는 본 발명의 제조예에 따른 바이오 잉크를 사용하여 제조된 스캐폴드를 5일간 배양한고, F-actin(빨강) 및 DAPI(파랑)을 염색한 후 촬영한 전체이미지(상단), 10x 배율 이미지(중단) 및 20x 배율 이미지(하단)이다.
도 13은 본 발명의 제조예에 따른 바이오 잉크를 사용하여 제조된 스캐폴드의 Live/Dead 이미지(a) 및 5일간 세포 생존율을 나타낸 Live/Dead 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 제조예에 따른 바이오 잉크를 사용하여 제조된 스캐폴드의 5일간 세포 증식을 보여주는 CCK-8 및 WST-1 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 제조예에 따른 바이오 잉크를 사용하여 제조된 스캐폴드의 모델링 대상인 사람의 귀 형상 이미지(A), 출력된 스캐폴드(B) 및 시간의 경과에 따른 출력된 스캐폴드의 4x 배율 현미경 이미지(C)이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 구체적으로 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있다.
본 발명은 세포, 광경화성 고분자, 광개시제 및 상기 광개시제와 다른 흡수 또는 투과 특성을 가지는 광조절제를 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
상기 세포는 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germcell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나일 수 있으며, 예를 들어, 상기 세포는 소 귀 유래 섬유아세포(BEFCs)일 수 있다.
상기 세포는 혈청 및 항생제가 첨가된 포도당에서 배양한 세포 배양액의 형태로 상기 바이오 잉크 조성물에 포함될 수 있다.
상기 혈청은 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)일 수 있으며, 상기 항생제는 페니실린 스트렙토마이신일 수 있다.
상기 포도당은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)일 수 있다.
상기 세포 배양액의 조성은 전체 용액에 대하여 5 내지 20%(v/v)의 혈청 및 0.1 내지 3%(w/v)의 항생제를 포함할 수 있다.
이때, 상기 세포는 2 내지 10% CO2에서 32 내지 41℃의 조건에서 배양할 수 있다.
상기 광경화성 고분자는 젤라틴 메타크릴레이트(gelatin methacrylate, GelMA)일 수 있다.
상기 젤라틴 메타크릴레이트는 젤라틴(gelatin)을 메타크릴화(methacryloylation)하여 광경화 특성을 부여한 재료로써 동물의 뼈, 피부 또는 근육으로부터 얻은 콜라겐(collagen)을 산 처리 또는 알칼리 처리하여 가수분해하여 얻을 수 있다.
예를 들어, 상기 젤라틴 메타크릴레이트는 젤라틴을 30 내지 70℃의 5 내지20% (w/v) 인산 완충 식염수(PBS)에 혼합하고 완전히 용해될 때까지 교반한 후, 30내지 70 ℃에서 2 내지 6 시간 반응시켜 제조할 수 있다.
일반적으로, 가교가 이루어진 젤라틴 메타크릴레이트는 기계적 물성이 약하여 대형의 스캐폴드 제작에는 어려움이 있다. 특히, 위에서 아래로 점층적으로 쌓아올리는 압출식 3D 프린터를 이용한 방식(Z-적층) 에서는 순수한 젤라틴 메타크릴레이트 스캐폴드는 중력에 의해 만들 수 없었다.
본 발명은 디지털 광원 처리(digital light processing, DLP) 방식으로 스캐폴드를제조하기 때문에 제조 과정상 이러한 한계가 없으며, 젤라틴 메타크릴레이트 용액의 낮은 점성은 오히려 세포에게 부담감이 덜하여 더 높은 세포 생존력을 보여줄 수 있다. 또한, 젤라틴 메타크릴레이트의 광반응성이 낮은 문제는 광개시제 및 광조절제의 최적화를 통해 해결하였다.
상기 젤라틴 메타크릴레이트는 세포부착 아미노산 펩타이드인 arginine-glycine-glutamic acid (Arg-Gly-Glu, RGD)를 갖고 있으며, 젤라틴 메타크릴레이트에 붙은 메타크릴로일기(methacryloyl group)는 광개시제 존재하에서 광에 의해 겔화된다.
상기 젤라틴 메타크릴레이트의 GelMA의 기계적 강도는 주로 메타크릴레이트의 농도와 메타크릴화도(degree of methacryloylation, DM), 광개시제의 농도, 광 조사량 및 광 노출 시간 등으로 조절할 수 있다.
본 발명에 적합한 젤라틴 메타크릴레이트의 메타크릴화도는 60 내지 90%일 수 있으며, 예를 들어, 70 내지 90%, 75 내지 85% 또는 80 내지 83%일 수 있다.
또한, 본 발명에 적합한 젤라틴 메타크릴레이트의 농도는 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 20%(w/v)일 수 있으며, 예를 들어, 5 내지 20%, 7 내지 18%, 9 내지 16% 또는 9 내지 11%일 수 있다.
젤라틴 메타크릴레이트의 메타크릴화도 및 농도가 상기 범위를 만족하는 경우 바이오 프린팅에 적합한 점도를 가지며, 제조된 스캐폴드가 생체 조직으로 사용하기 용이한 기계적 강도를 가질 수 있다.
