ES2204837T3 - Metodo para la preparacion de microesferas que contienen sistemas coloidales. - Google Patents
Metodo para la preparacion de microesferas que contienen sistemas coloidales.Info
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Abstract
Un método para la preparación de sistemas coloidales microencapsulados que comprende las etapas de: a) proporcionar una mezcla acuosa de i) una primera fase que comprende un polímero reticulable soluble en agua ii) una segunda fase que comprende un polímero soluble que es incompatible en solución con el polímero en dicha primera fase, y iii) sistemas coloidales a suspender en dicha primera fase; formar una emulsión de dicha primera fase en dicha segunda fase, y b) formar microesferas en la emulsión reticulando al menos parte de dicho polímero reticulable, formado de esta manera dichos sistemas coloidales microencapsulados.
Description
Método para la preparación de microesferas que
contienen sistemas coloidales.
La invención se refiere a un proceso para la
preparación de un sistema con un buen comportamiento de liberación
controlada, y a microesferas con un buen comportamiento de
liberación controlada. Más en particular, la invención se refiere a
un método para la preparación de sistemas coloidales
microencapsulados, es decir, microesferas que comprenden sistemas
coloidales, tales como liposomas. Estos sistemas coloidales
microencapsulados pueden usarse como sistemas de liberación
controlada para la administración de ingredientes activos en
aplicaciones in vivo e in vitro.
Los rápidos desarrollos en el campo de la
biotecnología conducen a un gran número de productos farmacéuticos
interesantes, especialmente proteínas, péptidos y genes. Tales
productos pueden usarse apropiadamente en el tratamiento de
enfermedades mortales, por ejemplo cáncer y varios tipos de
enfermedades víricas, bacterianas y parasíticas.
Debido a su naturaleza, las proteínas y los
productos proteicos, por ejemplo péptidos, cuyo grupo de productos
se denominará en lo sucesivo en este documento fármacos proteicos,
no pueden administrarse oralmente de forma eficaz. Tienen que
introducirse en el sistema de forma parenteral, es decir, por
inyección. El perfil farmacocinético es estos productos es tal que
la inyección del producto per se requiere una administración
frecuente. En otras palabras, como los fármacos proteicos son
química y físicamente inestables en el tracto gastrointestinal y
generalmente tienen un corto tiempo de residencia activa en el
cuerpo de un ser humano o un animal, se requieren múltiples
inyecciones en un corto plazo para conseguir un efecto terapéutico.
Es evidente que esto no es práctico para los pacientes que necesitan
estos fármacos proteicos.
Por esta razón, existe una necesidad de sistemas
de administración con una capacidad de liberación sostenida. Se han
propuesto diversas opciones para tales sistemas, tales como el uso
de polímeros sintéticos biodegradables mas bien definidos para
controlar la liberación de fármacos encapsulados.
Una de las opciones descritas en la técnica
anterior es el uso de microesferas y nanoesferas hechas de
materiales poliméricos. Estas microesferas o nanoesferas son
partículas esféricas, cápsulas esféricas, nanocápsulas o
nanopartículas con un diámetro de partícula entre aproximadamente
0,1 \mum y aproximadamente 100 \mum. En esta descripción y en
las reivindicaciones, la referencia a microesferas también abarca
micropartículas, microcápsulas, nanoesferas, nanopartículas y
nanocápsulas. Los polímeros ampliamente usados para preparar estas
microesferas son ácido poliláctico y copolímeros del ácido láctico y
del ácido glicólico. Los polímeros deben ser preferiblemente
biodegradables para evitar la eliminación del vehículo polimérico
después del uso.
Los métodos de preparación conocidos hasta ahora
de sistemas de liberación controlada o sostenida que contienen
fármacos implican generalmente el uso de disolventes orgánicos. Los
disolventes orgánicos pueden conducir a cambios estructurales en la
estructura de la proteínas, especialmente en la estructura
secundaria y terciaria. Tales cambios pueden conducir a una
desnaturalización del fármaco proteico. Como estos cambios conducen
normalmente a una pérdida en la actividad farmacológica y a la
ocurrencia de efectos secundarios no deseados, tales cambios no son
deseados, como es evidente. Además, el uso de disolventes orgánicos
tampoco es deseable desde un punto de vista ambiental.
Además, es casi imposible evitar que queden
trazas de disolventes orgánicos en las microesferas producidas. Esto
es un problema, especialmente cuando se usan disolventes tóxicos,
tales como los disolventes ampliamente utilizados cloroformo y
diclorometano.
Otro problema es que es difícil encapsular
proteínas en matrices poliméricas de forma reproducible. Es de suma
importancia que se liberen cantidades predecibles y reproducibles de
las proteínas u otros productos encapsulados que se usan como
fármacos.
Los hidrogeles poliméricos, es decir, redes
poliméricas que contienen una cantidad considerable de agua, se han
estudiado ampliamente como sistemas de liberación controlada. Aunque
los hidrogeles poliméricos pueden aplicarse satisfactoriamente como
sistemas de liberación controlada, sigue existiendo una necesidad
para modificar adicionalmente los perfiles de liberación obtenidos.
En particular el tiempo de retraso, es decir, el tiempo después del
cual tiene lugar el inicio de la liberación, y la duración del pulso
en el caso de la liberación por pulsos son parámetros que determinan
en gran medida el éxito de la aplicación de un sistema de liberación
controlada.
Uno de los sistemas de hidrogel que se ha usado
en la preparación de sistemas de administración de fármacos
proteicos comprender dextranos reticulados obtenidos por
polimerización radical del dextrano derivatizado con metacrilato
(dex-MA). Con relación a esto, se hace referencia a
van Dijk-Wolthuis et al., en Macromolecules
28, (1995), 6317-6322 y a Van
Dijk-Wolthuis et al., en Macromolecules
30, (1997), 3411-3413.
\newpage
Parecía que la liberación de proteínas de estos
hidrogeles depende de y pueden controlarse con el grado de
reticulación y el contenido inicial de agua del gel (Henniink et
al., J. of. Contr. Rel. 39 (1996), 47-57,
cuyo contenido se incorpora en este documento por referencia).
Los fármacos comprendidos se liberan de estos
hidrogeles o microesferas poliméricas durante la biodegradación del
material polimérico y/o por difusión.
Las fármacos se cargan normalmente en hidrogeles
o microesferas derivadas de los mismos por equilibrio en una
solución contenedora seguido de secado (véase por ejemplo Kim et
al., en Pharm. Res. 9(3) (1992) o por
incorporación del fármaco durante la preparación del hidrogel o de
las microesferas (véase por ejemplo Heller et al. en
Biomaterials 4 (1983)262-266). Ambas
técnicas tienen diversas desventajas distintas de las relacionadas
con el uso de disolventes orgánicos.
La carga por equilibrio conduce normalmente a un
contenido en fármaco relativamente bajo en el sistema de
administración debido a la exclusión entrópica: las moléculas más
grandes entran con más dificultad en el hidrogel que las más
pequeñas. Este es el caso, especialmente, cuando el fármaco es un
compuesto macromolecular. A menos que el tamaño del poro del
hidrogel o de la microesfera sea más bien grande, las macromoléculas
adsorben en la superficie exterior, lo que, después de la
aplicación, conduce a una liberación inmediata en el sistema del ser
humano o animal o in vitro. Además, la fase de disolvente que
contiene el fármaco, cuya fase está en contacto con el sistema de
administración para cargar el sistema de administración, tiene que
retirarse del hidrogel o de las microesferas. Esto puede producir la
migración del fármaco a la superficie del sistema de administración,
y, por lo tanto, a una distribución no homogénea del fármaco. Esto
tiende a tener como resultado una liberación de golpe significativa
del fármaco, lo que generalmente no se desea.
El objetivo es un proceso de carga adecuado para
incorporar fármacos moleculares.
En un artículo en Proceed. Intern. Symp. Control.
Rel. Bioadc. Materl., 22 (1995), 145-146,
Gekrje et al. ha descrito una técnica en la que se pueden
obtener niveles de carga mayores que los obtenibles con la absorción
de la solución, por tanto mayores del 0,1% en peso en hidrogeles
purificados preformados. La técnica de carga se basa en el hecho de
que ciertas mezclas de polímeros se dividen en fases distintas
cuando se disuelven en agua. Las proteínas disueltas en tal sistema
se distribuyen de forma no uniforme entre las fases. Este principio
también se mantiene cuando una de las fases de polímero es un gel
reticulado.
En particular, Gehrke et al. describe un
sistema de gel de dextrano reticulado/poli(etilenglicol) y un
sistema de gel de hidroxipropilmetilcelulosa
reticulado/poli(alcohol de vinilo). Las proteínas presentes
en una solución acuosa que contiene perlas del gel se adsorben,
después de la adición del segundo polímero no reticulado, en las
perlas y se absorben parcialmente a través de las mallas o poros en
las superficies de las perlas.
