KR20210027046A - 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법 - Google Patents

인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포운반물질로 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 특정 함량 이상으로 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물은 높은 점탄성, 강한 구조 안정성, 우수한 프린팅성, 생체적합성 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내기 때문에 삼차원적 바이오 프린팅을 이용한 조직 유사 구조체의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법{Composition of Bio-ink Comprising Human Derived Collagen and Methacrylated Low Molecular Weight Collagen and Method for Producing Tissue-Like Structure Using the Same}
본 발명은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포운반물질로 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 특정 함량 이상으로 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
삼차원적인 세포 배양기술은 실험실 내(in vitro)에서 생체조직과 유사한 환경에서 세포 및 조직을 제조할 수 있는 기술로 발달하여 세포의 성장과 분화, 조직 및 기관의 형성과 관련된 여러 연구 분야에 적용되고 있다. 이러한 조직 유사기관은 실제 조직이나 장기를 대신하여 약물의 독성 및 약물 동력학 연구에서 유용하게 사용될 수 있으며, 이에 따라 인간 검체 및 기타 포유동물에의 직접적인 실험 적용을 줄일 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 손상된 조직 및 장기를 대체 또는 치료하기 위한 목적인 조직공학(tissue engineering) 기법의 중요한 요소로 조직 및 장기의 공학적 설계에 기여하고 있다.
삼차원 바이오 프린팅 기술은 이러한 조직 유사기관 및 이식 가능한 구조체를 정밀하게 제조하기 위한 유용한 장치가 되었다. 이러한 기술은 실제 인간의 조직을 거의 그대로 모방한 미세 및 거대 조직 구조체를 생성하는 것을 가능하게 하고 있다. 하지만 바이오 프린팅시 살아있는 세포를 운반하는 생체재료, 즉, 바이오 잉크(bio-ink)는 그 활용도에 있어서 많은 한계점을 나타내고 있다. 바이오 프린팅에 적용되기 위해 요구되는 바이오 잉크의 특성으로는 우수한 생체적합성이 요구되고, 미세구경의 디스펜싱 노즐(dispensing nozzle)을 원활히 통과하여 원하는 패턴으로 프린팅이 될 수 있는 우수한 프린팅성을 가져야 하며, 프린팅 후 세포-특이적 신호를 제공하면서 기계적인 지지체 역할을 유지할 수 있는 구조 안정성을 가져야 한다는 것 등이다. 비록, 삼차원 바이오 프린팅 분야에서 천연 유래 또는 합성 하이드로겔 바이오 잉크가 개발되어 현재 사용되고 있지만, 이러한 기존 하이드로겔을 바탕으로 한 바이오 잉크는 생체적합성, 프린팅 적합성, 기하학적 정밀성, 정밀도와 같은 물리적 및 생물학적 측면에서 상당한 한계점을 보이고 있다.
본 발명의 발명자들은 선행연구를 통해 특정한 함량의 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 공개한바 있다(한국공개특허 제10-2017-0012099호). 이를 통해, 전술한 종래기술의 문제점 중 일부가 해결되는 성과를 얻을 수 있었지만 손상된 조직 및 장기를 대체 또는 치료하기 위한 목적인 조직공학에는 적합하지 않은 구조 안정성, 정교한 생체조직을 모사하기 위한 프린팅 정밀성 등에서 여전히 한계점이 있다는 것을 발견하고 이를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭하였다.
이에, 종래 바이오 잉크 조성물에서 세포 운반물질로 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen)을 특정 함량 이상으로 포함할 경우 놀라울 정도로 향상된 구조 안정성 및 프린팅 정밀성을 갖는 바이오 잉크를 제조할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포 운반물질로 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오 잉크 조성물을 이용한 조직 유사 구조체 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 조직 유사 구조체를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하며,
상기 세포 운반물질은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen)을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐의 분자량은 500 ~ 4000Da일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 인체 유래 콜라겐은 콜라겐 타입 Ⅰ일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물에 포함된 인체 유래 콜라겐은 0.1 ~ 10 w/v%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물에 포함된 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 0.1 ~ 10 w/v%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 가교 전 점도(complex viscosity)는 0.5 ~ 2.0 Pa·s이며, 가교 후 점도는 40 ~ 3400 Pa·s일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 점도는 0.5 ~ 0.7 Pa·s, 가교 후 점도는 340 ~ 380 Pa·s일 수 있다.
본 발멸은 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 가교 전 저장모듈러스(stroage modulus)는 0.4 ~ 3 Pa, 손실모듈러스(loss modulus)는 1 ~ 30 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2100 ~ 2400 Pa, 손실모듈러스는 180 ~ 300 Pa 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 저장모듈러스는 2.7 ~ 3.1 Pa, 손실모듈러스는 2.5 ~ 2.9 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2230 ~ 2270 Pa, 손실모듈러스는 170 ~ 210 Pa일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 가교전 탄젠트 델타(tangent delta) 값은 0.5 ~ 1.5, 가교 후 탄젠트 델타 값은 11.5 ~ 12.5 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물은 상기 점성 증강제가 0.01 ~ 1 w/v%, 윤활제가 1 ~ 30 w/v% 및 구조물질이 0.1 ~ 10 w/v% 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 점성 증가제는 히알루론산 또는 덱스트란이며, 상기 윤활제는 글리세롤 및 상기 구조물질은 피브리노겐 또는 메타크릴화 젤라틴일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물은 0.05 ~ 60×106/mL의 세포를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 광학개시제(photoinitiator)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 (a) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계; (b) 목적하는 삼차원 구조체를 삼차원 프린팅하는 단계; 및 (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 재생용 삼차원 구조체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계; (b) 목적하는 조직 유사 구조체를 삼차원 프린팅하는 단계; (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사 구조체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 방법은 (d) 상기 조직 유사 구조체를 배양액에서 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 조직 유사 구조체 또는 조직 유사기관(organoid)을 제공한다.