상기 광개시제는 상기 광경화성 고분자를 광 존재하에 겔화시킨다. 광경화성 고분자 사이의 가교역할을 해주며, 광개시제의 광 반응 파장대는 사실상 전체 바이오 잉크 조성물의 광 반응 파장대가 된다.
상기 광경화성 고분자가 젤라틴 메타크릴레이트인 경우, 상기 광개시제는 메타크릴로일기(methacryloyl group)를 광 가교시킴으로써 겔화할 수 있다.
상기 광개시제는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 4-(2-히드록시에톡시)페닐-(2-히드록시-2-프로필)케톤, 에오신 와이(Eoxin-Y), 로즈벵갈 (rose bengal) 및 리보플라빈 (riboflavin vitamin B2로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 광개시제는 친수성 및 무세포 독성의 관점에서 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트일 수 있다. 상기 개시제를 사용하는 경우 인산 완충 용액(DPBS)과 함께 세포를 담지할 수 있다.
상기 광개시제의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 1%(w/v)를 포함할 수 있다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물은 상기 광개시제와 다른 흡수 또는 투과 특성을 가지는 광조절제를 포함할 수 있다. 상기 광조절제는 광개시제와 다른 흡수 또는 투과 특성을 가지며, 바이오 잉크 조성물의 흡수 또는 투과 특성을 변화시킨다.
바이오 잉크 조성물에 상기 광개시제를 사용하는 경우, 광개시제의 광 반응 영역대가 UV 영역대에 가깝기 때문에 광 반응을 위해서는 UV를 세포에 직접 조사하여 세포 데미지가 유발되는 문제가 있다. 또한, 바이오 잉크 조성물의 광 반응 파장과 바이오 프린터의 광원의 파장이 상이한 경우 가교가 충분히 일어나기 어려워 정교한 스캐폴드의 제작이 어려운 문제도 있다.
따라서, 본 발명에서는 상기와 같은 광조절제를 포함함으로써 상기 문제를 해결할 수 있다.
구체적으로, 상기 본 발명의 광조절제는 광 반응 파장대를 조절해주며, 빛이 액상을 투과하는 깊이를 조절할 수 있다. 반응 파장대는 상기 광개시제의 파장대를 조절해주는 것으로 LAP의 주요 UV 반응 파장대는 바이오 프린터가 노출하는 빛의 영역인 405 nm에 부합하지도 않을 뿐만 아니라 세포 데미지를 유발한다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물은 광조절제를 더 포함함으로써, 405 nm의 바이오 프린터가 아니더라도 색상을 통해 다양한 영역대로 조절 가능한 이점이 있다. 또한, 빛의 투과 깊이를 조절하여 빛이 예상보다 바이오 잉크에 깊이 투과되는 것을 방지하는 역할을 할 수 있다. 예상보다 깊이 투과된 빛은 미리 설계한 3D 모델링보다 더 큰 과중합 현상을 발생시킬 수 있다.
상기 광조절제는 아조계, 크산텐계, 시아닌계, 프탈로시아닌계, 안트라퀴논계, 메틴계, 쿠마린계, 니트로계, 포르피린계, 인디고계, 스쿠아릴륨계 및 트리아릴메탄계로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 색소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 광조절제는 필로퀴논일 수 있다.
구체적으로, 바이오 프린터의 광원의 파장대를 파악한 다음, 상기 광원의 파장대에서 바이오 잉크 조성물의 광 흡수율을 높이거나 반응 파장대를 조절하기 위해 적합한 광조절제를 첨가할 수 있다.
예를 들어, 상기 바이오 프린터의 광원의 파장이 380 내지 440nm인 경우, 바이오 잉크 조성물의 광조절제로서 비타민 K1(필로퀴논)을 첨가할 수 있다.
상기 광조절제의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 3%(w/v)일 수 있다.
상기 바이오 잉크 조성물은 항생제를 더 포함할 수 있으며, 상기 항생제는 프린팅 과정에서 발생하는 외부 오염에 대한 위험성을 줄여줄 수 있다.
예를 들어, 상기 항생제는 페니실린-스트렙토마이신일 수 있다.
상기 항생제의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 1%(w/v)일 수 있다.
상기 바이오 잉크 조성물은 pH 조절제를 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 pH 조절제는 DPBS일 수 있다.
상기와 같은 pH 조절제를 포함함으로써, 세포가 pH에 의해 손상되는 것을 방지할 수 있다.
또한, 상기 바이오 잉크 조성물은 혈청을 더 포함할 수 있으며, 혈청은 FBS일 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 조성물 총 중량에 대하여, 혈청 0.5 내지 5%(v/v), 광경화성 고분자 1 내지 20%(w/v) 및 광개시제 0.001 내지 1%(w/v)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 광원(10); 바이오 잉크 조성물(20)을 수용하는 레진 탱크(30); Z 축으로 이동 가능하고, 상기 광원의 광 조사에 의하여 상기 바이오 잉크 조성물이 광 가교 반응하는 중합 플레이트(40); 및 상기 광원의 광 조사 시간 및 상기 중합 플레이트의 이동을 제어하는 제어부(50)를 포함하는 바이오 프린터를 제공한다.