Una desventaja de esta técnica es que el material
proteico solo se adsorbe en gran medida a las perlas, lo que
significa que si la fase que contiene el segundo polímero se
sustituye con otro sistema acuoso se observa una rápida retirada de
las proteínas de las perlas. Solo cuando hay presentes grandes
cantidades de poros con un diámetro mayor del tamaño del material
proteico a cargar puede tener lugar alguna absorción. Esta adsorción
y el limitado comportamiento de absorción tiene un efecto no
deseable en la liberación del material proteico de las perlas.
Para ilustrar adicionalmente el comportamiento de
liberación no deseado, se aprecia que los perfiles mostrados en el
artículo son -desde un punto de vista farmacológico- completamente
inadecuados para usar en sistemas de liberación controlada.
En el documento
EP-A-0 213 303 se describe un método
para producir partículas esféricas de polímero con sistemas que
contienen dos fases líquidas acuosas. Una de las dos fases se
dispersa en forma de gotitas en la otra fase para formar una
emulsión. Posteriormente, se hace que las gotitas se solidifiquen.
En fase a dispersar, se puede disolver una sustancia macromolecular.
Además, las sustancias de bajo peso molecular tales como
medicamentos, vacunas e insecticidas pueden unirse químicamente a la
sustancia que forma la partícula en la fase dispersa. No se menciona
nada sobre el comportamiento de liberación de la sustancia disuelta,
no de la aplicación de las partículas esféricas de polímero formadas
o del tamaño de las mismas.
El principio de partición por afinidad en
sistemas que contienen PEG de dos fases también se conoce de Göte
Johansson, Affinity Partitioning en PEG-containing
Two-phase Systems In: Topics in Applied Chemistry:
Poly(ethylene glycol) chemistry, Biotechnological and
Biomedical Applications, Ed. J.M. Harris, Plenum Press (1992). En
este artículo, se describe un sistema de dos fases, que se crea
cuando se mezcla una solución acuosa de dextrano y polietilenglicol
(PEG). Se forma un fase enriquecida en PEG y una fase enriquecida en
dextrano. Las proteínas se dividen de forma desigual en tales
sistemas. Estos sistemas conocidos se usan en la purificación de
proteínas.
Los liposomas se han investigado como sistemas de
liberación controlada durante muchos años. Los liposomas consisten
en membranas concéntricas cerradas, tales como una bicapa formada
por lípidos polares insolubles en agua, tales como fosfolípidos.
Otras sustancias, tales como colesterol, pueden incluirse también en
la membrana. Estos liposomas pueden variar en diámetro desde unas
pocas decenas de manómetros hasta micrómetros. Se pueden encapsular
fármacos polares y no polares como ingredientes activos dentro de
los liposomas. Las proteínas pueden encapsularse en liposomas muy
bien. Cuando se usan los liposomas como sistemas de liberación
controlada, se pueden prevenir concentraciones iniciales altas de
proteínas en la sangre. Tales concentraciones altas son normalmente
no deseables, porque pueden llevar a efectos adversos en el paciente
y a la degradación de la proteína. La liberación del ingrediente
activo del liposoma puede desencadenarse por la desestabilización de
la bicapa.
Se ha informado de la (micro)encapsulación
de liposomas en varios casos. Por ejemplo, Kibat et al.
(FASEB J., 4 (1990) 2533-2539) describe
microcápsulas compuestos de una matriz de hidrogel de alginato de
calcio. Estas microcápsulas contienen liposomas. La liberación
mediante pulsos del liposoma se consigue recubriendo los liposomas
con la enzima fosfolipasa A_{2}.
Cohen et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
88 (1991), 10440-10444) y Cohen et al.
(Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 16
(1989) 71-72 describe también liposomas
microencapsulados con alginato. Estos liposomas microencapsulados se
caracterizan por un perfil de liberación que comienza
inmediatamente, es decir, no muestran un tiempo de retraso. Además,
la liberación es gradual más que por pulsos.
El documento
US-A-4.921.757 describe liposomas
que están encapsulados en una placa sólida permeable de, por
ejemplo, agarosa o poliacrilamida, o en micropartículas basadas en
alginato reticulado con una piel policatiogénica.
Yeung et al. (Microencapsulation, 5
(1988) 331-337) describe liposomas incorporados en
microcápsulas basadas en nylon, que se preparan usando un proceso
interfacial de policondensación. Los perfiles de liberación de estos
liposomas microencapsulados no muestran tiempo de retraso. Además,
el uso del nylon hace una aplicación in vivo poco
probable.
Bochot et al. (International Journal of
Pharmaceutics, 162 (1998) 119-127) describe
un sistema de administración ocular basado en liposomas dispersos en
un gel de copolímero termosensible de
polioxietileno-polioxipropileno. El sistema se
prepara añadiendo liposomas al gel.
Weiner et al. (Journal of Pharmaceutical
Sciences, 74 (1985) 922-925) describe el uso
de un gel de colágeno para encapsular liposomas. Después de que los
liposomas se han añadido al colágeno, la formación de gel se inicia
cambiando la temperatura o el pH.
Alamelu et al. (Carbohydrate Polymers,
24 (1994) 215-221) describe un sistema de
administración basado en liposomas complejados acoplados a un gel de
quitosano. La formación del gel se efectúa por adición de una
solución alcalina.
Por último, Ditizio et al. (Biomaterials,
19 (1998) 1877-1884) describe un hidrogel
liposomal. El gel se forma cambiando el pH.
Todos estos liposomas microencapsulados de la
técnica anterior se basan en que las enzimas efectúan la liberación
de compuestos de los liposomas o no muestran características de
liberación deseables. Además, la eficacia de encapsulación de los
métodos de la técnica anterior es normalmente demasiado baja.
La presente invención tiene como objetivo
proporcionar un nuevo sistema de administración inyectable, aceptado
por el paciente, de liberación de ingredientes activos, tales como
fármacos proteicos u otros fármacos, seguro y biodegradable, y que
tiene una cinética de administración controlable. El periodo en el
que debe garantizarse la administración del fármaco depende del
ingrediente activo usado, que es preferiblemente un fármaco
proteico, y varía desde varios días a más de un año. Además, deben
obtenerse altos grados de carga en el sistema de administración.
Además, el sistema de la presente invención debe producirse sin
necesidad del uso de disolventes orgánicos.
Es otro objetivo de la invención proporcionar un
método para la preparación de sistemas coloidales microencapsulados,
tales como liposomas, cuyos sistemas coloidales pueden estar
asociados con un ingrediente activo, cuyos sistemas coloidales
microencapsulados muestran un perfil de liberación deseable, es
decir, una alta liberación de ingrediente activo (preferiblemente
más del 85%), un perfil de liberación por pulsos con un tiempo de
retraso adecuado, mientras que estos perfiles de liberación se
pueden controlar con el método de preparación. El perfil de
liberación deseable debe mantenerse también para el ingrediente
activo que puede estar asociado con los sistemas coloidales. La
definición de un tiempo de retraso adecuado depende del tipo de
aplicación. Cuando se usan vacunas como ingrediente activo, un
tiempo de retraso adecuado es entre dos semanas y un año,
preferiblemente 1-3 meses.
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar tal método que permita una alta eficacia de
encapsulación de los sistemas coloidales, es decir, una eficacia de
encapsulación de más del 80%, preferiblemente más del 90%.
La presente invención se dirige a una combinación
de sistemas coloidales e hidrogeles usados para la liberación
controlada de ingredientes activos.
Los sistemas coloidales adecuados que se pueden
usar en la presente invención son liposomas; iscoms; poliplexos, es
decir, combinaciones de polímeros (catiónicos) y ADN; lipoplexos, es
decir, combinaciones de lípidos (catiónicos) y ADN; nanopartículas,
es decir, esferas basadas en polímeros en el intervalo de tamaño de
manómetros; partículas sólidas de lípidos en el intervalo de tamaño
coloidal (véase, por ejemplo, R.H. Muller et al., Pharm.
Research 14 (1997) 458-462); emulsiones,
tales como sistemas similares a intralípidos; cualquier otra entidad
en el intervalo de tamaño coloidal con una baja solubilidad en agua;
y combinaciones de los mismos.
Las combinaciones de sistemas coloidales e
hidrogeles de acuerdo con la presente invención se ilustrará a
continuación en este documento usando liposomas como sistema
coloidal. Debe apreciarse que donde se mencionen liposomas a
continuación en este documento, estos liposomas pueden sustituirse
con cualquier de los sistemas coloidales adecuados mencionados
anteriormente, sin desviarse del espíritu de la invención.
