WO2015126234A1 - Método para la obtención de microesferas de liberación controlada de activos sensibles preparadas por ensamblaje de microesferas porosas y nanopartículas - Google Patents

Método para la obtención de microesferas de liberación controlada de activos sensibles preparadas por ensamblaje de microesferas porosas y nanopartículas Download PDF

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WO2015126234A1
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poly
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David Quintanar Guerrero
Sergio ALCALA ALCALA
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Universidad Nacional Autónoma de México
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Definitions

  • the present invention is related to the techniques used in the Pharmaceutical and Biotechnological Industry, and more particularly, is linked to the formulation of drugs sensitive to physicochemical or mechanical stress (such as peptides and proteins) that cause their degradation, using a technique of immersion in aqueous medium through the adsorption of these drugs in biodegradable polymeric nanoparticles and their subsequent infiltration into biodegradable porous microspheres to obtain an assembled controlled release system.
  • drugs sensitive to physicochemical or mechanical stress such as peptides and proteins
  • Microspheres have been proposed as drug carrying systems since the 1950s, when the pharmaceutical industry of that time used the microencapsulation process in order to reduce effects such as gastric irritation or to control the release of the drug from the systems.
  • the microencapsulation methods that have been used are coacervation, spray drying, fluid bed coating, interfacial or heterogeneous polymerization and solvent extraction / evaporation [Saez et al, 2007, (9)]; There are variants of the latter and the most commonly used is the “double solvent emulsion evaporation" [Sun et al, 2009 (1 1)].
  • the materials used to obtain these technologies are fats such as stearic acid, proteins such as gelatin and zein, polymers that can be natural such as alginate and chitosan or synthetic such as acrylics and polyesters, of the latter some are biodegradable such as polylactic acid -co-glycolic (PLGA).
  • PLGA polylactic acid -co-glycolic
  • the materials to be used must be soluble in a suitable solvent to obtain homogeneous, stable and suitable systems for its administration, but more importantly, they must be non-toxic, biocompatible and non-pharmacological materials.
  • microspheres made of polylactic / polyglycolic acid have a conventional active ingredient release mechanism that occurs by diffusion through the polymer matrix, as well as through the pores of the polymer structure, and when the biodegradation of the polymer occurs continuously It changes the geometry of the microsphere and the texture of the polymer matrix.
  • peptides and proteins have been investigated as therapeutic agents, since the knowledge acquired about the genome has generated lines of research responsible for obtaining and purifying different proteins for the treatment of current diseases.
  • the route of administration, release profile or pattern, stability and efficacy, as well as the manufacturing or formulation process [Saez et al, 2007 (9)].
  • Peptides and proteins have some limitations as drugs; first its instability during administration, its lability at physiological pHs or before the present enzymatic activity and on the other hand, its properties physicochemicals that make them molecules vulnerable to degradation, denaturation or aggregation during the formulation process.
  • Microencapsulation has been the most widely used technique to formulate this type of macrobiomolecules, but it presents several steps that are not favorable for this type of assets, some patents show the use of this method to encapsulate any type of drugs, including peptides and proteins [ Patents WO03 / 062199A2, 2003 (8) and US2009317478A1, 2009 (6)].
  • Porous microspheres have been described to encapsulate proteins using solvent emulsification-evaporation methods, with the aforementioned drawbacks, with the fact that high porosity alone causes the known "burst" effect that implies a rapid release of the drug and with the disadvantage of generating an incomplete release of the protein [Kee Kim et al, 2006 (1)].
  • Silica microparticles with pores of nanometric size and loaded with a peptide (Melanotan I) inside them are also described, which allows a sustained release thereof, since they are for subcutaneous administration [Kilpeláinen M.
  • Adsorption of peptides and proteins has been widely used in the development of biosensors, tissue regeneration, catalysis, immunoassays or in drug delivery systems. It has been established that the role of materials and surface charge, specifically speaking of electrostatic interactions, play an important role in the efficiency with which macrobiomolecules manage to adsorb, due to these characteristics it has been thought to adsorb peptides and proteins on polymeric structures of materials that present some property of attraction or interaction that allows the formulation or use of said molecules [L ⁇ W et al, 2007 (4)].
  • porous microspheres have been proposed for tissue regeneration processes, since they can adsorb cells or proteins necessary for this purpose [Shi et al, 2009 (10)]. These porous microspheres have also been used to adsorb proteins taking into account that the pores create a large surface area where the molecules can get trapped.
  • These systems consider a simple method of immersing the porous support in an aqueous medium in a solution containing dissolved peptide or protein of interest, the limitation in these systems is that they present a rapid release of the drugs so now the limitation is the short half-life that present this type of molecules [Sun et al, 2009 (11)]. However, the latter have not contemplated the use of the large surface area generated by the nanoparticles due to their tiny size, so this property could be used to adsorb a larger amount of drug.
  • microspheres consisting of poly DL-lactic-co-glycolic acid (PLGA) loaded in the nucleus and on the cover with chitosan-DNA nanoparticles, these microspheres were designed for gene therapy combined with chemotherapy [Xu Q et al, 2012 (13)].
  • PLGA poly DL-lactic-co-glycolic acid
  • the microsphere is loaded with a drug that is not sensitive to physicochemical stress.
  • DNA sensitive molecule
  • microspheres which describes compositions of gelatin nanoparticles arranged in the core of PLGA microspheres where the microencapsulation was carried out by a phase separation method and also by another solvent extraction method, resulting in more efficient separation. of phases, with 93.2%, and presented sustained release and avoiding the denaturation of protein-based drugs [Li JK et al, 1997 (3)].
  • the protein (albumin) is involved in preheating, stirring and emulsification processes at high speeds to encapsulate it in gelatin nanoparticles that then come into contact with organic solvents, such as methylene chloride, to be trapped in the microspheres PLGA, whose process of obtaining involves several steps to recover the systems, including agitation processes, washing with heptane and vacuum drying.
  • This process of obtaining systems is more complex, it increases the risks of toxicity, loss of the nanoparticles and the biomolecule; while in the present invention, the protein or peptide is involved in adsorption processes in aqueous medium and dried at room temperature, making the process of obtaining with the same release results effective and fast.
  • the present invention provides a form of administration of active ingredients sensitive or unstable to physicochemical variations such as peptides and proteins, which also resolves on the one hand the amount of peptide or protein that is desired to be loaded into the system, thus using
  • the surface area of the polymeric nanoparticles and the porous structure can be absorbed a greater amount of drug according to the dosage requirements and on the other, adsorbing and infiltrating the nanoparticles within the porous structure provides a system that can be saturated creating diffusion barriers which decrease the speed with which the drug is released, thus obtaining a controlled release system that can be administered enterally or parenterally in a shorter period of administration.
  • the technology proposed in this application is intended to take full advantage of the amount of active substance or drug administered by reducing the dose included in the medicine to the maximum, which leads to the reduction or elimination of the risk of unwanted effects.
  • the technology proposed in this application also aims to improve the dosage schedule by reducing the number of doses per day, even a single dose per day, even longer, can be achieved.
  • an object of the present invention to provide an assembled system infiltrating nanoparticles previously adsorbed with drug to a porous micrometer-sized support that can be administered by different routes. It is also another object of the present invention to provide ideal assembled systems for sensitive drugs that exhibit chemical instability to physicochemical changes by using different amounts of nanoparticles to be adsorbed and infiltrated in porous microspheres. It is a further object of the present invention to provide a The process for obtaining the assembled microspheres of the invention is based on the use of immersion in an aqueous medium, with mild conditions of agitation and recovery by filtration. It is still a further object of the present invention to provide a means of administering drugs sensitive to the conditions in which they are formulated and environmental conditions where they are released mainly in the body for peptides, polypeptides, proteins and DNA.
