ES2204837T3 - Metodo para la preparacion de microesferas que contienen sistemas coloidales. - Google Patents

Abstract

Un método para la preparación de sistemas coloidales microencapsulados que comprende las etapas de: a) proporcionar una mezcla acuosa de i) una primera fase que comprende un polímero reticulable soluble en agua ii) una segunda fase que comprende un polímero soluble que es incompatible en solución con el polímero en dicha primera fase, y iii) sistemas coloidales a suspender en dicha primera fase; formar una emulsión de dicha primera fase en dicha segunda fase, y b) formar microesferas en la emulsión reticulando al menos parte de dicho polímero reticulable, formado de esta manera dichos sistemas coloidales microencapsulados.

Description

Método para la preparación de microesferas que contienen sistemas coloidales.

Campo de la invención

La invención se refiere a un proceso para la preparación de un sistema con un buen comportamiento de liberación controlada, y a microesferas con un buen comportamiento de liberación controlada. Más en particular, la invención se refiere a un método para la preparación de sistemas coloidales microencapsulados, es decir, microesferas que comprenden sistemas coloidales, tales como liposomas. Estos sistemas coloidales microencapsulados pueden usarse como sistemas de liberación controlada para la administración de ingredientes activos en aplicaciones in vivo e in vitro.

Antecedentes de la invención

Los rápidos desarrollos en el campo de la biotecnología conducen a un gran número de productos farmacéuticos interesantes, especialmente proteínas, péptidos y genes. Tales productos pueden usarse apropiadamente en el tratamiento de enfermedades mortales, por ejemplo cáncer y varios tipos de enfermedades víricas, bacterianas y parasíticas.

Debido a su naturaleza, las proteínas y los productos proteicos, por ejemplo péptidos, cuyo grupo de productos se denominará en lo sucesivo en este documento fármacos proteicos, no pueden administrarse oralmente de forma eficaz. Tienen que introducirse en el sistema de forma parenteral, es decir, por inyección. El perfil farmacocinético es estos productos es tal que la inyección del producto per se requiere una administración frecuente. En otras palabras, como los fármacos proteicos son química y físicamente inestables en el tracto gastrointestinal y generalmente tienen un corto tiempo de residencia activa en el cuerpo de un ser humano o un animal, se requieren múltiples inyecciones en un corto plazo para conseguir un efecto terapéutico. Es evidente que esto no es práctico para los pacientes que necesitan estos fármacos proteicos.

Por esta razón, existe una necesidad de sistemas de administración con una capacidad de liberación sostenida. Se han propuesto diversas opciones para tales sistemas, tales como el uso de polímeros sintéticos biodegradables mas bien definidos para controlar la liberación de fármacos encapsulados.

Una de las opciones descritas en la técnica anterior es el uso de microesferas y nanoesferas hechas de materiales poliméricos. Estas microesferas o nanoesferas son partículas esféricas, cápsulas esféricas, nanocápsulas o nanopartículas con un diámetro de partícula entre aproximadamente 0,1 \mum y aproximadamente 100 \mum. En esta descripción y en las reivindicaciones, la referencia a microesferas también abarca micropartículas, microcápsulas, nanoesferas, nanopartículas y nanocápsulas. Los polímeros ampliamente usados para preparar estas microesferas son ácido poliláctico y copolímeros del ácido láctico y del ácido glicólico. Los polímeros deben ser preferiblemente biodegradables para evitar la eliminación del vehículo polimérico después del uso.

Los métodos de preparación conocidos hasta ahora de sistemas de liberación controlada o sostenida que contienen fármacos implican generalmente el uso de disolventes orgánicos. Los disolventes orgánicos pueden conducir a cambios estructurales en la estructura de la proteínas, especialmente en la estructura secundaria y terciaria. Tales cambios pueden conducir a una desnaturalización del fármaco proteico. Como estos cambios conducen normalmente a una pérdida en la actividad farmacológica y a la ocurrencia de efectos secundarios no deseados, tales cambios no son deseados, como es evidente. Además, el uso de disolventes orgánicos tampoco es deseable desde un punto de vista ambiental.

Además, es casi imposible evitar que queden trazas de disolventes orgánicos en las microesferas producidas. Esto es un problema, especialmente cuando se usan disolventes tóxicos, tales como los disolventes ampliamente utilizados cloroformo y diclorometano.

Otro problema es que es difícil encapsular proteínas en matrices poliméricas de forma reproducible. Es de suma importancia que se liberen cantidades predecibles y reproducibles de las proteínas u otros productos encapsulados que se usan como fármacos.

Los hidrogeles poliméricos, es decir, redes poliméricas que contienen una cantidad considerable de agua, se han estudiado ampliamente como sistemas de liberación controlada. Aunque los hidrogeles poliméricos pueden aplicarse satisfactoriamente como sistemas de liberación controlada, sigue existiendo una necesidad para modificar adicionalmente los perfiles de liberación obtenidos. En particular el tiempo de retraso, es decir, el tiempo después del cual tiene lugar el inicio de la liberación, y la duración del pulso en el caso de la liberación por pulsos son parámetros que determinan en gran medida el éxito de la aplicación de un sistema de liberación controlada.

Uno de los sistemas de hidrogel que se ha usado en la preparación de sistemas de administración de fármacos proteicos comprender dextranos reticulados obtenidos por polimerización radical del dextrano derivatizado con metacrilato (dex-MA). Con relación a esto, se hace referencia a van Dijk-Wolthuis et al., en Macromolecules 28, (1995), 6317-6322 y a Van Dijk-Wolthuis et al., en Macromolecules 30, (1997), 3411-3413.

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Parecía que la liberación de proteínas de estos hidrogeles depende de y pueden controlarse con el grado de reticulación y el contenido inicial de agua del gel (Henniink et al., J. of. Contr. Rel. 39 (1996), 47-57, cuyo contenido se incorpora en este documento por referencia).

Los fármacos comprendidos se liberan de estos hidrogeles o microesferas poliméricas durante la biodegradación del material polimérico y/o por difusión.

Las fármacos se cargan normalmente en hidrogeles o microesferas derivadas de los mismos por equilibrio en una solución contenedora seguido de secado (véase por ejemplo Kim et al., en Pharm. Res. 9(3) (1992) o por incorporación del fármaco durante la preparación del hidrogel o de las microesferas (véase por ejemplo Heller et al. en Biomaterials 4 (1983)262-266). Ambas técnicas tienen diversas desventajas distintas de las relacionadas con el uso de disolventes orgánicos.

La carga por equilibrio conduce normalmente a un contenido en fármaco relativamente bajo en el sistema de administración debido a la exclusión entrópica: las moléculas más grandes entran con más dificultad en el hidrogel que las más pequeñas. Este es el caso, especialmente, cuando el fármaco es un compuesto macromolecular. A menos que el tamaño del poro del hidrogel o de la microesfera sea más bien grande, las macromoléculas adsorben en la superficie exterior, lo que, después de la aplicación, conduce a una liberación inmediata en el sistema del ser humano o animal o in vitro. Además, la fase de disolvente que contiene el fármaco, cuya fase está en contacto con el sistema de administración para cargar el sistema de administración, tiene que retirarse del hidrogel o de las microesferas. Esto puede producir la migración del fármaco a la superficie del sistema de administración, y, por lo tanto, a una distribución no homogénea del fármaco. Esto tiende a tener como resultado una liberación de golpe significativa del fármaco, lo que generalmente no se desea.

El objetivo es un proceso de carga adecuado para incorporar fármacos moleculares.

En un artículo en Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioadc. Materl., 22 (1995), 145-146, Gekrje et al. ha descrito una técnica en la que se pueden obtener niveles de carga mayores que los obtenibles con la absorción de la solución, por tanto mayores del 0,1% en peso en hidrogeles purificados preformados. La técnica de carga se basa en el hecho de que ciertas mezclas de polímeros se dividen en fases distintas cuando se disuelven en agua. Las proteínas disueltas en tal sistema se distribuyen de forma no uniforme entre las fases. Este principio también se mantiene cuando una de las fases de polímero es un gel reticulado.

En particular, Gehrke et al. describe un sistema de gel de dextrano reticulado/poli(etilenglicol) y un sistema de gel de hidroxipropilmetilcelulosa reticulado/poli(alcohol de vinilo). Las proteínas presentes en una solución acuosa que contiene perlas del gel se adsorben, después de la adición del segundo polímero no reticulado, en las perlas y se absorben parcialmente a través de las mallas o poros en las superficies de las perlas.

