JP2019530461A - 天然の細胞外マトリックス分子から作られた三次元(3d)プリントインク - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、合衆国法典第35巻第119条(e)の下で、2016年10月12日に出願された米国仮出願番号62/406,977、および、2017年7月25日に出願された米国仮出願番号62/536,727の利益を主張し、そのそれぞれの内容全体は、本明細書中に参照により援用される。
本発明は、未変性コラーゲンに基づくバイオインク、それを含むキット、および、バイオインクを用いて三次元構造をプリントする方法に関する。
メタクリレート化コラーゲンバイオインク(LifeInk(登録商標)100)
リジンの40%がメタクリレート化されて、それから凍結乾燥された、テロ−ペプチドを含むI型コラーゲン(Advanced Biomatrixパート番号BRD5201)は、8mg/mlの濃度で20mM酢酸中に可溶化された。それから、溶液を2℃に冷却して、冷たいアルカリ性のリン酸緩衝生理食塩水を用いて中和した。Irgacure(登録商標)2959を添加して20ppm溶液を作製して、溶液を皿の中に注いで、37℃でゲル化した。15分間のゲル化後、UV光によって5分間、溶液を架橋した。ゲルの剛性をBohlinレオメータ(DVO−100)で測定して、6000Paであることが分かった。
純粋なコラーゲンバイオインク(LifeInk(登録商標)200)
テロ−ペプチドを含まないI型コラーゲンを、沈殿によって高濃度で調製した。このコラーゲンは、Advanced Biomatrix(パート番号#5202−1EA)から得ることができる。この溶液を皿の中に注いで、Bohlinレオメータで試験する前に30分間、37℃でゲル化させた。ゲルは初め、1300Paの剛性を有したが、やや低い速度で剪断されると、非常に低い値まで落ちた。剪断力が除去されると、ゲルは、その最初の高い剛性を取り戻した。プロセスは、図7に示されるように、それぞれの試験の間を15分間隔で、多数サイクルにわたって繰り返し可能であることが分かった。
純粋なコラーゲンバイオインクを用いたプリント(LifeInk(登録商標)200)
Advanced Biomatrix(パート番号#5202−1EA)からのLifeInk(登録商標)200を、空気式に基づく押出プリンターを用いてプリントして、鼻の描写を作製した。コラーゲンバイオインクは、1時間の工程にわたって室温でプリントされた。押出機の圧力は、全ての時間において<30psiであり、バイオインクは、約160マイクロメートルの最終的な解像度で30ゲージの針を通して押し出された。最終的なプリント構造は、>30mmの長さおよび10mmの高さであった(図8)。構造は、6ヶ月を超える期間、細胞培養培地中でその形状を維持した。
純粋なコラーゲンおよびゼラチンメタクリレートの混合物のプリント
Advanced BiomatrixからのLifeInk(登録商標)200(パート番号#5202−1EA)を、10分間、室温に置いた。Irgacure(登録商標)2959を35℃に温められた溶液中でメタクリレート化ゼラチンに添加した。5mLのメタクリレート化ゼラチンをシリンジ中にピペッティングして、<30℃まで冷却させた。メタクリレート化ゼラチンシリンジをLifeInk(登録商標)200コラーゲンバイオインクに連結して、それから、前後に>40回混合して、徹底的な混合を確実にした。これは、メタクリレート化ゼラチンに対してコラーゲンの1:1混合物を作製した。生じる混合物は、空気式プリンター上にプリントされて、10層の高さの構造を作ることが可能であった(図9)。プリント構造を硬化するためにUV光を用いた。
リボフラビンによるコラーゲンの架橋
Advanced BiomatrixからのFibriCol(登録商標)(パート番号#5133−20ML)を中和して、皿の中に注いで、37℃で30分間インキュベートした。それから、サンプルのゲル剛性をBohlinレオメータで測定した。FibriCol(登録商標)の別のサンプルを、リボフラビンと混合した。材料を皿の中に置いて、37℃でゲル化させた。30分後、このサンプルをUVチャンバー内に置いて、UV光に5分間曝露した。ゲル剛性を、Bohlinレオメータで測定した。表1は、リボフラビン(架橋剤)をコラーゲンバイオインク中に取り込むことによる、ゲル剛性の増大を示す。
純粋なコラーゲンバイオインクに対するヒアルロン酸の添加
