KR20230078572A - 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용하여 3차원 구조체를 제조하는 방법 - Google Patents

아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용하여 3차원 구조체를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용하여 3차원 구조체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 바이오 잉크 조성물은 우수한 세포 생존율, 세포 부착/증식성, 생분해성을 가질 뿐만 아니라, 우수한 인쇄적성을 가지기 때문에 3D 바이오 프린터를 이용한 조직 유사 구조체의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용하여 3차원 구조체를 제조하는 방법 {Atelocollagen-based bioink composition and a method for manufacturing a three-dimensional structure using the same}
아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용하여 3차원 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
3D 바이오 프린팅 기술은 세포 프린팅 혹은 장기 프린팅으로도 불리어지고 있는 기술로써, 다종의 세포, 생체 재료 및 바이오 분자를 이용하여 컴퓨터 디자인된 3차원 구조물의 제작을 가능하게 한다. 이 기술은 인공 조직 혹은 장기 재생을 목적으로 하는 조직 공학 분야에서 크게 각광을 받고 있다. 인체를 구성하는 장기 혹은 조직은 다종의 세포와 세포 외 기질을 구성하는 생체 재료로 구성되어 있다 할 수 있다. 3D 바이오 프린팅 기술을 이용하여 인체를 구성하는 조직과 유사한 세포 구조체의 제작을 통하여 필요로 하는 기능성 조직을 재생하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 최근 들어, 이 기술은 신약의 독성 및 효능 테스트를 위한 인공 생체 모델의 개발로도 큰 주목을 받고 있다. 이 프린팅 공정에서 바이오 잉크는 바이오 프린팅 공정에서 세포의 정밀한 패터닝과 생존률 보장에 가장 중요한 핵심 요소이며, 잉크의 특성은 공정과 직접적으로 연결되어 있다.
바이오 잉크(bio-ink)는 살아있는 세포 혹은 바이오 분자를 포함하며, 바이오 프린팅 기술에 응용하여 필요로 하는 구조물을 제작할 수 있는 소재를 통칭하는 용어이다. 따라서 바이오 잉크는 3차원 가공을 위한 물리적 성질과 세포가 목적된 기능을 수행하게 하기 위한 생물학적 환경을 제공하여 주어야 한다. 바이오 잉크는 우선 우수한 세포 친화성을 가져야 한다. 인공 조직 및 장기 재생의 경우는 프린팅된 세포의 증식 및 분화에 유리한 생물학적 환경이 바이오 잉크로부터 주어져야 한다. 또한, 프린팅 과정에서 발생하는 물리적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있어야 한다. 그 외에도 바이오 잉크는 3차원 패터닝의 반복성, 생산성, 노즐의 막힘이 없어야 하는 등 프린팅 공정상에서 필요로 하는 물리적 성질을 가져야 한다.
그러나, 바이오 프린팅시 살아있는 세포를 운반하는 생체재료, 즉, 바이오 잉크는 그 활용도에 있어서 여전히 많은 한계점을 나타내고 있는 실정이다. 바이오 프린팅에 적용되기 위해 요구되는 바이오 잉크의 특성으로는 우수한 생체적합성이 요구되고, 미세구경의 디스펜싱 노즐(dispensing nozzle)을 원활히 통과하여 원하는 패턴으로 프린팅이 될 수 있는 물리적 성질을 가져야 하며, 프린팅 후 세포-특이적 신호를 제공하면서 기계적인 지지체 역할을 유지할 수 있어야 한다는 것 등이다. 비록, 3D 바이오 프린팅 분야에서 천연 유래 또는 합성 하이드로겔을 이용한 하이드로겔 바이오 잉크가 개발되어 현재 사용되고 있지만(한국공개특허 KR 10-2021-0007889), 이러한 기존 하이드로겔을 바탕으로 한 바이오잉크는 인쇄적성, 기하학적 정밀성 등의 물리적 측면과 생체적합성, 세포생존율, 세포 부착/증식율, 생분해성 등의 생물학적 측면에서 상당한 한계점을 보이고 있는 바, 이러한 물리적 및 생물학적 특성이 향상된 바이오 잉크의 개발이 요구되는 실정이다.
일 양상은 분자량 100 내지 600 kDa의 아텔로콜라겐(atelocollagen)을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
다른 양상은 (a) 상기 바이오 잉크 조성물을 용융하여 용융 혼합물을 형성하는 단계; (b) 상기 용융 혼합물을 3D 바이오 프린터에 충전 후 압출하여 목적하는 3차원 구조체를 프린팅하는 단계; 및 (c) 상기 출력된 3차원 구조체를 경화시키는 단계;를 포함하는 3차원 구조체의 제조방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 방법에 따라 제조된 3차원 구조체를 제공한다.
일 양상은 분자량 100 내지 600 kDa의 아텔로콜라겐(atelocollagen)을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
용어 “바이오 잉크(bioinks)”는 3차원 바이오프린팅에 사용되는 하이드로겔 또는 하이드로겔과 세포의 혼합물을 의미할 수 있으며, 바이오 프린팅 기술에 응용하여 필요로 하는 구조물을 제작할 수 있는 소재를 총칭한다.
용어 "바이오프린팅(bioprinting)"이란 자동화된, 컴퓨터 보조의, 삼차원 시제품화 장치(예, 바이오프린터)와 상용되는 방법론을 통해 삼차원의 정확한 세포 침착(예, 세포 용액, 세포 함유 겔, 세포 현탁액, 세포 농축물, 다세포 응집체, 다세포체 등)을 이용하는 것을 의미한다. 바이오 프린팅 발명은 연속 또는 실질적으로 연속일 수 있다. 연속 바이오 프린팅 방법의 비제한적 예는 바이오 잉크의 저장소에 연결되는 분사 팁(dispense tip) (예, 주사기, 모세관 등)을 통해 바이오 프린터로부터 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 연속 바이오 프린팅 방법은 기능 단위의 반복 패턴에서 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 상기 반복 기능 단위는 예를 들어 원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 다각형, 및 불규칙 기하구조를 포함하는 임의의 적당한 기하구조를 갖는다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이오프린팅은 3D 바이오프린팅일 수 있다.
용어 "3D 바이오 프린팅(three-dimensional bio printing)"은 3D 프린팅을 이용해 인공 생체조직 및 장기를 만들어내는 것으로, 인체 조직에서 추출한 세포를 포함한 바이오 잉크를 3D 프린터에 넣고, 3차원 공간에서 세포 구조물을 만드는 것을 의미할 수 있다.
용어 "콜라겐(collagen)"은 동물에서 발견되며, 피부와 연골 든 체내의 결합조직을 구성하는 섬유 단백질을 의미할 수 있다. 콜라겐은 폴리펩타이드 세 분자가 서로 삼중나선으로 꼬인 밧줄과 같은 형태를 이루고 있는 것일 수 있다. 콜라겐과 관련하여 그의 원천은 예를 들어, 포유류, 어류, 돼지 뼈, 돼지 피부 등으로부터 유래된 다양한 콜라겐을 사용할 수 있으나, 구체적으로 돼지 피부에서 유래된 것일 수 있다. 상기 콜라겐은 제1형 콜라겐, 제4형 콜라겐 등을 포함할 수 있으며, 제1형 콜라겐을 주요하게 포함하는 것일 수 있다.