Una desventaja de esta técnica es que el material proteico solo se adsorbe en gran medida a las perlas, lo que significa que si la fase que contiene el segundo polímero se sustituye con otro sistema acuoso se observa una rápida retirada de las proteínas de las perlas. Solo cuando hay presentes grandes cantidades de poros con un diámetro mayor del tamaño del material proteico a cargar puede tener lugar alguna absorción. Esta adsorción y el limitado comportamiento de absorción tiene un efecto no deseable en la liberación del material proteico de las perlas.

Para ilustrar adicionalmente el comportamiento de liberación no deseado, se aprecia que los perfiles mostrados en el artículo son -desde un punto de vista farmacológico- completamente inadecuados para usar en sistemas de liberación controlada.

En el documento EP-A-0 213 303 se describe un método para producir partículas esféricas de polímero con sistemas que contienen dos fases líquidas acuosas. Una de las dos fases se dispersa en forma de gotitas en la otra fase para formar una emulsión. Posteriormente, se hace que las gotitas se solidifiquen. En fase a dispersar, se puede disolver una sustancia macromolecular. Además, las sustancias de bajo peso molecular tales como medicamentos, vacunas e insecticidas pueden unirse químicamente a la sustancia que forma la partícula en la fase dispersa. No se menciona nada sobre el comportamiento de liberación de la sustancia disuelta, no de la aplicación de las partículas esféricas de polímero formadas o del tamaño de las mismas.

El principio de partición por afinidad en sistemas que contienen PEG de dos fases también se conoce de Göte Johansson, Affinity Partitioning en PEG-containing Two-phase Systems In: Topics in Applied Chemistry: Poly(ethylene glycol) chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications, Ed. J.M. Harris, Plenum Press (1992). En este artículo, se describe un sistema de dos fases, que se crea cuando se mezcla una solución acuosa de dextrano y polietilenglicol (PEG). Se forma un fase enriquecida en PEG y una fase enriquecida en dextrano. Las proteínas se dividen de forma desigual en tales sistemas. Estos sistemas conocidos se usan en la purificación de proteínas.

Los liposomas se han investigado como sistemas de liberación controlada durante muchos años. Los liposomas consisten en membranas concéntricas cerradas, tales como una bicapa formada por lípidos polares insolubles en agua, tales como fosfolípidos. Otras sustancias, tales como colesterol, pueden incluirse también en la membrana. Estos liposomas pueden variar en diámetro desde unas pocas decenas de manómetros hasta micrómetros. Se pueden encapsular fármacos polares y no polares como ingredientes activos dentro de los liposomas. Las proteínas pueden encapsularse en liposomas muy bien. Cuando se usan los liposomas como sistemas de liberación controlada, se pueden prevenir concentraciones iniciales altas de proteínas en la sangre. Tales concentraciones altas son normalmente no deseables, porque pueden llevar a efectos adversos en el paciente y a la degradación de la proteína. La liberación del ingrediente activo del liposoma puede desencadenarse por la desestabilización de la bicapa.

Se ha informado de la (micro)encapsulación de liposomas en varios casos. Por ejemplo, Kibat et al. (FASEB J., 4 (1990) 2533-2539) describe microcápsulas compuestos de una matriz de hidrogel de alginato de calcio. Estas microcápsulas contienen liposomas. La liberación mediante pulsos del liposoma se consigue recubriendo los liposomas con la enzima fosfolipasa A_{2}.

Cohen et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 (1991), 10440-10444) y Cohen et al. (Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 16 (1989) 71-72 describe también liposomas microencapsulados con alginato. Estos liposomas microencapsulados se caracterizan por un perfil de liberación que comienza inmediatamente, es decir, no muestran un tiempo de retraso. Además, la liberación es gradual más que por pulsos.

El documento US-A-4.921.757 describe liposomas que están encapsulados en una placa sólida permeable de, por ejemplo, agarosa o poliacrilamida, o en micropartículas basadas en alginato reticulado con una piel policatiogénica.

Yeung et al. (Microencapsulation, 5 (1988) 331-337) describe liposomas incorporados en microcápsulas basadas en nylon, que se preparan usando un proceso interfacial de policondensación. Los perfiles de liberación de estos liposomas microencapsulados no muestran tiempo de retraso. Además, el uso del nylon hace una aplicación in vivo poco probable.

Bochot et al. (International Journal of Pharmaceutics, 162 (1998) 119-127) describe un sistema de administración ocular basado en liposomas dispersos en un gel de copolímero termosensible de polioxietileno-polioxipropileno. El sistema se prepara añadiendo liposomas al gel.

Weiner et al. (Journal of Pharmaceutical Sciences, 74 (1985) 922-925) describe el uso de un gel de colágeno para encapsular liposomas. Después de que los liposomas se han añadido al colágeno, la formación de gel se inicia cambiando la temperatura o el pH.

Alamelu et al. (Carbohydrate Polymers, 24 (1994) 215-221) describe un sistema de administración basado en liposomas complejados acoplados a un gel de quitosano. La formación del gel se efectúa por adición de una solución alcalina.

Por último, Ditizio et al. (Biomaterials, 19 (1998) 1877-1884) describe un hidrogel liposomal. El gel se forma cambiando el pH.

Todos estos liposomas microencapsulados de la técnica anterior se basan en que las enzimas efectúan la liberación de compuestos de los liposomas o no muestran características de liberación deseables. Además, la eficacia de encapsulación de los métodos de la técnica anterior es normalmente demasiado baja.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar un nuevo sistema de administración inyectable, aceptado por el paciente, de liberación de ingredientes activos, tales como fármacos proteicos u otros fármacos, seguro y biodegradable, y que tiene una cinética de administración controlable. El periodo en el que debe garantizarse la administración del fármaco depende del ingrediente activo usado, que es preferiblemente un fármaco proteico, y varía desde varios días a más de un año. Además, deben obtenerse altos grados de carga en el sistema de administración. Además, el sistema de la presente invención debe producirse sin necesidad del uso de disolventes orgánicos.

Es otro objetivo de la invención proporcionar un método para la preparación de sistemas coloidales microencapsulados, tales como liposomas, cuyos sistemas coloidales pueden estar asociados con un ingrediente activo, cuyos sistemas coloidales microencapsulados muestran un perfil de liberación deseable, es decir, una alta liberación de ingrediente activo (preferiblemente más del 85%), un perfil de liberación por pulsos con un tiempo de retraso adecuado, mientras que estos perfiles de liberación se pueden controlar con el método de preparación. El perfil de liberación deseable debe mantenerse también para el ingrediente activo que puede estar asociado con los sistemas coloidales. La definición de un tiempo de retraso adecuado depende del tipo de aplicación. Cuando se usan vacunas como ingrediente activo, un tiempo de retraso adecuado es entre dos semanas y un año, preferiblemente 1-3 meses.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar tal método que permita una alta eficacia de encapsulación de los sistemas coloidales, es decir, una eficacia de encapsulación de más del 80%, preferiblemente más del 90%.

Sumario de la invención

La presente invención se dirige a una combinación de sistemas coloidales e hidrogeles usados para la liberación controlada de ingredientes activos.

Los sistemas coloidales adecuados que se pueden usar en la presente invención son liposomas; iscoms; poliplexos, es decir, combinaciones de polímeros (catiónicos) y ADN; lipoplexos, es decir, combinaciones de lípidos (catiónicos) y ADN; nanopartículas, es decir, esferas basadas en polímeros en el intervalo de tamaño de manómetros; partículas sólidas de lípidos en el intervalo de tamaño coloidal (véase, por ejemplo, R.H. Muller et al., Pharm. Research 14 (1997) 458-462); emulsiones, tales como sistemas similares a intralípidos; cualquier otra entidad en el intervalo de tamaño coloidal con una baja solubilidad en agua; y combinaciones de los mismos.

Las combinaciones de sistemas coloidales e hidrogeles de acuerdo con la presente invención se ilustrará a continuación en este documento usando liposomas como sistema coloidal. Debe apreciarse que donde se mencionen liposomas a continuación en este documento, estos liposomas pueden sustituirse con cualquier de los sistemas coloidales adecuados mencionados anteriormente, sin desviarse del espíritu de la invención.