본 발명의 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물은 높은 점탄성, 강한 구조 안정성, 우수한 프린팅성, 생체적합성 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내기 때문에 삼차원적 바이오 프린팅을 이용한 조직 유사 구조체의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물(ColMA 바이오잉크) 및 젤라틴을 포함하는 바이오잉크 조성물(Cel4cell)의 가교 전(A) 및 가교 후(B)의 점도를 비교한 데이터이다.
도 2는 주파수 1Hz일 때 기준으로 가교 전 및 가교 후 바이오잉크 조성물의 점도를 비교한 데이터이다. 각 샘플넘버는 다음과 같다: 1) Gel4cell, 2) ColMA 1%, 3) ColMA 2%, 4) ColMA 3%, 5) ColMA 4%, 6) ColMA 5%.
도 3은 ColMA 바이오잉크 및 Cel4cell 바이오잉크의 가교 전(A) 및 가교 후(B)의 모듈러스를 비교한 데이터이다.
도 4는 주파수 1Hz일 때 기준으로 가교 전 및 가교 후 바이오잉크 조성물의 모듈러스를 비교한 데이터이다. 각 샘플넘버는 다음과 같다: 1) Gel4cell, 2) ColMA 1%, 3) ColMA 2%, 4) ColMA 3%, 5) ColMA 4%, 6) ColMA 5%.
도 5는 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물의 가교 전(A) 및 가교 후(B)의 점도를 비교한 데이터이다.
도 6은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물에 대해, 주파수 1Hz일 때 기준으로 가교 전 및 가교 후 바이오잉크 조성물의 점도를 비교한 데이터이다.
도 7은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물의 가교 전(A) 및 가교 후(B)의 모듈러스를 비교한 데이터이다.
도 8은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물에 대해, 주파수 1Hz일 때 기준으로 가교 전 및 가교 후 바이오잉크 조성물의 모듈러스를 비교한 데이터이다.
도 9는 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물에 대해, 주파수 1Hz일 때 기준으로 가교 전 및 가교 후의 탄젠트 델타(tangent delta; tanδ)값(A) 및 가교 후 탄젠트 델타 값의 상승률(B)을 확인한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 일관점에서 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하며, 상기 세포 운반물질은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen)을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 식용으로 사용되는 저분자 콜라겐의 구조 안전성을 높이기 위해 메타크릴레이트(methacrylate) 반응을 진행한 것으로, 고비용의 고분자 콜라겐을 대체하여 세포의 점착이나 성장, 이동, 분화 등의 세포의 기능적인 면에 도움을 줌으로써 조직 재생 이외에도 많은 분야에 응용이 가능하다.
본 발명에서 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐이란 화학적 변형을 통하여 가교할 수 있도록 변형된 형태의 저분자 콜라겐을 의미하는 것으로서, 바람직하게는 500 ~ 4000 Da의 분자량을 가진다.
상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 세포 운반물질 또는 구조물질로 사용될 수 있다. 세포 운반물질은 바이오 프린팅된 구조체 내에서 세포가 생존하기에 적합한 환경을 제공할 수 있는 물질로서, 생체적합성을 나타내어야 함은 물론이며 바이오 프린팅된 이후에 구조체에 안정성을 부여할 수 있는 적절한 물리적 강성 또한 나타내어야 한다.
따라서, 세포 운반물질로서 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 함께 사용할 경우, 세포 운반물질로 젤라틴만을 사용한 종래 바이오 잉크 조성물에 비해 프린팅 후 구조 안정성이 현저히 우수하고, 보다 정밀한 프린팅성을 나타내는 바이오잉크 조성물을 제조할 수 있다. 또한. 인체 유래 콜라겐을 사용함으로써 생체적합성을 보다 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
또한, 상기 세포 운반물질에 젤라틴, 알기네이트, 아가(agar), 아가로스, 플루로닉(pluronic) 및 폴리비닐알콜로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 물질을 추가로 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 점성 증강제는 우수한 프린팅 경향성 및 바이오 잉크의 초기 강성(strength)을 유지하는데 적합한 것을 선택할 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로는 히알루론산 또는 덱스트란일 수 있다.
상기 윤활제는 전단율(shear rate)을 최소화할 수 있고, 분배 속도(dispensing speed)를 개선할 수 있는 물질 중에서 선택되는 것이 바람직하며, 이의 비제한적인 예시로는 글리세롤을 들 수 있다.