1,300,000Daの分子量を有する0.85mLの3%ヒアルロン酸および1.15mLの細胞培養培地を、Advanced BiomatrixからのLifeInk(登録商標)200(パート番号#5202−1EA)5mLに添加した。生じるバイオインクは、天然ECMとさらに似ていて、約12%のグリコサミノグリカン、および88%のI型コラーゲンから構成された。バイオインクの混合物は、それから、30ゲージの針を通して押し出されて、生じるフィラメント強度を、正当なLifeInk(登録商標)200のフィラメント強度と比較した。フィラメントは、強度の忠実性において同程度であり、バイオインク混合物は、同等のプリント可能性を示した。
純粋なコラーゲンバイオインクに対する生体活性ガラスの添加
生体活性ガラスは、針の中にガラスが定着して目詰まりが生じるのを防ぐために、3Dバイオプリント用の粘性材料中に懸濁される必要がある。生体活性ガラスを、LifeInk(登録商標)200に様々な比(10:90、30:70、65:35ガラス/コラーゲン)で添加して、30ゲージの針を通して支持槽中に3Dバイオプリントした(図10)。生じる材料は、模擬体液に曝すことができて、ヒドロキシアパタイトに変化する。この新しい環境は、骨芽細胞が骨を生産するのに理想的である。
pH中性の10mg/mlのI型アテロコラーゲンを用いたバイオプリント
Advanced BiomatrixからのFibriCol(登録商標)(catalog#5133−20ML)は、10mg/mlの濃度のI型アテロコラーゲンである。この材料を中和して、室温で支持培地中にプリントした。アテロコラーゲンは、プリントの前にゲル化せずに室温でのプリントを可能にする。プリントされた時点で、構造を37℃でインキュベートして、コラーゲンの熱的ゲル化を可能にした。コラーゲンのゲル強度は、30分のインキュベーション後、約1000Paであった。
pH中性の3mg/mlのI型テロコラーゲンを用いたバイオプリント
Advanced BiomatrixからのTeloCol(登録商標)(5026−50ML)は、3mg/mlのテロコラーゲンである。この材料を中和して、プリント前のシリンジにおけるコラーゲンのゲル化を防ぐために、冷たい環境(<10℃)においてプリントした。材料を室温の支持槽中にプリントして、プリントの際にコラーゲンがゲル化するのを可能にした。プリント後、37℃で30分間、構造をインキュベーター内に置いて、さらなるゲル化を可能にした(図11)。
Claims (63)
- 未変性コラーゲンを含むバイオインクであって、
前記バイオインクは、室温において、約100〜約150,000Paの静剛性および0.001sec−1よりも大きな剪断速度で約50Pa未満の剪断剛性を有する、
バイオインク。 - 3mg/mlよりも高い濃度の未変性コラーゲンを含むバイオインクであって、
ここでコラーゲンは、前記バイオインク内の唯一の細胞外マトリックスタンパク質である、
バイオインク。 - 1mg/mlよりも高い濃度の未変性中和化コラーゲンおよび架橋剤を含む、
バイオインク。 - 1mg/mlよりも高い濃度の未変性コラーゲンを含むバイオインクであって、
前記バイオインクは、中和した場合に、10℃よりも高い温度でゲル化する、
バイオインク。 - 10mg/mlよりも高い濃度の未変性酸性化コラーゲンを含む、
バイオインク。 - 請求項1から5のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、沈殿コラーゲンである、
バイオインク。 - 1mg/mlよりも高い濃度の未変性沈殿コラーゲンを含む、
バイオインク。 - 請求項1から7のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンの濃度は、5mg/mlよりも高い、
バイオインク。 - 請求項1から8のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンの濃度は、10mg/mlよりも高い、
バイオインク。 - 請求項1から9のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、I型コラーゲンである、
バイオインク。 - 請求項1から10のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、テロコラーゲンである、
バイオインク。 - 請求項1から10のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、アテロコラーゲンである、
バイオインク。 - 請求項1から10のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、テロコラーゲンおよびアテロコラーゲンの混合物である、
バイオインク。 - 請求項1から13のいずれか一項のバイオインクであって、
1よりも多いタイプのコラーゲンを含む、