Los problemas mencionados anteriormente se solucionan con un método de preparación específica de sistemas de liberación controlada, tales como microesferas, en las que se usa agua como disolvente. El uso de agua como único disolvente es ventajoso desde un punto de vista ambiental, por consideraciones toxicológicas y, especialmente, por razones de estabilidad de las proteínas.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para la preparación de un sistema de liberación controlada que comprende:

(a) formar un sistema acuoso de dos fases con dos polímeros solubles en agua y agua y al menos una entidad liberable, tal como un liposoma u otro sistema coloidal, siendo los dos polímeros solubles en agua incompatibles en solución, siendo al menos uno de estos polímeros reticulable, estando la fase del polímero reticulable emulsionada en la otra fase de polímero; y siendo al menos una entidad liberable soluble o dispersable en la fase del polímero reticulable en la solución acuosa;

(b) permitir que la entidad liberable se distribuya en la fase del polímero reticulable; y

(c) reticular el polímero reticulable.

En una realización preferida, la reticulación se realiza en tal medida que los poros (malla) en la estructura reticulada que se forma al final es sustancialmente menor que el tamaño de la entidad liberable.

Emulsionando un polímero acuoso reticulable en una fase continua comprendida por agua y un polímero que no es compatible con el polímero reticulable, y reticulando la fase discontinua, se forman las partículas. El tamaño de partícula de las partículas de polímero reticulado puede ajustarse cambiando la viscosidad de una o ambas fases, por ejemplo, seleccionando polímeros de diferente peso molecular, o cambiando la relación de volumen de ambas fases (véase por ejemplo, Stenekes et al., Pharm. Res 15 (1998) pág. 557-561, estando su incorporado en este documento por referencia). De esta forma se puede obtener una distribución estrecha de tamaño de partícula, como se describe a continuación en este documento con más detalle.

En otro aspecto, la presente invención se dirige a microesferas, teniendo al menos el 80% en peso de las mismas un tamaño de partícula de entre 100 nanómetros y 100 \mum, cuyas esferas están comprendidas por un polímero degradable reticulado que encapsula al menos una entidad liberable, tal como un liposoma, siendo el tamaño del poro del polímero reticulado igual o preferiblemente menor que el tamaño de la entidad liberable. Estas microesferas se pueden obtener usando el proceso de la invención, y no tienen disolventes orgánicos. Dependiendo de las aplicación de las microesferas, el tamaño puede ajustarse, por ejemplo, entre 1 y 50 \mum, preferiblemente entre 2 \mum y 25 \mum, tal como entre 5 y 15 \mum.

Cuando el tamaño del poro o la malla del polímero reticulado es igual o menor que el tamaño del diámetro hidrodinámico del componente liberable, el componente liberable se libera esencialmente cuando el polímero se degrada. Más en particular, en esta realización, la estructura reticulada debe ser degradable en el cuerpo del ser humano o de un animal, de forma que la entidad liberable encapsulada pueda salir de la matriz reticulada. Si, por otro lado, el tamaño del poro o la malla del polímero reticulado es mayor que el tamaño del componente liberable, el componente liberable se libera al menos parcialmente por difusión. De esta forma, el tamaño de poro del producto reticulado obtenido con el proceso de la presente invención proporciona una herramienta perfecta para controlar la liberación. Además, la eficacia de la incorporación de una entidad liberable en tal estructura polimérica es muy alta, mientras que el grado de carga puede ajustarse hasta la concentración de saturación de la entidad a liberar.

La degradabilidad de la estructura reticulada puede regularse de distintas maneras. Como primer ejemplo, debe apreciarse que pueden incorporarse enlaces, que son hidrolizables en condiciones fisiológicas. Con respecto a esto, se puede hacer referencia a la solicitud de Patente Europea 96201821,4 y al documento WO-A-97/00170, cuyo contenido se incorpora a este documento por referencia. Estas solicitudes de patentes muestran hidrogeles que comprenden espaciadores hidrolíticamente lábiles entre distintas cadenas poliméricas. Los espaciadores hidrolíticamente lábiles descritos en ese documento pueden usarse apropiadamente en la presente invención y las solicitudes de patente mencionadas anteriormente se incorporan en este documento por referencia.

Otro ejemplo para controlar la degradabilidad es la coencapsulación de una enzima o sustancia química capaz de romper enlaces en el polímero reticulado. En una realización preferida del proceso de la presente invención el polímero reticulable es un polímero de dextrano. En esta realización se puede añadir una dextranasa al sistema acuoso de dos fases antes de la etapa de reticulación o añadirse después.

El polímero de dextrano puede usarse adecuadamente en el proceso de la presente invención junto con Pluronic® o un polietilenglicol, prefiriéndose este último polímero en el proceso de la presente invención.

El producto objetivo de la presente invención se puede separar de la otra fase de polímero usando técnicas convencionales, por ejemplo centrifugación y decantación.

En una primera etapa del proceso de la presente invención se forma un sistema acuoso de dos fases. Este sistema de dos fases comprender agua, y al menos dos polímeros solubles en agua, que son incompatibles en solución. Preferiblemente también hay presente una entidad para liberar, aunque es posible añadir la entidad a liberar después de la etapa de reticulación. Sin embargo, los sistemas coloidales usados en la presente invención son generalmente demasiado grandes para entrar en las microesferas después de la etapa de reticulación en cantidad suficiente, en particular cuando se usan liposomas como sistema coloidal. Por lo tanto, se prefiere añadir estos sistemas coloidales antes de la etapa de reticulación. Al menos uno de los polímeros presentes en la fase acuosa es química o físicamente reticulable, y la fase del polímero reticulable se emulsiona en la otra fase de polímero acuoso.

Los polímeros usados pueden seleccionarse dependiendo de la naturaleza de la entidad a liberar. Se prefiere que la entidad a liberar tenga una clara preferencia por la fase de polímero reticulable. En ese caso, se puede obtener el mayor grado posible de carga en las microesferas, teóricamente hasta la concentración de saturación.

La elección del polímero reticulable utilizado no es crítica. Sin embargo, si se pretende introducir el sistema de liberación controlada que comprende el polímero en forma reticulada en un cuerpo de un ser humano o un animal, el polímero debe ser farmacéuticamente aceptable y preferiblemente debe ser degradable. Algunos polímero reticulables solubles en agua adecuados son dextranos y dextranos derivatizados, almidones y derivados de almidones, derivados de celulosa tales como hidroxietil e hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, proteínas y proteínas derivatizadas, etc. El peso molecular del polímero reticulable está normalmente entre 1.000 y 1.000.000 Da. Se aprecia que con un mayor peso molecular del polímero, se obtiene generalmente una mejor separación de fases en la solución acuosa usada en el proceso de la invención.

El especialista en la técnica tiene el conocimiento para seleccionar el polímero reticulable y las condiciones de reticulación requeridas para la emulsión preparada. Por ejemplo, los dextranos pueden reticularse con metacrilato o grupos metacrilato. Otro ejemplo es un sistema que comprende PVP como fase externa y dextrano como fase emulsionada, en el que el dextrano se reticula mediante la presencia de isocianatos.

Adicionalmente, se hace referencia a la reticulación usando radiación. El Dex-MA (dextrano derivatizado con metacrilato) puede polimerizarse, por ejemplo, usando pequeñas dosis de radiación \gamma, tal como menos de 0,1 Mrad. Una ventaja de esta realización es que se pueden obtener micropartículas estériles en una etapa. Además, la reticulación con radiación UV y la reticulación física usando, por ejemplo, colas hidrófobas acopladas a un polímero son técnicas posibles.

En una realización preferida, el polímero reticulable es un polímero sensible a la temperatura tal como poli-N-isopropilacrilamida, que puede, por ejemplo, estar presente como injerto en otro polímero tal como dextrano. Los hidrogeles de estos polímeros muestran un mayor comportamiento de inflamación a menores temperaturas. Esto hace posible que el material liberable pueda penetrar fácilmente en el hidrogel después de la reacción de reticulación. Aumentando posteriormente la temperatura, por ejemplo a un valor de 37ºC, las mallas del hidrogel encogen, capturando por tanto la entidad liberable.

El polímero que está presente en la fase acuosa continua puede ser cualquier polímero que sea incompatible con el polímero reticulable. Este polímero también puede ser reticulable, pero por supuesto no con las condiciones de reacción usadas para la reticulación de la fase discontinua de polímero, esto no se prefiere. Algunos ejemplos de polímeros incompatibles con el polímero a reticular son poli(etilenglicol) (PEG) y poli(alcohol de vinilo) (PVA) (en combinación con, por ejemplo, dextranos y derivados de dextrano, almidones y derivados de almidón, PVP, y derivados de celulosa solubles en agua).