  • Figure 1 shows a general scheme representing the process of obtaining systems assembled by adsorption / infiltration of nanoparticles in biodegradable porous microspheres.
  • Figure 2 shows a graph showing the release profiles of the systems assembled by adsorption / infiltration, using Leuprolide acetate as a peptide model.
  • Figure 3 shows a graph corresponding to the circular dichroism of Leuprolide acetate released from the assembled adsorption / infiltration systems.
  • Control free Leuprolide (without adsorbing);
  • System 1 porous system without infiltration of nanoparticles;
  • System 2 with 50 mg / mL of nanoparticles; and
  • System 3 with 100 mg / mL of nanoparticles.
  • Figure 4 shows a graph showing the release profiles of systems assembled by adsorption / infiltration, using ⁇ -amylase as a protein model.
  • Figure 5 shows a graph showing the enzymatic activity of the amylase released from the assembled systems by adsorption / infiltration after 12 h of release.
  • Free amylase (without adsorbing);
  • S1 porous system without infiltration of nanoparticles;
  • S2 with 25 mg / mL of nanoparticles;
  • S3 with 50 mg / mL of nanoparticles;
  • S4 with 75 mg / mL of nanoparticles;
  • S5 with 100 mg / mL of nanoparticles.
  • Figure 6 shows a graph showing the circular dichroism of the a-amylase released from the assembled systems by adsorption / infiltration, free amylase (without adsorbing);
  • S1 porous system without infiltration of nanoparticles;
  • S2 with 25 mg / mL of nanoparticles;
  • S3 with 50 mg / mL of nanoparticles;
  • S4 with 75 mg / mL of nanoparticles;
  • S5 with 100 mg / mL of nanoparticles.
  • the present invention provides an assembled system infiltrating nanoparticles previously adsorbed with drug to a porous micrometer-sized support that can be administered by different routes, including parenteral.
  • the present invention contributes to pharmaceutical technology by providing a method that contemplates the use of different amounts of nanoparticles to be adsorbed and infiltrated in porous microspheres to obtain assembled systems ideal for sensitive drugs, such as peptides, polypeptides, DNA and proteins, or compounds. that are not of a protein or DNA nature but that also have a certain chemical instability to physical-chemical changes, making it difficult to apply controlled release technologies in them.
  • the method or process of obtaining the assembled microspheres of the invention is based on the use of immersion in aqueous medium, with mild conditions of agitation and recovery by filtration.
  • the objective of the invention is to provide a means of administering drugs sensitive to the conditions in which they are formulated and to the conditions of the environment where they are released in the body primarily designed for peptides, polypeptides, proteins and DNA. Either alone or in combination, as well as offering a control on the release and therefore a decrease in the frequency of administration, in addition to being a means of biodegradable administration, which uses simple unit operations that can be easily scaled.
  • Formulate sensitive and hydrophilic drugs or active ingredients such as peptides and proteins, including compounds that are not of a prosthetic nature but are also unstable to physical-chemical changes; protect the drug during formulation while maintaining its structural integrity; offer release control that results in a lower frequency of administration; provide the possibility of being administered by different routes, mainly parenteral and finally be a biodegradable system.
  • the present invention provides a method for obtaining systems assembled by the adsorption / infiltration method of polymeric nanoparticles adsorbed with peptides and proteins in biodegradable polymeric porous microspheres.
  • the components of the system, nanoparticles and microspheres are prepared in separate steps that do not involve the sensitive drug in obtaining them.
  • nanoparticles and microspheres are prepared in separate steps that do not involve the sensitive drug in obtaining them.
  • the sensitive drug, peptide or protein is incorporated in the stages of simple adsorption, where the molecule it is added to an aqueous medium of suitable pH to favor adsorption in the nanoparticles; During drug loading, it can be trapped both on the surface of the nanoparticle and on the internal surfaces of the porous microsphere.
  • the assembled system can become saturated, "Hay", of nanoparticles, forming a compact system that delays the release of the drug.
  • the systems are obtained mainly in the following three major steps: 1) Obtaining the polymeric nanoparticles of 250 ⁇ 10 nm.
  • the materials used can be synthetic biodegradable polymers such as poly-polylactic-co-glycolic acid (PLGA), polycaprolactone, polyhydroxybutyrate, among others; natural as chitosan, albumin, carboxycellulose, etc.
  • the nanoparticles are obtained using the well-known solvent emulsification-diffusion method.
  • the polymer is dissolved in an organic solvent such as ethyl acetate to subsequently be emulsified with twice the volume of an aqueous solution, previously saturated with the same organic solvent, of a stabilizing agent such as polyvinyl alcohol (PVAL), poloxamers, among others.
  • a stabilizing agent such as polyvinyl alcohol (PVAL), poloxamers, among others.
  • the materials used can be of the same nature as those described in the previous point.
  • the structures are obtained with the modified double emulsion-evaporation method of solvent, in which a porogen capable of creating a porous structure is added through the production of gas during the production process.
  • the polymer is dissolved in an organic solvent such as methylene chloride and is subsequently emulsified for a period of time with a volume four times less than an aqueous solution of the porogen (such as ammonium bicarbonate, sugars, among others).
  • an aqueous solution of the porogen such as ammonium bicarbonate, sugars, among others.
  • an amount of nanoparticles of 250 ⁇ 10 nm (the amount is defined according to the type of saturation or adsorption efficiency that is desired to be obtained) is resuspended in a glass vial with aqueous medium for approximately 12 hours, in a pH buffer that favors the adsorption of the drug (according to the properties of the molecule such as pKa, isoelectric point or solubility).
  • the drug is added (an amount adequate to obtain the required dose) and it is carried out with gentle horizontal agitation for a certain period of time in order to cause adsorption of the drug on the surface of the nanoparticles.
  • the parameters that can be used to manipulate the degree or percentage of infiltration in a deliberate manner and depending on each particular case are: agitation and contact times of 1 or 2 hours, nanoparticle concentrations with such an amount ranging from 25 to 100% of the weight corresponding to porous microspheres to achieve different degrees of saturation the porous support and amounts of peptide or protein that can be chosen starting from the therapeutic dose and up to a weight equivalent to the degree of saturation of the available surface area.
  • the porous microspheres are placed in a 10 pm stainless steel mesh, which allows the passage of the nanoparticle suspension, favoring the infiltration of nanoparticles into the porous microsphere.
  • the porous microspheres are immersed in the suspension of drug nanoparticles to be again taken to a horizontal agitation system for a certain period of time.
  • the assembled systems are recovered by removing the stainless steel mesh and drying at room temperature. The remaining suspension is centrifuged to quantify the amount of drug that is trapped in the assembled system. With this process, the adsorption properties of the drug and the surface area available for such an event are used, so that both the surface area of the nanoparticles and the pore channels of the microspheres are adsorbed by drug. .
  • the drug is not involved in the manufacture of the nanoparticles or in obtaining the microspheres, therefore, contact with organic solvent, interfaces and shear forces are avoided during drug loading.
  • the nanoparticles have a large surface area due to their tiny size, so having a larger amount of nanoparticles available, the surface area increases.
  • porous microspheres have interconnected pores, which leads to channels inside which also increase the surface area of the microstructure.
  • both surfaces are used, so considering that nanoparticles can easily enter and fill the spaces of the porous structure, they can be taken inside the porous structure through the process of adsorption / infiltration by immersion in aqueous medium, resulting in a carry of the drug to the micrometric size structure.
  • hydrophilic drugs with different properties can be formulated either alone or in combination, for example: peptides, proteins, DNA, enzymes, hormones, genes and any other susceptible drug.
  • Peptides and therapeutic proteins may include, for example: interferons, interleukins, erythropoietin, antibodies and active fragments thereof, peptides with antimicrobial properties, peptides with properties Immunomodulators, apoptosis regulating peptides with application in cancer, or neurodegenerative diseases, among others.