상기 구조물질은 빠른 가교결합의 형성 및 기계적 강성을 유지할 수 있는 물질로부터 선택되는 것이 바람직하며, 이의 비제한적인 예시로는 피브리노겐, 화학적으로 가교할 수 있도록 변형된 히알루론산(예, 메타아크릴레이티드 히알루론산, 사이올레이티드 히알루론산, 등), 화학적으로 가교할 수 있도록 변형된 젤라틴 (예, 젤라틴 메타아크릴레이티드, 사이올레이티드 젤라틴, 등), 알기네이트, 메틸 셀룰로오스, 키토산, 키틴, 합성펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜 기초의 하이드로겔로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 피브리노겐은 겔의 안정성 측면에서 구조물질로서 적합할 뿐만 아니라, 세포가 프린팅된 이후에 세포의 부착 및 분화에 적합한 미세환경을 조성한다는 점에서 바람직한 구조물질로 선택될 수 있다. 히알루론산과 글리세롤은 각각 삼차원적 바이오 프린팅 적용시 분배 균일성(dispensing uniformity) 및 노즐의 막힘 방지효과 측면에서 본 발명의 조성물에 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 0.01 ~ 10 w/v%, 0.05 ~ 10 w/v%, 0.5 ~ 10 w/v%, 1 ~ 10 w/v%, 0.1 ~ 8 w/v%, 0.5 ~ 8 w/v%, 1 ~ 8 w/v%, 0.1 ~ 6 w/v%, 0.5 ~ 6 w/v%, 1 ~ 6 w/v%, 0.1 ~ 5 w/v%, 0.5 ~ 5 w/v% 또는 1 ~ 5 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 ~ 4 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 인체 유래 콜라겐은 0.01 ~ 10 w/v%, 0.05 ~ 10 w/v%, 0.1 ~ 10 w/v%, 0.05 ~ 8 w/v%, 0.1 ~ 8 w/v%, 0.05 ~ 6 w/v%, 0.1 ~ 6 w/v%, 0.05 ~ 5 w/v% 또는 0.1 ~ 5 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.1 ~ 4 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 세포 운반물질은 0.01 ~ 10 w/v%, 0.05 ~ 10 w/v%, 0.5 ~ 10 w/v%, 1 ~ 10 w/v%, 1.5 ~ 10 w/v%, 2 ~ 10 w/v%, 0.1 ~ 8 w/v%, 0.5 ~ 8 w/v%, 1 ~ 8 w/v%, 2 ~ 8 w/v%, 0.1 ~ 6 w/v%, 0.5 ~ 6 w/v%, 1 ~ 6 w/v%, 2 ~ 6 w/v%, 0.1 ~ 5 w/v%, 0.5 ~ 5 w/v%, 1 ~ 5 w/v% 또는 2 ~ 5 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 ~ 4 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 점성 증강제는 0.01 ~ 1 w/v%, 0.05 ~ 1 w/v%, 0.1 ~ 1 w/v%, 0.2 ~ 1 w/v%, 0.01 ~ 0.8 w/v%, 0.05 ~ 0.8 w/v%, 0.1 ~ 0.8 w/v%, 0.2 ~ 0.8 w/v%, 0.01 ~ 0.5 w/v%, 0.05 ~ 0.5 w/v% 또는 0.1 ~ 0.5 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.2 ~ 0.4 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 윤활제는 0.1 ~ 30 w/v%, 1 ~ 30 w/v%, 5 ~ 30 w/v%, 10 ~ 30 w/v%, 0.1 ~ 20 w/v%, 1 ~ 20 w/v%, 5 ~ 20 w/v%, 10 ~ 20 w/v%, 0.1 ~ 15 w/v%, 1 ~ 15 w/v%, 5 ~ 15 w/v% 또는 10 ~ 15 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 10 ~ 13 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 구조물질은 0.1 ~ 10 w/v%, 0.5 ~ 10 w/v%, 1 ~ 10 w/v%, 0.1 ~ 8 w/v%, 0.5 ~ 8 w/v%, 1 ~ 8 w/v%, 0.1 ~ 10 w/v%, 0.5 ~ 10 w/v% 또는 3 ~ 10 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 3 ~ 7 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발명자들은 삼차원적 바이오 프린팅에 적용되기에 적합한 물리적 및 생물학적 특성을 나타내는 바이오 잉크 조성물을 개발하기 위해 다양한 조합의 구성을 갖는 조성물의 물리적 및 생물학적 특성을 테스트하여 본 결과, 상기 조합 및 상기 함량의 구성성분의 조합으로 이루어진 바이오 잉크 조성물이 높은 구조 안정성, 우수한 프린팅 성능 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내어 조직 유사 구조체의 제조를 위한 삼차원적 바이오 프린팅에 특히 적합하다는 것을 발견하였다.
상기 바이오잉크 조성물은 (a) 점성증가제와 구조물질을 혼합하여 교반하는 단계; (b) 상기 교반 용액에 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 첨가하여 교반하는 단계; 및 (c) 상기 교반 용액에 윤활제를 첨가하여 교반하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 바이오잉크 조성물의 가교 전 점도(complex viscosity)는 0.5 ~ 2.0 Pa·s이며, 가교 후 점도는 40 ~ 3400 Pa·s일 수 있다. 보다 바람직하게 주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 저장모듈러스는 2.7 ~ 3.1 Pa, 손실모듈러스는 2.5 ~ 2.9 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2230 ~ 2270 Pa, 손실모듈러스는 170 ~ 210 Pa일 수 있다.
상기 바이오잉크 조성물의 가교 전 저장모듈러스(stroage modulus)는 0.4 ~ 3 Pa, 손실모듈러스(loss modulus)는 1 ~ 30 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2100 ~ 2400 Pa, 손실모듈러스는 180 ~ 300 Pa 일 수 있다. 보다 바람직하게 주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 저장모듈러스는 2.7 ~ 3.1 Pa, 손실모듈러스는 2.5 ~ 2.9 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2230 ~ 2270 Pa, 손실모듈러스는 170 ~ 210 Pa일 수 있다.