Los problemas mencionados anteriormente se
solucionan con un método de preparación específica de sistemas de
liberación controlada, tales como microesferas, en las que se usa
agua como disolvente. El uso de agua como único disolvente es
ventajoso desde un punto de vista ambiental, por consideraciones
toxicológicas y, especialmente, por razones de estabilidad de las
proteínas.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona un método para la preparación de un sistema de
liberación controlada que comprende:
(a) formar un sistema acuoso de dos fases con dos
polímeros solubles en agua y agua y al menos una entidad liberable,
tal como un liposoma u otro sistema coloidal, siendo los dos
polímeros solubles en agua incompatibles en solución, siendo al
menos uno de estos polímeros reticulable, estando la fase del
polímero reticulable emulsionada en la otra fase de polímero; y
siendo al menos una entidad liberable soluble o dispersable en la
fase del polímero reticulable en la solución acuosa;
(b) permitir que la entidad liberable se
distribuya en la fase del polímero reticulable; y
(c) reticular el polímero reticulable.
En una realización preferida, la reticulación se
realiza en tal medida que los poros (malla) en la estructura
reticulada que se forma al final es sustancialmente menor que el
tamaño de la entidad liberable.
Emulsionando un polímero acuoso reticulable en
una fase continua comprendida por agua y un polímero que no es
compatible con el polímero reticulable, y reticulando la fase
discontinua, se forman las partículas. El tamaño de partícula de las
partículas de polímero reticulado puede ajustarse cambiando la
viscosidad de una o ambas fases, por ejemplo, seleccionando
polímeros de diferente peso molecular, o cambiando la relación de
volumen de ambas fases (véase por ejemplo, Stenekes et al.,
Pharm. Res 15 (1998) pág. 557-561, estando su
incorporado en este documento por referencia). De esta forma se
puede obtener una distribución estrecha de tamaño de partícula, como
se describe a continuación en este documento con más detalle.
En otro aspecto, la presente invención se dirige
a microesferas, teniendo al menos el 80% en peso de las mismas un
tamaño de partícula de entre 100 nanómetros y 100 \mum, cuyas
esferas están comprendidas por un polímero degradable reticulado que
encapsula al menos una entidad liberable, tal como un liposoma,
siendo el tamaño del poro del polímero reticulado igual o
preferiblemente menor que el tamaño de la entidad liberable. Estas
microesferas se pueden obtener usando el proceso de la invención, y
no tienen disolventes orgánicos. Dependiendo de las aplicación de
las microesferas, el tamaño puede ajustarse, por ejemplo, entre 1 y
50 \mum, preferiblemente entre 2 \mum y 25 \mum, tal como
entre 5 y 15 \mum.
Cuando el tamaño del poro o la malla del polímero
reticulado es igual o menor que el tamaño del diámetro hidrodinámico
del componente liberable, el componente liberable se libera
esencialmente cuando el polímero se degrada. Más en particular, en
esta realización, la estructura reticulada debe ser degradable en el
cuerpo del ser humano o de un animal, de forma que la entidad
liberable encapsulada pueda salir de la matriz reticulada. Si, por
otro lado, el tamaño del poro o la malla del polímero reticulado es
mayor que el tamaño del componente liberable, el componente
liberable se libera al menos parcialmente por difusión. De esta
forma, el tamaño de poro del producto reticulado obtenido con el
proceso de la presente invención proporciona una herramienta
perfecta para controlar la liberación. Además, la eficacia de la
incorporación de una entidad liberable en tal estructura polimérica
es muy alta, mientras que el grado de carga puede ajustarse hasta la
concentración de saturación de la entidad a liberar.
La degradabilidad de la estructura reticulada
puede regularse de distintas maneras. Como primer ejemplo, debe
apreciarse que pueden incorporarse enlaces, que son hidrolizables en
condiciones fisiológicas. Con respecto a esto, se puede hacer
referencia a la solicitud de Patente Europea 96201821,4 y al
documento WO-A-97/00170, cuyo
contenido se incorpora a este documento por referencia. Estas
solicitudes de patentes muestran hidrogeles que comprenden
espaciadores hidrolíticamente lábiles entre distintas cadenas
poliméricas. Los espaciadores hidrolíticamente lábiles descritos en
ese documento pueden usarse apropiadamente en la presente invención
y las solicitudes de patente mencionadas anteriormente se incorporan
en este documento por referencia.
Otro ejemplo para controlar la degradabilidad es
la coencapsulación de una enzima o sustancia química capaz de romper
enlaces en el polímero reticulado. En una realización preferida del
proceso de la presente invención el polímero reticulable es un
polímero de dextrano. En esta realización se puede añadir una
dextranasa al sistema acuoso de dos fases antes de la etapa de
reticulación o añadirse después.
El polímero de dextrano puede usarse
adecuadamente en el proceso de la presente invención junto con
Pluronic® o un polietilenglicol, prefiriéndose este último polímero
en el proceso de la presente invención.
El producto objetivo de la presente invención se
puede separar de la otra fase de polímero usando técnicas
convencionales, por ejemplo centrifugación y decantación.
En una primera etapa del proceso de la presente
invención se forma un sistema acuoso de dos fases. Este sistema de
dos fases comprender agua, y al menos dos polímeros solubles en
agua, que son incompatibles en solución. Preferiblemente también hay
presente una entidad para liberar, aunque es posible añadir la
entidad a liberar después de la etapa de reticulación. Sin embargo,
los sistemas coloidales usados en la presente invención son
generalmente demasiado grandes para entrar en las microesferas
después de la etapa de reticulación en cantidad suficiente, en
particular cuando se usan liposomas como sistema coloidal. Por lo
tanto, se prefiere añadir estos sistemas coloidales antes de la
etapa de reticulación. Al menos uno de los polímeros presentes en la
fase acuosa es química o físicamente reticulable, y la fase del
polímero reticulable se emulsiona en la otra fase de polímero
acuoso.
Los polímeros usados pueden seleccionarse
dependiendo de la naturaleza de la entidad a liberar. Se prefiere
que la entidad a liberar tenga una clara preferencia por la fase de
polímero reticulable. En ese caso, se puede obtener el mayor grado
posible de carga en las microesferas, teóricamente hasta la
concentración de saturación.
La elección del polímero reticulable utilizado no
es crítica. Sin embargo, si se pretende introducir el sistema de
liberación controlada que comprende el polímero en forma reticulada
en un cuerpo de un ser humano o un animal, el polímero debe ser
farmacéuticamente aceptable y preferiblemente debe ser degradable.
Algunos polímero reticulables solubles en agua adecuados son
dextranos y dextranos derivatizados, almidones y derivados de
almidones, derivados de celulosa tales como hidroxietil e
hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, proteínas y proteínas
derivatizadas, etc. El peso molecular del polímero reticulable está
normalmente entre 1.000 y 1.000.000 Da. Se aprecia que con un mayor
peso molecular del polímero, se obtiene generalmente una mejor
separación de fases en la solución acuosa usada en el proceso de la
invención.
El especialista en la técnica tiene el
conocimiento para seleccionar el polímero reticulable y las
condiciones de reticulación requeridas para la emulsión preparada.
Por ejemplo, los dextranos pueden reticularse con metacrilato o
grupos metacrilato. Otro ejemplo es un sistema que comprende PVP
como fase externa y dextrano como fase emulsionada, en el que el
dextrano se reticula mediante la presencia de isocianatos.
Adicionalmente, se hace referencia a la
reticulación usando radiación. El Dex-MA (dextrano
derivatizado con metacrilato) puede polimerizarse, por ejemplo,
usando pequeñas dosis de radiación \gamma, tal como menos de 0,1
Mrad. Una ventaja de esta realización es que se pueden obtener
micropartículas estériles en una etapa. Además, la reticulación con
radiación UV y la reticulación física usando, por ejemplo, colas
hidrófobas acopladas a un polímero son técnicas posibles.
En una realización preferida, el polímero
reticulable es un polímero sensible a la temperatura tal como
poli-N-isopropilacrilamida, que
puede, por ejemplo, estar presente como injerto en otro polímero tal
como dextrano. Los hidrogeles de estos polímeros muestran un mayor
comportamiento de inflamación a menores temperaturas. Esto hace
posible que el material liberable pueda penetrar fácilmente en el
hidrogel después de la reacción de reticulación. Aumentando
posteriormente la temperatura, por ejemplo a un valor de 37ºC, las
mallas del hidrogel encogen, capturando por tanto la entidad
liberable.
El polímero que está presente en la fase acuosa
continua puede ser cualquier polímero que sea incompatible con el
polímero reticulable. Este polímero también puede ser reticulable,
pero por supuesto no con las condiciones de reacción usadas para la
reticulación de la fase discontinua de polímero, esto no se
prefiere. Algunos ejemplos de polímeros incompatibles con el
polímero a reticular son poli(etilenglicol) (PEG) y
poli(alcohol de vinilo) (PVA) (en combinación con, por
ejemplo, dextranos y derivados de dextrano, almidones y derivados de
almidón, PVP, y derivados de celulosa solubles en agua).