  • the system of the invention can be used as an agent for gene transfer for therapeutic or organism transformation purposes; The system of the invention can be used for ex vivo or in vivo gene therapy protocols.
  • microspheres are administrable enterally or parenterally, including intravenously and intramuscularly, and topically: nasal, ocular, otic, vaginal.
  • the advantages are associated with a lower loss of the pharmacological activity of the drugs during the process of synthesis or assembly of the system since it is a process of obtaining that offers care when there are molecules susceptible to degradation, avoiding high cutting forces, changes pH, use of organic solvents (which could be toxic or cause structural changes in the molecules) or interfaces that generate aggregation. Being able to control the release due to the saturation of the porous systems with infiltrated nanoparticles causes the frequency of administration to be decreased, so there will be acceptance by the patient. Finally, another of its advantages is that there are biodegradable systems, so it is not necessary to remove the system, it will degrade according to the properties of the polymer generating waste that is part of the normal metabolic pathways of living beings.
  • One embodiment of the invention relates to the use of biodegradable polymers for obtaining porous microparticles, for example, polypolylactic-co-glycolic acid (PLGA), polycaprolactone, polyhydroxybutyrate, L-PLA: poly-L- acid may be used.
  • PLGA polypolylactic-co-glycolic acid
  • L-PLA poly-L- acid
  • lactic; DL-PLA poly-DL-lactic acid; PLGA: poly-DL-co-glycolic acid; PGA: polyglycolic acid; PCL: poly-E-aprolactone;
  • PLGCLA poly-DL-lactic-co-glycolic acid-co-E-caprolactone, and natural as chitosan, albumin or carboxycellulose.
  • Microspheres assembled with nanoparticles have been obtained to carry the peptide of Leuprolide acetate (nonapeptide), which is used in the treatment of prostate cancer, and which are made of a biodegradable polymer, poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA ).
  • adsorption efficiencies close to 90% have been achieved, that is to say that 9 out of every 10 mg initials that were in solution during the assembly process are adsorbed on the available surfaces of the systems.
  • polymeric nanoparticles 25, 50, 75 and 100 mg / ml
  • increasing amounts of adsorbed peptide 1.9, 2.6, 5.1 and 9.6 are obtained. mg, respectively; Therefore, with this process therapeutic amounts of the drug were obtained.
  • nanoparticle suspensions are dispersed in phosphate buffer pH 7.2 and in this same medium the peptide is dissolved, so under these conditions there are charged species, that is to say that Leuprolide has a positive charge (due to the basic amino acids Histidine and Arginine ) and the PLGA has a negative charge (due to its pKa, 3.8), which favors electrostatic interactions in the adsorption process.
  • Another important aspect is that by increasing the amount of infiltrated nanoparticles we have reduced the rate of release of the drug, so that when there are no infiltrated nanoparticles, the drug is released in 12 hours and when saturated with infiltrated nanoparticles (25, 50, 75 and 100 mg / ml) equal amounts of microspheres, the same amount of drug is released in longer times (2, 3.5, 4.5, 6 and 7 days, respectively, see figure 2).
  • the adsorption / infiltration of polymeric nanoparticles increases the amount of drug that is loaded into the system and delays the rate of drug release.
  • the release was carried out in phosphate buffer at pH 7.2 and at 37 ° C.
  • this protein has been adsorbed on increasing amounts of nanoparticles, 25, 50, 75 and 100 mg / ml, which have subsequently been infiltrated into biodegradable porous microspheres of PLGA.
  • the aqueous medium in which the adsorption process was carried out is a buffer solution of acetates at pH 4.0; This pH was chosen because under these conditions the ⁇ -amylase protein is positively charged (isoelectric point 4.2) and the PLGA has a negative charge (pKa of 3.8), which again favors the electrical attractions in the adsorption process. These amounts of protein are released in approximately 2, 3, 4 and 6 days (see figure 4). Release studies were carried out in phosphate buffer pH 7.2 and 37 ° C.

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Abstract

La invención describe un sistema polimérico biodegradable para formular fármacos sensibles e hidrófilos tales como péptidos y proteínas. Los sistemas se ensamblaron a través de la adsorción de las nanoparticulas poliméricas biodegradables en microesferas porosas biodegradables mediante un proceso de adsorción/infiltración. El fármaco no está implicado en la fabricación de las nanoparticulas o en la obtención de las microesferas, por lo tanto, el contacto con disolvente orgánico, las interfaces y las fuerzas de corte se evitan durante la carga de fármaco. El fármaco se adsorbe sobre diferentes cantidades de nanoparticulas que son infiltradas en las microesferas porosas. La eficacia de adsorción y la velocidad de liberación dependen de la cantidad de nanoparticulas adsorbidas/infiltradas. El método presentado aquí puede ser usado como una alternativa potencial para formular fármacos sensibles e hidrófilos.

Description

MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN DE MICROESFERAS DE LIBERACIÓN CONTROLADA DE ACTIVOS SENSIBLES PREPARADAS POR ENSAMBLAJE DE MICROESFERAS POROSAS Y NANOPARTÍCULAS CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención está relacionada con las técnicas utilizadas en la Industria Farmacéutica y Biotecnológica, y más particularmente, está vinculada con la formulación de fármacos sensibles al estrés fisicoquímico o mecánico (como los péptidos y las proteínas) que provoquen su degradación, empleando una técnica de inmersión en medio acuoso a través de la adsorción de estos fármacos en nanopartículas poliméricas biodegradables y su posterior infiltración en microesferas porosas biodegradables para obtener un sistema ensamblado de liberación controlada.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las microesferas se han propuesto como sistemas acarreadores de fármacos desde los años 50's, cuando la industria farmacéutica de ese tiempo empleó el proceso de microencapsulación con la finalidad de reducir efectos como la irritación gástrica o de controlar la liberación del fármaco a partir de los sistemas. Los métodos de microencapsulación que se han empleado son el de coacervación, secado por atomización, recubrimiento con lecho fluido, polimerización interfacial o heterogénea y extracción/evaporación de solvente [Saez et al, 2007, (9)]; de este último existen variantes y el más empleado es el conocido como "doble emulsión-evaporación de solvente" [Sun et al, 2009 (1 1 )]. Los materiales empleados para obtener estás tecnologías son grasas como el ácido esteárico, proteínas como la gelatina y zein, polímeros que pueden ser naturales como alginato y quitosán o sintéticos como los acrílicos y poliésteres, de estos últimos algunos son biodegradables como el ácido poli- láctico-co-glicólico (PLGA). Sin embargo, los materiales a emplear deben ser solubles en un solvente adecuado para obtener sistemas homogéneos, estables y adecuados para su administración, pero más importante aún deben ser materiales no tóxicos, biocompatibles y que no presenten actividad farmacológica. Las microesferas hechas de ácido poliáctico/poliglicólico presentan un mecanismo de liberación de principio activo convencional que ocurre por difusión a través de la matriz del polímero, así como a través de los poros de la estructura del polímero, y al ocurrir la biodegradación del polímero continuamente cambia la geometría de la microesfera y la textura de la matriz del polímero.
Durante el desarrollo de la presente invención en la selección de materiales nos dirigimos al uso de polímeros biodegradables y biocompatibles como el PLGA u otros, ya que son materiales que en su proceso de degradación liberan residuos que forman parte de las rutas metabólicas comunes en los seres humanos y que dependiendo de su composición y peso molecular pueden generar diferentes perfiles de liberación [Saez et al, 2007 (9)].