용어 "아텔로콜라겐(atelocollagen)"은 콜라겐에서 인체에 항원으로 작용할 수 있는 '텔로펩타이드(Telopeptide)' 말단을 제거한 콜라겐을 의미할 수 있다. 텔로펩타이드는 효소로 제거된 것일 수 있으며, 콜라겐의 n-말단 텔로 펩타이드(n-terminal telopeptide)와 c-말단 텔로 펩티드(c-terminal telopeptide)가 제거되어 가교 결합 부위가 적은 특성을 갖는 것일 수 있다. 아텔로콜라겐은 천연 콜라겐보다 유동성이 뛰어난 것일 수 있다. 또한, 아텔로콜라겐은 용해성이 높아 크림 같은 제형의 바이오잉크를 형성하는 데 유리할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 아텔로콜라겐의 분자량은 100 내지 600 kDa일 수 있다. 예를 들어, 상기 아텔로콜라겐의 분자량은 120 내지 600 kDa,150 내지 600 kDa, 180 내지 600 kDa, 200 내지 600 kDa, 100 내지 500 kDa, 120 내지 500 kDa,150 내지 500 kDa, 180 내지 500 kDa, 200 내지 500 kDa, 100 내지 400 kDa, 120 내지 400 kDa,150 내지 400 kDa, 180 내지 400 kDa, 200 내지 400 kDa, 100 내지 380 kDa, 120 내지 380 kDa,150 내지 380 kDa, 180 내지 380 kDa, 200 내지 380 kDa, 100 내지 360 kDa, 120 내지 360 kDa,150 내지 360 kDa, 180 내지 360 kDa, 200 내지 360 kDa, 220 내지 360 kDa, 240 내지 360 kDa, 260 내지 360 kDa, 280 내지 360 kDa, 300 내지 360 kDa, 100 내지 330 kDa, 120 내지 330 kDa,150 내지 330 kDa, 180 내지 330 kDa, 200 내지 330 kDa, 220 내지 330 kDa, 240 내지 330 kDa, 260 내지 330 kDa, 280 내지 330 kDa, 300 내지 330 kDa, 100 내지 300 kDa, 120 내지 300 kDa, 150 내지 300 kDa, 180 내지 300 kDa, 200 내지 300 kDa, 220 내지 300 kDa, 240 내지 300 kDa, 260 내지 300 kDa, 280 내지 300 kDa, 200 내지 280 kDa, 220 내지 280 kDa, 240 내지 280 kDa, 260 내지 280 kDa, 200 내지 260 kDa, 220 내지 260 kDa, 240 내지 260 kDa, 또는 200 내지 240 kDa일 수 있다. 상기 분자량이 상기 범위를 벗어나 너무 클 경우 노즐의 막힘, 프린팅된 구조체의 불균일성, 적층 불균형, 프린팅 해상도/정밀도 저하 등의 문제가 발생할 수 있고, 상기 상기 범위를 벗어나 너무 작을 경우 프린팅된 구조체의 약화, 적층 두께의 불균형, 구조체 성형 이상 등의 문제가 발생할 수 있다.
상기 바이오 잉크 조성물은 상기 아텔로콜라겐을 pH 6.0 내지 7.4 Tris-HCl 용해완충용액 (dissoving buffer)에 첨가하여 다양한 농도로 제조되는 것일 수 있으며, 난용성 물질과 혼합하는 경우에는 pH 6.8 내지 pH 7.4 HEPES 용해완충용액이 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 아텔로콜라겐은 상기 바이오 잉크 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 10.0 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 아텔로콜라겐은 0.1 내지 10.0 중량%, 0.1 내지 9.0 중량%, 0.1 내지 8.0 중량%, 0.1 내지 7.0 중량%, 0.1 내지 6.0 중량%, 0.1 내지 5.0 중량%, 0.1 내지 4.0 중량%, 1.0 내지 10.0 중량%, 1.0 내지 9.0 중량%, 1.0 내지 8.0 중량%, 1.0 내지 7.0 중량%, 1.0 내지 6.0 중량%, 1.0 내지 5.0 중량%, 1.0 내지 4.0 중량%, 2.0 내지 10.0 중량%, 2.0 내지 9.0 중량%, 2.0 내지 8.0 중량%, 2.0 내지 7.0 중량%, 2.0 내지 6.0 중량%, 2.0 내지 5.0 중량%, 2.0 내지 4.0 중량%, 3.0 내지 10.0 중량%, 3.0 내지 9.0 중량%, 3.0 내지 8.0 중량%, 3.0 내지 7.0 중량%, 3.0 내지 6.0 중량%, 3.0 내지 5.0 중량%, 3.0 내지 4.0 중량%, 4.0 내지 10.0 중량%, 4.0 내지 9.0 중량%, 4.0 내지 8.0 중량%, 4.0 내지 7.0 중량%, 4.0 내지 6.0 중량%, 4.0 내지 5.0 중량%, 4.5 내지 10.0 중량%, 4.5 내지 9.0 중량%, 4.5 내지 8.0 중량%, 4.5 내지 7.0 중량%, 4.5 내지 6.0 중량%, 또는 4.5 내지 5.0 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 상기 아텔로콜라겐의 농도가 상기 범위를 벗어나 너무 높을 경우 아텔로콜라겐의 최대 용해도를 초과하기 때문에 용액의 제조가 불가능 할 수 있고, 상기 범위를 벗어나 너무 낮을 경우 상기 바이오 잉크를 이용하여 프린팅한 구조체의 형태 유지가 어려울 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 바이오 잉크 조성물은 점도가 1000 내지 2500 Pa·s 인 것일 수 있다. 구체적으로, 20 내지 40℃, 예를 들어, 약 21~25℃에서 주파수(Frequency) 0.1~1000 Hz 조건일 때 측정된 점도가 1000 내지 2500 Pa·s 인 것일 수 있으며, 예를 들어, 1000 내지 2500 Pa·s, 1000 내지 2400 Pa·s, 1000 내지 2300 Pa·s, 1000 내지 2200 Pa·s, 1000 내지 2100 Pa·s, 1000 내지 2000 Pa·s, 1000 내지 1900 Pa·s, 1000 내지 1800 Pa·s, 1000 내지 1700 Pa·s, 1000 내지 1600 Pa·s, 1000 내지 1500 Pa·s, 1500 내지 2500 Pa·s, 1500 내지 2400 Pa·s, 1500 내지 2300 Pa·s, 1500 내지 2200 Pa·s, 1500 내지 2100 Pa·s, 1500 내지 2000 Pa·s, 1500 내지 1900 Pa·s, 1500 내지 1800 Pa·s, 1500 내지 1700 Pa·s, 1500 내지 1600 Pa·s, 2000 내지 2500 Pa·s, 2000 내지 2400 Pa·s, 2000 내지 2300 Pa·s, 또는 2000 내지 2200 Pa·s일 수 있다. 상기 점도가 상기 범위를 벗어나 너무 높을 경우 인쇄 자체가 어려울 수 있고, 상기 범위를 벗어나 너무 낮을 경우 상기 바이오 잉크를 이용하여 프린팅한 구조체의 형태 유지가 어려울 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 바이오 잉크 조성물은 20 내지 40℃에서 졸(sol) 상태이며, 4 내지 20℃에서 젤(gel) 상태인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 바이오 잉크 조성물은 세포, 생리활성물질, 및 첨가제, 완충용액, 및 용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 세포는 3차원 프린팅된 아텔로콜라겐 기반 구조체 내에서 배양하고자 하는 세포, 조직, 또는 다른 세포로 분화시키고자 하는 세포, 또는 조직 재생에 사용하고자 하는 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포 (epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포 (cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬 세포(pancreatic islet cell), 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 세포는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 배양 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures; Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다. 일반적인 포유동물 세포 배양 기술, 세포주, 및 본 발명과 함께 사용될 수 있는 세포 배양액, 세포 배양 시스템 또한 문헌 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다. 상기 세포 배양액은, 이에 제한되지는 않으나, 목적하는 세포에 적합한 임의의 배지를 포함하는 것으로, 당업계 에 세포주에 적합한 임의의 배지들이 공지되어 있고, 예를 들어, MEM 배지, RPMI1640 배지, DMEM 배지, IMDM 배지 등일 수 있다. 또한, 상기 세포 배양액에는 이에 제한되지는 않으나, 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항생 물질 등이 추가로 포함될 수 있다.