La liberación de la entidad liberable depende de
diversas variables que pueden usarse para ajustar la administración
según se desee. Una de estas variables en el tamaño de las
microesferas. El tamaño puede ajustarse modificando cuidadosamente
las circunstancias del proceso y los parámetros de formulación en la
etapa de emulsión. Por ejemplo, el contenido en agua, la presencia
de grupos hidrófobos en cualquier de los polímero o mezclas de
polímeros usadas, la viscosidad de la fase continua y discontinua, y
la carga eléctrica en al menos dos polímeros usados son algunos
ejemplos de herramientas para ajustar el tamaño de las microesferas
o micropartículas a producir. Además, pueden añadirse emulsionantes.
Los emulsionantes adecuados con copolímeros, preferiblemente
copolímeros de bloque, de unidades de los dos polímeros
incompatibles, por ejemplo, un copolímero de bloque de PEG y
dextrano, usado para crear el sistema de dos fases.
Para garantizar adicionalmente un liberación
controlada, el polímero reticulado debe ser preferiblemente
degradable.
Como se ha mencionado en este documento
anteriormente, es importante que los dos polímero solubles en agua
sean incompatibles el uno con el otro, de forma que se obtiene un
sistema de dos fases después de que los dos polímeros se han añadido
el uno al otro en una solución acuosa. Si se obtiene o no un sistema
de dos fases depende no solo de la naturaleza de los dos polímeros
implicados, sino también de las condiciones en las que son añadidos.
Los factores que son relevantes en este sentido son el peso
molecular de los polímeros, sus concentraciones en la solución
acuosa, la temperatura a la que son añadidos el uno al otro y
factores similares. Es parte de las habilidades convencionales del
especialista determinar un diagrama de fase para cualquier
combinación de polímeros que se pueda usar, y de esta forma
seleccionar condiciones adecuadas para obtener una separación de
fases.
En la Fig. 8 adjunta se muestra como ejemplo un
diagrama de fase de un sistema ternario de agua/PEG/dextrano. Cuando
la composición de partida está por debajo de la (- - -) binodal, hay
presente un sistema de una fase, mientras que por encima de la
binodal, se forman dos fases coexistentes: una rica en polímero 1
(composición x_{1}) y la otra rica en polímero 2 (composición
x_{2})- x_{1} y x_{2} están conectadas mediante un enlace
(________). Todos los sistemas preparados usando composiciones de
partida en el mismo enlace se separan en fases de composición
constante. Para una composición de partida dada, la relación en
volumen de las fases coexistentes x_{1}/x_{2} es igual a
y_{2}/y_{1}.
Como se ha indicado anteriormente en este
documento, la entidad liberable puede ser un fármaco proteico. Sin
embargo, también es posible encapsular un fármaco o antígeno u otros
agentes activos que contienen sistemas coloidales, tales como
nanopartículas o micropartículas, por ejemplo liposomas e iscoms. La
encapsulación de este tipo de partículas tiene la ventaja de evitar
una liberación demasiado rápida de la entidad encapsulada, o dicho
en otros palabras, los efectos de ráfaga pueden evitarse de una
forma más segura.
Los sistemas coloidales microencapsulados
obtenidos con el método de la invención comprenden una matriz de un
polímero degradable en el cual están presentes los sistemas
coloidales, tales como liposomas. Los ingredientes activos pueden
estar presentes en los sistemas coloidales. Es una ventaja
considerable de la presente invención que estos ingredientes activos
pueden seleccionarse en principio independientemente de su
compatibilidad con la matriz polimérica, es decir, no se requiere
que los ingredientes activos sean solubles o dispersables en la
matriz, dado que es suficiente que estos ingredientes activos sean
compatibles con el sistema coloidal. Esto permite la preparación de
sistemas de liberación que comprenden ingredientes activos que solo
podrían incorporarse con dificultad, o con medidas adicionales, en
los sistemas de liberación de la técnica anterior.
De esta manera, el método de la invención permite
a las microesferas, por ejemplo, la liberación retrasada o por
pulsos de todo tipo de ingredientes activos. Cuando se usan
liposomas como sistemas coloidales, la presencia de la capa de la
membrana de lípidos bimolecular permite la incorporación de
sustancias hidrófobas, que no se podrían incorporar en sistemas de
hidrogel convencionales. Estas sustancias hidrófobas pueden
incorporarse en, o asociarse con la bicapa de lípidos.
Algunos ejemplos de partículas coloidales a
encapsular son: iscoms, lipoplexos, poliplexos, nanopartícula y
liponanopartículas sólidas.
Los iscoms pueden liberarse de las microesferas
lentamente o por pulsos. Esto permite al diseñador de vacunas
manipular la respuesta inmune inducida por los iscoms que contienen
antígenos. Por ejemplo, si se desea una revacunación, la
microesferas pueden inducir un efecto de revacunación mediante la
liberación por pulsos de los iscoms después de un tiempo de retraso
predeterminado.
Se puede desear tener acceso a sistemas de
administración que liberan poliplexos y lipoplexos (complejos de
material genético y (mezcla) o (mezclas) de polímeros en
condensación de una forma controlada. Las microesferas son capaces
de hacer eso.
Lo mismo se aplica a nanopartículas y
lipoesferas, que pueden cargarse con material o antígenos
terapéuticamente activos. Las nanopartículas son partículas
coloidales basadas en, por ejemplo, policianoacrilatos. Las
nanopartículas sólidas de lípidos son partículas coloidales basadas
en lípidos que están en fase sólida a la temperatura del cuerpo. Las
nanopartículas son nanopartículas sólidas de lípidos que pueden
liberarse de las microesferas en patrones similares a los liposomas.
La liberación del fármaco de estas partículas coloidales depende de
sus componentes y de las condiciones de fabricación.
Además, incorporando el ingrediente activo en el
sistema coloidal, el ingrediente activo se protege de las reacciones
que tienen lugar durante la etapa de polimerización posterior, cuyas
reacciones pueden causar una oxidación no deseada del ingrediente
activo.
Con el método de la invención, es posible
proporcionar microcápsulas que comprenden 10% o más del sistema
coloidal. Normalmente, la cantidad de sistema coloidal incorporado
será de aproximadamente 5-10% en peso, pero esta
cantidad variará con las condiciones específicas usadas.
La cantidad de ingrediente activo que puede
incorporarse en total en la microesfera, como eficacia de esta
incorporación, variará también fuertemente dependiendo de las
condiciones de síntesis y la aplicación deseada. Por ejemplo, si se
incorpora una proteína de membrana en un liposoma, se absorberá
fácilmente en la bicapa de los liposomas. Estos liposomas pueden
incorporarse en microesferas con altas eficacias, como se ha
afirmado anteriormente. Por otro lado, una proteína hidrófila se
incorporará en un liposoma de forma menos eficaz, teniendo como
resultado un menor contenido en proteína de la microesfera final. Si
se desean microesferas con un alto contenido de ingrediente activo,
se puede usar un sistema coloidal más hidrófilo.
Normalmente, la cantidad de ingrediente activo
presente en las microesferas preparadas con el método de la presente
invención, será de aproximadamente 0,5-50 \mug de
ingrediente activo/mg de material de microesfera.
La partición de la entidad a liberar se determina
principalmente por la naturaleza de los polímeros presentes en el
sistema acuoso de dos fases. Esta partición puede influenciarse, por
ejemplo, añadiendo sal al sistema acuoso, o ajustando el pH.
Si las entidades liberables, tales como
proteínas, están presentes durante la etapa de reticulación, se debe
tener cuidado de asegurar la integridad de las entidades liberables.
Por ejemplo, se debe evitar que se oxide el material proteico con
sistemas inciadores, etc. En relación a esto, debe apreciarse que se
los efectos adversos pueden evitarse o minimizarse minimizando la
cantidad de iniciador, reduciendo el tiempo de polimerización o
añadiendo antioxidantes adecuados, tales como
\alpha-tocoferol.
La separación de las estructuras reticuladas que
comprenden la entidad liberable de la otra fase se puede realizar de
cualquier forma convencional. Preferiblemente, la separación se
efectúa por filtración o centrifugación. Las estructuras reticuladas
pueden lavarse con agua posteriormente y secarse. La etapa de secado
determina que se pueda obtener un producto farmacéutico aceptable,
con un periodo de conservación de más de 2 años. Un método de secado
muy preferido es el secado con nebulizador, aunque también se puede
realizar el secado de forma apropiada usando liofilización.