Con el desarrollo de la biotecnología, los péptidos y proteínas se han venido investigando como agentes terapéuticos, pues el conocimiento adquirido acerca del genoma ha generado líneas de investigación encargadas de obtener y purificar diferentes proteínas para el tratamiento de enfermedades actuales. En las últimas tres décadas ha habido un importante interés en el desarrollo de sistemas de liberación de péptidos y proteínas considerando al menos cuatro factores: la ruta de administración, perfil o patrón de liberación, estabilidad y eficacia, así como el proceso de fabricación o formulación [Saez et al, 2007 (9)]. Los péptidos y proteínas presentan algunas limitantes como fármacos; primero su inestabilidad durante la administración, su labilidad a pH's fisiológicos o bien ante la actividad enzimática presente y por otro lado, sus propiedades fisicoquímicas que las hacen moléculas vulnerables a la degradación, desnaturalización o agregación durante el proceso de formulación. La microencapsulacion ha sido la técnica más empleada para formular este tipo de macrobiomoléculas, pero presenta varios pasos que no son favorables para este tipo de activos, algunas patentes muestran el uso de este método para encapsular cualquier tipo de fármacos, incluidos los péptidos y proteínas [Patentes WO03/062199A2, 2003 (8) y US2009317478A1 , 2009 (6)].
Las etapas comunes de la microencapsulacion, empleando polímeros como el PLGA, pueden provocar la degradación de péptidos y proteínas en: a) la etapa de carga de fármaco, donde normalmente se tiene disuelta a la proteína en una fase orgánica que puede inducir a cambios conformacionales y pérdida de sus propiedades farmacológicas. La emulsificación es una operación frecuentemente utilizada en este paso y el problema asociado es que genera interfaces agua/aceite donde la proteína sufre procesos de agregación y precipitación, b) En la etapa de formación de la microesfera se presentan procesos de calentamiento, interfaces y altas fuerzas de corte que intentan eliminar el solvente orgánico, que fue utilizado en la emulsificación, para lograr una compactación del polímero y obtener la estructura micrométrica de tal forma que este estrés físico es crítico para la estabilidad fisicoquímica de las macrobiomoléculas. Algunos inventores incorporan fármacos sensibles ó inestables como péptidos o proteínas en estas dos primeras etapas de la microencapsulacion [Patente MX PA02011560 A, 2004 (5)]. Finalmente, c) en la etapa de secado durante el proceso convencional de microencapsulación, ya sea por liofilización o secado al vacío como se ha descrito por algunos autores [Patente 4,818,542, 1989 (7)], se ha visto que estas operaciones promueven las interacciones hídrofóbicas entre el polímero y las proteínas llevando a una liberación incompleta de las moléculas a partir de los sistemas [Van de Weert et al, 2000 (12)]. Estas limitantes han motivado a la búsqueda de nuevos sistemas que eviten uno o más de los inconvenientes antes descritos. Las microesferas porosas se han descrito para encapsular proteínas empleando métodos de emulsificación-evaporación de solvente, con los inconvenientes antes mencionados, con el hecho de que la alta porosidad por sí sola provoca el conocido efecto "burst" que implica una rápida liberación del fármaco y con la desventaja de generar una liberación incompleta de la proteína [Kee Kim et al, 2006 (1)]. También se describen micropartículas de sílice con poros de tamaño nanométrico y cargadas con un péptido (Melanotan I) dentro de los mismos, lo que permite una liberación sostenida de los mismos, ya que son para administración subcutánea [Kilpeláinen M. et al, 2011 (2)], sin embargo sólo se tiene la estructura porosa sin la ventaja de usar nanopartículas, mientras que el proceso de obtención de estos sistemas es completamente diferente y más riesgoso que el utilizado en la presente invención, pues implica la disolución del péptido en un solvente orgánico con toxicidad conocida (metanol), que podría dejar trazas o bien comprometer la conformación de biomoléculas más grandes, sin dejar de mencionar que estas micropartículas deben ser retiradas del organismo debido a que no son biodegradables.
La adsorción de péptidos y proteínas ha sido ampliamente utilizada en el desarrollo de biosensores, regeneración de tejidos, catálisis, inmunoensayos o en sistemas de liberación de fármacos. Se ha establecido que el rol de los materiales y la carga de superficies, específicamente hablando de las interacciones electrostáticas, juegan un papel importante en la eficiencia con la que las macrobiomoléculas logran adsorberse, debido a estas características se ha pensado en adsorber péptidos y proteínas sobre estructuras poliméricas de materiales que presenten alguna propiedad de atracción o interacción que permita la formulación o uso de dichas moléculas [L¡ W et al, 2007 (4)].
Recientemente, las microesferas porosas se han propuesto para procesos de regeneración de tejidos, ya que éstas pueden adsorber células o proteínas necesarias para este fin [Shi et al, 2009 (10)]. También se han empleado estas microesferas porosas para adsorber proteínas tomando en cuenta que los poros crean una gran área superficial donde las moléculas pueden quedar atrapadas. Estos sistemas consideran un sencillo método de inmersión del soporte poroso en un medio acuoso en una solución que contiene disuelto al péptido o proteína de interés, la limitante en estos sistemas es que presentan una rápida liberación de los fármacos por lo que ahora la limitante son los tiempos de vida media cortos que presentan este tipo de moléculas [Sun et al, 2009 (11)]. Sin embargo, estos últimos no han contemplado el uso de la gran área superficial que generan las nanopartículas debido a su diminuto tamaño, por lo que esta propiedad podría ser utilizada para adsorber una mayor cantidad de fármaco.
Otro diseño es el que consiste de microesferas con doble pared constituida de ácido poli D-L-láctico-co-glicólico (PLGA) cargadas en el núcleo y en la cubierta con nanopartículas de quitosán-DNA, estas microesferas fueron diseñadas para terapia génica combinada con quimioterapia [Xu Q et al, 2012 (13)]. Aun cuando el sistema descrito es propuesto como sistema dual, es importante mencionar que la microesfera es cargada con un fármaco que no es sensible al estrés fisicoquímico. En cuando al ADN (molécula sensible), éste es cargado en nanopartículas de quitosán. Para obtener estas nanopartículas los materiales deben ser disueltos (incluida la biomolécula) y sometidos a altas temperaturas (50-55 °C) que podrían comprometer la integridad de la molécula; lo cual es diferente a la presente invención, pues todos los pasos aquí descritos son a temperatura ambiente y en medios acuosos. Otro diseño de microesferas es el que describe composiciones de nanopartículas de gelatina dispuestas en el núcleo de microesferas de PLGA donde la microencapsulación se llevó a cabo mediante un método de separación de fases y también mediante otro método de extracción del solvente, resultando más eficiente la separación de fases, con un 93.2%, y presentó liberación sostenida y evitando la desnaturalización de fármacos a base de proteínas [Li JK et al, 1997 (3)]. Sin embargo en estos sistemas se involucra a la proteína (albúmina) en procesos de precalentamiento, agitación y emulsificación a altas velocidades para encapsularla en nanopartículas de gelatina que después entran contacto con solventes orgánicos, como el cloruro de metileno, para ser atrapadas en las microesferas de PLGA, cuyo proceso de obtención involucra varios pasos para recuperar los sistemas, entre los que se incluyen procesos de agitación, lavados con heptano y secado al vacío. Este proceso de obtención de sistemas es más complejo, incrementa los riesgos de toxicidad, pérdida de las nanopartículas y de la bíomolécula; mientras que en la presente invención, la proteína o péptido es involucrado en procesos de adsorción en medio acuoso y secado a temperatura ambiente, haciendo eficaz y rápido el proceso de obtención con los mismos resultados de liberación. Ninguno de los documentos del estado de la técnica sugieren o motivan a una persona con pericia y conocimientos medios en la materia a elaborar microesferas porosas con nanopartículas infiltradas que portan péptidos o proteínas activas adsorbidos en la superficie tanto de las nanopartículas infiltradas como en los canales formados por los poros de la microesfera, adicionalmente, no se divulga anteriormente a la presente solicitud la formación de nanopartículas y/o microesferas sin la proteína o bíomolécula activa, la posterior adsorción de la bíomolécula activa en las partículas formadas y la infiltración de las nanopartículas con la biomolécula activa en los soportes porosos.