상기 세포는 1 x 105 내지 1 x 107 cells/ml, 3 x 105 내지 1 x 107 cells/ml, 5 x 105 내지 1 x 107 cells/ml, 1 x 106 내지 1 x 107 cells/ml, 2 x 106 내지 1 x 107 cells/ml, 1 x 105 내지 5 x 106 cells/ml, 3 x 105 내지 5 x 106 cells/ml, 5 x 105 내지 5 x 106 cells/ml, 1 x 106 내지 5 x 106 cells/ml, 2 x 106 내지 5 x 106 cells/ml, 1 x 105 내지 3 x 106 cells/ml, 3 x 105 내지 3 x 106 cells/ml, 5 x 105 내지 3 x 106 cells/ml, 1 x 106 내지 3 x 106 cells/ml, 2 x 106 내지 3 x 106 cells/ml로 포함되는 것일 수 있다.
상기 생리활성물질은 세포의 성장과 기능을 조절할 수 있는 물질 또는 세포의 조직으로의 분화, 또는 다른 세포로의 분화를 유도하는 물질을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 생리활성물질은 전환 성장인자(transforming growth factor-beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 골 형태발생 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), Thymosin β-4, 표피 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 태반 성장인자 (placental growth factor, PIGF), 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF), 및 아스코르베이트 2-포스페이트(ascorbate 2-phosphate)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 생리활성물질은 상기 바이오 잉크 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 생리활성물질은 0.0001 내지 50 중량%, 0.0001 내지 40 중량%, 0.0001 내지 30 중량%, 0.0001 내지 20 중량%, 0.0001 내지 10 중량%, 0.0001 내지 5 중량%, 0.1 내지 50 중량%, 0.1 내지 40 중량%, 0.1 내지 30 중량%, 0.1 내지 20 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 5 중량%, 1.0 내지 50 중량%, 1.0 내지 40 중량%, 1.0 내지 30 중량%, 1.0 내지 20 중량%, 1.0 내지 10 중량%, 또는 10 내지 50 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 첨가제는 점성 증가제, 윤활제, 세포 접착을 촉진하는 물질, 산화방지제, 세포사를 억제하는 물질, 및 가교제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 점성 증강제는 상기 바이오 잉크 조성물의 기계적 물성 또는 인쇄적성을 조절하기 위해 첨가될 수 있으며, 예를 들어, 히알루론산 또는 덱스트란일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 윤활제는 바이오 프린팅시 막힘 방지 효과 측면에서 상기 바이오 잉크 조성물에 적합하게 사용될 수 있으며, 예를 들어, 글리세롤일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포 접착을 촉진하는 물질은 예를 들어, 피브린 글루 (Fibrin glue) 등의 혈액 응고제를 응용한 제품 등인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 산화방지제는 예를 들어, 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤, L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 갈릭산트리아밀, 갈릭산프로필 또는 에틸렌디아민4아세트산나트륨 (EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포사 (예를 들어, 괴사, 세포사멸, 또는 자율흡수작용)를 억제하는 물질은 예를 들어, 소분자, 항체, 펩티드, 펩티바디, 항-TNF 물질, 인터류킨의 활성을 억제하는 물질, 인터페론의 활성을 억제하는 물질, GCSF (과립구 콜로니-자극 인자)의 활성을 억제하는 물질, 대식세포 염증성 단백질의 활성을 억제하는 물질, MMP(매트릭스 메탈로프로티나제)의 활성을 억제하는 물질, 카스페이스의 활성을 억제하는 물질, MAPK/JNK 신호전달 캐스케이드의 활성을 억제하는 물질, Src 키나아제의 활성을 억제하는 물질, JAK(야누스 키나아제)의 활성을 억제하는 물질, 또는 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 가교제는 화학적 가교제일 수 있으며, 예를 들어, 폴리카프로락톤(Poly-caprolactone; PCL), 폴리글리콜산(Poly glycolic acid; PGA), 폴리락트산 (poly-lactic acid; PLA), 폴리부틸렌숙시네이트 (Poly-butylene succinate; PBS), 폴리락트산-글리콜산 공중합체 (Poly-lactic-co-glycolic acid; PLGA), 트리칼슘 포스페이트 (tricalcium phosphate; TCP) 등일 수 있다.
일 양상에 따른 바이오 잉크 조성물에 포함되는 아텔로콜라겐은, (a) 돼지 피부를 전처리하는 단계; (b) 상기 전처리된 돼지 피부에 펩신을 처리하여 텔로펩타이드를 제거하는 단계; (c) 텔로펩타이드가 제거된 돼지 피부에 NaCl을 첨가하여 염석 반응을 시키는 단계; (d) 원심분리하여 아텔로콜라겐을 수득하는 단계; (e) 수득된 아텔로콜라겐에 요소를 처리하는 단계; 및 (f) 접선유동여과장치 (tangential flow filtration; TFF)를 이용하여 정제 및 농축하는 단계;를 포함하는 아텔로콜라겐의 제조 방법으로 제조된 것일 수 있다. 상기 방법에 있어서, 아텔로콜라겐에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계는 돼지 피부를 세척한 후 아세트산을 처리하여 물리적인 지방을 제거시키고 균질화하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (b)단계는 돼지 피부 1kg 당 0.5×108 내지 2.0×108 unit의 펩신을 1 내지 10℃ 온도에서 24시간 동안 처리하여 텔로펩타이드를 제거하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (c) 단계는 2.5 내지 5.0M의 NaCl을 첨가하여 1 내지 10℃ 온도에서 염석 반응을 시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (d) 단계는 원심분리하여 상하층의 지방 및 불순물을 제거하여 수득된 중간층에서 아텔로콜라겐을 수득하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (e) 단계는 수득된 아텔로콜라겐에 0.01M 내지 0.03M의 요소(urea)를 처리하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (f) 단계는 접선유동여과장치를 이용하여 이전 단계에서 사용된 펩신, NaCl 등 저분자 물질을 제거하는 것일 수 있으며, 이때 접선유동여과장치는 100 내지 150 kDa의 분자량 차단(MWCO) 여과막을 사용하는 것일 수 있으며, 상기 범위의 분자량 차단 여과막을 사용함으로써 200 내지 360 kDa의 아텔로콜라겐의 소실을 방지하는 것일 수 있다. 또한, 200 내지 360 kDa의 일정한 분자량을 지닌 아텔로콜라겐의 농축을 위해 접선유동여과 장치내 아텔로콜라겐 용액을 주입하는 속도는 50 내지 300 ml/min, 예를 들어 100 내지 250 ml/min일 수 있으며, 이때의 압력은 주입부 압력이 0 내지 3.0 bar, 예를 들어, 0 내지 2.5 bar일 수 있으며, 농축/순환부 압력은 1 내지 4.5 bar, 예를 들어, 2 내지 4.5 bar 내의 범위를 유지하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 아텔로콜라겐 제조방법은 최종 여과, 정제, 농축 과정에서 접선유동여과방식을 포함함으로써 200 내지 360 kDa의 아텔로콜라겐만을 정제, 여과, 농축하여 일정 분자량 범위의 균일한 아텔로콜라겐을 제조하는 것일 수 있다. 비교예로 사용된 시판품인 아텔로콜라겐(MSBIO사, MS Collagen)은 40 내지 600 kDa의 광범위한 분자량을 지닌 아텔로콜라겐이 포함되어 있으며, 이러한 최종 아텔로콜라겐의 분자량 차이는 바이오 잉크 조성물의 인쇄적성, 프린팅 해상도, 프린팅 정밀도, 세포 독성, 세포 부착/증식률, 생분해성, 물성, 점도 등에 영향을 미치는 것일 수 있다.