La liberación de la entidad liberable depende de diversas variables que pueden usarse para ajustar la administración según se desee. Una de estas variables en el tamaño de las microesferas. El tamaño puede ajustarse modificando cuidadosamente las circunstancias del proceso y los parámetros de formulación en la etapa de emulsión. Por ejemplo, el contenido en agua, la presencia de grupos hidrófobos en cualquier de los polímero o mezclas de polímeros usadas, la viscosidad de la fase continua y discontinua, y la carga eléctrica en al menos dos polímeros usados son algunos ejemplos de herramientas para ajustar el tamaño de las microesferas o micropartículas a producir. Además, pueden añadirse emulsionantes. Los emulsionantes adecuados con copolímeros, preferiblemente copolímeros de bloque, de unidades de los dos polímeros incompatibles, por ejemplo, un copolímero de bloque de PEG y dextrano, usado para crear el sistema de dos fases.

Para garantizar adicionalmente un liberación controlada, el polímero reticulado debe ser preferiblemente degradable.

Como se ha mencionado en este documento anteriormente, es importante que los dos polímero solubles en agua sean incompatibles el uno con el otro, de forma que se obtiene un sistema de dos fases después de que los dos polímeros se han añadido el uno al otro en una solución acuosa. Si se obtiene o no un sistema de dos fases depende no solo de la naturaleza de los dos polímeros implicados, sino también de las condiciones en las que son añadidos. Los factores que son relevantes en este sentido son el peso molecular de los polímeros, sus concentraciones en la solución acuosa, la temperatura a la que son añadidos el uno al otro y factores similares. Es parte de las habilidades convencionales del especialista determinar un diagrama de fase para cualquier combinación de polímeros que se pueda usar, y de esta forma seleccionar condiciones adecuadas para obtener una separación de fases.

En la Fig. 8 adjunta se muestra como ejemplo un diagrama de fase de un sistema ternario de agua/PEG/dextrano. Cuando la composición de partida está por debajo de la (- - -) binodal, hay presente un sistema de una fase, mientras que por encima de la binodal, se forman dos fases coexistentes: una rica en polímero 1 (composición x_{1}) y la otra rica en polímero 2 (composición x_{2})- x_{1} y x_{2} están conectadas mediante un enlace (________). Todos los sistemas preparados usando composiciones de partida en el mismo enlace se separan en fases de composición constante. Para una composición de partida dada, la relación en volumen de las fases coexistentes x_{1}/x_{2} es igual a y_{2}/y_{1}.

Como se ha indicado anteriormente en este documento, la entidad liberable puede ser un fármaco proteico. Sin embargo, también es posible encapsular un fármaco o antígeno u otros agentes activos que contienen sistemas coloidales, tales como nanopartículas o micropartículas, por ejemplo liposomas e iscoms. La encapsulación de este tipo de partículas tiene la ventaja de evitar una liberación demasiado rápida de la entidad encapsulada, o dicho en otros palabras, los efectos de ráfaga pueden evitarse de una forma más segura.

Los sistemas coloidales microencapsulados obtenidos con el método de la invención comprenden una matriz de un polímero degradable en el cual están presentes los sistemas coloidales, tales como liposomas. Los ingredientes activos pueden estar presentes en los sistemas coloidales. Es una ventaja considerable de la presente invención que estos ingredientes activos pueden seleccionarse en principio independientemente de su compatibilidad con la matriz polimérica, es decir, no se requiere que los ingredientes activos sean solubles o dispersables en la matriz, dado que es suficiente que estos ingredientes activos sean compatibles con el sistema coloidal. Esto permite la preparación de sistemas de liberación que comprenden ingredientes activos que solo podrían incorporarse con dificultad, o con medidas adicionales, en los sistemas de liberación de la técnica anterior.

De esta manera, el método de la invención permite a las microesferas, por ejemplo, la liberación retrasada o por pulsos de todo tipo de ingredientes activos. Cuando se usan liposomas como sistemas coloidales, la presencia de la capa de la membrana de lípidos bimolecular permite la incorporación de sustancias hidrófobas, que no se podrían incorporar en sistemas de hidrogel convencionales. Estas sustancias hidrófobas pueden incorporarse en, o asociarse con la bicapa de lípidos.

Algunos ejemplos de partículas coloidales a encapsular son: iscoms, lipoplexos, poliplexos, nanopartícula y liponanopartículas sólidas.

Los iscoms pueden liberarse de las microesferas lentamente o por pulsos. Esto permite al diseñador de vacunas manipular la respuesta inmune inducida por los iscoms que contienen antígenos. Por ejemplo, si se desea una revacunación, la microesferas pueden inducir un efecto de revacunación mediante la liberación por pulsos de los iscoms después de un tiempo de retraso predeterminado.

Se puede desear tener acceso a sistemas de administración que liberan poliplexos y lipoplexos (complejos de material genético y (mezcla) o (mezclas) de polímeros en condensación de una forma controlada. Las microesferas son capaces de hacer eso.

Lo mismo se aplica a nanopartículas y lipoesferas, que pueden cargarse con material o antígenos terapéuticamente activos. Las nanopartículas son partículas coloidales basadas en, por ejemplo, policianoacrilatos. Las nanopartículas sólidas de lípidos son partículas coloidales basadas en lípidos que están en fase sólida a la temperatura del cuerpo. Las nanopartículas son nanopartículas sólidas de lípidos que pueden liberarse de las microesferas en patrones similares a los liposomas. La liberación del fármaco de estas partículas coloidales depende de sus componentes y de las condiciones de fabricación.

Además, incorporando el ingrediente activo en el sistema coloidal, el ingrediente activo se protege de las reacciones que tienen lugar durante la etapa de polimerización posterior, cuyas reacciones pueden causar una oxidación no deseada del ingrediente activo.

Con el método de la invención, es posible proporcionar microcápsulas que comprenden 10% o más del sistema coloidal. Normalmente, la cantidad de sistema coloidal incorporado será de aproximadamente 5-10% en peso, pero esta cantidad variará con las condiciones específicas usadas.

La cantidad de ingrediente activo que puede incorporarse en total en la microesfera, como eficacia de esta incorporación, variará también fuertemente dependiendo de las condiciones de síntesis y la aplicación deseada. Por ejemplo, si se incorpora una proteína de membrana en un liposoma, se absorberá fácilmente en la bicapa de los liposomas. Estos liposomas pueden incorporarse en microesferas con altas eficacias, como se ha afirmado anteriormente. Por otro lado, una proteína hidrófila se incorporará en un liposoma de forma menos eficaz, teniendo como resultado un menor contenido en proteína de la microesfera final. Si se desean microesferas con un alto contenido de ingrediente activo, se puede usar un sistema coloidal más hidrófilo.

Normalmente, la cantidad de ingrediente activo presente en las microesferas preparadas con el método de la presente invención, será de aproximadamente 0,5-50 \mug de ingrediente activo/mg de material de microesfera.

La partición de la entidad a liberar se determina principalmente por la naturaleza de los polímeros presentes en el sistema acuoso de dos fases. Esta partición puede influenciarse, por ejemplo, añadiendo sal al sistema acuoso, o ajustando el pH.

Si las entidades liberables, tales como proteínas, están presentes durante la etapa de reticulación, se debe tener cuidado de asegurar la integridad de las entidades liberables. Por ejemplo, se debe evitar que se oxide el material proteico con sistemas inciadores, etc. En relación a esto, debe apreciarse que se los efectos adversos pueden evitarse o minimizarse minimizando la cantidad de iniciador, reduciendo el tiempo de polimerización o añadiendo antioxidantes adecuados, tales como \alpha-tocoferol.

La separación de las estructuras reticuladas que comprenden la entidad liberable de la otra fase se puede realizar de cualquier forma convencional. Preferiblemente, la separación se efectúa por filtración o centrifugación. Las estructuras reticuladas pueden lavarse con agua posteriormente y secarse. La etapa de secado determina que se pueda obtener un producto farmacéutico aceptable, con un periodo de conservación de más de 2 años. Un método de secado muy preferido es el secado con nebulizador, aunque también se puede realizar el secado de forma apropiada usando liofilización.

Breve descripción de las figuras

La Fig.1 muestra una distribución de volumen del tamaño de partícula de microesferas de dextrano preparadas mediante la técnica de emulsión agua-en-agua.