La presente invención provee de una forma de administración de principios activos sensibles o inestables a las variaciones fisicoquímicas como lo son los péptidos y las proteínas, que además resuelve por un lado la cantidad de péptido o proteína que se desea cargar en el sistema, pues empleando el área superficial de las nanopartículas poliméricas y de la estructura porosa se puede adsorber una mayor cantidad de fármaco según los requerimientos de dosificación y por otro, el adsorber e infiltrar las nanopartículas dentro de la estructura porosa provee un sistema que puede saturarse creando barreras de difusión que disminuyen la velocidad con que el fármaco es liberado, obteniéndose de esta manera un sistema de liberación controlada que puede ser administrado por vía enteral o parenteral en un periodo de administración más corto. La tecnología que se plantea en la presente solicitud pretende aprovechar totalmente la cantidad de principio activo o fármaco administrada mediante reducción al máximo de la dosis incluida ya en el medicamento, que conlleva a la disminución o eliminación del riesgo de efectos no deseados de estos. La tecnología que se plantea en la presente solicitud también pretende mejorar la pauta posológica reduciendo el número de tomas al día, incluso se puede conseguir que sea suficiente una dosis única al día, incluso más largos.
Es importante mencionar que no existen otras patentes que incluyan el uso de nanopartículas poliméricas infiltradas, incluidas o utilizadas en conjunto con microesferas porosas para crear sistemas de liberación de activos sensibles como péptidos y proteínas, pudiendo ser útiles para otros fármacos o compuestos que no son de naturaleza protética pero que también son inestables a los cambios fisicoquímicos implicados en la síntesis de formas para liberación prolongada de los mismos. Por consecuencia de lo anterior, se ha buscado suprimir los inconvenientes que presentan los tratamientos y medicamentos del arte previo, desarrollando un una formulación de fármacos sensibles empleando una técnica de inmersión en medio acuoso a través de la adsorción de estos fármacos en nanopartículas poliméricas biodegradables y su posterior infiltración en microesferas porosas biodegradables para obtener un sistema ensamblado de liberación controlada.
OBJETOS DE LA INVENCIÓN
Tomando en cuenta las implicaciones del estado de la técnica, es un objeto de la presente invención proporcionar un sistema ensamblado infiltrando nanopartículas previamente adsorbidas con fármaco a un soporte poroso de talla micrométrica que puede ser administrado por diferentes vías. Asimismo, es otro objeto de la presente invención proporcionar sistemas ensamblados ideales para fármacos sensibles que presentan inestabilidad química a los cambios fisicoquímicos mediante el uso de diferentes cantidades de nanopartículas para ser adsorbidas e infiltradas en microesferas porosas Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un proceso de obtención de las microesferas ensambladas de la invención se basa en el empleo de inmersión en medio acuoso, con condiciones suaves de agitación y recuperación por filtración. Es aún un objeto más de la la presente invención proporcionar un medio de administración de fármacos sensibles a las condiciones en las que se formulan y a las condiciones del ambiente en donde se liberan en el organismo principalmente diseñados para péptidos, polipéptidos, proteínas y DNA.
Es otro objeto adicional de la presente invención proporcionar un control en la liberación y por tanto una disminución en la frecuencia de administración, además de ser un medio de administración biodegradable, que utiliza operaciones unitarias simples que pueden ser fácilmente escaladas.
Es todavía más un objeto de la presente invención proveer un procedimiento para la obtención de sistemas ensamblados por el método de adsorción/infiltración de nanopartículas poliméricas adsorbidas con péptidos y proteínas en microesferas porosas poliméricas biodegradables
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Los aspectos novedosos que se consideran característicos de la presente invención, se establecerán con particularidad en las reivindicaciones anexas. Sin embargo, algunas modalidades, características y algunos objetos y ventajas de la misma, se comprenderán mejor en la descripción detallada, cuando se lea en relación con los dibujos anexos, en los cuales:
La Figura 1 muestra un esquema general que representa el proceso de obtención de sistemas ensamblados por adsorción/infiltración de nanopartículas en microesferas porosas biodegradables. La Figura 2 muestra una gráfica que presenta los perfiles de liberación de los sistemas ensamblados por adsorción/infiltración, empleando acetato de Leuprolide como modelo peptídico. La Figura 3 muestra una gráfica que corresponde al dicroísmo circular del acetato de Leuprolide liberado desde los sistemas ensamblados por adsorción/infiltración. Control = Leuprolide libre (sin adsorber); Sistema 1 = sistema poroso sin infiltración de nanopartículas; Sistema 2 = con 50 mg/mL de nanopartículas; y Sistema 3 = con 100 mg/mL de nanopartículas.
La Figura 4 muestra una gráfica que presenta los perfiles de liberación de los sistemas ensamblados por adsorción/infiltración, empleando α-amilasa como modelo proteico.
La Figura 5 muestra una gráfica que exhibe la actividad enzimática de la a- amilasa liberada desde los sistemas ensamblados por adsorción/infiltración después de 12 h de liberación. Amilasa libre (sin adsorber); S1 = sistema poroso sin infiltración de nanopartículas; S2 = con 25 mg/mL de nanopartículas; S3 = con 50 mg/mL de nanopartículas; S4 = con 75 mg/mL de nanopartículas; y S5 = con 100 mg/mL de nanopartículas.
La Figura 6 muestra una gráfica que exhibe el dicroísmo circular de la a-amilasa liberada desde los sistemas ensamblados por adsorción/infiltración, amilasa libre (sin adsorber); S1 = sistema poroso sin infiltración de nanopartículas; S2 = con 25 mg/mL de nanopartículas; S3 = con 50 mg/mL de nanopartículas; S4 = con 75 mg/mL de nanopartículas; y S5 = con 100 mg/mL de nanopartículas. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se proporciona un sistema ensamblado infiltrando nanopartículas previamente adsorbidas con fármaco a un soporte poroso de talla micrométrica que puede ser administrado por diferentes vías, incluida la parenteral.
La presente invención contribuye con la tecnología farmacéutica al proveer de un método que contempla el uso de diferentes cantidades de nanopartículas para ser adsorbidas e infiltradas en microesferas porosas para obtener sistemas ensamblados ideales para fármacos sensibles, como péptidos, polipéptidos, DNA y proteínas, o compuestos que no son de naturaleza proteica ni DNA pero que igualmente presentan cierta inestabilidad química a los cambios físicoquímicos por lo que se dificulta aplicar en ellos tecnologías de liberación controlada. El método o proceso de obtención de las microesferas ensambladas de la invención se basa en el empleo de inmersión en medio acuoso, con condiciones suaves de agitación y recuperación por filtración.
El objetivo de la invención es proveer un medio de administración de fármacos sensibles a las condiciones en las que se formulan y a las condiciones del ambiente en donde se liberan en el organismo principalmente diseñados para péptidos, polipéptidos, proteínas y DNA. Ya sea solo o combinado, así como ofrecer un control en la liberación y por tanto una disminución en la frecuencia de administración, además de ser un medio de administración biodegradable, que utiliza operaciones unitarias simples que pueden ser fácilmente escaladas.
Entre los propósitos y usos de los sistemas ensamblados por adsorción/infiltración se encuentran: Formular fármacos o principios activos sensibles e hídrofílicos como péptidos y proteínas, incluyendo compuestos que no son de naturaleza protética pero que también son inestables a los cambios físicoquímicos; proteger al fármaco durante la formulación manteniendo su integridad estructural; ofrecer un control en la liberación que redunde en una menor frecuencia de administración; proveer la posibilidad de administrarse por diferentes vías, principalmente la parenteral y finalmente ser un sistema biodegradable.