다른 양상은 (a) 상기 바이오 잉크 조성물을 용융하여 용융 혼합물을 형성하는 단계; (b) 상기 용융 혼합물을 3D 바이오 프린터에 충전 후 압출하여 목적하는 3차원 구조체를 프린팅하는 단계; 및 (c) 상기 출력된 3차원 구조체를 경화시키는 단계;를 포함하는 3차원 구조체의 제조방법을 제공한다. 상기 방법에 있어서, 바이오 잉크 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다.
용어 “3차원 구조체”는 용어 “3차원 스캐폴드”, “인공 조직”, “조직 유사 기관”, “오가노이드 (organoid)”, 또는 “인공 조직 모델”과 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 생체조직을 모사하는 구조체로서 체내에 이식되어 조직 재생을 유도하기 위한 지지체 또는 화장품/의약품 개발 산업에서의 세포독성·부작용 테스트 등을 위한 in vitro 인공 조직 모델을 의미할 수 있다. 상기 3차원 구조체는 격자 무늬 패턴을 갖는 구조체가 1 개 이상 적층된 구조일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 용융 혼합물을 형성하는 단계는 0 내지 42 ℃의 온도, 예를 들어, 0 내지 37 ℃, 0 내지 30 ℃, 0 내지 25 ℃, 0 내지 20 ℃, 0 내지 15 ℃, 0 내지 10 ℃, 4 내지 42 ℃, 4 내지 37 ℃, 4 내지 30 ℃, 4 내지 25 ℃, 4 내지 20 ℃, 4 내지 15 ℃, 4 내지 10 ℃, 10 내지 42 ℃, 10 내지 37 ℃, 10 내지 30 ℃, 10 내지 25 ℃, 10 내지 20 ℃, 또는 10 내지 15 ℃에서 용융하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 3차원 구조체를 프린팅하는 단계는 100 내지 800 ㎛ 직경, 예를 들어, 100 내지 600 ㎛, 100 내지 500 ㎛, 100 내지 400 ㎛, 100 내지 300 ㎛, 200 내지 800 ㎛, 200 내지 600, 200 내지 500 ㎛, 200 내지 400 ㎛, 200 내지 300 ㎛, 300 내지 800 ㎛, 300 내지 600, 300 내지 500 ㎛, 또는 300 내지 400 ㎛ 직경의 노즐을 구비한 3차원 바이오 프린터를 이용하여, 0.01 내지 1.0 MPa의 압력, 예를 들어, 0.03 내지 1.0 MPa, 0.05 내지 1.0 MPa, 0.07 내지 1.0 MPa, 0.1 내지 1.0 MPa, 0.01 내지 0.5 MPa, 0.03 내지 0.5 MPa, 0.05 내지 0.5 MPa, 0.07 내지 0.5 MPa, 0.1 내지 0.5 MPa, 0.01 내지 0.1 MPa, 0.03 내지 0.1 MPa, 0.05 내지 0.1 MPa, 0.07 내지 0.1 MPa, 0.01 내지 0.08 MPa, 0.03 내지 0.08 MPa, 0.05 내지 0.08 MPa, 또는 0.07 내지 0.08 MPa의 압력 하에, 100 ~ 500%의 압출량으로 수행되는 것일 수 있다.
상기 경화시키는 단계는 UV, 가시광 및 레이저로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 광을 조사하여 경화하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 경화 단계는, 365 nm 및 405 nm 파장에서 30 초 내지 48 시간 동안 수행되는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 방법에 따라 제조된 3차원 구조체를 제공한다. 상기 방법으로 제조된 3차원 구조체는 아텔로콜라겐을 기반으로 하여 이식 환자에서 면역거부반응을 일으키지 않아 안전하고, 세포 생존율, 세포 부착/증식성, 생분해성이 우수하여 체내에서 섬유아세포의 유입, 신경의 생성, 혈관 재생성 등 조직 재생을 원할히 유도할 수 있다.
일 양상에 따른 바이오 잉크 조성물은 우수한 세포 생존율, 세포 부착/증식성, 생분해성을 가질 뿐만 아니라, 우수한 인쇄적성을 가지기 때문에 3D 바이오 프린터를 이용한 조직 유사 구조체의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 아텔로콜라겐의 제조방법의 모식도이다.
도 2는 실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐의 특성을 시판품인 비교예 1의 아텔로콜라겐과 비교한 결과로, 도 2a는 Sirius red 법에 따라 아텔로콜라겐의 순도를 측정한 결과, 도 2b는 SDS-Page를 수행하여 아텔로콜라겐의 분자량을 측정한 결과이다.
도 3은 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물의 농도에 따른 인쇄적성을 평가한 결과이다.
도 4는 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물의 농도에 따른 프린팅 해상도를 평가한 결과이다.
도 5는 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.0 중량%)의 프린팅 정밀도를 평가한 결과이다.
도 6은 실시예 1에서 제조된 다양한 농도의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물에 대하여 주파수에 따른 점도 변화를 평가한 결과이다.
도 7은 실시예 1에서 제조된 농도 4.5 중량의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)에 대하여 온도에 따른 점도 변화를 동일 농도의 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물과 비교 평가한 결과이다.
도 8은 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크에 화학적 가교제 (PCL)과의 혼합 후에도 아텔로콜라겐의 (물리·화학적) 성상이 유지될 수 있는지를 FT-IR 방법으로 측정한 결과이다.
도 9는 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)과 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)에 각각 L-929 세포를 첨가하여 프린팅 한 후, 바이오 잉크 내 L-929 세포의 생존율을 평가한 결과로, 도 9a는 Live/Dead 분석 결과, 도 9b는 CCK-8 분석 결과이다.
도 10은 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)과 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)에 각각 L-929 세포를 첨가하여 프린팅 한 후, 프린팅된 구조체 표면에서 L-929 세포의 seeding 효율을 평가한 결과이다.
도 11은 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)과 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)에 각각 L-929 세포를 첨가하여 프린팅 한 후, 프린팅된 구조체 내부에서 L-929 세포의 증식율 평가한 결과이다.
도 12는 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)과 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)에 각각 L-929 세포를 첨가하여 프린팅 한 후, 프린팅된 구조체 내부에서 L-929 세포의 seeding 효율을 평가한 결과이다.
도 13은 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)과 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)에 각각 L-929 세포를 첨가하여 프린팅한 후 프린팅된 구조체 내에서 L-929 세포의 형태를 확인한 결과이다.