상기 바이오잉크 조성물의 가교전 탄젠트 델타(tangent delta) 값은 0.5 ~ 1.5, 가교 후 탄젠트 델타 값은 10 ~ 14 일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 세포 운반물질로 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 바이오잉크 조성물로 적합한지 확인하기 위해, 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 1 w/v%, 2 w/v% 3 w/v%, 4 w/v% 및 5 w/v%가 되도록 바이오잉크 조성물(ColMA)을 각각 제조하였으며, 세포 운반물질로 메타크릴화된 저분자 콜라겐 대신 젤라틴을 포함하는 바이오잉크 조성물(Gel4cell)을 비교예로 사용하였다.
본 발명에서 제조된 ColMA 바이오잉크 조성물 및 Gel4cell 바이오잉크 조성물의 물성을 비교한 결과, 가교 전후 ColMA 바이오잉크는 Gel4cell 바이오잉크에 비해 유사한거나 높은 점도(도 1) 및 모듈러스(도 3)를 보이는 것을 확인하였으며, 특히 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%일 때 점도가 가장 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 주파수 1Hz일 때 기준으로 점도 및 모듈러스를 비교한 결과, 가교 전후 모두 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 1 w/v% 포함된 경우, 점도, 저장모듈러스 및 손실 모듈러스 모두 최대값을 보이는 것을 확인하였다.
즉, 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%로 포함된 바이오잉크 조성물(ColMA 1%)의 기계적 물성이 젤리틴이 포함된 바이오잉크 조성물(Gel4cell)에 비해 기계적 물성이 우수한 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 구체적인 구현예에서, 보다 우수한 생체 접합성 및 프린팅 후 기계적 특성을 나타내는 바이오잉크를 제조하기 위해, 세포 운반물질로 인체유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 모두 포함된 바이오잉크 조성물을 제조하였다. 그 결과, 인체유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 모두 포함된 바이오잉크 조성물의 경화 후 점도, 저장모듈러스 및 손실 모듈러스가 모두 증가한 것을 확인하였을 뿐만 아니라(도 5 ~ 도 8), 가교 전의 탄젠트 델타값에 비해 가교 후의 탄젠트 델타값 역시 현저하게 상승하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 인체유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함한 바이오잉크 조성물은 세포 운반물질로 젤라틴만을 사용한 종래 바이오 잉크 조성물(Gel4cell)에 비해 우수한 물성을 가진 구조체의 제작이 가능한 것을 확인하였다.
한편, 본 발명의 상기 바이오 잉크 조성물은 세포 0.05 ~ 60×106/mL을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 세포는 바람직하게는, 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 상기 세포 및 바이오 프린팅된 조직 유사 구조체 내에 포함된 세포는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 및 조직 배양 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures;Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본 발명에 참고 인용된다. 일반적인 포유동물 세포 배양 기술, 세포주, 및 본 발명과 함께 사용될 수 있는 세포 배양 시스템이 또한 문헌[Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G., (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본 발명에 참고 인용된다.
세포는 또한 원하는 세포주를 따라 세포의 분화를 유도하는 세포 분화 물질과 배양될 수도 있다. 예를 들면, 줄기세포는 분화 배지와 접촉하여 인큐베이션 됨으로써 일정 범위의 세포 유형을 생성한다. 다수 유형의 분화 배지가 적당하다. 상기 줄기세포는 비제한적 예로서 골원성(osteogenic) 분화 배지, 연골원성(chondrogenic) 분화 배지, 지방생성(adipogenic) 분화 배지, 신경 분화 배지, 심근세포 분화 배지, 및 장세포 분화 배지(예, 장표피)를 포함하는 분화 배지와 접촉하여 인큐베이션 될 수 있다.
본 발명에서 상기 세포는 삼차원적 바이오프린터로부터 바이오 잉크를 침착 또는 압출시킴으로써 바이오 프린팅될 수 있다. 본 발명의 바이오 잉크는 복수의 세포를 포함하는 액체, 반고체, 또는 고체 조성물의 형태일 수 있다. 바이오 잉크는 액체 또는 반고체 세포 용액, 세포 현탁액, 또는 세포 농축물을 포함한다. 상기 바이오 잉크 조성물은 1) 복수의 세포 또는 세포 응집체와 생체적합성 액체 또는 겔을 소정의 비율에서 혼합하여 바이오잉크를 제조하는 단계, 및 2) 바이오 잉크를 치밀화하여 원하는 세포 밀도 및 점도를 갖는 바이오 잉크를 제조하는 단계 등에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, 바이오 잉크의 치밀화는 원심분리, 접선류 여과("TFF"), 또는 이의 조합에 의해 실현되며 바이오 잉크의 치밀화는 압출가능한 조성물을 제조하여 다세포 응집체 또는 다세포체를 형성한다. 상기 "압출가능한"이란 노즐(nozzle) 또는 오리피스(예, 하나 이상의 구멍 또는 튜브)를 (예를 들어, 압력 하에서) 통과시킴으로써 성형될 수 있는 것을 의미한다. 또한, 바이오 잉크의 치밀화는 적당한 밀도로 세포를 성장시키는 것으로부터 유도된다. 바이오 잉크에 필요한 세포 밀도는 사용할 세포 및 제조할 조직 또는 장기에 따라 달라진다.