Con base en el concepto de "bottom-up" o producción de abajo hacia arriba, empleado en la Nanotecnología, se lleva a cabo un proceso de ensamblaje de nanoestructuras infiltradas en sistemas porosos en inmersión acuosa que contemplen la posibilidad de crear sistemas acarreadores para fármacos sensibles (como péptidos y proteínas), sin que éstos pasen por los procesos de obtención de encapsulación convencionales, los cuales generan un ambiente con interfaces agua/aceite, intensas fuerzas de corte, cambios de pH, altas temperaturas o uso de solventes orgánicos que no favorecen la estabilidad de los fármacos durante la formulación. Este proceso de ensamblaje ha de considerarse libre de disolvente y de estrés físico, promoviendo la protección de estas moléculas, minimizando el proceso de degradación, agregación o desnaturalización.
La presente invención provee de un procedimiento para la obtención de sistemas ensamblados por el método de adsorción/infiltración de nanopartículas poliméricas adsorbidas con péptidos y proteínas en microesferas porosas poliméricas biodegradables. En primera estancia los componentes del sistema, nanopartículas y microesferas, son preparados en pasos separados que no involucran al fármaco sensible en su obtención.
Como se ilustra en la figura 1 , en primera estancia los componentes del sistema, nanopartículas y microesferas, son preparadas en pasos separados que no involucran al fármaco sensible en su obtención. Se puede observar también que el fármaco sensible, péptido o proteína, se incorpora en las etapas de simple adsorción, donde la molécula es agregada a un medio acuoso de pH adecuado para favorecer la adsorción en las nanopartículas; durante la carga del fármaco, éste puede ser atrapado tanto en la superficie de la nanopartícula como en las superficies internas de la microesfera porosa. En la última etapa del proceso ilustrado en la figura 1 se puede observar cómo el sistema ensamblado puede quedar saturado, "Heno", de nanopartículas, formando un sistema compacto que retrasa la liberación del fármaco.
Los sistemas son obtenidos principalmente en los siguientes tres grandes pasos: 1 ) Obtención de las nanopartículas poliméricas de 250 ± 10 nm. Los materiales empleados pueden ser polímeros biodegradables sintéticos como el ácido poli- poliláctico-co-glicólico (PLGA), policaprolactona, polihidroxibutirato, entre otros; naturales como el chitosán, albúmina, carboxicelulosa, etc. Las nanopartículas son obtenidas empleando el ya conocido método de emulsificación-difusión de disolvente. En el cual el polímero es disuelto en un solvente orgánico como el acetato de etilo para posteriormente ser emulsificado con el doble de volumen de una solución acuosa, previamente saturada con el mismo solvente orgánico, de un agente estabilizante como el alcohol polivinílico (PVAL), poloxámeros, entre otros. Después del tiempo de agitación se adiciona un volumen de agua que supera tres veces el volumen de la emulsión, con la finalidad de provocar la difusión del solvente orgánico hacia la fase acuosa hasta lograr que el polímero se agregue y se forme la nanopartícula. La recuperación de las nanopartículas es por centrifugación y posterior liofilización. Es importante indicar que el fármaco no está incluido en esta etapa. 2) Obtención de las microesferas porosas de 60 a 100 μηι. Los materiales empleados pueden ser de la misma naturaleza que los descritos en el punto anterior. Las estructuras se obtienen con el método modificado de doble emulsión-evaporación de disolvente, en el cual se agrega un agente porógeno capaz de crear una estructura porosa a través de la producción de gas durante el proceso de obtención. El polímero es disuelto en un solvente orgánico como el cloruro de metileno y posteriormente es emulsificado durante un periodo de tiempo con un volumen cuatro veces menor de una solución acuosa del agente porógeno (como el bicarbonato de amonio, azúcares, entre otros). Una vez obtenida la primera emulsión, ésta es nuevamente emulsificada con un volumen treinta veces mayor de una solución acuosa de agente estabilizante (como los descritos en el punto anterior), y mantenida en agitación hasta que el solvente orgánico es evaporado. Finalmente las microesferas porosas son recuperadas por filtración y posterior liofilización.
3) Ya obtenidos los componentes biodegradables del sistema se lleva a cabo el proceso de ensamblaje por adsorción/infiltración que se lleva a cabo en 2 pasos independientes:
Primero, una cantidad de nanopartículas de 250 ± 10 nm (la cantidad es definida según el tipo de saturación o eficiencia de adsorción que se desea obtener) es resuspendida en un vial de vidrio con medio acuoso durante aproximadamente 12 horas, en un buffer de pH que favorezca la adsorción del fármaco (según las propiedades de la molécula como pKa, punto isoeléctrico o solubilidad). Una vez transcurrido este tiempo se agrega el fármaco (una cantidad adecuada para obtener la dosis requerida) y se lleva a agitación horizontal suave durante un cierto periodo de tiempo a fin de provocar la adsorción del fármaco sobre la superficie de las nanopartículas. Los parámetros que se pueden usar para manipular el grado o el porcentaje de infiltración de manera deliberada y dependiendo de cada caso en particular son: tiempos de agitación y contacto de 1 o 2 horas, concentraciones de nanopartículas con una cantidad tal que abarque del 25 al 100% del peso correspondiente a las microesferas porosas para de lograr diferentes grados de saturación el soporte poroso y cantidades de péptido o proteína que se pueden elegir partiendo de la dosis terapéutica y hasta un peso equivalente al grado de saturación del área superficial disponible. Por otra parte, las microesferas porosas son colocadas en una malla de acero inoxidable de 10 pm, la cual permite el paso de la suspensión de nanopartículas, favoreciendo la infiltración de nanopartículas a la microesfera porosa. Una vez que ha transcurrido el tiempo de la primera agitación, las microesferas porosas son sumergidas en la suspensión de nanopartículas con fármaco para nuevamente ser llevados a un sistema de agitación horizontal por un cierto periodo de tiempo. Cumplido lo anterior, los sistemas ensamblados son recuperados al retirar la malla de acero inoxidable y secados a temperatura ambiente. La suspensión restante es centrifugada para poder cuantificar la cantidad de fármaco que se encuentra atrapado en el sistema ensamblado. Con este proceso se hace uso de las propiedades de adsorción del fármaco y del área superficial disponible para tal suceso, por lo que tanto el área de la superficie de las nanopartículas como la de los canales de los poros de las microesferas se encuentran adsorbidas por fármaco. El fármaco no está implicado en la fabricación de las nanopartículas o en la obtención de las microesferas, por lo tanto, el contacto con disolvente orgánico, las interfaces y las fuerzas de corte se evitan durante la carga de fármaco.
Las nanopartículas presentan una gran área superficial debido a su diminuto tamaño, por lo que al tener una mayor cantidad de nanopartículas disponibles, el área superficial aumenta. Por otro lado, las microesferas porosas cuentan con poros interconectados, lo cual va generando canales en su interior que aumentan también el área superficial de la microestructura. En los sistemas propuestos se hace uso de ambas superficies, por lo que considerando que las nanopartículas fácilmente pueden entrar y llenar los espacios de la estructura porosa, éstas pueden llevarse al interior de la estructura porosa a través del proceso de adsorción/infiltración por inmersión en medio acuoso, dando como resultado un acarreo del fármaco hacia la estructura de talla micrométrica. De tal forma que se puede controlar la cantidad de fármaco que se desea dosificar y la cantidad de nanopartículas que queremos infiltrar a la estructura porosa; con todo lo anterior es posible controlar la velocidad de liberación del fármaco con base en la saturación de las microesferas porosas con nanopartículas. El fármaco se adsorbe sobre diferentes cantidades de nanopartículas que son infiltradas en las microesferas porosas dependiendo de la concentración de fármaco que se utilice durante la adsorción/infiltración; así mismo la cantidad de nanopartículas adsorbidas/infiltradas es manipulable durante el proceso lo que permite a su vez manipular la velocidad de liberación dependiendo de las necesidades del caso y estando al alcance de un técnico especializado en el área, estas modalidades se incluyen en el espíritu de la invención.