La Fig. 2 muestra un micrógrafo SEM de las microesferas de dextrano de la Fig. 1.

La Fig. 3 muestra el tamaño medio de volumen y peso de las microesferas de dextrano como una función del grado de sustitución MA y el peso molecular del PEG.

La Fig. 4 muestra el tamaño medio de volumen y peso de las microesferas de dextrano como una función del grado de sustitución MA y la concentración de la concentración acuosa de dex-MA.

La Fig. 5 muestra el efecto de la concentración y del peso molecular del pEG en el tamaño medio de volumen y peso de las microesferas de dextrano.

La Fig. 6 muestra los perfiles de liberación de microesferas de dextrano en degradación.

La Fig. 7 también muestra perfiles de liberación de microesferas de dextrano en degradación.

La Fig. 8 muestra un diagrama de fase de un sistema ternario de agua/PEG/dextrano.

La Fig. 9 muestra la liberación de liposoma en 3 lotes preparados individualmente de microesferas de dextrano a pH 7,2. Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 8, contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex: 40, liposomas 184 nm DPPC:DPPG:Chol (10:1:10).

La Fig. 10 muestra la liberación de la calceína libre, calceína total y fosfato liposomal a pH 8,0. Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 8, contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex: 40, liposomas DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) con (226 nm) y sin (184 nm) calceína.

La Fig. 11A muestra el efecto del tamaño del liposoma en las características de la liberación a pH 7,2. Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 8, contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex: 40, liposomas DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) 95 y 184.

La Fig. 11B muestra el efecto del tamaño del liposoma en las características de la liberación a pH 8,0. Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 8, contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex: 40, liposomas DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) 95 y 184.

La Fig. 12 muestra el efecto de la relación de volumen PEG/dex en las características de la liberación a pH 7,2. Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 8, contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex: 20, 40 y 80, liposomas DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) 184 nm.

La Fig. 13A muestra el efecto del contenido en agua en las características de la liberación de liposomas microencapsulados de acuerdo con la invención a pH 7,2, comparado con la liberación de microesferas de dexMA no degradables. Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 8, contenido en agua 70% y 50%, relación de volumen PEG/dex: 40. Liposomas DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) 184 nm.

La Fig. 13B muestra el efecto del contenido en agua en las características de la liberación a pH 7,2. Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 5 y 8, contenido en agua 70%, relación de volumen PEG/dex: 40. Liposomas DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) 184 nm.

La Fig. 14A muestra el efecto del grado de sustitución en las características de la liberación a pH 7,2. Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 5 y 8, contenido en agua 70%, relación de volumen: 40. tamaño del liposoma: 184 nm.

La Fig. 14B muestra el efecto del grado de sustitución en las características de la liberación a pH 8,0. Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados: DexHEMA DS 5 y 8, contenido en agua 70%, relación de volumen: 40. tamaño del liposoma: 184 nm.

La Fig. 15 muestra el efecto del derivado de dextrano en las características de la liberación a pH 7,2. Siendo la formulación de los liposomas microencapsulados: dexLactatoHEMA (DS 4) mono- y polidisperso, contenido en agua 70%, relación de volumen: 40, tamaño del liposoma: 184 nm.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método para la encapsulación de sistemas coloidales, tales como liposomas, en microesferas reticuladas.

Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que cuando las microesferas que comprenden sistemas coloidales se preparan de acuerdo a un método que comprende las etapas de:

a) proporcionar una mezcla acuosa de i) un primera fase que comprende un polímero reticulable soluble en agua, ii) una segunda fase que comprende un polímero soluble en agua que es incompatible en solución con el polímero de dicha primera fase, y iii) sistemas coloidales para suspender en dicha primera fase; formar una emulsión de dicha primera fase en dicha segunda fase, y

b) formar microesferas en la emulsión reticulando una parte de dicho polímero reticulable, formando de esta manera dichos sistemas coloidales microencapsulados,

se pueden superar los problemas mencionados en este documento anteriormente.

En una realización preferida, el método de la invención se realiza mezclando primero los sistemas coloidales con dicha primera fase y poniendo en contacto posteriormente esta mezcla con dicha segunda fase. Formando una premezcla poniendo en contacto dichos sistemas coloidales con dicha primera fase en la etapa a), y poniendo en contacto posteriormente esta premezcla con dicha segunda fase, los sistemas coloidales se pueden encapsular en las microesferas con eficacias de encapsulación muy altas.

Cuando los sistemas coloidales microencapsulados producidos de acuerdo con la invención, una gran parte de los sistemas coloidales se liberan intactas de las microesferas, produciendo un perfil de liberación deseable. En un intervalo de tamaño amplio, el perfil de liberación no se ve afectado por el tamaño de los sistemas coloidales utilizados. Además, el perfil de liberación puede ajustarse modificando ciertas etapas en el método de la invención, como se explicará a continuación en este documento.

La preparación de los sistemas coloidales microencapsulados, tales como liposomas, de acuerdo con la invención se realizan usando agua como fase continua, es decir, como disolvente o fase de dispersión. Esto es ventajoso desde un punto de vista toxicológico. Además, la ausencia de disolventes orgánicos evita la degradación de los sistemas coloidales y del ingrediente activo comprendido en los sistemas coloidales.

De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que los sistemas coloidales tales como liposomas pueden encapsularse en microesferas y especialmente en microesferas de dextrano con eficacias de encapsulación muy altas. Con el método de acuerdo con la invención, se pueden obtener una cantidad de sistemas coloidales añadidos a la mezcla inicial prácticamente completa, es decir, más del 85% en peso, preferiblemente más del 90% en peso.

Los sistemas coloidales se liberan intactas de las microesferas degradables y se puede obtener una liberación por pulsos. También se pueden obtener sistemas que muestran una liberación por pulsos después de la aplicación. El periodo de liberación en condiciones fisiológicas puede ajustarse de, por ejemplo, 6 días (dexLactatoHEMA DS 4, contenido en agua 70%, relación de volumen: 40) a, por ejemplo, 3 meses (dexHEMA DS 8, contenido en agua 50%, relación de volumen: 40). La liberación extrapolada de experimentos de liberación a pH 8,0 usando dexHEMA DS 16 en condiciones fisiológicas usando un contenido en agua de 50%, fue incluso mayor de 3 meses.

Generalmente, se observa un pulso más largo en microesferas con un menor contenido en agua y un mayor grado de sustitución debido a la degradación más lenta de la microesfera.

Generalmente, las microesferas de dexLactatoHEMA liberan sistemas coloidales más rápidamente que las de dexHEMA, porque el éster de lactato es más susceptible a la hidrólisis que el éster de carbonato.

El polímero reticulable utilizado debe ser farmacéuticamente aceptable y ser preferiblemente degradable. Algunos polímeros solubles en agua reticulables adecuados son dextranos y dextranos derivatizados, almidones y derivados de almidón, derivados de celulosa tales como hidroxietil e hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, proteínas y proteínas derivatizadas. Un polímero reticulable preferido es dextrano que comprende grupos reticulables. Los grupos reticulables preferidos son grupos metacrilato, seleccionando los polímeros de dextrano más preferidos entre el grupo compuesto por dexMA, dexHEMA y dexLactato-EMA.

El proceso de la presente invención se ilustrará adicionalmente a continuación en este documento con la preparación de microesferas de dextrano que comprenden liposomas como sistema coloidal, usando la técnica de emulsión de agua-en-agua.

Ejemplos

Los liposomas microencapsulados de la invención se ilustrarán a continuación con los siguientes ejemplos no limitantes, con referencia a las Figuras 9-15.

Ejemplo 1

Se obtuvieron polietilenglicoles (PEG) con distintos pesos moleculares de Merck-Schuchardi, Alemania. Se sintetizaron dextranos derivatizados con metacrilato (dex-MA) con distintos DS (grados de sustitución; el número de grupos metacrilato por 100 restos glucopiranosa) mediante una reacción de acoplamiento de dextrano T40 y metacrilato de glicidilo en DMSO (dimetilsulfóxido) usando DMAP (N,N-dimetilamino-piridina) como catalizador, esencialmente como ha descrito Van Dijk-Wolthuis et al. en Macromolecules 28, (1995) 6317-6322.