도 14는 마우스에 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물을 주입한 후 체중 변화를 관찰한 결과이다.
도 15는 마우스에 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 1, 3, 4 중량%)을 주입한 후 육안 관찰을 수행한 결과이다.
도 16은 마우스에 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 1, 3, 4 중량%)을 주입한 후 MRI 영상을 촬영한 결과이다.
도 17은 실시예 1의 바이오잉크 조성물을 활용한 3차원 인공피부모델의 제작 가능성을 평가하기 위하여, 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 3.0 중량%), 섬유아세포, 및 각질세포를 포함하는 인공피부모델을 제작 후 H&E 조직학적 염색을 수행하여 3일차, 5일차, 7일차에 세포의 분화 및 콜라겐의 수축을 광학현미경으로 평가한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 3차원 구조체의 제조
(1.1) 바이오 잉크 조성물의 제조
먼저, HACCP 인증받은 돈피를 팽윤(swelling)시키고 세척한 후 0.1 내지 1.0M의 아세트산을 overnight 동안 처리하여 물리적인 지방을 제거시키고 멸균된 돈피를 에탄올에 overnight 동안 교반하여 전처리 시킨 뒤, -30℃ 이하의 초저온에서 냉동 보관하였다. 이후 초저온 냉동 보관한 돈피를 재팽윤, 초산 제거 공정을 거쳐 블렌딩(blending) 한 후 균질화(homogenizing) 공정을 통해 가공하였다.
다음으로, 전처리 된 냉동 돈피 1kg 당 0.5×108 내지 2.0×108 unit의 펩신을 1 내지 10℃ 온도에서 24시간 동안 처리하여 면역반응을 일으키는 콜라겐 분자 말단 텔로펩타이드(telopeptide)를 제거한 후 펩신여과를 수행하여 펩신을 불활성화시켰으며, 상기 과정을 수회 반복하여 텔로펩타이드를 최대한 제거하였다.
다음으로, 펩신이 불활성화된 콜라겐을 돈피 1kg 당 2.5 내지 5.0M의 NaCl을 사용하여 1 내지 10℃ 온도에서 overnight 동안 염석을 진행하고, 원심분리를 통하여 염석 여과를 진행하였다.
이후 1 내지 20L의 에탄올을 사용하여 수회 세척하고 1 내지 10℃ 온도에서 overnight 동안 단계별 여과 처리를 진행한 후 원심분리하였다. 원심분리 결과에서 상하층의 지방 및 불순물을 제거하여 수득된 중간층에서 아텔로콜라겐을 추출하였다.
다음으로, 수득된 아텔로콜라겐에 0.01M 내지 0.03M의 요소(urea)를 처리하고 1 내지 10℃ 온도에서 overnight 동안 멸균시킨 후 접선유동여과장치 (tangential flow filtration; TFF)를 이용하여 분리 및 정제하였다. 이때, 일정한 분자량을 지닌 아텔로콜라겐의 농축을 위해 접선유동여과 장치내 아텔로콜라겐 용액을 100 내지 250 ml/min의 속도로 주입하였으며, 주입부 압력은 0 내지 2.5 bar, 농축/순환부 압력은 2 내지 4.5 bar 내 범위를 유지하여 분리 및 정제를 수행하였다. 분리 및 정제된 아텔로콜라겐은 동결건조한 후, 멸균 (EO gas 멸균) 처리하였다.
상기 제조된 아텔로콜라겐의 특성을 확인하기 위하여, SDS-Page 및 Sircol kit을 수행하여 분자량 및 순도를 분석하였으며, 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 그 결과, 아텔로콜라겐(atelocollagen)이 순도 99% 이상으로 함유되었으며, 200 내지 360 kDa 범위의 균일한 분자량을 갖는 아텔로콜라겐이 분리 정제된 것을 확인하였다.
상기 제조한 200 내지 360 kDa의 분자량을 갖는 아텔로콜라겐(atelocollagen)이 순도 99% 이상으로 함유된 동결건조한 파우더 또는 스폰지 형태의 아텔로콜라겐 1~5g을 pH 6.0 내지 7.4 Tris-HCl 용해완충용액 (dissoving buffer) 20~100 ml에 첨가하여 다양한 농도 (1.0 내지 5.0 중량%)의 바이오 잉크 조성물을 제조하였고, 이를 하기 실험에 이용하였다.
(1.2) 3차원 구조체의 제조
상기 (1.1)에서 준비한 바이오 잉크 조성물을 클린룸 내에 설치된 3D 프린터 (3DX-Printer, T&R Biofab, Korea; Baobab Root-1, 바오밥헬스케어, Korea)의 시린지에 충진하여 격자무늬 패턴으로 프린팅하였다. 프린팅 시 300 내지 500 ㎛ 직경을 갖는 노즐을 사용하였으며, 0 내지 20 ℃에서 0.01 내지 1.0 MPa의 압력 조건으로 수행하였다.
비교예 1. 시판품-아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 3차원 구조체의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐(atelocollagen) 대신 시판품인 의료용 아텔로콜라겐 (MSBIO사, MS Collagen)을 이용하여 바이오 잉크 조성물을 제조한 점을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 3차원 구조체를 제조하여, 이를 하기 실험에 이용하였다.
상기 시판품인 아텔로콜라겐의 특성을 확인하기 위하여, SDS-Page 및 Sircol kit을 수행하여 분자량 및 순도를 분석하였으며, 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 그 결과, 아텔로콜라겐(atelocollagen)이 순도 약 85 %로 함유되었으며, 40 내지 600 kDa의 광범위한 분자량을 지닌 아텔로콜라겐이 포함된 것을 확인하였다
실험예 1. 바이오 잉크 조성물의 인쇄 적성(printability) 평가
(1.1) 인쇄 적성 평가
바이오 잉크 조성물은 미세 구경의 디스펜싱 노즐(dispensing nozzle)을 원활히 통과하여 원하는 패턴으로 프린팅 될 수 있어야 하는 바, 상기 실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물을 3D 바이오 프린터에 충전한 후 격자무늬로 프린팅하여 구조체를 제작한 후 바이오 잉크 농도에 따른 인쇄적성을 평가하였다.
구체적으로, 세포를 첨가하지 않은 농도 별 실시예 1의 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 중량%)을 각각 3D 바이오 프린터(3DX-Printer, T&R Biofab, Korea)에 충전한 뒤, 15℃ (오차범위 2℃ 이내) 온도 조건하에서 0.01 내지 1.0 MPa의 압력으로 300㎛ 노즐(nozzle)을 이용하여 격자무늬 패턴(pattern)으로 프린팅 한 후 인쇄 가능성을 평가하였다.
도 3은 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물의 농도에 따른 인쇄적성을 평가한 결과이다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 바이오 잉크 조성물 총 중량에 대하여 실시예 1의 아텔로콜라겐의 함량이 4.0 중량% 이상인 경우 출력이 가능함을 확인하였다.
(1.2) 프린팅 해상도 평가
바이오프린팅을 이용하여 복잡한 내부 및 외부 구조를 갖는 생체 조직을 모사하는 3차원 구조체를 제조하기 위해서는, 바이오 잉크가 고해상도로 출력 가능해야 하는 바, 상기 실시예 1에서 제조된 다양한 농도의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물을 3D 바이오 프린터에 충전한 후 격자무늬로 프린팅하여 구조체를 제작한 후 바이오 잉크 농도에 따른 프린팅 해상도를 평가하였다.