상기 바이오 잉크 조성물이 광원의 광 조사에 의해 가교 반응하며, 상기 중합 플레이트의 이동에 의해 Z 축 방향으로 한 층당 소정의 두께로 연속해서 적층될 수 있다.
도 4를 참조하면, 상기 바이오 프린터(1)는 바이오 잉크(20)를 레진 탱크(30)에 담은 후, 중합 플레이트(40)가 레진 탱크(30)에 담기면 하단의 광원(10)이 출력하고자 하는 디자인을 소정의 단위로 슬라이싱하여 빛을 노출시키는 디지털 광원 처리(digital light processing, DLP) 기술을 활용할 수 있다.
상기 제어부는, 상기 광원의 노출 시간을 바이오 잉크 조성물의 점탄성 계수에 대한 탄젠트 델타 값이 상승하는 시간으로 제어할 수 있다.
예를 들어, 상기 광 노출 시간은 3 내지 10초일 수 있으며, 구체적으로 상기 광 노출 시간은 5 내지 7초 또는 5.5 내지 6.5초일 수 있다.
또한, 본 발명은 광원을 포함하는 바이오 프린터로 상기 바이오 잉크 조성물을 광 조사하여 스캐폴드를 생산하는 바이오 프린팅 방법으로서, 바이오 프린터의 광원이 방출하는 파장 범위에 바이오 잉크 조성물의 최대 광 흡수 파장이 포함되도록 광 조절제를 바이오 잉크 조성물에 첨가는 단계를 포함하는 바이오 프린팅 방법을 제공한다.
바이오 프린터는 주로 380~440 nm 사이의 광파장대를 출력하는데, 광개시제만을 사용하는 경우, 바이오 프린터 광원이 방출하는 파장 영역대와 바이오 잉크의 광 반응 파장의 미스매치로 인하여 반응성이 부족하다.
따라서, 본 발명은 광조절제의 첨가를 통해 바이오 잉크의 광 반응 파장 범위가 상기 바이오 프린터의 광원이 방출하는 파장 범위에 포함되도록 조절할 수 있다.
또한, 광원을 이용하여 바이오 잉크 조성물에 이미지를 광 조사하는 단계; 및 한 층당 소정의 두께로 연속 출력하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 광 조사하는 단계에서 광 조사 시간은 3 내지 10초일 수 있다. 예를 들어, 상기 광 조사하는 단계에서 광 조사 시간은 5 내지 7초 또는 5.5 내지 6.5초일 수 있다.
본 발명은 일 실시예로서, 상기 출력하는 단계에서 상기 스캐폴드는 바이오 잉크 조성물이 광 조사에 의하여 광 가교된 것으로, Z-축방향으로 한 층당 소정의 두께로 연속해서 적층된 형태일 수 있다.
이 때, 한 층당 두께는 25 내지 150μm일 수 있으며, 예를 들어, 50 내지 120μm 또는 90 내지 110μm일 수 있다. 한 층당 두께가 상기 범위를 만족하는 경우 안정된 세포의 담지가 가능하며, 바이오 프린팅 속도를 향상할 수 있다.
실시예
1. 세포 배양
소 귀 유래 섬유 아세포(BEFCs, 라트바이오)를 10%(v/v)의 소 태아 혈청(FBS) 및 1%(w/v)의 페니실린 스트렙토 마이신(p/s)이 첨가된 고 포도당(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)에서 배양하였다. 세포는 5%의 CO2 및 37 ℃에서 배양되었다. 세포는 0.05% 트립신-EDTA(Welgene, 한국)를 사용하여 주당 약 2회 계대 배양되었고 배지는 2일마다 교환되었다.
2. 젤라틴 메타크릴레이트 합성
젤라틴 (A 형, 300 bloom from procine skin)을 50 ℃의 10% (w/v) 인산 완충 수용액(PBS, pH 7.4)에 혼합하고 완전히 용해될 때까지 교반 하였다. 메타크릴산 무수물을 15 % (v/v)에 도달할 때까지 1ml/min의 속도로 50 ℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 반응을 멈추기 위해 400 % (v/v) 40 ℃의 PBS를 첨가한 후, 혼합물을 12-14 kDa cut-off dialysis tubing을 사용하여 증류수에 대해 1 주 동안 투석하여 잔류 메타크릴산 무수물을 제거하였다. 용액을 4 일 동안 동결 건조하여 정제된 젤라틴 메타크릴레이트를 제조하였다.
3. 바이오 잉크의 제조
비교예
바이오잉크의 준비를 위해 동결 건조된 젤라틴 메타크릴레이트를 2%(v/v)의 소 태아 혈청(FBS, Welgene, 한국)과 1% 페니실린 스트렙토마이신(Welgene, 한국) 및 0.05% (w/v) 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 (
95 %, LAP, Sigma-Aldrich, 미국)가 첨가된 37 ℃의 Dulbecco's 인산 완충 식염수(DPBS, Welgene, 한국)에 10 % (w/v) 농도로 완전히 용해하였다. 배양된 세포를 수급하여 상기 용액에 2x106/ml의 농도로 조심스럽게 고르게 퍼지도록 섞어 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.