La Fig.1 muestra una distribución de volumen del
tamaño de partícula de microesferas de dextrano preparadas mediante
la técnica de emulsión
agua-en-agua.
La Fig. 2 muestra un micrógrafo SEM de las
microesferas de dextrano de la Fig. 1.
La Fig. 3 muestra el tamaño medio de volumen y
peso de las microesferas de dextrano como una función del grado de
sustitución MA y el peso molecular del PEG.
La Fig. 4 muestra el tamaño medio de volumen y
peso de las microesferas de dextrano como una función del grado de
sustitución MA y la concentración de la concentración acuosa de
dex-MA.
La Fig. 5 muestra el efecto de la concentración y
del peso molecular del pEG en el tamaño medio de volumen y peso de
las microesferas de dextrano.
La Fig. 6 muestra los perfiles de liberación de
microesferas de dextrano en degradación.
La Fig. 7 también muestra perfiles de liberación
de microesferas de dextrano en degradación.
La Fig. 8 muestra un diagrama de fase de un
sistema ternario de agua/PEG/dextrano.
La Fig. 9 muestra la liberación de liposoma en 3
lotes preparados individualmente de microesferas de dextrano a pH
7,2. Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados:
DexHEMA DS 8, contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex:
40, liposomas 184 nm DPPC:DPPG:Chol (10:1:10).
La Fig. 10 muestra la liberación de la calceína
libre, calceína total y fosfato liposomal a pH 8,0. Siendo la
formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 8,
contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex: 40, liposomas
DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) con (226 nm) y sin (184 nm) calceína.
La Fig. 11A muestra el efecto del tamaño del
liposoma en las características de la liberación a pH 7,2. Siendo la
formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 8,
contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex: 40, liposomas
DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) 95 y 184.
La Fig. 11B muestra el efecto del tamaño del
liposoma en las características de la liberación a pH 8,0. Siendo la
formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 8,
contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex: 40, liposomas
DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) 95 y 184.
La Fig. 12 muestra el efecto de la relación de
volumen PEG/dex en las características de la liberación a pH 7,2.
Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS
8, contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex: 20, 40 y 80,
liposomas DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) 184 nm.
La Fig. 13A muestra el efecto del contenido en
agua en las características de la liberación de liposomas
microencapsulados de acuerdo con la invención a pH 7,2, comparado
con la liberación de microesferas de dexMA no degradables. Siendo la
formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 8,
contenido en agua 70% y 50%, relación de volumen PEG/dex: 40.
Liposomas DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) 184 nm.
La Fig. 13B muestra el efecto del contenido en
agua en las características de la liberación a pH 7,2. Siendo la
formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 5 y 8,
contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex: 40. Liposomas
DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) 184 nm.
La Fig. 14A muestra el efecto del grado de
sustitución en las características de la liberación a pH 7,2. Siendo
la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 5 y 8,
contenido en agua 70%, relación de volumen: 40. tamaño del liposoma:
184 nm.
La Fig. 14B muestra el efecto del grado de
sustitución en las características de la liberación a pH 8,0. Siendo
la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 5 y 8,
contenido en agua 70%, relación de volumen: 40. tamaño del liposoma:
184 nm.
La Fig. 15 muestra el efecto del derivado de
dextrano en las características de la liberación a pH 7,2. Siendo la
formulación de los liposomas microencapsulados: dexLactatoHEMA (DS
4) mono- y polidisperso, contenido en agua 70%, relación de volumen:
40, tamaño del liposoma: 184 nm.
La presente invención proporciona un método para
la encapsulación de sistemas coloidales, tales como liposomas, en
microesferas reticuladas.
Sorprendentemente, los presentes inventores han
descubierto que cuando las microesferas que comprenden sistemas
coloidales se preparan de acuerdo a un método que comprende las
etapas de:
a) proporcionar una mezcla acuosa de i) un
primera fase que comprende un polímero reticulable soluble en agua,
ii) una segunda fase que comprende un polímero soluble en agua que
es incompatible en solución con el polímero de dicha primera fase, y
iii) sistemas coloidales para suspender en dicha primera fase;
formar una emulsión de dicha primera fase en dicha segunda fase,
y
b) formar microesferas en la emulsión reticulando
una parte de dicho polímero reticulable, formando de esta manera
dichos sistemas coloidales microencapsulados,
se pueden superar los problemas mencionados en
este documento anteriormente.
En una realización preferida, el método de la
invención se realiza mezclando primero los sistemas coloidales con
dicha primera fase y poniendo en contacto posteriormente esta mezcla
con dicha segunda fase. Formando una premezcla poniendo en contacto
dichos sistemas coloidales con dicha primera fase en la etapa a), y
poniendo en contacto posteriormente esta premezcla con dicha segunda
fase, los sistemas coloidales se pueden encapsular en las
microesferas con eficacias de encapsulación muy altas.
Cuando los sistemas coloidales microencapsulados
producidos de acuerdo con la invención, una gran parte de los
sistemas coloidales se liberan intactas de las microesferas,
produciendo un perfil de liberación deseable. En un intervalo de
tamaño amplio, el perfil de liberación no se ve afectado por el
tamaño de los sistemas coloidales utilizados. Además, el perfil de
liberación puede ajustarse modificando ciertas etapas en el método
de la invención, como se explicará a continuación en este
documento.
La preparación de los sistemas coloidales
microencapsulados, tales como liposomas, de acuerdo con la invención
se realizan usando agua como fase continua, es decir, como
disolvente o fase de dispersión. Esto es ventajoso desde un punto de
vista toxicológico. Además, la ausencia de disolventes orgánicos
evita la degradación de los sistemas coloidales y del ingrediente
activo comprendido en los sistemas coloidales.
De acuerdo con la presente invención, se ha
descubierto que los sistemas coloidales tales como liposomas pueden
encapsularse en microesferas y especialmente en microesferas de
dextrano con eficacias de encapsulación muy altas. Con el método de
acuerdo con la invención, se pueden obtener una cantidad de sistemas
coloidales añadidos a la mezcla inicial prácticamente completa, es
decir, más del 85% en peso, preferiblemente más del 90% en peso.
Los sistemas coloidales se liberan intactas de
las microesferas degradables y se puede obtener una liberación por
pulsos. También se pueden obtener sistemas que muestran una
liberación por pulsos después de la aplicación. El periodo de
liberación en condiciones fisiológicas puede ajustarse de, por
ejemplo, 6 días (dexLactatoHEMA DS 4, contenido en agua 70%,
relación de volumen: 40) a, por ejemplo, 3 meses (dexHEMA DS 8,
contenido en agua 50%, relación de volumen: 40). La liberación
extrapolada de experimentos de liberación a pH 8,0 usando dexHEMA DS
16 en condiciones fisiológicas usando un contenido en agua de 50%,
fue incluso mayor de 3 meses.
Generalmente, se observa un pulso más largo en
microesferas con un menor contenido en agua y un mayor grado de
sustitución debido a la degradación más lenta de la microesfera.
Generalmente, las microesferas de dexLactatoHEMA
liberan sistemas coloidales más rápidamente que las de dexHEMA,
porque el éster de lactato es más susceptible a la hidrólisis que el
éster de carbonato.
El polímero reticulable utilizado debe ser
farmacéuticamente aceptable y ser preferiblemente degradable.
Algunos polímeros solubles en agua reticulables adecuados son
dextranos y dextranos derivatizados, almidones y derivados de
almidón, derivados de celulosa tales como hidroxietil e
hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, proteínas y proteínas
derivatizadas. Un polímero reticulable preferido es dextrano que
comprende grupos reticulables. Los grupos reticulables preferidos
son grupos metacrilato, seleccionando los polímeros de dextrano más
preferidos entre el grupo compuesto por dexMA, dexHEMA y
dexLactato-EMA.
El proceso de la presente invención se ilustrará
adicionalmente a continuación en este documento con la preparación
de microesferas de dextrano que comprenden liposomas como sistema
coloidal, usando la técnica de emulsión de
agua-en-agua.
Los liposomas microencapsulados de la invención
se ilustrarán a continuación con los siguientes ejemplos no
limitantes, con referencia a las Figuras 9-15.
Se obtuvieron polietilenglicoles (PEG) con
distintos pesos moleculares de Merck-Schuchardi,
Alemania. Se sintetizaron dextranos derivatizados con metacrilato
(dex-MA) con distintos DS (grados de sustitución; el
número de grupos metacrilato por 100 restos glucopiranosa) mediante
una reacción de acoplamiento de dextrano T40 y metacrilato de
glicidilo en DMSO (dimetilsulfóxido) usando DMAP
(N,N-dimetilamino-piridina) como
catalizador, esencialmente como ha descrito Van
Dijk-Wolthuis et al. en Macromolecules
28, (1995) 6317-6322.