본 발명의 상기 바이오 잉크 조성물은 구성성분의 가교결합을 촉진하기 위한 가교제 또는 광학개시제(photoinitiator)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 가교제는 통상적인 하이드로겔 조성물에 사용되는 다가 금속이온을 포함하는 화합물일 수 있다. 다가 금속이온 화합물은 알루미늄 화합물, 칼슘 화합물 및 마그네슘 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 수산화알루미늄, 함수규산알루미늄, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화알루미늄, 메타규산알루미늄산마그네슘, 아세트산알루미늄 및 규산알루미늄산마그네슘으로 구성되는 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다.
상기 광학개시제는 빛에 노출됨에 따라 신속한 가교결합을 유발하는 물질을 의미한다. 본 발명에서 상기 광학개시제의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 자외선(UV)의 조사에 의해 가교반응이 일어나는 광학개시제 또는 가시광선의 조사에 의해 가교반응이 일어나는 광학개시제가 사용이 될 수 있다. 적절한 광학개시제의 비제한적인 예시로는, 아세토페논, 벤조인 메틸 에티르, 디에톡시아세토페논, 벤조일 포스핀 옥사이드 및 1-히드록시사이클로헥실 페닐 케톤, 에오신 등을 들 수 있다. 첨가되는 광학개시제의 양은 노출되는 빛의 파장 및 시간에 따라 달라질 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서,
(a) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계;
(b) 목적하는 삼차원 구조체를 삼차원 프린팅하는 단계; 및
(c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 재생용 삼차원 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계;
(b) 목적하는 조직 유사 구조체를 삼차원 프린팅하는 단계; 및
(c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사 구조체의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 (d) 상기 조직 유사 구조체를 배양액에서 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 조직 유사 구조체의 배양을 통해 조직 유사 기관(organoid)을 제조할 수 있다.
또한, 필요에 따라 상기 조직 유사 구조체는 세포를 포함한 바이오잉크 조성물을 프린팅하여 제조할 수 있으며, 세포를 포함하지 않은 바이오잉크 조성물을 프린팅 하여 구조체를 제조한 후, 구조체에 세포를 추가하여 배양할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 바이오 잉크 조성물은 다양한 조직 재생용 삼차원 구조체, 조직 유사 구조체 또는 조직 유사기관의 제조에 용이하다. 바이오 프린팅 기술은 삼차원 구조체 또는 조직 유사 구조체를 제조하기 위한 유용한 도구로서 당업계에서 발전되고 있다. 한편, 바이오 프린팅에 사용되기 위한 종래의 바이오 잉크 조성물들은 액상 형태이기 때문에 충분한 물리적 강성을 갖기가 힘들거나, 또는 지나치게 물리적 강성이 강하여 프린팅 과정에서 세포의 생존이 충분히 보장되지 않는다는 문제점이 있었다. 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 삼차원적 바이오 프린팅에 적용하여 조직 유사 구조체를 제조함에 있어서 충분한 물리적 강성은 유지하고, 바이오 프린터에 의해 분사됨에 있어서 세포의 생존이 충분히 보장된다는 장점이 있어 조직 유사 구조체의 제조에 굉장히 적합한 물리적 및 생물학적 특성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 종래 젤라틴만을 세포 운반물질로 사용한 바이오 잉크 조성물과 비교하여 정교한 프린팅 성능을 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명에서의 바이오 잉크 조성물은 삼차원적인 구조체의 적층을 가능하게 한다. 충분한 양의 세포가 포함된 본 발명의 바이오 잉크 조성물이 삼차원 바이오 프린터에 의해 적층됨으로써 조직 유사 구조체를 형성하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서의 "바이오 프린팅"이란 자동화된, 컴퓨터 보조의, 삼차원 시제품화 장치(예, 바이오프린터)와 상용되는 방법론을 통해 삼차원의 정확한 세포 침착(예, 세포 용액, 세포 함유 겔, 세포 현탁액, 세포 농축물, 다세포 응집체, 다세포체 등)을 이용하는 것을 의미한다.
본 발명에서의 바이오 프린팅 방법은 연속 및/또는 실질적으로 연속이다. 연속 바이오 프린팅 방법의 비제한적 예는 바이오 잉크의 저장소에 연결되는 분사 팁(dispense tip) (예, 주사기, 모세관 등)을 통해 바이오 프린터로부터 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 연속 바이오 프린팅 방법은 기능 단위의 반복 패턴에서 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 상기 반복 기능 단위는 예를 들어 원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 다각형, 및 불규칙 기하구조를 포함하는 임의의 적당한 기하구조를 갖는다. 또한, 바이오 프린팅된 기능 단위의 반복 패턴은 층을 포함하고 복수의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 바이오 프린팅 될 수 있다.(예를 들면, 적층된다). 구체적으로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 바이오 프린팅 될 수 있다.
바이오 프린팅된 기능 단위는 격자무늬(tessellated) 패턴으로 반복될 수 있다. "격자무늬 패턴"은 중첩되지 않고 갭이 없는 평면을 충전하는 평면 도형이다. 연속 및/또는 격자무늬 바이오프린팅의 이점은 바이오 프린팅된 조직의 증가된 생산성을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적 잠재적 이점은 이전에 침착된 바이오 잉크의 요소와 바이오 프린터를 정렬할 필요를 없앨 수 있다는 것이다. 연속 바이오프린팅은 또한 경우에 따라 시린지 메커니즘을 사용하여 바이오 잉크의 대형 저장소로부터 보다 큰 조직을 인쇄하는 것을 용이하게 할 수 있다.