제조예
광조절제로서 비타민 K1(필로퀴논)을 더 첨가한 것을 제외하고는 상기 비교예와 동일하게 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.
4. 바이오 프린터 셋팅
상기 바이오 잉크 조성물을 미리 37 ℃로 예열해놓은 IM2(3D printer; carima, 한국)의 레진 탱크에 옮겨 담았다. 초기 3 개의 층은 중합 플레이트에서 떨어지지 않도록 10 초의 시간동안 광 노출하도록 설정하였다. 또한, 한 층은 두께는 100 μm 단위로 설정하였으며, 매 층마다 초기 층을 제외한 나머지 기본 광 노출 시간을 5초(실시예 1), 6 초(실시예 2) 및 7초(실시예 3)으로 설정하였다.
프린팅 과정이 끝나면 중합 플레이트에서 제작된 스캐폴드를 떼어낸 후, 37 ℃의 DPBS에 2번의 워싱을 반복하였다. 그런 다음, 스캐폴드를 10% FBS, 1% p/s를 첨가 한 DMEM에서 배양하였다.
5. 특성화
5-1. 푸리에 변환 적외선 분광법(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)
젤라틴과 젤라틴 메타크릴레이트의 화학 구조는 2 mg의 샘플을 100mg의 브롬화 칼륨과 혼합한 후 푸리에 변환 적외선 분광기(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)(FTIR-4100, Jasco, 일본)를 사용하여 분석하였다.
도 1은 젤라틴을 무수 메타크릴산과 반응시켜 50℃에서 중성 조건에서 아민 기의 치환 반응을 통해 합성한 젤라틴 메타크릴레이트의 반응 개략도이다.
도 2를 참조하면, 젤라틴(gelatin) 및 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA)의 FTIR 스펙트럼은 1077 cm-1 (C-H band), 1534 cm-1 (amide 2, N-H bending 및 C-N stretching), 1630 cm-1 (amide 1, C=O stretching), 2929 cm-1 (C-H stretching), 및 3300 cm-1 (O-H stretching)에서 공통적인 밴드를 나타내었으며. 1640 cm-1과 1540 cm-1에서 전형적인 아미드 1 및 2 밴드가 젤라틴과 젤라틴 메타크릴레이트에 존재하지만 그 정도는 서로 다르다. 젤라틴과 젤라틴 메타크릴레이트 스펙트럼을 비교했을 때, 젤라틴의 라이신 그룹에 메타크릴레이트 그룹이 추가되어 C-H 스트레칭 및 밴딩 영역에 차이가 있다. 이러한 차이를 통해 젤라틴에서 젤라틴 메타크릴레이트로 화학적, 구조적 변화가 발생하였음을 확인할 수 있다.
5-2.
1
H NMR 분석(nuclear magnetic resonance spectroscopy)
젤라틴 메타크릴레이트의 메타크릴화도를 결정하기 위해 1H NMR 분광법을 수행하였다. 젤라틴과 젤라틴 메타크릴레이트를 D2O에 용해시키고 500MHz FT-NMR 분광계(Varian; Palo Alto, California, USA)를 사용하여 분석하였다.
도 1 및 도 3을 참조하면, 젤라틴의 스펙트럼과 비교하여 젤라틴 메타크릴레이트 샘플은 빨간색 "a"및 녹색 "c"로 표시된 새로운 작용기를 형성하였다. 약 5.3 및 5.5 ppm의 화학적 이동에 나타난 피크는 그래프트된 메타크릴로일기의 양성자를 나타내고, 1.9ppm의 또 다른 피크는 그래프트된 메타크릴로일기의 메틸기에 기인한다.
한편, 2.9 내지 3.1ppm에서 강도가 감소한 것은 라이신 메틸렌에 의한 것으로 청색 "b"로 표시되었다. 라이신이 반응 부위이기 때문에 이 경향은 메타크릴화도를 정량화하는데 사용할 수 있으며, 이는 81.4%로 산출되었다.
5-3. 광조절제의 효과
도 4는 바이오 프린터의 개략도를 나타낸다. 프린팅 과정동안 세포의 생존환경을 유지하기 위해 레신 탱크를 37 ℃로 유지하였다. 또한, 젤라틴 메타크릴레이트를 DPBS에 녹임으로써 pH에 의한 사멸을 예방하였다.
상기 바이오 프린터는 젤라틴 메타크릴레이트와 세포를 포함하는 저점도 바이오 잉크를 레진 탱크에 담은 후, 중합 플레이트가 레진 탱크에 담기면 하단의 LED가 출력하고자 하는 디자인을 100 μm 단위로 슬라이싱하여 빛을 노출시키는 디지털 광원 처리(digital light processing, DLP) 기술을 활용하였다.
매 층은 정교하게 100 μm 단위로 출력되었으며, 이에 따라 세포는 고르게 분포되었다(도 4의 확대 부분). 다만, 비교예의 바이오 잉크를 사용한 경우 광개시제로 사용된 LAP의 반응 파장대와 바이오 프린터의 출력 광 파장대의 차이로 인해 출력된 결과물은 정교함이 떨어졌다.