El Dex-PEG se sintetizó como se
indica a continuación. Se disolvieron mPEG
(monometoxi-polietilenglicol, M 5000 g/mmol, 5 g,
que corresponde a 1 mmol de grupos hidroxilo) y CDI
(carbonildiimidazol, 162 mg, 1 mmol) en 100 ml de tetrahidrofurano
anhidro. La solución se agitó durante una noche a temperatura
ambiente, seguido de la evaporación del disolvente a presión
reducida. Después, el mPEG activado con CI (carbonilimidazol) se
añadió a una solución de dextrano T40 (1,7 g) y DMAP (0,35 g) en 50
ml de DMSO. Esta solución se agitó durante una semana a temperatura
ambiente. Después de la neutralización del DMAP con HCl, la solución
se dializó exhaustivamente en agua y posteriormente se liofilizó. El
producto se caracterizó por cromatografía de permeación por gel y
RMN. El grado de sustitución ascendía a 3. El
dex-lactato-HEMA (DS 3) se sintetizó
como se describe en la solicitud pendiente de Patente Europea Nº
96201821.4.
El polietilenglicol (PEG, distinto peso
molecular) se disolvió en KCl 0,22M a una concentración de
12-40% (p/p) . Se disolvió Dex-MA en
KCl 0,22M a una concentración de 10-40% (p/p). Ambas
soluciones se lavaron con nitrógeno durante 10 minutos. Después se
mezclaron 4,75 ml de la solución de PEG y 0,25 ml de la solución de
dex-MA y se agitó vorticialmente (Winn
Vortex-Genie, máxima velocidad) durante 1 minuto
teniendo como resultado una emulsión
agua-en-agua con dextrano como fase
interna y PEG como fase externa. Después de 10 minutos se añadieron
((N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina, 100 \mul, 20%
(v/v) en KCl 0,22M, pH ajustado con HCl concentrado a 7,2) y KPS
(peroxidisulfato de potasio, 180 \mul, 50 mg/ml en agua). La
emulsión se incubó durante 30 minutos a 37ºC para polimerizar el
dex-MA. Las microesferas se lavaron dos veces con
agua y se liofilizaron.
Se demostró usando cultivos celulares in
vitro que la citotoxicidad del dex-MA es baja,
similar a la citotoxicidad del dextrano, compuesto que se ha usado
durante años como agente de sustitución del plasma en seres
humanos.
El tamaño de partícula (tamaño de peso en número
(=Snd/Sn) y tamaño de volumen en número (=Snd^{4}/Snd^{3}), I.C.
Edmundson, Particle-size analysis, H.S. Bean, A.H.
Beckett y J.E. Carles (eds) en: Advances in Pharmaceutical Sciences
vol. 2, Academic Press, London 1967, 95-174) y la
distribución del tamaño de partícula se calcularon con una técnica
de bloqueo de luz láser (Accusizer™, model 770, Particle Sizing
Systems, Santa Barbara, CA, USA). Las características de forma y
superficie (porosidad) de las microesferas se estableció mediante un
análisis de microscopia electrónica de barrido (SEM).
La Figura 1 da un ejemplo representativo de la
distribución del tamaño de partícula en un lote de microesferas de
dextrano preparado con la técnica de emulsión
agua-en-agua determinada usando el
Accusizer. El análisis mostró que las partículas son perfectamente
esféricas y no porosas (Figura 2).
La Figura 3 muestra el tamaño medio de volumen y
peso de microesferas de dextrano como una función del grado de
sustitución MA y el peso molecular del PEG. La concentración de la
solución de PEG fue del 24% (p/p); la concentración de la
concentración de dex-MA fue 20%. Se muestra que el
tamaño de partícula aumenta con la reducción del peso molecular del
PEG. Con un peso molecular del EPEG fijo, el tamaño de partícula se
reduce ligeramente al aumentar el DS.
\newpage
La Figura 4 muestra el tamaño medio de volumen y
peso de microesferas de dextrano como una función del grado de
sustitución MA y la concentración de la concentración acuosa de
dex-MA. El diámetro medio aumenta al reducir la
concentración de dex-MA.
La Figura 5 muestra el efecto de la concentración
y el peso molecular del PEG en el tamaño medio de volumen y peso de
las microesferas de dextrano. Para esta evaluación, se usó
dex-MA con una DS de 8 en KCl 0,22M (20%, p/p).
Parece que para un PEG dado, las partículas más grandes se
obtuvieron con una concentración de PEG de aproximadamente 24%.
Se prepararon microesferas con las siguientes
formulaciones usando el protocolo dado en el Ejemplo 1 y usando las
siguientes soluciones stock
Soluciones stock (% en p/p) en KCl 0,22M:
A. PEG 10.000, 24%
B. PEG 20.000, 24%
C. Dex-MA (DS 13), 20%
D. Dex-lactHEMA (DS 3) 20%
E. Dex-lactHEMA (DS 3) 10%
F. Dex-PEG 20%
Como puede verse, un emulsionante adecuado
(copolímero en bloque de dextrano y PEG) da partículas más pequeñas
con una menor dispersión (= diámetro peso medio/diámetro número
medio).
Se evaluó la liberación de una proteína modelo
con microesferas de dextrano no degradables y con microesferas
degradables. Las microesferas se hicieron degradables por
incorporación de dextranasa en las microesferas de
dex-MA.
dex-MA.
Se disolvió dex-MA (DS 8) en
tampón fosfato 10 mM pH 8,0. A 2 ml de esta solución se añadió una
cantidad fija de IgG (Inmunoglobulina G, 25,6 mg) y una cantidad
variable de dextranasa (Sigma D1508; 0, 0,1 y 1 U (1 U libera 1
\mumol de oligosacáridos reductores por minuto a 37ºC y pH 6,0)).
Esta solución se emulsionó en una solución acuosa de PEG (10.000 M,
concentración 24% (p/p)) en KCl 0,22M. A continuación, añadió TEMED
(N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina, 100 \mul, 20%
(v/v) en KCl 0,22M, pH ajustado con HCl concentrado a 7,2) y KPS
(peroxidisulfato de potasio, 180 \mul, 50 mg/ml en agua). Las
microesferas se lavaron con agua y se secaron con un caudal de
nitrógeno.
\newpage
Se suspendió una cantidad medida con precisión
(0,3-0,5 g) de microesferas en 10 ml de tampón
fosfato pH 5,5 y se calculó la cantidad de proteína liberada usando
en ensayo de proteínas biorad (M. Bradford. Anal. Biochem. 72 (1976)
248-254). La Figura 6 muestra los perfiles de
liberación. En esta figura, es evidente que la liberación de IgG de
las microesferas de dextrano se puede modular con dextranasa.
Ejemplo 4 (Ejemplo de
Referencia)
Se evaluó la liberación de una proteína modelo
(IgG) en microesferas de dextrano degradables. La degradación se
estableció por incorporando dextranasa en las micropartículas.
Se disolvió dextrano derivatizado con metacrilato
(DS=8; 138 mg) en 612 \mul de tampón (fosfato 10 mM, KCl 220 mM,
pH 8,0). A continuación, se añadieron 250 \mul de una solución
acuosa de IgG (50 mg/ml) y 250 \mul de una solución acuosa de
dextranasa (concentración variable). La IgG y la dextranasa se
disolvieron en la misma solución tampón (fosfato 10 mM, KCl 220 mM,
pH 8,0). Después, se añadieron 500 \mul de la solución de dexMA,
IgG y dextranasa a 50 ml de una solución acuosa de PEG (peso
molecular 10.000 g/mol, concentración 17,5, 24 ó 30% p/p) en la
misma solución tampón. Estos sistemas de fases separadas se agitaron
vorticialmente durante 1 minuto, seguido de la adición de 180 \mul
de peroxodisulfato de potasio (50 mg/ml; disuelto en tampón fosfato)
y TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina, 20%
v/v, pH ajustado a 8,0 con HCl). Después, las muestras se incubaron
durante 30 minutos a 37ºC para polimerizar el DexMA. Las partículas
se recogieron por centrifugación y se lavaron con agua. Las
partículas se resuspendieron en solución tampón (NH_{4}Ac 5 mM, pH
5,5) y se incuban a 37ºC. Periódicamente, se toman muestras y se
analiza su contenido en proteínas (ensayo Biorad). La Figura 7
muestra los perfiles de liberación. Se puede apreciar que, en
ausencia de dextranasa, la liberación acumulativa fue menor del 10%,
indicando que el diámetro hidrodinámico de la proteína era mayor que
el tamaño de malla del hidrogel. Además, la velocidad de liberación
aumenta al aumentar la cantidad de dextranasa en las partículas. Una
mayor cantidad de dextranasa en las partículas tuvo como resultado
una menor velocidad de degradación. Esto significa que la liberación
de las proteínas comprendidas en las partículas de dextrano se puede
modular con la velocidad de degradación de la matriz del hidrogel.