구체적으로, 세포를 첨가하지 않은 농도 별 실시예 1의 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 중량%)을 각각 3D 바이오 프린터 (Baobab Root-1, 바오밥헬스케어, Korea)에 충전한 뒤 18℃ (오차범위 2℃ 이내) 온도 조건하에서 0.01 내지 0.1 MPa의 압력으로 300㎛ 노즐(nozzle)을 이용하여 격자무늬 패턴(pattern)으로 프린팅한 후 프린팅 해상도를 평가하였다.
도 4는 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물의 농도에 따른 프린팅 해상도를 평가한 결과이다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 바이오 잉크 조성물 총 중량에 대하여 실시예 1의 아텔로콜라겐의 함량이 4.0 중량% 이상인 경우 150 μm 이하의 해상도로 출력이 가능함을 확인하였다. 이는 종래의 바이오잉크 조성물 최고 수준인 200 μm (노리다케, Japan)에 비해 프린팅 해상도가 현저히 향상된 것인 바, 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물은 고해상도로 프린팅이 가능하여 복잡한 내부 및 외부 구조를 갖는 3D 생체 구조를 인쇄하기에 보다 적합한 바이오 잉크임을 의미한다.
(1.3) 프린팅 정밀도 평가
바이오프린팅을 이용하여 정교한 생체조직을 모사하는 3차원 구조체를 제조하기 위해서는, 바이오 잉크가 균일하게 출력될 수 있어야 하는 바, 상기 실험예 1.2에서 150 μm 이하의 해상도로 출력이 가능한 것으로 확인된 농도 4.0 중량%의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물을 사용하여 프린팅된 구조체를 대상으로 프린팅 정밀도를 평가하였다.
구체적으로, 세포를 첨가하지 않은 실시예 1의 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.0 중량%)을 3D 바이오 프린터(Baobab Root-1, 바오밥헬스케어, Korea)에 충전한 뒤 18℃ (오차범위 2℃ 이내) 온도 조건하에서 0.01 내지 0.1 MPa의 압력으로 300㎛ 노즐(nozzle)을 이용하여 격자무늬 패턴(pattern)으로 프린팅 한 후 모델과 실제 프린팅된 구조체 간의 strut size, pore size, strut-pore-strut size 편차를 계산하였다.
도 5는 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.0 중량%)의 프린팅 정밀도를 평가한 결과이다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 슬라이싱 모델과 실제 프린팅 된 구조체 간 strut size, pore size, strut-pore-strut size의 오차범위는 각각 5 μm 이하, 5 μm 이하, 12 μm 이하로 매우 낮은 것으로 나타났는 바, 실시예 1의 바이오 잉크 조성물을 이용하여 오차범위 12 μm 이하로 고르게 인쇄가 가능한 것을 확인하였다. 이는 종래의 바이오잉크 조성물 최고 수준인 오차범위 80 μm (로킷, Korea)에 비해 프린팅 정밀도가 현저히 향상된 것인 바, 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물은 균일하게 프린팅이 가능하여 정교한 생체조직을 모사하기 위한 3차원 구조체를 인쇄하기에 보다 적합한 바이오 잉크임을 의미한다.
실험예 2. 바이오 잉크 조성물의 점도 평가
상기 실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물의 유변학적 특성을 확인하기 위하여, Rheological analysis를 이용해 0.1~1000 Hz 주파수 범위에서 바이오잉크의 농도 별 점도 분석을 수행하였다.
구체적으로, 아텔로콜라겐의 농도가 각각 1.0, 3.0, 5.0 중량%인 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물에 대하여, 0.1~1000 Hz 주파수 범위(Frequency range; logarithm uniformly 11 pts), 온도 25 ℃, 진폭(Amplitude) 0.1~1000 % 조건에서 점도 측정을 수행하였다.
도 6은 실시예 1에서 제조된 다양한 농도의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물에 대하여 주파수에 따른 점도 변화를 평가한 결과이다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 아텔로콜라겐 3.0 내지 5.0 중량%에서 주파수에 따른 점도변화가 가장 크므로 안정적인 출력이 가능함을 확인하였다. 이는 본 발명의 아텔로콜라겐 기반의 바이오 잉크가 3.0 중량% 내지 5.0 중량% 농도 조건에서 3D 바이오 프린팅에 적용될 수 있음을 의미한다.
실험예 3. 바이오 잉크 조성물의 가교성 평가
상기 실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물의 겔화 거동을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물의 온도에 따른 점도 분석으로 가교성을 평가하였다.
구체적으로, 아텔로콜라겐의 농도가 4.5 중량%인 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물에 대하여, 주파수 10 Hz, 온도 4-40 ℃, 진폭(Amplitude) 0.1~1000 % 조건에서 점도 측정을 수행하였다. 이 때, 대조군으로는 아텔로콜라겐의 농도가 4.5 중량%인 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크를 사용하였다.
도 7은 실시예 1에서 제조된 농도 4.5 중량%의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물에 대하여 온도에 따른 점도 변화를 동일 농도의 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물과 비교 평가한 결과이다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 바이오 잉크 조성물은 20 내지 40℃에서 졸(sol) 상태이며, 4 내지 20℃에서 젤(gel) 상태인 것 확인하였으며, 저온 (4 내지 8℃)에서 비교예 1보다 점도가 낮고, 10℃ 이상에서는 유사함을 확인하였다. 이는 실시예 1의 바이오 잉크 조성물은 저온 (0 내지 15℃)에서 적용하기 유리하므로 보다 우수한 가교성을 나타낼 수 있는 바이오 잉크임을 의미한다.
실험예 4. 바이오 잉크 조성물의 물성 평가
상기 실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물에 화학적 가교제 (Polycaprolactone; PCL)를 혼합하여도 아텔로콜라겐의 물성이 유지될 수 있는지 확인하기 위하여 FT-IR 분석을 수행하였다.
구체적으로, 아텔로콜라겐 4.5 중량%를 기반으로 가교성 화합물인 PCL, PCL을 혼합한 아텔로콜라겐 바이오 잉크를 대상으로 퓨리에 변환 적외선 (FT-IR) 분광법 (Nicolet 6700, Thermo Scientific, USA)에 의해 진동 분석을 수행하였다. FT-IR 스펙트럼은 2000-600cm-1범위로 측정하였고, C=0 신장 (AmideⅠ), N=H 변형 (AmideⅡ) 및 N 변형 (AmideⅢ)을 나타내는 1651, 1543, 및 1236cm-1의 전형적인 Amide 밴드를 나타내는지 확인하였다.
도 8은 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크에 화학적 가교제 (PCL)과의 혼합 후에도 아텔로콜라겐의 (물리·화학적) 성상이 유지될 수 있는지를 FT-IR 방법으로 측정한 결과이다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 아마이드 I, II 그룹은 아텔로콜라겐으로부터, 아마이드 III 그룹은 PCL (폴리카프로락톤)으로부터 유래된 것으로 나타났는 바, 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크에 화학적 가교제 (PCL)를 혼합한 후에도 아텔로콜라겐의 아마이드 (amide) 기가 유지되는 것을 확인하였다. 이는 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크에 가교성 화학첨가체를 혼합하여도 물성이 유지되는 것임을 의미한다.
실험예 5. 바이오 잉크 조성물의 세포 생존율 평가
바이오잉크 조성물은 압출 과정 동안 세포에 열과 전단응력을 가할 수 있어 세포의 생존율을 저하시킬 수 있다, 따라서, 상기 실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물이 세포를 열과 전단응력으로부터 보호할 수 있는지 확인하기 위하여, L-929 세포를 첨가한 실시예 1의 바이오 잉크 조성물을 사용하여 3D 바이오 프린터로 프린팅한 후 LIVE/DEAD assays와 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Japan)를 수행하여 세포 생존율(cell viability)을 평가하였다.