도 5에 나타낸 바와 같이 바이오 프린터는 주로 380~440 nm 사이의 광파장대를 출력(보라색 영역)하였으나, LAP만 사용한 비교예의 경우(검정색) 바이오 프린터 영역대의 파장에 대한 반응성이 부족하였다. 제조예의 바이오 잉크를 사용한 경우, 광조절제에 의하여 380 ~ 440 nm의 광 반응 파장대에서도 반응(빨강색)하였다.
따라서, 비교예의 바이오 잉크와 제조예의 광조절제가 혼합된 바이오 잉크의 프린팅 결과물은 명확하게 차이가 있었다. 도 6을 참조하면, 비교예(도 6의 상부)의 경우, 일부는 광 가교가 불충분하게 일어나며, 다른 일부는 광 가교가 과다하게 발생하여 프린팅하고자 했던 모델을 명확하게 프린팅하지 못하였다. 제조예(도 6의 하부)와 같이 광조절제를 같이 사용한 경우, 광가교는 안정적으로 이루어져 명확하게 모서리 부분까지 표현하면서 프린팅이 가능하였다.
이를 통해, 광경화성 고분자의 반응 파장대와 바이오 프린터의 광원의 방출 파장이 상이할 경우, 정교한 프린팅이 불가능함을 확인할 수 있었으며, 특히, DLP 또는 SLA-프린터와 같은 광 가교를 원리로 하는 바이오 프린터에서 방출되는 광 파장 영역대는 일정하지 않으며, 이에 따라 바이오 잉크를 방출되는 광원의 파장 영역대에 맞추어 최적화하는 과정이 필요하다는 것이 증명되었다.
본 발명에서는 정교한 프린팅을 위하여 광조절제를 사용한 것을 특징으로 하는데, 상기 광조절제는 색에 따라 그 역할이 달라질 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 사용된 바이오 프린터의 방출 파장 영역대는 도 7에 나타낸 그래프에서 파란 범위의 영역대이다. 광조절제 처리가 안된 비교예는 이 영역대에서 낮은 흡수율을 보여준다. 하지만 노란색 또는 초록색 광조절제를 사용한 제조예는 해당 영역대에서 높은 흡수율로 조정되었음을 확인할 수 있다.
또한, 같은 영역대 안에서도 색에 따라 더 높은 흡수율을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 따라서, 자외선 그리고 가시광선 영역대 안에서 광조절제를 통하여 흡수 파장 영역대를 조절할 수 있을 뿐만 아니라 그 흡수율 또한 사용자가 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.
5-4. 프린팅 정확성 분석
조직의 기하학적 형태와 복잡한 구조를 재현하기 위해서, 바이오 잉크의 프린팅 정확성을 조사하였다. 광 중합형 바이오잉크의 특징상 광 노출 시간에 따라 프린팅 정확성에 차이를 보였다. 젤라틴 메타크릴레이트의 겔화 역학을 조사하기 위해 광-유변학 분석을 시행하였다. 젤라틴 메타크릴레이트의 프린팅 환경과 유사한 조건에서 실험을 위해, 도 8(a)(도면 3-A)에 나타낸 바와 같이 UV 모듈 악세사리가 장착된 HAKKE MARS 40 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 사용하였다. 바이오 프린터(IM2)와 유사한 파장을 가진 광원은 400 nm LED 채널이 장착된 Omnicure LX 505 (Lumen Dynamics; Mississauga, ON, Canada)에 의해 생성되었다. UV의 세기는 유리판 지오메트리에서 측정하여 바이오 프린터(IM2)와 같은 세기로 설정하였다. 약 10 μl의 무세포 바이오잉크를 플레이트 사이에 로드하고 간격을 100 μm로 설정하였다. 진동(oscillation) 실험은 0.01%의 진동 전단 변형과 1 Hz의 주파수로 37 ℃에서 수행되었다. 유변학 측정과 UV 노출 시작은 지연 없이 동시에 시작되었다.
도 8(b)를 참조하면, 37 ℃에서 바이오 잉크는 광 노출 시작(0 초)과 동시에 저장 계수(G') 및 손실 계수(G'')가 상승하는 경향을 보였지만, 손실 탄젠트(tan δ)에는 변화가 발생하지 않았다. 하지만 5.3 초에서 바이오잉크의 광가교가 발생하면서 G'이 G''보다 빠르게 감소하면서 tan δ는 급격한 상승 곡선을 보였다. 6.4 초에서 G'이 빠르게 반등하면서 tan δ는 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 따라서, 바이오 잉크는 광 노출을 시작하고 5.3 초에서부터 중합 반응을 시작할 수 있었으며, 6.4 초까지 반응되었다.