バイオインク。 - 請求項1および3から14のいずれか一項のバイオインクであって、
ここでコラーゲンは、前記バイオインク内の唯一の細胞外マトリックスタンパク質である、
バイオインク。 - 請求項1から15のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、前記コラーゲンの架橋を可能にする化学基によって改変される、
バイオインク。 - 請求項16のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、メタクリレート、アクリレート、ジビニルスルホン、またはそれらの任意の組み合わせによって改変される、
バイオインク。 - 請求項16または17のバイオインクであって、
前記化学基は、細胞に非毒性である条件下で架橋を可能にする、
バイオインク。 - 請求項1から15のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、前記コラーゲンの化学的改変を伴わずに架橋され得る、
バイオインク。 - 請求項17のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、リボフラビン、GelMA、PEGDA、アルギン酸、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ゲニピン、アンモニウム誘導体、光開始剤、Irgacure(登録商標)、LAP(リチウムフェニル−2,4,6−トリメチルベンゾイルホスフィナート)、ルテニウム、またはそれらの任意の組み合わせによって架橋され得る、
バイオインク。 - 請求項19のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、光開始剤および光曝露によって架橋され得る、
バイオインク。 - 請求項1から21のいずれか一項のバイオインクであって、
添加剤をさらに含む、
バイオインク。 - 請求項22のバイオインクであって、
前記添加剤は、架橋剤、硬化剤、合成材料、またはそれらの任意の組み合わせである、
バイオインク。 - 請求項22のバイオインクであって、
前記添加剤は、リボフラビン、GelMA、PEGDA、アルギン酸、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ゲニピン、アンモニウム誘導体、光開始剤、Irgacure(登録商標)、LAP(リチウムフェニル−2,4,6−トリメチルベンゾイルホスフィナート)、ルテニウム、またはそれらの任意の組み合わせから選択される架橋剤である、
バイオインク。 - 請求項22のバイオインクであって、
前記添加剤は、カーボンナノチューブ、炭素繊維、バイオガラス、リン酸カルシウムセラミック、ナノセルロース、カーボンナノブラシ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される硬化剤である、
バイオインク。 - 請求項22のバイオインクであって、
前記添加剤は、タンパク質、グリコサミノグリカン、増殖因子、またはそれらの任意の組み合わせである、
バイオインク。 - 請求項22のバイオインクであって、
前記添加剤は、細胞外マトリックス分子、脱細胞化組織、またはそれらの任意の組み合わせである、
バイオインク。 - 請求項27のバイオインクであって、
前記の細胞外マトリックス分子または脱細胞化組織は、心臓、肺、腎臓、肝臓、皮膚、胎盤、腸または膀胱組織由来であり、任意選択で可溶化されていてもよい、
バイオインク。 - 請求項1、3から14、および16から28のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、異なる細胞外マトリックス分子をさらに含む、
バイオインク。 - 請求項29のバイオインクであって、
前記の異なる細胞外マトリックス分子は、ヒアルロン酸である、
バイオインク。 - 請求項1から30のいずれか一項のバイオインクであって、
生理学的塩類をさらに含む、
バイオインク。 - 請求項1から30のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、中性pHである、
バイオインク。 - 請求項1から30のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、酸性または塩基性pHである、
バイオインク。 - 請求項1から33のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、滅菌される、