La degradación puede establecerse por adición de una enzima
(dextranasa) o por introducción de espaciadores hidrolíticamente
lábiles (por ejemplo ésteres de lactato) en la reticulación.
Ejemplo
Comparativo
Se disolvieron 5 gramos de dextrano en el que las
cadenas de dextrano ser derivan con grupos metacrilato con un peso
molecular de 40.000 en 45 ml de agua.
A temperatura ambiente, la primera solución se
añadió a la segunda solución con agitación. El resultado fue un
sistema de una fase, en el que no se podían formar microesferas.
Este ejemplo ilustra la necesidad de seleccionar el peso molecular y
las concentraciones de los materiales de partida de forma de se
obtenga un sistema de dos fases.
En los siguientes Ejemplos 5-0,
se usaron los materiales que se indican a continuación.
El PEG 10.000 (M_{w} 12.000; M_{n} 8.00) y
el peroxodisulfato de potasio se obtuvieron en Merck (Darmstadt,
Alemania). Dex 40.000 (M_{w} 38800; M_{n} 16400) y
N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina se compraron en
Fluka (Buchs, Suiza). M_{w} y M_{n} se refieren al peso medio
molecular en peso y número, respectivamente (calculado por GPC). El
dextrano derivado con metacrilato (dexMA) con un grado de
sustitución (DS: el número de grupos MA por 100 unidades de monómero
de glucopiranoil de dextrano) de 10 se preparó como describe Ban
Dijk-Wolthuis et al. en Macromolecules
28 (1995), 6317-6322. El dextrano
derivatizado con metacrilato de hidroxietilo (dexHEMA) con distintos
DS se preparó como describe Van Dijk-Wolthuis et
al.. Los grados de sustitución determinados por
^{1}H-RMH fueron 5, 8 y 16. El dextrano
derivatizado con lactato de HEMA monodisperso y polidisperso
(dexLactateHEMA) se preparó de acuerdo con Cadée et al.
(Polymer 40 (1999) 6877-6881) y Van
Dijk-Wolthuis et al. y ambos tenían un DS de
4.
La dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y el
diapalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) fueron donados por Lipoid GmbH
(Ludwigshafen, Alemania). El colesterol y la calceína se obtuvieron
en Sigma (Rockford, IL, USA). El cloroformo y el metanol (p.a.) se
compraron en Merck (Darmstadt, Alemania).
Se prepararon liposomas DPPC:DPPG:Chol (10:1:10)
por hidratación de la película de lípidos como describe Crommelin
et al. ("Liposomes", en Kreuter, J. (ed.). Colloidal
Drug Delivery Systems Inc. Marcel Dekker (1994), pág
73-190), con y sin calceína, una marcador acuoso
usado a una concentración de 80 mM como ingrediente activo. La
incorporación de calceína se describe en Gregoriadis (ed.),
"Liposome Technology", Vol. I, II y III, 1ª y 2ª edición, CRC
Press, Boca Raton, FL, (1984, 1993).
Se usó tampón HEPES 10 mM
(N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[ácido
4-butano sulfónico) que contenía NaCl al 0,8%, pH
ajustado a 7,2 como medio acuoso (concentración total de lípidos 81
mM). Posteriormente, los liposomas se extruyeron a través de filtros
de policarbonato de 0,6, 0,2, 0,1 y 0,05 \mum para obtener el
tamaño deseado. Los liposomas que contenían calceína se lavaron por
ultracentrifugación para retirar la calceína no incorporada. El
contenido de fosfolípidos se midió por determinación de fosfato de
acuerdo con Rousser et al. ("Two-dimensional thin
layer chromatographic separation of polar lipids and determination
of phospholipids by phosphorous analysis of spots", Lipids
5 (1970) 494-496). El tamaño medio de
partícula se calculó por dispersión de luz dinámica (DLS). El
tamaño, índice de polidispersión y contenido de fosfato o calceína
de los liposomas preparados se presentan en la Tabla 2.
Se prepararon liposomas encapsulados mezclando
los liposomas preparados en el Ejemplo 5 con una solución acuosa de
dexMA en solución tampón HEPES 10 mM. Se produjeron dos lotes, uno
con calceína presente en los liposomas, y otro sin calceína. También
se preparó una solución acuosa de PEG en solución tampón HEPES 10
mM. Ambas soluciones se lavaron abundantemente con nitrógeno durante
10 minutos antes de añadir los liposomas y se pasaron posteriormente
a un vial de escintilación (peso total 5 g). El sistema de dos fases
resultante se agito vorticialmente de forma enérgica durante 60 seg
para crear una emulsión de
agua-en-agua. Después, la emulsión
se dejó estabilizar durante 10-15 minutos
(condiciones ambiente), seguido de la adición de TEMED (100 \mul,
20% v/v, ajustado a pH 7 con HCl 4M) y KPS (180 \mul, 50 mg/ml).
Este sistema se incubó 30 minutos a 37ºC para polimerizar los grupos
metacrilato acoplados a las cadenas de dextrano. Posteriormente, la
fase de PEG se retiró por múltiples etapas de lavado y
centrifugación. El tamaño de partícula y la distribución de tamaño
se midieron con una técnica de bloqueo de luz láser
(Accusizer™).
Se prepararon lotes diferentes usando distintos
tamaños de liposoma (95, 184 y 370 nm), contenidos de agua en la
microsfera (50-70%) y relaciones de volumen PEG/dex
(20-80).
La eficacia de encapsulación de liposomas en las
microesferas se definió como la cantidad de liposomas en las
microesferas divida por la cantidad de liposomas añadidos al sistema
de dos fases. La cantidad de liposomas en las microesferas se
determinó midiendo la concentración de fosfolípidos en el gránulo de
la microesfera usando la determinación por fosfato de acuerdo con
Rousser et al.. (Lipids 5 (1970)
494-496).
La eficacia de encapsulación fue muy
reproducible. Para 5 muestras preparadas de forma independiente
(formulación: dex-MA DS 10, contenido en agua: 70%,
relación de volumen, 40: tamaño del liposoma: 184 nm), la eficacia
de encapsulación fue del 94,4%. En este caso los liposomas se
mezclaron con la fase de dextrano antes de la adición a la fase de
PEG, de acuerdo con una realización preferida de la invención.
Cuando los liposomas se añadieron al sistema de fases separadas,
esto tuvo como resultado una eficacia de encapsulación del 88,1%. De
esta forma, mezclar antes los liposomas con la fase de dextrano tuvo
como resultado una mayor eficacia de encapsulación.
Se estudiaron los efectos del tamaño del
liposoma, contenido en agua de la microesfera y relación de volumen
PEG/dex en la eficacia de encapsulación, y se presentan en la Tabla
3.
En la Tabla 3 es evidente que, en la mayoría de
los casos, la eficacia de encapsulación es próxima al 100%. No
parece que haya relación entre el tamaño del liposoma y la eficacia
de encapsulación (para cualquier contenido de agua y/o relación de
volumen). Se esperaba que la eficacia de encapsulación aumentarse al
usar liposomas más granes, pero aparentemente, incluso los liposomas
más pequeños estaban atrapados completamente en la matriz de
dextrano. Se esperaba una mayor eficacia de encapsulación con un
contenido menor de agua, ya que un menor contenido en agua tiene
como resultado poros más pequeños en el hidrogel. Sin embargo, la
Tabla 3 muestra que no hay relación entre el contenido en agua y la
eficacia de encapsulación. Para una relación de volumen de 80, la
eficacia de encapsulación es ligeramente menor, ya que una relación
grande de PEG/dex resulta en un volumen pequeño de fase de dextrano
y por lo tanto los liposomas no pueden encapsulares tan bien.
Se repitió el Ejemplo 6 usando dexHEMA en lugar
de dexMA como polímero reticulable. Todas las otras etapas fueron
iguales.
Se repitió el Ejemplo 6 usando dexLactateHEMA en
lugar de dexMA como polímero reticulable. Todas las otras etapas
fueron iguales.