상기 광 노출 시간에 따른 효과가 스캐폴드에 반영되는 결과를 확인하기 위하여, 도 9과 같이 주입구 1개 및 주입구와 이어지는 14개의 서로 다른 지름을 지닌 속이 빈 튜브(27.2 mm (가로) x 11 mm (세로) x 2.5 mm (높이))를 가진 모델을 바이오 프린팅하였다. 속이 빈 튜브 모델은 액상을 광 중합하는 프린팅 원리의 특징상 정밀한 가교 기술이 아니면 제작하기 힘들기 때문에 채택되었다.
상기 광-유변학 분석에 의해 얻어진 정보를 바탕으로 3가지 조건 (LED 광 노출 시간: 5, 6 및 7 초)으로 나누어 프린팅을 실시하였다. 프린팅된 스캐폴드의 속이 빈 튜브를 정확히 확인하기 위해 주사기를 통해 주입구에 0.065% (w/v) eosin Y 액상을 충분히 흘려넣었다. 그런 다음, 450 내지 550 nm의 외부 필터가 장착된 Omnicure S2000 (Lumen Dynamics; Mississauga, ON, Canada)에 의해 생성된 UV를 이용하여 스캐폴드 내에 침투한 형광물질을 통해 속이 빈 튜브를 관찰하였다.
도 10(a)를 참조하면, 5 초의 광 노출 시간을 적용한 스캐폴드(실시예 1)는 직경 1000 μm(1) 부터 450 μm (10)까지 확인 가능하였다. 미세한 튜브까지 구현 가능하였지만, 불충분한 중합에 의해 구조적 무너짐이 발생하였다.
도 10(c)를 참조하면, 7 초의 광 노출 시간을 적용한 스캐폴드(실시예 3)는 모델링의 구현도가 높았으며, 구조적으로 안정하였다. 그러나, 과중합으로 인해 대부분의 속이 빈 튜브는 막혔다. 직경 600 μm (7)까지만 구현 가능하였으며, 700 μm (5) 부터 600 μm (7)는 과중합으로 인해 모델링과 다르게 더 얇은 직경으로 구현되었다.
도 10(b)를 참조하면, 6 초의 광 노출 시간을 적요한 스캐폴드(실시예 2)는 구조적으로 안정적인 스캐폴드를 구현하였으며, 모델링의 재현 충실도가 높았다. 속이 빈 튜브는 직경 1000 μm (1) 부터 550 μm (8)까지 구현 가능하였으며, 과중합은 발생하지 않았다.
결론적으로, 광-유변학 분석를 활용하여 조직의 기하학적인 형태와 복잡한 구조를 재현하기 위한 최적의 광 노출 시간을 확인할 수 있었다.
5-5. 주사전자현미경 (Scanning Electron Microscope, SEM) 이미지 분석
프린팅된 스캐폴드는 기공 구조를 통해 세포 니체(niche)를 제공하고, 세포의 분아 증식(proliferation)을 위해 추가적인 공간을 형성할 수 있어야한다.
이를 확인하기 위하여 프린팅된 스캐폴드 내 세포 미세환경의 형태학적 특성을 SEM에 의해 조사하였다.
구체적으로, 도 11(a)에 표시한 바와 같이, 스캐폴드의 내부 구조를 확인하기 위해 직육면체 모델 스캐폴드(15mm (가로) x 6mm (세로) x 15mm (높이))를 프린팅하고, 이를 -80 ℃에서 3 일 동안 동결 건조시킨 후 단면 형태를 SU-8010 주사 전자 현미경(Hitachi, 일본)으로 이미지화 하였다. 기공 크기는 SEM 이미지에서 동결 건조된 모든 기공을 100x 이미지로 측정하여 확인하였다.
도 11(b)를 참조하면, 프린팅 후 1일 간 인큐베이터에 있던 그룹의 스캐폴드의 평균 기공 크기는 48.5 ± 13.1 μm이었다. 3일 그룹은 약간의 증가가 있는 52.4 ± 14.2 μm이었다. 반면, 5일 그룹은 1일차와 비교하였을 때 통계적으로 유의미한 차이가 있는 80.7 ± 5.9 μm이였다.
기공 크기는 실제 하이드로젤의 기공을 나타내지 못하지만, 기공 크기에 대한 상대적인 비교와 간접적 예측은 가능하다. 시간이 지남에 따라 규칙적인 구조를 유지하지 못하면서 큰 크기의 기공이 증가하여 기공 분포도(pore distribution)가 증가하는 경향을 보였다.
도 11(c) 및 도 11(f)를 참조하면, 1일차에는 일정한 크기와 규칙적인 구조를 가지고 있었다. 도 11(d) 및 도 11(g)를 참조하면, 3일차에는 약간의 불규칙적인 구조가 보였지만, 전체적인 공극 크기의 분포도는 유사하였다. 도 11(e) 및 도 11(h)를 참조하면, 5일차에는 긴 시간 동안 발생한 젤라틴 메타크릴레이트의 생분해적 특징 과 생리적활성 온도에서 발생되는 높은 스웰링(swelling) 특징에 기인하여 큰 기공 크기의 분포가 많이 증가하였으며, 구조적 붕괴가 발생함에 따라 공간의 확장성이 확인되었다. 이러한 결과를 바탕으로 젤라틴 메타크릴레이트 스캐폴드가 초기에 담지된 세포가 캡슐화될 수 있는 기공성 구조이며, 시간이 지남에 따라 세포 분아 증식을 위한 공간을 확보할 수 있는 특성을 지녔다는 것을 확인하였다.