구체적으로, L-929 세포를 첨가한 실시예 1의 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)을 3D 바이오 프린터에 충전하여 50-80 kPa의 압력으로 300 um 직경의 노즐을 통해 격자무늬 패턴으로 프린팅 한 후, LIVE/DEAD assays와 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Japan)를 수행하여 세포 생존율(cell viability)을 분석하였다. 이 때, 비교군으로는 L-929 세포를 첨가한 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)을 사용하였다. 세포 생존율 분석을 위한 LIVE/DEAD assays는 2μM calcein AM과 4μM EthD-1이 포함된 LIVE/DEAD staining 용액을 사용하여 염색하였다. 스테이닝된 샘플은 공촛점현미경 (FV1200; Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였다. calcein AM은 세포질에서 녹색 형광을 띠며 살아 있는 세포를 확인하는데 사용되고, EthD-1은 핵산과 결합하여 밝은 붉은색 형광을 띠며 죽은 세포를 확인하기 위하여 사용된다. 또한, CCK-8을 사용하여 7일 동안 세포 증식 분석을 수행하였다. CCK-8 용액과 무혈청 DMEM을 1:10 비율로 혼합한 다음 각 샘플에 첨가하였다. 3시간 동안 배양한 후, 혼합 용액을 추출하고, 마이크로 플레이트 판독기 (GloMax; Promaga, USA)를 사용하여 450㎚에서의 광학 밀도 (OD)값을 측정하였다.
도 9는 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)과 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)에 각각 L-929 세포를 첨가하여 프린팅 한 후, 바이오 잉크 내 L-929 세포의 생존율을 평가한 결과로, 도 9a는 Live/Dead 분석 결과, 도 9b는 CCK-8 분석 결과이다.
그 결과, 도 9a 및 도 9b에 나타난 바와 같이, 프린팅 직후 4일 동안 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크의 세포 생존율은 95% 이상에 달하였으며, 7일 동안 85% 이상의 높은 세포 생존율을 유지하여, 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크와 유사하거나 더 우수함을 확인하였다. 이는 실시예 1의 바이오 잉크가 프린팅 프로세스 동안 세포를 열과 전단응력으로부터 보호할 수 있으며, 세포 독성이 없어 세포 활동에 적합한 환경을 제공할 수 있음을 의미한다.
실험예 6. 바이오 잉크 조성물의 세포 부착/증식률 평가
상기 실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물의 세포 부착/증식률을 평가하기 위하여, L-929 세포를 첨가한 실시예 1의 바이오 잉크 조성물을 사용하여 3D 바이오 프린터로 프린팅한 후 프린팅된 구조체 표면 및 내부에서 세포 부착/증식률을 평가하였다.
구체적으로, 비교예 1과 실시예 1의 4.5 중량% 바이오 잉크 조성물에 L-929세포를 1x106 cells/mL 밀도로 첨가하여 겔화한 뒤, 1시간 후에 겔 밖으로 탈락된 세포와 겔 안에 내재된 세포 수를 백분율로 환산하여 부착 효능을 평가하였다. L-929세포는 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Japan)를 이용하여 염색하여 프린팅을 하였고, 공촛점현미경 (FV1200; Olympus, Japan)을 사용하여 이미징 관찰 및 마이크로 플레이트 판독기 (GloMax; Promaga, USA)를 사용하여 450㎚에서의 광학 밀도 (OD)값을 측정하여, 세포 이미지와 형광 분석을 통해 결과를 도출하였다.
도 10은 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)과 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)에 각각 L-929 세포를 첨가하여 프린팅 한 후, 프린팅된 구조체 표면에서 L-929 세포의 seeding 효율을 평가한 결과이다. 도 11은 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)과 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)에 각각 L-929 세포를 첨가하여 프린팅 한 후, 프린팅된 구조체 내부에서 L-929 세포의 증식율 평가한 결과이다. 도 12는 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)과 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)에 각각 L-929 세포를 첨가하여 프린팅 한 후, 프린팅된 구조체 내부에서 L-929 세포의 seeding 효율을 평가한 결과이다,
그 결과, 도 10 내지 도 12에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크가 프린팅된 구조체 표면 또는 내부에서 세포 부착/증식률이 85% 이상인 것으로 나타나, 시판중인 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크와 동등하거나 보다 우수함을 확인하였다. 이는 세포의 분화/증식, 독성 측면에 있어 100 kDa 이하, 최대 500 kDa 이상의 아텔로콜라겐은 세포 독성 물질로 작용이 가능하며, 증식/분화에도 영향을 줄 수 있음을 시사하며, 200 내지 360 kDa의 균일한 분자량을 갖는 본 발명의 아텔로콜라겐 기반 바이오잉크 조성물이 세포 부착 효율성과 세포 독성 측면에서 더 우수함을 의미한다.
실험예 7. 바이오 잉크 조성물 내 세포의 형태학적 평가
1x106 cells/mL 밀도로 L-929 세포를 첨가한 비교예 1과 실시예 1의 4.5 중량% 바이오 잉크 조성물을 사용하여 3D 바이오 프린터로 프린팅한 후 프링틴된 세포의 형태학적 분석을 수행하였다.
구체적으로, 대조군으로는 L-929 세포를 바이오 잉크 조성물과의 혼합 없이 2차원 세포 배양한 것을 사용하였으며, 1~3일간 배양한 후 세포 핵을 DAPI(파랑), 세포 골격을 Phalloidin(초록), 세포 렉틴을 Wheat germ agglutinin(빨강)으로 각각 염색하여 형광 시각화 (CellBrite kit; Fisher Biotec, Australia)한 후, 공촛점현미경 (FV1200; Olympus, Japan)을 사용하여 이미지를 관찰하고 분석하였다.
도 13은 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)과 비교예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 4.5 중량%)에 각각 L-929 세포를 첨가하여 프린팅한 후 프린팅된 구조체 내에서 L-929 세포의 형태를 확인한 결과이다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 1일 차에는 비교예 1 및 실시예 1 모두에서 세포의 형태학적 변화가 없었으며, 3일차에는 비교예 1 대비 실시예 1의 세포가 형태학적 변화 없이 더 증식한 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물은 출력에 의해 세포의 형태학적 변형을 유발하지 않으므로 안전하게 세포 프린팅이 가능함을 의미한다.
실험예 8. 바이오 잉크 조성물의 생분해성 in vivo 평가
바이오프린팅된 구조체는 생체 내에서 일정 기간 경과 후 안전하게 분해될 수 있어야 한다. 따라서, 상기 실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물을 사용하여 프린팅된 구조체가 우수한 생분해성을 나타낼 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 바이오 잉크 조성물을 마우스에 주사한 후 시간 경과에 따른 체중 변화 평가, 육안 평가, MRI 영상 평가를 실시하였다.