El Dex-PEG se sintetizó como se indica a continuación. Se disolvieron mPEG (monometoxi-polietilenglicol, M 5000 g/mmol, 5 g, que corresponde a 1 mmol de grupos hidroxilo) y CDI (carbonildiimidazol, 162 mg, 1 mmol) en 100 ml de tetrahidrofurano anhidro. La solución se agitó durante una noche a temperatura ambiente, seguido de la evaporación del disolvente a presión reducida. Después, el mPEG activado con CI (carbonilimidazol) se añadió a una solución de dextrano T40 (1,7 g) y DMAP (0,35 g) en 50 ml de DMSO. Esta solución se agitó durante una semana a temperatura ambiente. Después de la neutralización del DMAP con HCl, la solución se dializó exhaustivamente en agua y posteriormente se liofilizó. El producto se caracterizó por cromatografía de permeación por gel y RMN. El grado de sustitución ascendía a 3. El dex-lactato-HEMA (DS 3) se sintetizó como se describe en la solicitud pendiente de Patente Europea Nº 96201821.4.

El polietilenglicol (PEG, distinto peso molecular) se disolvió en KCl 0,22M a una concentración de 12-40% (p/p) . Se disolvió Dex-MA en KCl 0,22M a una concentración de 10-40% (p/p). Ambas soluciones se lavaron con nitrógeno durante 10 minutos. Después se mezclaron 4,75 ml de la solución de PEG y 0,25 ml de la solución de dex-MA y se agitó vorticialmente (Winn Vortex-Genie, máxima velocidad) durante 1 minuto teniendo como resultado una emulsión agua-en-agua con dextrano como fase interna y PEG como fase externa. Después de 10 minutos se añadieron ((N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina, 100 \mul, 20% (v/v) en KCl 0,22M, pH ajustado con HCl concentrado a 7,2) y KPS (peroxidisulfato de potasio, 180 \mul, 50 mg/ml en agua). La emulsión se incubó durante 30 minutos a 37ºC para polimerizar el dex-MA. Las microesferas se lavaron dos veces con agua y se liofilizaron.

Se demostró usando cultivos celulares in vitro que la citotoxicidad del dex-MA es baja, similar a la citotoxicidad del dextrano, compuesto que se ha usado durante años como agente de sustitución del plasma en seres humanos.

El tamaño de partícula (tamaño de peso en número (=Snd/Sn) y tamaño de volumen en número (=Snd^{4}/Snd^{3}), I.C. Edmundson, Particle-size analysis, H.S. Bean, A.H. Beckett y J.E. Carles (eds) en: Advances in Pharmaceutical Sciences vol. 2, Academic Press, London 1967, 95-174) y la distribución del tamaño de partícula se calcularon con una técnica de bloqueo de luz láser (Accusizer™, model 770, Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA, USA). Las características de forma y superficie (porosidad) de las microesferas se estableció mediante un análisis de microscopia electrónica de barrido (SEM).

La Figura 1 da un ejemplo representativo de la distribución del tamaño de partícula en un lote de microesferas de dextrano preparado con la técnica de emulsión agua-en-agua determinada usando el Accusizer. El análisis mostró que las partículas son perfectamente esféricas y no porosas (Figura 2).

La Figura 3 muestra el tamaño medio de volumen y peso de microesferas de dextrano como una función del grado de sustitución MA y el peso molecular del PEG. La concentración de la solución de PEG fue del 24% (p/p); la concentración de la concentración de dex-MA fue 20%. Se muestra que el tamaño de partícula aumenta con la reducción del peso molecular del PEG. Con un peso molecular del EPEG fijo, el tamaño de partícula se reduce ligeramente al aumentar el DS.

\newpage

La Figura 4 muestra el tamaño medio de volumen y peso de microesferas de dextrano como una función del grado de sustitución MA y la concentración de la concentración acuosa de dex-MA. El diámetro medio aumenta al reducir la concentración de dex-MA.

La Figura 5 muestra el efecto de la concentración y el peso molecular del PEG en el tamaño medio de volumen y peso de las microesferas de dextrano. Para esta evaluación, se usó dex-MA con una DS de 8 en KCl 0,22M (20%, p/p). Parece que para un PEG dado, las partículas más grandes se obtuvieron con una concentración de PEG de aproximadamente 24%.

Ejemplo 2

Se prepararon microesferas con las siguientes formulaciones usando el protocolo dado en el Ejemplo 1 y usando las siguientes soluciones stock

Soluciones stock (% en p/p) en KCl 0,22M:

A. PEG 10.000, 24%

B. PEG 20.000, 24%

C. Dex-MA (DS 13), 20%

D. Dex-lactHEMA (DS 3) 20%

E. Dex-lactHEMA (DS 3) 10%

F. Dex-PEG 20%

1

Como puede verse, un emulsionante adecuado (copolímero en bloque de dextrano y PEG) da partículas más pequeñas con una menor dispersión (= diámetro peso medio/diámetro número medio).

Ejemplo 3

Se evaluó la liberación de una proteína modelo con microesferas de dextrano no degradables y con microesferas degradables. Las microesferas se hicieron degradables por incorporación de dextranasa en las microesferas de
dex-MA.

Se disolvió dex-MA (DS 8) en tampón fosfato 10 mM pH 8,0. A 2 ml de esta solución se añadió una cantidad fija de IgG (Inmunoglobulina G, 25,6 mg) y una cantidad variable de dextranasa (Sigma D1508; 0, 0,1 y 1 U (1 U libera 1 \mumol de oligosacáridos reductores por minuto a 37ºC y pH 6,0)). Esta solución se emulsionó en una solución acuosa de PEG (10.000 M, concentración 24% (p/p)) en KCl 0,22M. A continuación, añadió TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina, 100 \mul, 20% (v/v) en KCl 0,22M, pH ajustado con HCl concentrado a 7,2) y KPS (peroxidisulfato de potasio, 180 \mul, 50 mg/ml en agua). Las microesferas se lavaron con agua y se secaron con un caudal de nitrógeno.

\newpage

Se suspendió una cantidad medida con precisión (0,3-0,5 g) de microesferas en 10 ml de tampón fosfato pH 5,5 y se calculó la cantidad de proteína liberada usando en ensayo de proteínas biorad (M. Bradford. Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254). La Figura 6 muestra los perfiles de liberación. En esta figura, es evidente que la liberación de IgG de las microesferas de dextrano se puede modular con dextranasa.

Ejemplo 4 (Ejemplo de Referencia)

Se evaluó la liberación de una proteína modelo (IgG) en microesferas de dextrano degradables. La degradación se estableció por incorporando dextranasa en las micropartículas.

Se disolvió dextrano derivatizado con metacrilato (DS=8; 138 mg) en 612 \mul de tampón (fosfato 10 mM, KCl 220 mM, pH 8,0). A continuación, se añadieron 250 \mul de una solución acuosa de IgG (50 mg/ml) y 250 \mul de una solución acuosa de dextranasa (concentración variable). La IgG y la dextranasa se disolvieron en la misma solución tampón (fosfato 10 mM, KCl 220 mM, pH 8,0). Después, se añadieron 500 \mul de la solución de dexMA, IgG y dextranasa a 50 ml de una solución acuosa de PEG (peso molecular 10.000 g/mol, concentración 17,5, 24 ó 30% p/p) en la misma solución tampón. Estos sistemas de fases separadas se agitaron vorticialmente durante 1 minuto, seguido de la adición de 180 \mul de peroxodisulfato de potasio (50 mg/ml; disuelto en tampón fosfato) y TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina, 20% v/v, pH ajustado a 8,0 con HCl). Después, las muestras se incubaron durante 30 minutos a 37ºC para polimerizar el DexMA. Las partículas se recogieron por centrifugación y se lavaron con agua. Las partículas se resuspendieron en solución tampón (NH_{4}Ac 5 mM, pH 5,5) y se incuban a 37ºC. Periódicamente, se toman muestras y se analiza su contenido en proteínas (ensayo Biorad). La Figura 7 muestra los perfiles de liberación. Se puede apreciar que, en ausencia de dextranasa, la liberación acumulativa fue menor del 10%, indicando que el diámetro hidrodinámico de la proteína era mayor que el tamaño de malla del hidrogel. Además, la velocidad de liberación aumenta al aumentar la cantidad de dextranasa en las partículas. Una mayor cantidad de dextranasa en las partículas tuvo como resultado una menor velocidad de degradación. Esto significa que la liberación de las proteínas comprendidas en las partículas de dextrano se puede modular con la velocidad de degradación de la matriz del hidrogel. La degradación puede establecerse por adición de una enzima (dextranasa) o por introducción de espaciadores hidrolíticamente lábiles (por ejemplo ésteres de lactato) en la reticulación.