5-6. 스캐폴드의 세포 부착능
다층적 구조로 구성된 스캐포드 내에서 세포 형태를 통해 세포 부착(adhesion)과 마이크로필라멘트(microlament) 형성을 관찰하기 위해, 스캐폴드를 F-action/DAPI를 염색하였다. 3D 스캐폴드에 요구되는 세포의 부착 특성은 조작된 조직에서 세포 생존, 기능 유지 및 스캐폴드 내 캡슐화된 세포를 장기간 배양하기 위한 필수적인 특성이다.
도 12를 참조하면, 5일간 스캐폴드 내에서 배양된 BEFCs의 이미지를 확인할 수 있다. 샘플 전체의 이미지를 보면, 지름 8mm, 높이 2mm (100 μm 단위로 20개의 층)로 이루어진 디스크 형태의 샘플 전체에 BEFCs는 세포 생존은 물론 마이크로필라멘트를 형성하며, 활성화된 모습을 보였으며, 스캐폴드 내 세포가 균일하게 분포된 모습도 확인할 수 있다. 또한, 10x, 20x 이미지에서는 세포는 사방으로 3차원적 공간을 활용하여 세포 부착을 이루고 있음을 확인할 수 있다. 이를 통해, Z-stacking 스캐폴드는 3차원적인 세포 부착을 이룰 수 있는 능력을 갖췄음을 확인하였다.
5-7. 세포 생존력 평가
Z-적층 스캐폴드를 성공적으로 사용하기 위해 캡슐화된 BEFCs의 생존력과 형태를 5일간 조사하였다. 특히, Z-적층 스캐폴드 내에 고농도의 세포가 캡슐화되어 원활한 영양분과 산소 공급을 통해 세포 생존력을 유지할 수 있는지를 조사하였다.
도 13을 참조하면, 배양 1일 후 세포 생존율은 94.2 ± 3.9%로 높은 초기 세포 생존력을 보여주어 바이오 잉크 제작 과정과 프린팅 과정에서 세포의 안정적인 캡슐화가 이뤄졌음을 보여주었다. 3일 후 세포 생존율은 99.5 ± 0.4%로 세포의 증식에 따라 더 많은 세포가 관찰되었으며, 이웃 세포와의 상호 연결된 네트워크를 형성하기 시작하였다. 배양 5일 후, 3차원적 공간으로 형성되는 작은 다세포 네트워크와 길쭉한 세포 형태가 관찰되었다. 5일차의 Z-적층 스캐폴드 내 BEFCs의 세포 생존력은 99.3 ± 0.07%이였다.
결론적으로, 5일동안 Z-적층 스캐폴드는 세포에게 세포외기질 (ECM)과 같은 3차원 세포 배양 환경의 제공을 통해 우수한 세포 생존력을 유지할 수 있었다.
5-8. 세포 증식 분석
Z-적층 스캐폴드 내 캡슐화된 BEFCs의 세포 증식을 최대 5일간 조사하였다. ECM 역할을 하는 Z-적층 스캐폴드의 잠재력을 보다 철저히 조사하기 위해 CCK-8 과 WST-1 분석을 시행하였다. 1, 3, 및 5 일 동안 Z-적층 스캐폴드에 캘슐화된 BEFCs는 효과적으로 증식하였다.
도 14를 참조하면, CCK-8 분석 결과에서 3일차는 1일차보다 316% 및 5일차는 3일차보다 273% 상승하였다. WST-1 분석 결과에서는 3일차는 1일차보다 266% 및 5일차는 3일차보다 243% 상승하였다. 실험 프로토콜의 특성상 미디어(media) 체인지는 이뤄지지 않았지만, 5일 간 높은 세포 성장률을 보여주었다. 따라서, CCK-8 및 WST-1 분석의 결과를 통해 세포의 ECM으로서의 Z-적층 스캐폴드가 세포 캡슐화 및 증식에 유리한 환경을 제공함을 입증할 수 있었다.
5-9. 귀 형상의 Z-적층 스캐폴드 프린팅 및 세포 배양
Z-적층 스캐폴드의 정교함과 실제 인공 조직 제작의 가능성을 확인하기 위해 BEFCs가 담지된 바이오 잉크로 영유아기의 귀를 디자인하여 프린팅하였으며, 이를 도 15에 나타내었다.
바이오 프린터를 통한 거대 스캐폴드를 제작하는 동안 영양 제한, 건조 및 캡슐화 스트레스 등으로 인해 손실이 유발될 수 있다. 앞선 실험 결과들을 통해 얻은 최적화된 바이오잉크와 광 노출 시간은 더욱 높은 해상도와 모델 재현성뿐만 아니라 빠른 프린팅 과정을 가능케하여 큰 빌드 사이즈를 출력하는 동안 세포의 영양제한 발생과 건조를 예방할 수 있었다.