바이오 프린터로부터 적당한 및/또는 최적의 분사 거리는 재료 편평화 또는 분사 바늘에의 부착화를 생성하지 않는다. 바이오 프린터 분사 팁은 약 1, 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 ㎛ 이상 및 이 범위 내의 증분의 내경을 갖는다. 또한, 바이오 프린터의 바이오 잉크 저장소는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 입방 센티미터 이상 및 이 범위 내의 증분의 용적을 갖는다. 펌프 속도는 시스템에서의 잔류 압력 상승이 낮을 경우 적당하고/하거나 최적일 수 있다. 양호한 펌프 속도는 저장소의 단면적과 분사 바늘 사이의 비율에 의존할 수 있고, 보다 높은 비율은 보다 낮은 펌프 속도를 필요로 한다.
다양한 종류의 조직 재생용 삼차원 구조체 또는 조직 유사 구조체가 상기한 방법에 의해 생성될 수 있다. 바이오 잉크 조성물을 적층하는 패턴이나 적층 배열은 제조하고자 하는 조직 유사 구조체의 크기 및 직경 등에 의해 결정될 수 있다. 또한, 삼차원 구조체 또는 조직 유사 구조체를 제조하기 위해 사용되는 바이오 잉크에 포함되는 세포의 개수는 세포의 종류, 바이오 잉크 조성물에 포함된 세포 영양성분의 함량 등에 따라 조절될 수 있다. 또한, 바이오 잉크 조성물에 포함되는 세포의 종류는 상기 방법에 따라 제조하고자 하는 삼차원 구조체 또는 조직 유사 구조체의 종류에 따라 다양하게 변경이 가능하다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자라면, 삼차원 바이오 프린팅을 통해 제조하고자 하는 삼차원 구조체 또는 조직 유사 구조체의 종류에 따라 적절한 세포를 선택하여 이에 적용할 수 있을 것이다.
바이오 잉크 조성물이 삼차원 바이오 프린터에 의해 분사되어 적층된 이후에는 이를 광(자외선 또는 가시광선)에 노출시키거나 또는 가교 결합용액을 첨가함으로써 바이오 잉크 조성물의 가교결합을 촉진할 수 있다. 이러한 가교결합은 적층된 바이오 잉크 조성물이 보다 단단한 구조물로 완성될 수 있도록 해준다. 한편, 상기 광(자외선 또는 가시광선)은 적층된 바이오 잉크 조성물의 표면에 직접적으로 노출시킬 수 있으며, 예를 들어 광(자외선 또는 가시광선) 발생기로부터 발생된 300 nm 내지 800 nm 의 파장을 이용하여 적층된 바이오 잉크 조성물로부터 1~20 cm 거리에서 1초 내지는 1000초간 노출이 될 수 있고, 또는 20초 내지 500초, 또는 40초 내지 240초간 노출될 수 있다. 이러한 광(자외선 및 가시광선) 노출 거리 및 시간은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 기술자라면, 짧은 거리 및 강한 파장이라면 짧은 시간 동안의 노출로도 충분한 가교결합을 형성할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다.
가교결합을 위한 바람직한 광(자외선 또는 가시광선)의 파장은 300 nm ~ 800 nm일 수 있으며, 바람직하게는 자외선의 경우 350 nm ~ 380 nm, 가시광선의 경우 400nm ~ 600nm, 보다 바람직하게는 자외선의 경우 355 nm ~ 375 nm, 가시광선의 경우 400 nm ~ 500 nm, 가장 바람직하게는 자외선의 경우 360 nm ~ 370 nm, 가시광선의 경우 400nm ~ 480nm일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 따라 제조된 체내 이식 가능한 조직 유사기관 또는 조직 구조체에 관한 것이다.
삼차원 바이오 프린팅 기술은 모양 및 크기 면에서 임상적으로 적용이 가능한 조직 또는 기관 구조물을 제작할 수 있는 가능성을 가지고 있다. 조직-특이적인 세포 종류 및 삼차원적 구조물에 적용된 바이오 잉크의 조합을 통하여, 세포에 내재된 재생산 능력을 이용할 수 있고, 이를 통해 필요한 조직 또는 장기를 생산해 내는 것이 가능할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물을 이용하여 바이오 프린팅된 조직 구조체들은, 포유류 조직 및 기관과 해부학적으로 및 기능학적으로 유사성을 지닌 구조체를 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물을 이용하면 조직 유사기관 또는 체내 이식 가능한 조직의 단일 구조체를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 여러 가지 세포를 동시에 프린팅하여 조직과 조직간의 연계를 재연할 수 있는, 기능성이 현저히 향상된 조직 구조체를 제조할 수도 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오 잉크 조성물의 제조
메타크릴화된 저분자 콜라겐은 약 3500Da 분자량을 가지는 저분자 콜라겐에 메타크릴산무수물(methacrylic anhydride)을 반응시켜 공지된 방법에 따라 제조하였다(R. Ravichandran et al., Journal of Materials Chemistry B, 4(2):318-326, 2016).