バイオインク。 - 請求項1から34のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、細胞をさらに含む、
バイオインク。 - 請求項35のバイオインクであって、
前記バイオインクは、1よりも多いタイプの細胞を含む、
バイオインク。 - 請求項2から36のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、約100〜約150,000Paの静剛性および0.001sec−1よりも大きな剪断速度で約50Pa未満の剪断剛性を有する、
バイオインク。 - 請求項1から37のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、250μm未満の直径を有するノズルまたはオリフィスを通して押し出され得る、
バイオインク。 - 請求項1から38のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、室温において3D構造をプリントするために用いられ得る、
バイオインク。 - 請求項1から39のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、プリントの1分以内に100Paよりも大きな静剛性を達成する、
バイオインク。 - 100〜150,000Paの静剛性、および、0.001sec−1よりも大きな剪断速度で約50Pa未満の剪断剛性を有し、プリントの15分以内にその静剛性の少なくとも20%を取り戻す、
揺変性バイオインク。 - プリントの1分以内に100Paよりも大きな静剛性を達成する、
未変性コラーゲンに基づくバイオインク。 - 請求項1から42のいずれか一項のバイオインクを含む、
キット。 - 請求項43のキットであって、シリンジおよび/またはシリンジ連結体をさらに備える、
キット。 - バイオインクの調製のためのキットであって、
前記キットは、未変性コラーゲンを含む、
キット。 - 請求項45のキットであって、
前記コラーゲンは、沈殿コラーゲンである、
キット。 - 請求項45または46のキットであって、
前記コラーゲンは、架橋を可能にする化学基によって改変される、
キット。 - 請求項45から47のいずれか一項のキットであって、
添加剤、バッファー、溶媒、中和溶液、架橋溶液、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、
キット。 - 未変性コラーゲンを含む3D構造をプリントする方法であって、
前記方法は、3Dプリンターにおいて、請求項1から42のいずれか一項のバイオインクを使用するステップを含む、
方法。 - 請求項49の方法であって、
前記3Dプリンターは、ロボット分注プリンター、インクジェットプリンター、またはレーザーに基づくプリンターである、
方法。 - 請求項49または50の方法であって、
プリントされるときまたはプリントされた後に、前記3D構造を架橋するステップをさらに含む、
方法。 - 請求項49から51のいずれか一項の方法であって、
プリントされるときまたはプリントされた後に、前記3D構造の温度を変更するステップをさらに含む、
方法。 - 請求項49から52のいずれか一項の方法であって、
プリントされるときまたはプリントされた後に、前記3D構造のpHを変更するステップをさらに含む、
方法。 - 請求項49から53のいずれか一項の方法であって、
プリントされるときまたはプリントされた後に、前記3D構造を光に曝露するステップをさらに含む、
方法。 - 請求項49から54のいずれか一項の方法であって、
プリントされるときまたはプリントされた後に、前記3D構造に細胞を添加するステップをさらに含む、
方法。 - 請求項55の方法であって、
前記細胞は、前記3D構造上にプリントされる、
方法。 - 請求項55の方法であって、
前記細胞は、プリントされた後に、前記3D構造と共にインキュベートされる、
方法。 - 請求項49から57のいずれか一項の方法であって、
前記バイオインクは、支持培地中にプリントされる、
方法。 - 請求項58の方法であって、
前記支持培地は、細胞のための栄養分を含む、
方法。 - 請求項58または59の方法であって、
前記支持培地は、前記3D構造に対して一時的な支持を提供する、
方法。 - 請求項60の方法であって、
前記の一時的な支持は、ゼラチンスラリーによって提供される、
方法。 - 請求項60の方法であって、
前記の一時的な支持は、ヒドロゲル粒子のスラリーによって提供される、
方法。 - 請求項60の方法であって、
前記の一時的な支持は、親水性粒子のスラリーによって提供される、
方法。
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