Ejemplo Comparativo

Se disolvieron 5 gramos de dextrano en el que las cadenas de dextrano ser derivan con grupos metacrilato con un peso molecular de 40.000 en 45 ml de agua.

A temperatura ambiente, la primera solución se añadió a la segunda solución con agitación. El resultado fue un sistema de una fase, en el que no se podían formar microesferas. Este ejemplo ilustra la necesidad de seleccionar el peso molecular y las concentraciones de los materiales de partida de forma de se obtenga un sistema de dos fases.

En los siguientes Ejemplos 5-0, se usaron los materiales que se indican a continuación.

Materiales relacionados con el polímero

El PEG 10.000 (M_{w} 12.000; M_{n} 8.00) y el peroxodisulfato de potasio se obtuvieron en Merck (Darmstadt, Alemania). Dex 40.000 (M_{w} 38800; M_{n} 16400) y N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina se compraron en Fluka (Buchs, Suiza). M_{w} y M_{n} se refieren al peso medio molecular en peso y número, respectivamente (calculado por GPC). El dextrano derivado con metacrilato (dexMA) con un grado de sustitución (DS: el número de grupos MA por 100 unidades de monómero de glucopiranoil de dextrano) de 10 se preparó como describe Ban Dijk-Wolthuis et al. en Macromolecules 28 (1995), 6317-6322. El dextrano derivatizado con metacrilato de hidroxietilo (dexHEMA) con distintos DS se preparó como describe Van Dijk-Wolthuis et al.. Los grados de sustitución determinados por ^{1}H-RMH fueron 5, 8 y 16. El dextrano derivatizado con lactato de HEMA monodisperso y polidisperso (dexLactateHEMA) se preparó de acuerdo con Cadée et al. (Polymer 40 (1999) 6877-6881) y Van Dijk-Wolthuis et al. y ambos tenían un DS de 4.

Materiales relacionados con los liposomas

La dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y el diapalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) fueron donados por Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemania). El colesterol y la calceína se obtuvieron en Sigma (Rockford, IL, USA). El cloroformo y el metanol (p.a.) se compraron en Merck (Darmstadt, Alemania).

Ejemplo 5

Se prepararon liposomas DPPC:DPPG:Chol (10:1:10) por hidratación de la película de lípidos como describe Crommelin et al. ("Liposomes", en Kreuter, J. (ed.). Colloidal Drug Delivery Systems Inc. Marcel Dekker (1994), pág 73-190), con y sin calceína, una marcador acuoso usado a una concentración de 80 mM como ingrediente activo. La incorporación de calceína se describe en Gregoriadis (ed.), "Liposome Technology", Vol. I, II y III, 1ª y 2ª edición, CRC Press, Boca Raton, FL, (1984, 1993).

Se usó tampón HEPES 10 mM (N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[ácido 4-butano sulfónico) que contenía NaCl al 0,8%, pH ajustado a 7,2 como medio acuoso (concentración total de lípidos 81 mM). Posteriormente, los liposomas se extruyeron a través de filtros de policarbonato de 0,6, 0,2, 0,1 y 0,05 \mum para obtener el tamaño deseado. Los liposomas que contenían calceína se lavaron por ultracentrifugación para retirar la calceína no incorporada. El contenido de fosfolípidos se midió por determinación de fosfato de acuerdo con Rousser et al. ("Two-dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorous analysis of spots", Lipids 5 (1970) 494-496). El tamaño medio de partícula se calculó por dispersión de luz dinámica (DLS). El tamaño, índice de polidispersión y contenido de fosfato o calceína de los liposomas preparados se presentan en la Tabla 2.

TABLA 2

2

Ejemplo 6

Se prepararon liposomas encapsulados mezclando los liposomas preparados en el Ejemplo 5 con una solución acuosa de dexMA en solución tampón HEPES 10 mM. Se produjeron dos lotes, uno con calceína presente en los liposomas, y otro sin calceína. También se preparó una solución acuosa de PEG en solución tampón HEPES 10 mM. Ambas soluciones se lavaron abundantemente con nitrógeno durante 10 minutos antes de añadir los liposomas y se pasaron posteriormente a un vial de escintilación (peso total 5 g). El sistema de dos fases resultante se agito vorticialmente de forma enérgica durante 60 seg para crear una emulsión de agua-en-agua. Después, la emulsión se dejó estabilizar durante 10-15 minutos (condiciones ambiente), seguido de la adición de TEMED (100 \mul, 20% v/v, ajustado a pH 7 con HCl 4M) y KPS (180 \mul, 50 mg/ml). Este sistema se incubó 30 minutos a 37ºC para polimerizar los grupos metacrilato acoplados a las cadenas de dextrano. Posteriormente, la fase de PEG se retiró por múltiples etapas de lavado y centrifugación. El tamaño de partícula y la distribución de tamaño se midieron con una técnica de bloqueo de luz láser (Accusizer™).

Se prepararon lotes diferentes usando distintos tamaños de liposoma (95, 184 y 370 nm), contenidos de agua en la microsfera (50-70%) y relaciones de volumen PEG/dex (20-80).

La eficacia de encapsulación de liposomas en las microesferas se definió como la cantidad de liposomas en las microesferas divida por la cantidad de liposomas añadidos al sistema de dos fases. La cantidad de liposomas en las microesferas se determinó midiendo la concentración de fosfolípidos en el gránulo de la microesfera usando la determinación por fosfato de acuerdo con Rousser et al.. (Lipids 5 (1970) 494-496).

La eficacia de encapsulación fue muy reproducible. Para 5 muestras preparadas de forma independiente (formulación: dex-MA DS 10, contenido en agua: 70%, relación de volumen, 40: tamaño del liposoma: 184 nm), la eficacia de encapsulación fue del 94,4%. En este caso los liposomas se mezclaron con la fase de dextrano antes de la adición a la fase de PEG, de acuerdo con una realización preferida de la invención. Cuando los liposomas se añadieron al sistema de fases separadas, esto tuvo como resultado una eficacia de encapsulación del 88,1%. De esta forma, mezclar antes los liposomas con la fase de dextrano tuvo como resultado una mayor eficacia de encapsulación.

Se estudiaron los efectos del tamaño del liposoma, contenido en agua de la microesfera y relación de volumen PEG/dex en la eficacia de encapsulación, y se presentan en la Tabla 3.

TABLA 3

3

En la Tabla 3 es evidente que, en la mayoría de los casos, la eficacia de encapsulación es próxima al 100%. No parece que haya relación entre el tamaño del liposoma y la eficacia de encapsulación (para cualquier contenido de agua y/o relación de volumen). Se esperaba que la eficacia de encapsulación aumentarse al usar liposomas más granes, pero aparentemente, incluso los liposomas más pequeños estaban atrapados completamente en la matriz de dextrano. Se esperaba una mayor eficacia de encapsulación con un contenido menor de agua, ya que un menor contenido en agua tiene como resultado poros más pequeños en el hidrogel. Sin embargo, la Tabla 3 muestra que no hay relación entre el contenido en agua y la eficacia de encapsulación. Para una relación de volumen de 80, la eficacia de encapsulación es ligeramente menor, ya que una relación grande de PEG/dex resulta en un volumen pequeño de fase de dextrano y por lo tanto los liposomas no pueden encapsulares tan bien.

Ejemplo 7

Se repitió el Ejemplo 6 usando dexHEMA en lugar de dexMA como polímero reticulable. Todas las otras etapas fueron iguales.

Ejemplo 8

Se repitió el Ejemplo 6 usando dexLactateHEMA en lugar de dexMA como polímero reticulable. Todas las otras etapas fueron iguales.