Los usos que pueden darse al sistema de micoresferas ensambladas de la invención son como sistemas biodegradables inyectables tipo "depot", desde donde el fármaco es liberado. Adicionalmente, usando el sistema de la invención se pueden formular fármacos hidrofílicos con diferentes propiedades ya sea solos o combinados, por ejemplo: péptidos, proteínas, ADN, enzimas, hormonas, genes y cualquier otro fármaco susceptible. Entre los péptidos y proteínas terapéuticas se pueden incluir por ejemplo: interferones, interleucinas, eritropoyetina, anticuerpos y fragmentos activos de los mismos, péptidos con propiedades antimicrobianas, péptidos con propiedades ¡nmunomoduladoras, péptidos reguladores de apoptosis con aplicación en cáncer, o en enfermedades neurodegenerativas, entre otros. Adicionalmente usando el sistema de la invención se puede utilizar como agente para la transferencia génica con fines terapéuticos o de transformación de organismos; el sistema de la invención se puede usar para protocolos de terapia génica ex vivo o in vivo.
Otra modalidad de la invención se refiere a que las microesferas ensambladas son administrables por vía enteral o parenteral incluyendo las vías intravenosa e intramuscular, y por vía tópica: nasal, ocular, ótica, vaginal.
Las ventajas están asociadas a una menor pérdida de la actividad farmacológica de los fármacos durante el proceso de síntesis o ensamblaje del sistema ya que es un proceso de obtención que ofrece cuidado cuando se tienen moléculas susceptibles a la degradación, evitando altas fuerzas de corte, cambios de pH, uso de solventes orgánicos (que podrían ser tóxicos o provocar cambios estructurales en las moléculas) o interfaces que generan agregación. El poder controlar la liberación debido a la saturación de los sistemas porosos con nanopartículas infiltradas genera que la frecuencia de administración se vea disminuida, por lo que habrá aceptación por parte del paciente. Finalmente, otra de sus ventajas es que se tienen sistemas biodegradables, por lo que no es necesario retirar el sistema, éste se degradará según las propiedades del polímero generando residuos que forman parte de las rutas metabólicas normales de los seres vivos.
Una modalidad de la invención se refiere al uso de polímero biodegradables para la obtención de las micropartículas porosas pudiendo utilizarse por ejemplo: el ácido poli- poliláctico-co-glicólico (PLGA), policaprolactona, polihidroxibutirato, L-PLA: ácido poli-L-láctico; DL-PLA: ácido poli-DL-láctico; PLGA: ácido poli-DL-co-glicólico; PGA: ácido poli-glicólico; PCL: poli-E-aprolactona; PLGCLA: ácido poli-DL-láctico-co-glicólico- co-E- -caprolactona, y naturales como chitosán, albúmina ó carboxicelulosa.
EJEMPLOS
La presente invención será mejor entendida a partir de los siguientes ejemplos, los cuales se presentan únicamente con fines ilustrativos para permitir la comprensión cabal de las modalidades preferidas de la presente invención, sin que por ello se implique que no existen otras modalidades no ilustradas que puedan llevarse a la práctica con base en la descripción detallada previamente realizada.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de las propiedades, capacidades y alcances de la invención, pero no son limitantes de su verdadero alcance. Como ejemplo de la aplicación y desempeño del proceso para obtener las microesferas ensambladas ya descritas, se describen los siguientes datos y resultados experimentales, esto con la finalidad de aportar los elementos necesarios para llevar cabo la invención, mas no son limitativos del alcance de la invención:
EJEMPLO 1
Sistemas ensamblados que contienen el péptido acetato de Leuprolide.
Se han obtenido microesferas ensambladas con nanopartículas para portar al péptido acetato de Leuprolide (nonapéptido), el cual es empleado en el tratamiento de cáncer de próstata, y que están hechos de un polímero biodegradable, el ácido poli-láctico-co- glicólico (PLGA). Al obtener estos sistemas se han logrado eficiencias de adsorción cercanas al 90%, es decir que 9 de cada 10 mg iniciales que se tenían en solución durante el proceso de ensamblaje son adsorbidos en las superficies disponibles de los sistemas. Al infiltrar cantidades crecientes de nanopartículas poliméricas, 25, 50, 75 y 100 mg/ml, se obtienen cantidades crecientes de péptido adsorbido, 1.9, 2.6, 5.1 y 9.6 mg, respectivamente; por lo que con este proceso se obtuvieron cantidades terapéuticas del fármaco. Estas suspensiones de nanopartículas están dispersas en buffer de fosfatos pH 7.2 y en este mismo medio se encuentra disuelto el péptido, por lo que bajo estas condiciones existen especies cargadas, es decir que el Leuprolide presenta carga positiva (debido a los aminoácidos básicos Histidina y Arginina) y el PLGA presenta carga negativa (debido a su pKa, 3.8), lo que favorece las interacciones electrostáticas en el proceso de adsorción. Otro aspecto importante es que al aumentar la cantidad de nanopartículas infiltradas hemos reducido la velocidad de liberación del fármaco, de tal forma que cuando no se tienen nanopartículas infiltradas el fármaco es liberado en 12 horas y al saturar con nanopartículas infiltradas (25, 50, 75 y 100 mg/ml) cantidades iguales de microesferas, la misma cantidad de fármaco es liberado en tiempos más prolongados (2, 3.5, 4.5, 6 y 7 días, respectivamente, ver figura 2). Con lo cual queda demostrado que la adsorción/infiltración de nanopartículas poliméricas aumenta la cantidad de fármaco que es cargada en el sistema y retrasa la velocidad de liberación del fármaco. La liberación se llevó a cabo en buffer de fosfatos a pH 7.2 y a 37 °C. Para estudiar la integridad del péptido se llevaron a cabo estudios de dicroísmo circular, empleando buffer de fosfatos 20 mM, pH 7.2, monitoreando en el UV de 190 a 250 nm. Los resultados mostraron que no hay cambios importantes en la conformación que toma el péptido cuando es adsorbido y posteriormente liberado o bien cuando está libre en solución, es decir sin haber sido adsorbido (ver figura 3).
EJEMPLO 2
Sistemas ensamblados que contienen la enzima g-Amilasa.
También se ha logrado formular un modelo proteico, la enzima a-Amilasa (450 aminoácidos). Empleando la invención descrita se ha adsorbido esta proteína sobre cantidades crecientes de nanopartículas, 25, 50, 75 y 100 mg/ml, que posteriormente se han infiltrado a microesferas porosas biodegradables de PLGA. Se observa un comportamiento similar al ejemplo anterior, pues se ha conseguido adsorber 3.0, 3.8, 4.7 y 5.2 mg cuando se infiltran 25, 50, 75 y 100 mg/ml de nanopartículas, respectivamente. El medio acuoso en el que se llevó a cabo el proceso de adsorción se trata de una solución buffer de acetatos a pH 4.0; este pH fue elegido debido a que bajo estas condiciones la proteína α-amilasa se encuentra cargada positivamente (punto isoeléctrico de 4.2) y el PLGA presenta carga negativa (pKa de 3.8), lo cual nuevamente favorece las atracciones eléctricas en el proceso de adsorción. Estas cantidades de proteína son liberadas en 2, 3, 4 y 6 días aproximadamente (ver figura 4). Los estudios de liberación se llevaron a cabo en buffer de fosfato pH 7.2 y 37 °C. Después del proceso de liberación la proteína sigue siendo activa, lo que quedó demostrado al realizar estudios de actividad enzimática empleando como substrato el 2-cloro-4- nitrofenil-maltriosa, el cual es degradado en presencia de la enzima generando como producto el 2-cloro-nitrofenol que presenta un color amarillo que es monitoreado espectrofotométricamente a 405 nm. Los estudios de actividad enzimática se desempeñaron después de 12 horas de liberación en buffer de fosfatos pH 7.2, no encontrando diferencias estadísticamente significativas en comparación con un control de α-amilasa que no fue adsorbido (ver figura 5). De igual manera se evaluaron las diferentes proteínas liberadas desde los sistemas con la técnica de dicroísmo circular para detectar cambios conformacionales, encontrando que no hay diferencias significativas o cambios importantes en la conformación de la proteína (ver figura 6), lo cual complementa los estudios de actividad enzimática.