구체적으로, 실험동물은 설치류인 랫트 (SD Rat, 오리엔트 바이오, 한국)를 사용하였으며, 실시예 1에서 제조된 다양한 농도의 아텔로콜라겐 바이오 잉크 0.25g 용량을 등부위 척추선 기준으로 양쪽에 피하주사 하였다. 일반증상관찰은 실시예 1의 바이오잉크가 이식된 각 개체들의 외관, 사료섭취, 음수섭취, 투여부위 조직반응 등을 관찰하였고, 체중은 투여 전, 투여 당일 및 매주 1회씩 측정하였다. 육안관찰 및 사진촬영은 실험군의 일정에 따라 안락사한 후 피하 이식부위를 절개하여 육안으로 관찰하고, 카메라로 촬영하여 기록하였다. MRI 영상 촬영은 MR 영상 장비 (BioSpec; Bruker, Germany)를 이용하여 1일~16주의 각 개체들을 촬영하여 영상을 분석하였다.
도 14는 마우스에 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물을 주입한 후 체중 변화를 관찰한 결과이다. 도 15는 마우스에 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 1, 3, 4 중량%)을 주입한 후 육안 관찰을 수행한 결과이다. 도 16은 마우스에 실시예 1의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 1, 3, 4 중량%)을 주입한 후 MRI 영상을 촬영한 결과이다.
그 결과, 도 14 내지 16에 나타난 바와 같이, 이식 기간 동안 10% 이상의 체중 감소 없이 정상적인 체중 증가 양상을 보였으며, 육안 관찰 결과 시험물질 주변 조직에서 홍반 및 부종 등 염증 관련 소견이 나타나지 않았다. 또한, 이식된 시험 물질은 시간 경과에 따라 감소되어, 주입 후 8주 이후에는 완전히 분해되어 시험물질로 판단되는 영상은 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 또한, 1 중량% 아텔로콜라겐 수용액의 생분해성은 7~14일로 확인되었으며, 3 중량%는 3~4주, 4 중량%는 6~8주 내 생분해되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물은 우수한 생분해성을 나타내므로 생체 적합성이 우수함을 의미한다.
실험예 9. 바이오 잉크 조성물을 활용한 각질세포 및 섬유아세포 3차원 배양 평가
상기 실시예 1의 바이오 잉크 조성물을 활용한 3차원 인공피부모델의 제작 가능성을 평가하기 위하여, 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 3.0 중량%), 섬유아세포, 및 각질세포를 포함하는 인공피부모델을 제작 후 세포의 분화 및 콜라겐의 수축을 조직학적 염색을 통하여 분석하였다.
구체적으로, 1x106 cells/mL 밀도로 섬유아세포 (NHDF-Neo - Human Dermal Fibroblasts, Neonatal - Lonza)를 혼재하여 제공된 12mm 직경의 0.4 μm 마이크로포어를 갖는 transwell에 1mL의 실시예 1의 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 3.0 중량%) 또는 비교예 1의 바이오잉크 조성물 (아텔로콜라겐 농도 3.0 중량%)을 도포하여 1시간 동안 37 ℃, 5% CO2 세포배양기에 배양하여 구조체 시편을 제작하였다. 이후 3x106 cells 수의 각질세포 (NHEK-Neo - Human Epidermal Keratinocytes - Neonatal, Lonza)를 상기 구조체 위에 파종하였다. 3일간 배양 후 구조체를 동결박절하여 H&E (Hematoxylin and Eosin) 조직학적 염색 (Abcam사, H&E Staining Kit, ab245880)을 통해 광학현미경으로 분석하였다.
도 17은 실시예 1의 바이오잉크 조성물을 활용한 3차원 인공피부모델의 제작 가능성을 평가하기 위하여, 바이오 잉크 조성물(아텔로콜라겐 농도 3.0 중량%), 섬유아세포, 및 각질세포를 포함하는 인공피부모델을 제작 후 H&E 조직학적 염색을 수행하여 3일차, 5일차, 7일차에 세포의 분화 및 콜라겐의 수축을 광학현미경으로 평가한 결과이다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 비교예 1과 실시예 1 모두 유사한 각질 세포 분화능을 보이나, 실시예 1이 비교예1 보다 세포 분화시 콜라겐층의 소실 및 수축 정도가 월등히 적고 안정적이며, 기저층(basal layer)이 안정적으로 존재하는 것으로 보아, 실시예 1이 3차원 인공피부 모델 제작에 더 적합한 것으로 확인되었다. 또한, 실시예 1은 장기적으로 배양하는데 있어서도 7일 이상 안정적임을 확인하였다.
상기 결과를 종합하면, 실시예 1에서 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오잉크 조성물은 200 내지 360 kDa의 균일한 아텔로콜라겐을 포함함으로써 100 kDa 이하, 500 kDa 이상의 분자량을 포함하는 40 내지 600 kDa의 광범위한 아텔로콜라겐을 포함하는 비교예 1의 시판품에 비해, 세포 독성이나 안전성을 비롯한 프린팅 해상도 및 정밀도 등의 측면에서 높은 장점을 지닐 뿐만 아니라, 3차원 인공피부모델의 제작시에 우수한 세포분화 및 구조적인 안정성을 제공하고, 장기 배양 안정성 또한 우수한 것으로 나타났는 바, 3D 바이오프린팅의 구조체 디자인과 혼합 물질, 목적 등을 고려하여 다양한 농도로 다양한 조직으로 적용이 가능함을 의미한다.

Claims (14)

  1. 분자량 100 내지 600 kDa의 아텔로콜라겐(atelocollagen)을 포함하는 바이오 잉크 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 아텔로콜라겐의 분자량은 200 내지 360 kDa인 것인 바이오 잉크 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 아텔로콜라겐은 상기 바이오 잉크 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 10.0 중량%로 포함되는 것인 바이오 잉크 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 바이오 잉크 조성물은 점도가 1000 내지 2500 Pas 인 것인 바이오 잉크 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 바이오 잉크 조성물은 20 내지 40℃에서 졸(sol) 상태이며, 4 내지 20℃에서 젤(gel) 상태인 것인 바이오 잉크 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 아텔로콜라겐은 돼지 피부에서 유래된 것인 바이오 잉크 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 바이오 잉크 조성물은 세포, 생리활성물질, 첨가제, 완충용액, 및 용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포 (epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포 (cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬 세포(pancreatic islet cell), 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 바이오 잉크 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 생리활성물질은 전환 성장인자(transforming growth factor-beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 골 형태발생 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), Thymosin β-4, 표피 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 태반 성장인자 (placental growth factor, PIGF), 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF), 및 아스코르베이트 2-포스페이트(ascorbate 2-phosphate)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 바이오 잉크 조성물.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 첨가제는 점성 증가제, 윤활제, 세포 접착을 촉진하는 물질, 산화방지제, 세포사를 억제하는 물질, 및 가교제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 바이오 잉크 조성물.
  11. (a) 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 바이오 잉크 조성물을 용융하여 용융 혼합물을 형성하는 단계;
    (b) 상기 용융 혼합물을 3D 바이오 프린터에 충전 후 압출하여 목적하는 3차원 구조체를 프린팅하는 단계; 및
    (c) 상기 출력된 3차원 구조체를 경화시키는 단계;를 포함하는 3차원 구조체의 제조방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 용융 혼합물을 형성하는 단계는 0 내지 42 ℃의 온도에서 용융하는 것인 3차원 구조체의 제조방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 3차원 구조체를 프린팅하는 단계는 100 내지 800 ㎛ 직경의 노즐을 구비한 3차원 바이오 프린터를 이용하여, 0.01 내지 1.0 MPa의 압력 하에, 100 ~ 500%의 압출량으로 수행되는 것인 3차원 구조체의 제조방법.
  14. 청구항 11에 따른 방법에 따라 제조된 3차원 구조체.
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