바이오잉크 조성물은 상온에서 제조하였으며, 먼저 0.7 mL/mL DMEM(biowest)에 4 mg/mL 히알루론산(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 1시간 동안 혼합하였다. 그 다음, 50 mg/mL 메타크릴화된 젤라틴(GelMA, 자체제작)을 첨가하고 1시간 동안 교반시킨 후, 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 각각 1 w/v%, 2 w/v%, 3 w/v%, 4 w/v% 및 5 w/v%로 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 0.1 mL/mL 글리세롤(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 30분 동안 교반하여 바이오잉크 조성물(이하, ColMA로 혼용 표기함)을 제조하였다.
비교예로 메타크릴화된 저분자 콜라겐 대신 젤라틴을 포함하는 바이오잉크 조성물(Gel4cell)을 상기와 같이 제조하였다.
메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오 잉크 조성물의 물리화학적 특성 확인 - 점도
상기 실시예 1에서 제조한 바이오잉크 조성물의 점도를 확인하기 위해, 광학개시제를 혼합한 다음, 365 nm 파장의 UV로 2분간 가교하였다.
가교 전(Before curing) 및 가교 후(After curing)로 나누어 측정하였으며, 복합 점도(complex viscosity)는 Rheometer(mcr 301, Anton paar)를 활용하여 측정하였다. 점도 측정은 0.1 ~ 10Hz 주파수 범위(Frequency range; logarithm uniformly 11 pts), 온도 25℃, 진폭(Amplitude) 0.1　~1000 % 조건으로 수행하였다.
메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량에 따른 가교 전후 점도 비교
가교전 점도 (Pa·s) 가교후 점도(Pa·s)
Gel4cell 7 ~ 500 10 ~ 1000
ColMA 1% 16 ~ 1000 40 ~ 3000
ColMA 2% 10 ~ 600 20 ~ 1300
ColMA 3% 8 ~ 400 20 ~ 1000
ColMA 4% 8 ~ 400 30 ~ 1800
ColMA 5% 8 ~ 400 30 ~ 1800
주파수 1Hz에서의 가교 전후 점도 비교
가교전 점도 (Pa·s) 가교후 점도(Pa·s)
Gel4cell 62 109
ColMA 1% 136 324
ColMA 2% 96 166
ColMA 3% 70 138
ColMA 4% 64 229
ColMA 5% 70 219
그 결과, 도 1 및 표 1에 나타난 바와 같이 가교 전후 모두 ColMA 바이오잉크는 Gel4cell 바이오잉크에 비해 유사한 점도를 보이거나 높은 점도를 보이는 것을 확인하였으며, 특히 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%일 때 점도가 가장 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 주파수 1Hz일 때 기준으로 점도를 비교한 결과, 도 2 및 표 2에 나타난 바와 같이, 가교 전후 모두 젤라틴 대신 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함한 바이오잉크 조성물의 점도가 우수한 것을 확인하였으며, 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%일 때 점도가 가장 높은 것을 확인하였다.
메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오 잉크 조성물의 물리화학적 특성 확인 - 모듈러스
상기 실시예 1에서 제조한 바이오잉크 조성물의 모듈러스(modulus)를 확인하였다. 가교 전(Before curing) 및 가교 후(After curing)로 나누어 측정하였다.
모듈러스 측정은 상기 실시예 2의 점도 측정과 동일한 조건으로 수행하였다.
메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량에 따른 가교 전후 모듈러스 비교
가교전 모듈러스 (Pa) 가교후 모듈러스(Pa)
stroage modulus loss modulus stroage modulus loss modulus
Gel4cell 350 ~ 400 14 ~ 48 680 ~ 690 47 ~ 48
ColMA 1% 650 ~ 1000 150 ~ 160 1700 ~ 2300 380 ~ 400
ColMA 2% 400 ~ 700 100 ~ 120 800 ~ 1300 220 ~ 270
ColMA 3% 300 ~ 550 80 ~ 100 700 ~ 1100 160 ~ 250
ColMA 4% 250 ~ 500 70 ~ 90 1100 ~ 1700 220 ~ 330
ColMA 5% 300 ~ 550 80 ~ 95 1100 ~ 1600 260 ~ 320
주파수 1Hz에서의 가교 전후 모듈러스 비교
가교전 모듈러스 (Pa) 가교후 모듈러스(Pa)
stroage modulus loss modulus stroage modulus loss modulus
Gel4cell 390 25 680 30
ColMA 1% 830 170 2000 200
ColMA 2% 590 120 1000 150
ColMA 3% 430 95 850 140
ColMA 4% 400 85 1400 200
ColMA 5% 430 90 1360 190
그 결과, 도 3 및 표 3에 나타난 바와 같이, 점도와 마찬가지로 가교 전 및 가교 후 모두 가교 전후 모두 ColMA 바이오잉크는 Gel4cell 바이오잉크에 비해 유사하거나 높은 모듈러스를 보이는 것을 확인하였으며, 특히 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%일 때 모듈러스가 가장 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 주파수 1Hz일 때 기준으로 점도 및 모듈러스를 비교한 결과, 가교 전후 모두 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 1% 포함된 경우, 저장모듈러스 및 손실 모듈러스 모두 최대값을 보이는 것을 확인하였다.