La liberación de liposomas de las microesferas se
midió incubando las microesferas resuspendidas (en tampón HEPES 10
mM del pH deseado) a 37ºC. En los instantes de tiempo deseados y
después de la centrifugación (10 min, 4.500 rpm), se retiró todo el
sobrenadante. El gránulo de la microesfera se resuspendió en 10 ml
de solución tampón fresca y se devolvió al banco de rodillos. La
cantidad de liposomas en el sobrenadante se calculó por
determinación con fosfatos de acuerdo con Rousser et al. (Lipids
5 (1970) 494-496). Se estudió la integridad
de los liposomas liberados usando liposomas que contenían calceína y
determinando la fluorescencia (\lambda_{ex}=485,
\lambda_{em}=512 nm) del sobrenadante no tratado y del
sobrenadante tratado con tritón X-100. Dada la alta
concentración de calceína dentro de los liposomas, se produce una
inactivación, resultando en una baja señal fluorescente en liposomas
intactos. Si se libera calceína en el medio circundante, la calceína
se diluye teniendo como resultado una mayor señal fluorescente. El
tratamiento con tritón X-100 tiene como resultado la
destrucción de los liposomas y la liberación de toda la calceína. La
diferencia entre la liberación de calceína libre y la liberación de
la calceína total (después del tratamiento con tritón
X-100) se usó para determinar la cantidad de
liposomas intactos liberados.
La mayoría de formulaciones mostró un
comportamiento de liberación por pulsos. En la Figura 9, se presenta
la curva de liberación de una muestra preparada en el Ejemplo 2.
Esta Figura muestra que la liberación de liposomas de las
microesferas de dextrano es muy reproducible (n=3). La pendiente de
la curva sugiere la degradación en masa de las microesferas.
Inicialmente, solo se libera aproximadamente el 10% de los liposomas
presentes en la superficie de las microesferas. La hidrólisis de las
microesferas tiene como resultado en un mayor tamaño del poro y
después de un tiempo de retraso de aproximadamente 18 días se
liberaron el resto de liposomas, dando un 100% de recuperación.
Para comprobar si los liposomas se habían
liberado intactos, se estudió la liberación de los liposomas que
contenían calceína. En la Figura 19, se presentan las curvas de
liberación de la calceína libre, la calceína total, calceína
liposomal y fosfato de una muestra del Ejemplo 2. Es evidente que
apenas se libera calceína libre. Sin embargo, después de tratar las
muestras con triton X-100, se mide una alta
fluorescencia, indicando que la calceína estaba todavía dentro de
los liposomas. Además, las curvas de liberación determinadas por
determinación con fosfato y fluorescencia de calceína son bastante
similares. Esto indica que los liposomas se liberan de las
microesferas intactas. Esto se confirmó también con medidas de
dispersión de luz dinámica (DLS) de los liposomas liberados, cuyos
resultados se dan en la Tabla 4.
En la Tabla 4, es evidente que el tamaño de
partícula después de la liberación es similar al tamaño de partícula
antes de la encapsulación en las microesferas. El efecto del tamaño
del liposoma en las características de liberación se presenta en las
Figuras 11A y 11B para pH 7,2 y 8,0 respectivamente. En ambas
figuras es evidente que el tamaño de liposoma no afecta el tiempo de
retraso. Además, en las Figuras 11A y 11B se aprecia que la longitud
del pulso varía sólo ligeramente con el tamaño de partícula.
En la Figura 12, se presenta el efecto de la
relación de volumen PEG/dextrano en las características de
liberación. Como se esperaba, una relación de volumen menor tiene
como resultado un pulso mayor, ya que una relación de volumen menor
tiene como resultado un mayor volumen de fase de dextrano. Por lo
tanto, se tienen que degradar más reticulaciones para liberar todos
los liposomas, resultando en un pulso más largo. La aparición del
pulso no se vio afectada por la relación de volumen, porque el
tamaño del poro y la velocidad de degradación es la misma,
independientemente del volumen de la fase de dextrano.
El efecto del contenido de agua en la liberación
se da en la Figura 13A. Se observa una liberación sobre un periodo
de tiempo más largo. Sin embargo, el tiempo de retraso no aumentó
para contenidos de agua más bajos, aunque la cantidad de liposomas
liberados inicialmente fue menor en las microesferas con menor
contenido de agua. Los efectos mencionados anteriormente del
contenido en agua no se observaron cuando se uso dexHEMA con un
menor grado de sustitución (Fig. 3B). Esto se puede explicar por el
hecho de que los hidrogeles con DS menor de 10 no son estables
dimensionalmente y por lo tanto se hinchan.
En las Figuras 14A y 14B se presentan otros
efectos del grado de sustitución en las características de
liberación. Es evidente que las formulaciones con un mayor DS
liberan los liposomas después de un tiempo de retraso más largo y
que la pendiente del pulso es menos inclinada. Por lo tanto, el
tiempo total de liberación es más largo. También se observo una
menor pendiente del pulso a pH 8,0 (Fig. 14B). Cuando se usó DS 16,
se obtuvo una liberación de prácticamente orden cero, mientras que
con DS 5 se obtuvo como resultado un pulso agudo. Sin embargo, a
este pH, no se observaron las diferencias en el tiempo de retraso
(tan pronto como a pH 7,2).
Además de dexHEMA, también se estudio la
liberación de liposomas de microesferas dexLactateHEMA
(monodispersas y polidispersas). EN la Figura 15, se comparan los
perfiles de liberación de microesferas dexHEMA (DS 5) y
dexLactateHEMA (DS 4). La liberación en las microesferas
dexLactateHEMA fue mucho más rápida, por que el éster de lactato
presente en dexLactateHEMA es más susceptible a la hidrólisis que el
éster de carbonato presente en dexHEMA. No se observaron diferencias
entre dexLactateHEMA mono- y polidisperso, porque el éster de
lactato degradante es el mismo en ambos polímeros. Sin embargo,
algunas ventajas del dexLactateHEMA es que se disuelve más
fácilmente y que tienen como resultado una red mejor definida.
La liberación se estudió a pH 7,2 y 8,0 porque a
estos valores de pH, la degradación del hidrogel está catalizada
completamente básica, la tasa de liberación es lineal
proporcionalmente con la concentración de OH^{-}. El pH de los
tampones de liberación se estableció a 7,2 y 8,0 (temperatura
ambiente), pero a 37ºC (temperatura de liberación) fueron 7,1 y 7,8
respectivamente. Por lo tanto, la concentración de OH^{-} es 4,9
veces mayor para pH 7,8 que para pH 7,1 de forma que se esperaba que
la liberación fuese 4,9 veces más rápida para el mayor pH. En la
Tabla 5, se representa la relación entre el tiempo en el que se
libera el 50% de los liposomas para ambos valores de pH.
La diferencia esperada teóricamente en la
velocidad de liberación se corresponde con los valores encontrados
experimentalmente. La discrepancia observada para DS=5 puede
explicarse de nuevo por el hinchamiento del hidrogel.
Claims (12)
1. Un método para la preparación de sistemas
coloidales microencapsulados que comprende las etapas de:
a) proporcionar una mezcla acuosa de
- i)
- una primera fase que comprende un polímero reticulable soluble en agua
- ii)
- una segunda fase que comprende un polímero soluble que es incompatible en solución con el polímero en dicha primera fase, y
- iii)
- sistemas coloidales a suspender en dicha primera fase;
formar una emulsión de dicha primera fase en
dicha segunda fase, y
b) formar microesferas en la emulsión reticulando
al menos parte de dicho polímero reticulable, formado de esta manera
dichos sistemas coloidales microencapsulados.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la
etapa a) se realiza formando una premezcla, poniendo en contacto
dichos sistemas coloidales con dicha primera fase, y juntando
posteriormente esta premezcla con dicha segunda fase.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
dichos sistemas coloidales se seleccionan entre el grupo compuesto
por liposomas, iscoms, poliplexos, lipoplexos, nanopartículas,
partículas lípídicas sólidas en el intervalo de tamaño coloidal,
emulsiones y combinaciones de las mismas.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho polímero reticulable es un polímero de dextrano que comprende
grupos reticulables.
5. El método de la reivindicación 4, en el que
dichos grupos reticulables son grupos metacrilato.
6. El método de la reivindicación 5, en el que
dicho polímero de dextrano se selecciona entre el grupo compuesto
por dexMA, dexHEMA y dexLactateHEMA.
7. El método de la reivindicación 6, en el que el
DS (grado de sustitución) de dicho polímero de dextrano es de 2 a
30.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho polímero en la segunda fase se selecciona entre el grupo
compuesto por polietilenglicol (PEG) y alcohol polivinílico
(PVA).
9. El método de la reivindicación 1, en el que se
usan sistemas coloidales que comprenden un ingrediente activo, cuyo
ingrediente activo es preferiblemente un fármaco proteico.
10. Microesferas, en las que al menos un 50% en
peso de las mismas tienen un diámetro de partícula entre 100 nm y
100 \mum, preferiblemente entre 5 y 15 \mum, que están
comprendidas por un polímero degradable reticulado que encapsula
sistemas coloidales.
11. Las microesferas de acuerdo con la
reivindicación 10, que no tienen disolventes orgánicos.
12. Las microesferas de acuerdo con la
reivindicación 10, en las que los sistemas coloidales comprenden un
ingrediente activo, que es preferiblemente un fármaco proteico.
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