귀 모양 Z-적층 스캐폴드는 표면이 매끈하게 표현되었으며, 귓구멍뿐만 아니라 귓바퀴와 같이 곡선의 복잡한 구조도 우수하게 재현하였다.
도 15(B)를 참조하면, 페놀-레드(Phenol-red)가 첨가된 DMEM을 베이스로 한 배양액에서 7일 간 배양되는 동안 다공성 구조로 이루어진 스캐폴드는 스웰링으로 인해 붉은 색을 나타내었다.
도 15(C)를 참조하면, 귀 형상 Z-적층 스캐폴드의 배양 1일차에 스캐폴드 내에 성공적으로 캡슐화된 세포가 관찰되었다. 3차원 공간에 고르게 분포되어 있었으며, 이웃 세포와 상호 연결 네트워크 형성을 시작하는 길쭉한 세포가 확인되었다. 또한, 배양 3 및 5일차에 각 층 마다 분포된 세포가 광범위하게 증식하였다. 제작된 스캐폴드의 모서리에 맞춰 세포 간의 연접을 통해 정렬되는 다세포 네트워크를 볼 수 있었다. 배양 7일차에도 세포의 증식이 꾸준히 이루어지고 있었으며, 스캐폴드를 이루는 젤라틴 메타크릴레이트 하이드로겔의 생분해로 인해 더 자유로운 세포 증식과 이동이 복합적으로 이루어져 고밀집된 세포 네트워크가 형성되었다.
따라서, 본 발명에 따른 Z-적층 스캐폴드는 광노출 시간 및 바이오 잉크의 파장대 조절을 통해 입력된 모델링을 명확하게 재현할 수 있었으며, 7일간의 장기간 배양을 통해 장기간 세포 증식이 가능하고 다세포 네트워크를 형성할 수 있음을 확인하였다.
Claims (19)
- 세포, 광경화성 고분자, 광개시제 및 상기 광개시제와 다른 흡수 또는 투과 특성을 가지는 광조절제를 포함하고,
상기 광개시제는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 (lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP)이고,
상기 광조절제는 비타민 K1(필로퀴논)이며,
상기 광경화성 고분자는 젤라틴 메타크릴레이트(gelatin methacrylate)이며,
상기 젤라틴 메타크릴레이트의 메타크릴화도는 60 내지 90%이고,
상기 젤라틴 메타크릴레이트의 농도는 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 20%(W/V)이며,
상기 광조절제는 바이오 잉크 조성물의 광 가교 파장 범위를 조절하는 바이오 잉크 조성물.
- 제1항에 있어서,
항생제를 더 포함하는 바이오 잉크 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 항생제가 페니실린-스트렙토마이신인 바이오 잉크 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 세포는 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germcell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나인 바이오 잉크 조성물.
- 제1항에 있어서,
pH 조절제를 더 포함하는 바이오 잉크 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 pH 조절제가 DPBS인 바이오 잉크 조성물.
- 제1항에 있어서,
조성물 총 중량에 대하여, 광개시제 0.001 내지 1%(w/v) 및 광조절제 0.01 내지 1%(w/v)를 포함하는 바이오 잉크 조성물.
- 광원;
제1항의 바이오 잉크 조성물을 수용하는 레진 탱크;
Z 축으로 이동 가능하고, 상기 광원의 광 조사에 의하여 상기 바이오 잉크 조성물이 광 가교 반응하는 중합 플레이트; 및
상기 광원의 광 조사 시간 및 상기 중합 플레이트의 이동을 제어하는 제어부를 포함하는 바이오 프린터.
- 제12항에 있어서,
상기 중합 플레이트는 Z 축 방향으로 이동하며, 스캐폴드를 한 층당 소정의 두께로 연속해서 적층 출력하는 것인 바이오 프린터.
- 제12항에 있어서,
상기 제어부는,
상기 광원의 조사 시간을 바이오 잉크 조성물의 점탄성 계수에 대한 탄젠트 델타 값이 상승하는 시간으로 제어하는 바이오 프린터.
- 광원을 포함하는 바이오 프린터로 제1항의 바이오 잉크 조성물을 광 조사하여 스캐폴드를 생산하는 바이오 프린팅 방법으로서,
바이오 프린터의 광원이 방출하는 파장 범위에 바이오 잉크 조성물의 최대 광 흡수 파장이 포함되도록 광 조절제를 바이오 잉크 조성물에 첨가는 단계를 포함하는 바이오 프린팅 방법.
- 제15항에 있어서,
바이오 잉크 조성물에 대한 광원의 조사 시간은 바이오 잉크 조성물의 점탄성 계수에 대한 탄젠트 델타 값이 상승하는 시간으로 제어하는 단계를 포함하는 바이오 프린팅 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 광원의 조사 시간이 3 내지 10초인 바이오 프린팅 방법.
- 제15항에 있어서,
상기 스캐폴드는 바이오 잉크 조성물이 광 조사에 의하여 광 가교된 것으로, Z-축방향으로 한 층당 소정의 두께로 연속해서 적층된 형태인 바이오 프린팅 방법.
- 제18항에 있어서,
상기 한 층당 두께는 25μm 내지 150μm인 바이오 프린팅 방법.
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2021
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Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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