즉, 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%로 포함된 바이오잉크 조성물(ColMA 1%)의 기계적 물성이 젤리틴이 포함된 바이오잉크 조성물(Gel4cell)에 비해 기계적 물성이 우수한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함한 바이오잉크 조성물은 세포 운반물질로 젤라틴만을 사용한 종래 바이오 잉크 조성물(Gel4cell)에 비해 우수한 물성을 가진 구조체의 제작이 가능한 것을 확인하였다.
인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물의 제조
본 발명에서는 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물을 제조하였다.
상기 실시예 1 내지 실시예 4를 참고로 하여 메타크릴화된 저분자 콜라겐의 함량은 1 w/v%가 되도록, 인체 유래 콜라겐(Huma Skin Collagen Type I; Humabiologics, 미국)은 0.1 w/v%가 되도록 바이오잉크 조성물을 제조하였다.
구체적으로, 바이오잉크 조성물은 상온에서 제조하였으며, 먼저 0.7 mL/mL DMEM(biowest)에 4 mg/mL 히알루론산(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 1시간 동안 혼합하였다. 그 다음, 50 mg/mL 메타크릴화된 젤라틴(GelMA, 자체제작)을 첨가하고 1시간 동안 교반시킨 후, 1 w/v% 메타크릴화된 저분자 콜라겐 및 0.1 w/v% 인체 유래 콜라겐을 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 0.1 mL/mL 글리세롤(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 30분 동안 교반하여 바이오잉크 조성물을 제조하였다.
인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물의 물리화학적 특성 확인
5-1 : 점도 확인
상기 실시예 4에서 제조한 바이오잉크 조성물의 점도를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다.
가교 전후 점도 비교
가교전 점도 (Pa·s) 가교후 점도(Pa·s)
Col + ColMA 0.5 ~ 2.0 40 ~ 3400
Col + ColMA
(주파수 1Hz)		 0.6 360
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물의 가교 후 점도는 40 ~ 3400 Pa·s, 주파수 1Hz 일때 기준 360 Pa·s로, 메타크릴화된 저분자 콜라겐만 포함된 경우(상기 표 1 및 표 2 참고)에 비해 높은 점도를 보이는 것을 확인하였다.
5-2 : 모듈러스 확인
상기 실시예 4에서 제조한 바이오잉크 조성물의 모듈러스를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다.
가교 전후 모듈러스 비교
가교전 모듈러스 (Pa) 가교후 모듈러스(Pa)
stroage modulus loss modulus stroage modulus loss modulus
Col + ColMA 0.4 ~ 3 1 ~ 30 2100 ~ 2400 180 ~ 300
Col + ColMA
(주파수 1Hz)		 2.9 2.7 2250 190
그 결과, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물의 가교 후 저장모듈러스는 2100 ~ 2400 Pa, 주파수 1Hz 일때 기준 2250 Pa으로, 메타크릴화된 저분자 콜라겐만 포함된 경우(상기 표 3 및 표 4 참고)에 비해 높은 저장모듈러스를 보이는 것을 확인하였다.
5-3 : 탄젠트 델타(tangent delta; tanδ)측정
상기 실시예 4에서 제조한 바이오잉크 조성물의 탄젠트 델타는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다. 탄젠트 상수는 하기 수학식 1과 같이 계산하였다.
[수학식 1]
탄젠트 상수 = 가교 후 탄젠트 델타 / 가교 전 탄젠트 델타
가교 전후 탄젠트 델타값 비교
가교전 tanδ 가교후 tanδ
tangent delta 1 12
Delta constant 11
탄젠트 델타값은 절대치 보다 가교 전에 대비하여 가교 후의 증가량이 중요하며, 도 9에 나타난 바와 같이, 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물은 가교 전의 탄젠트 델타값에 비해 가교 후의 탄젠트 델타값이 현저하게 상승하는 것을 확인하였다.

Claims (11)

  1. 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하며,
    상기 세포 운반물질은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen)을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐의 분자량은 500 ~ 4000Da인 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
  3. 상기 바이오잉크 조성물에 포함된 인체 유래 콜라겐은 0.1 ~ 10 w/v%이며, 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 0.1 ~ 10 w/v%인 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 가교 전 점도(complex viscosity)는 0.5 ~ 2.0 Pa·s, 가교 후 점도는 40 ~ 3400 Pa·s이며,
    주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 점도는 0.5 ~ 0.7 Pa·s, 가교 후 점도는 340 ~ 380 Pa·s인 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 가교 전 저장모듈러스(stroage modulus)는 0.4 ~ 3 Pa, 손실모듈러스(loss modulus)는 1 ~ 30 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2100 ~ 2400 Pa, 손실모듈러스는 180 ~ 300 Pa 이고,
    주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 저장모듈러스는 2.7 ~ 3.1 Pa, 손실모듈러스는 2.5 ~ 2.9 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2230 ~ 2270 Pa, 손실모듈러스는 170 ~ 210 Pa 인 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 가교전 탄젠트 델타(tangent delta) 값은 0.5 ~ 1.5, 가교 후 탄젠트 델타 값은 11.5 ~ 12.5인 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 점성 증가제는 히알루론산 또는 덱스트란이며, 상기 윤활제는 글리세롤이고, 상기 구조물질은 피브리노겐 또는 메타크릴화된 젤라틴인 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물은 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물은 광학개시제(photoinitiator)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  10. (a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계;
    (b) 목적하는 조직 유사 구조체를 삼차원 프린팅하는 단계; 및
    (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사 구조체의 제조방법.
  11. 제10항의 방법에 따라 제조된 조직 유사 구조체.
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