Ejemplo 9

La liberación de liposomas de las microesferas se midió incubando las microesferas resuspendidas (en tampón HEPES 10 mM del pH deseado) a 37ºC. En los instantes de tiempo deseados y después de la centrifugación (10 min, 4.500 rpm), se retiró todo el sobrenadante. El gránulo de la microesfera se resuspendió en 10 ml de solución tampón fresca y se devolvió al banco de rodillos. La cantidad de liposomas en el sobrenadante se calculó por determinación con fosfatos de acuerdo con Rousser et al. (Lipids 5 (1970) 494-496). Se estudió la integridad de los liposomas liberados usando liposomas que contenían calceína y determinando la fluorescencia (\lambda_{ex}=485, \lambda_{em}=512 nm) del sobrenadante no tratado y del sobrenadante tratado con tritón X-100. Dada la alta concentración de calceína dentro de los liposomas, se produce una inactivación, resultando en una baja señal fluorescente en liposomas intactos. Si se libera calceína en el medio circundante, la calceína se diluye teniendo como resultado una mayor señal fluorescente. El tratamiento con tritón X-100 tiene como resultado la destrucción de los liposomas y la liberación de toda la calceína. La diferencia entre la liberación de calceína libre y la liberación de la calceína total (después del tratamiento con tritón X-100) se usó para determinar la cantidad de liposomas intactos liberados.

La mayoría de formulaciones mostró un comportamiento de liberación por pulsos. En la Figura 9, se presenta la curva de liberación de una muestra preparada en el Ejemplo 2. Esta Figura muestra que la liberación de liposomas de las microesferas de dextrano es muy reproducible (n=3). La pendiente de la curva sugiere la degradación en masa de las microesferas. Inicialmente, solo se libera aproximadamente el 10% de los liposomas presentes en la superficie de las microesferas. La hidrólisis de las microesferas tiene como resultado en un mayor tamaño del poro y después de un tiempo de retraso de aproximadamente 18 días se liberaron el resto de liposomas, dando un 100% de recuperación.

Para comprobar si los liposomas se habían liberado intactos, se estudió la liberación de los liposomas que contenían calceína. En la Figura 19, se presentan las curvas de liberación de la calceína libre, la calceína total, calceína liposomal y fosfato de una muestra del Ejemplo 2. Es evidente que apenas se libera calceína libre. Sin embargo, después de tratar las muestras con triton X-100, se mide una alta fluorescencia, indicando que la calceína estaba todavía dentro de los liposomas. Además, las curvas de liberación determinadas por determinación con fosfato y fluorescencia de calceína son bastante similares. Esto indica que los liposomas se liberan de las microesferas intactas. Esto se confirmó también con medidas de dispersión de luz dinámica (DLS) de los liposomas liberados, cuyos resultados se dan en la Tabla 4.

TABLA 4

4

En la Tabla 4, es evidente que el tamaño de partícula después de la liberación es similar al tamaño de partícula antes de la encapsulación en las microesferas. El efecto del tamaño del liposoma en las características de liberación se presenta en las Figuras 11A y 11B para pH 7,2 y 8,0 respectivamente. En ambas figuras es evidente que el tamaño de liposoma no afecta el tiempo de retraso. Además, en las Figuras 11A y 11B se aprecia que la longitud del pulso varía sólo ligeramente con el tamaño de partícula.

En la Figura 12, se presenta el efecto de la relación de volumen PEG/dextrano en las características de liberación. Como se esperaba, una relación de volumen menor tiene como resultado un pulso mayor, ya que una relación de volumen menor tiene como resultado un mayor volumen de fase de dextrano. Por lo tanto, se tienen que degradar más reticulaciones para liberar todos los liposomas, resultando en un pulso más largo. La aparición del pulso no se vio afectada por la relación de volumen, porque el tamaño del poro y la velocidad de degradación es la misma, independientemente del volumen de la fase de dextrano.

El efecto del contenido de agua en la liberación se da en la Figura 13A. Se observa una liberación sobre un periodo de tiempo más largo. Sin embargo, el tiempo de retraso no aumentó para contenidos de agua más bajos, aunque la cantidad de liposomas liberados inicialmente fue menor en las microesferas con menor contenido de agua. Los efectos mencionados anteriormente del contenido en agua no se observaron cuando se uso dexHEMA con un menor grado de sustitución (Fig. 3B). Esto se puede explicar por el hecho de que los hidrogeles con DS menor de 10 no son estables dimensionalmente y por lo tanto se hinchan.

En las Figuras 14A y 14B se presentan otros efectos del grado de sustitución en las características de liberación. Es evidente que las formulaciones con un mayor DS liberan los liposomas después de un tiempo de retraso más largo y que la pendiente del pulso es menos inclinada. Por lo tanto, el tiempo total de liberación es más largo. También se observo una menor pendiente del pulso a pH 8,0 (Fig. 14B). Cuando se usó DS 16, se obtuvo una liberación de prácticamente orden cero, mientras que con DS 5 se obtuvo como resultado un pulso agudo. Sin embargo, a este pH, no se observaron las diferencias en el tiempo de retraso (tan pronto como a pH 7,2).

Además de dexHEMA, también se estudio la liberación de liposomas de microesferas dexLactateHEMA (monodispersas y polidispersas). EN la Figura 15, se comparan los perfiles de liberación de microesferas dexHEMA (DS 5) y dexLactateHEMA (DS 4). La liberación en las microesferas dexLactateHEMA fue mucho más rápida, por que el éster de lactato presente en dexLactateHEMA es más susceptible a la hidrólisis que el éster de carbonato presente en dexHEMA. No se observaron diferencias entre dexLactateHEMA mono- y polidisperso, porque el éster de lactato degradante es el mismo en ambos polímeros. Sin embargo, algunas ventajas del dexLactateHEMA es que se disuelve más fácilmente y que tienen como resultado una red mejor definida.

La liberación se estudió a pH 7,2 y 8,0 porque a estos valores de pH, la degradación del hidrogel está catalizada completamente básica, la tasa de liberación es lineal proporcionalmente con la concentración de OH^{-}. El pH de los tampones de liberación se estableció a 7,2 y 8,0 (temperatura ambiente), pero a 37ºC (temperatura de liberación) fueron 7,1 y 7,8 respectivamente. Por lo tanto, la concentración de OH^{-} es 4,9 veces mayor para pH 7,8 que para pH 7,1 de forma que se esperaba que la liberación fuese 4,9 veces más rápida para el mayor pH. En la Tabla 5, se representa la relación entre el tiempo en el que se libera el 50% de los liposomas para ambos valores de pH.

TABLA 5

5

La diferencia esperada teóricamente en la velocidad de liberación se corresponde con los valores encontrados experimentalmente. La discrepancia observada para DS=5 puede explicarse de nuevo por el hinchamiento del hidrogel.

Claims (12)

1. Un método para la preparación de sistemas coloidales microencapsulados que comprende las etapas de:

a) proporcionar una mezcla acuosa de

i)

una primera fase que comprende un polímero reticulable soluble en agua

ii)

una segunda fase que comprende un polímero soluble que es incompatible en solución con el polímero en dicha primera fase, y

iii)

sistemas coloidales a suspender en dicha primera fase;

formar una emulsión de dicha primera fase en dicha segunda fase, y

b) formar microesferas en la emulsión reticulando al menos parte de dicho polímero reticulable, formado de esta manera dichos sistemas coloidales microencapsulados.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa a) se realiza formando una premezcla, poniendo en contacto dichos sistemas coloidales con dicha primera fase, y juntando posteriormente esta premezcla con dicha segunda fase.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dichos sistemas coloidales se seleccionan entre el grupo compuesto por liposomas, iscoms, poliplexos, lipoplexos, nanopartículas, partículas lípídicas sólidas en el intervalo de tamaño coloidal, emulsiones y combinaciones de las mismas.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicho polímero reticulable es un polímero de dextrano que comprende grupos reticulables.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dichos grupos reticulables son grupos metacrilato.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dicho polímero de dextrano se selecciona entre el grupo compuesto por dexMA, dexHEMA y dexLactateHEMA.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el DS (grado de sustitución) de dicho polímero de dextrano es de 2 a 30.

8. El método de la reivindicación 1, en el que dicho polímero en la segunda fase se selecciona entre el grupo compuesto por polietilenglicol (PEG) y alcohol polivinílico (PVA).

9. El método de la reivindicación 1, en el que se usan sistemas coloidales que comprenden un ingrediente activo, cuyo ingrediente activo es preferiblemente un fármaco proteico.

10. Microesferas, en las que al menos un 50% en peso de las mismas tienen un diámetro de partícula entre 100 nm y 100 \mum, preferiblemente entre 5 y 15 \mum, que están comprendidas por un polímero degradable reticulado que encapsula sistemas coloidales.

11. Las microesferas de acuerdo con la reivindicación 10, que no tienen disolventes orgánicos.

12. Las microesferas de acuerdo con la reivindicación 10, en las que los sistemas coloidales comprenden un ingrediente activo, que es preferiblemente un fármaco proteico.