Aun cuando se han ilustrado y descrito ciertas modalidades de la invención, debe hacerse hincapié en que son posibles numerosas modificaciones a la misma, tales como concentraciones, diferentes antiretrovirales, o inclusión de nuevas sustancias activas, a la presente invención pero tales modificaciones no representarían un alejamiento del verdadero alcance de la invención. Por lo tanto, la presente invención no deberá considerarse como restringida excepto por lo establecido en el estado de la técnica, así como por el alcance de las reivindicaciones anexas.
REFERENCIAS
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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un proceso para la preparación de microesferas porosas, de 78 ± 32 μηη, ensambladas con nanopartículas portadoras de un principio activo sensible o fármaco sensible de liberación controlada y que mantiene la integridad de dicho principio activo o fármaco, caracterizado porque:
i. Se obtienen nanopartículas poliméricas mediante los siguientes pasos:
a. disolución de un polímero biodegradable en un solvente orgánico y se emulsifica con el doble de volumen de una solución acuosa, previamente saturada con el mismo solvente orgánico, de un agente estabilizante ;
b. después del tiempo de agitación se adiciona un volumen de agua que supera tres veces el volumen de la emulsión, con la finalidad de provocar la difusión del solvente orgánico hacia la fase acuosa hasta lograr que el polímero se agregue y se forme la nanopartícula, c. las nanopartículas se recuperan por centrifugación y posterior liofilización.
ii. Se obtienen las microesferas porosas mediante el método de doble emulsión- evaporación de disolvente, mediante los siguientes pasos:
a. disolución de un polímero biodegradable en un solvente orgánico; b. posteriormente es emulsificado durante un periodo de tiempo con un volumen cuatro veces menor de una solución acuosa del agente porógeno;
c. una vez obtenida la primera emulsión, ésta es nuevamente emulsificada con un volumen treinta veces mayor de una solución acuosa de agente estabilizante y mantenida en agitación hasta que el solvente orgánico es evaporado;
d. las microesferas porosas son recuperadas por filtración y posterior liofilización.
iii. Una vez obtenidas las nanopartículas del paso i y las micro esferas del paso ii, llevar a cabo el proceso de ensamblaje por adsorción/infiltración en 2 pasos :
a. una cantidad de nanopartículas de 250 ± 10 nm, obtenidas en el paso i es resuspendida en un vial de vidrio con medio acuoso durante aproximadamente 12 horas, en un buffer de pH que favorezca la adsorción del fármaco;
b. se agrega una cantidad adecuada del fármaco para obtener la dosis requerida y se lleva a agitación horizontal suave durante el tiempo suficiente para provocar la adsorción del fármaco sobre la superficie de las nanopartículas;
c. las microesferas porosas obtenidas en el paso ii son colocadas en una malla de acero inoxidable de 10 μιη, la cual permite el paso de la suspensión de nanopartículas obtenidas del paso anterior, las microesferas porosas son sumergidas en la suspensión de nanopartículas con fármaco obtenidas del paso anterior, y se colocan en un sistema de agitación horizontal por el tiempo suficiente para que ocurra la infiltración de las nanopartículas a la microesfera porosa; el porcentaje de infiltración se manipula dependiendo del requerimiento particular.
d. las microesferas porosas ensambladas con nanopartículas adsorbidas con moléculas del fármaco en los poros y también moléculas de fármaco adsorbidas directamente en las paredes de los poros, son recuperados al retirar la malla de acero inoxidable y secados a temperatura ambiente;
e. opcionalmente, la suspensión restante es centrifugada para poder cuantificar la cantidad de fármaco que se encuentra atrapado en el sistema ensamblado.
2. - El proceso para la preparación de microesferas porosas ensambladas con nanopartículas portadoras de moléculas de al menos un fármaco que mantiene la integridad del mismo de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque el solvente orgánico que se usa para la disolución del polímero del paso i-a es acetato de etilo o cloruro de metileno.
3. - El proceso para la preparación de microesferas porosas ensambladas con nanopartículas portadoras de moléculas de al menos un fármaco que mantiene la integridad del mismo de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque el agente estabilizante del paso i-a es alcohol polivinílico (PVAL) ó un poloxámero.
4. - El proceso para la preparación de microesferas porosas ensambladas con nanopartículas portadoras de moléculas de al menos un fármaco que mantiene la integridad del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el solvente orgánico que se utiliza en el paso ii-a es el cloruro de metileno.
5. - El proceso para la preparación de microesferas porosas ensambladas con nanopartículas portadoras de moléculas de al menos un fármaco que mantiene la integridad del mismo de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque el polímero biodegradable que se utiliza en el paso i-a y en el paso ii-a es al menos uno seleccionado del grupo que consiste de: ácido poli- poliláctico-co-glicólico (PLGA), policaprolactona, polihidroxibutirato, L-PLA: ácido poli-L-láctico; DL-PLA: ácido poli-DL-láctico; PLGA: ácido poli-DL-co-glicólico; PGA: ácido poli-glicólico; PCL: poli-E- aprolactona; PLGCLA: ácido poli-DL-láctico-co-glicólico-co-E- -caprolactona, y naturales como chitosán, albúmina ó carboxicelulosa.
6 - El proceso para la preparación de microesferas porosas ensambladas con nanopartículas portadoras de moléculas de al menos un fármaco que mantiene la integridad del mismo de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque el agente porógeno que se utiliza en el paso ii-b es bicarbonato de amonio o azúcares como glucosa, fructuosa o manitol.
7. - El proceso para la preparación de microesferas porosas ensambladas con nanopartículas portadoras de moléculas de al menos un fármaco que mantiene la integridad del mismo de de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde dicho fármaco es: a) un péptido o polipéptido b) una proteína ó c) un compuesto no proteico de administración oral sensible a la degradación, o una combinación de estos.
8. - Unas microesferas porosas biodegradables ensambladas con nanopartículas portadoras de al menos un principio activo sensible caracterizadas porque: a. las nanopartículas se encuentran infiltradas en los poros de dichas microesferas y portan a dicho principio activo
b. la superficie libre de los poros a su vez también portan dicho principio activo. c. poseen una capacidad de adsorción entre el 50 y 90%.
9.- Las microesferas porosas biodegradables ensambladas con nanopartículas portadoras de al menos un principio activo sensible de conformidad con la reivindicación 8 caracterizadas además porque:
a. mantienen la integridad molecular y estructural de dicho principio activo y lo liberan de manera controlada una vez administrado al paciente b. son administrables por vía intravenosa, intramuscular, oral, nasal, ocular, ótica, o vaginal.
10.- Las microesferas porosas biodegradables ensambladas con nanopartículas portadoras de al menos un principio activo sensible de conformidad con la reivindicación 8 caracterizadas además porque:
a. las microesferas y las nanopartículas se constituyen de un polímero que se selecciona del grupo que consiste de: ácido poli- poliláctico-co-glicólico (PLGA), policaprolactona, polihidroxibutirato, L-PLA: ácido poli-L-láctico; DL-PLA: ácido poli-DL- láctico; PLGA: ácido poli-DL-co-glicólico; PGA: ácido poli-glicólico; PCL: poli-E- aprolactona; PLGCLA: ácido poli-DL-láctico-co-glicólico-co-E- -caprolactona, chitosán, albúmina ó carboxicelulosa.
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